一种近红外碳点/二硫化钼复合材料及其应用的制作方法

1.本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种具有多重杀菌性能的近红外碳点/二硫化钼复合材料及其应用。


背景技术：

2.机械伤口及烧伤烫伤等后续可能产生的伤口感染已经成为影响人们生活质量的重要问题，在过去几十年里，抗生素在伤口感染的治疗中起着十分重要的作用。然而，传统抗生素滥用导致的细菌耐药性增加及生物体内积累，使药物治疗效果下降甚至造成人体不可逆的肝脏损伤，因此开发一种安全性高、杀菌见效快、稳定性好的抗菌剂迫在眉睫。随着纳米技术的发展，许多纳米材料已被设计用于抗菌领域。
3.光热疗法（photothermal therapy, ptt）和光动力疗法（photodynamic therapy, pdt）由于其无创性、耐药性、低毒性和可忽略的副作用等特点而处于医学和材料科学的前沿。光热疗法利用具有高光热转换效率的光敏剂，在外部光源照射下将光能转化为热能，达到局部温度升高以破坏细菌细胞膜从而引起细菌死亡。光动力疗法是通过激光辐照光敏剂过程中释放的活性氧（ros）来破坏细菌的细胞膜、蛋白质甚至dna以达到杀菌效果。然而单一的光动力治疗往往无法达到期望的治愈要求，近红外激光的高功率密度及长时间的暴露往往会导致伤口附近正常细胞的损伤，并且，过量的ros可能会引发正常组织的炎症反应。因此，制备一种多重抗菌策略于一体的抗菌剂是十分必要的。
4.碳点（carbon quantum dots，cqds，c-dots或cds）是一类尺寸小于10 nm的新型碳纳米材料，因其较高的水溶性、固有的发光性、优异的生物相容性、表面易改性受到研究者的广泛关注。碳点在生物医用领域具有巨大的发展潜力，如生物传感、生物成像、药物传递、抗菌等。
5.二硫化钼具有窄带隙，受到光的激发可产生ros，且该材料还具有一定的光热效应。由于其优异的光学、物理化学和生物相容性，二硫化钼已成为一种新型的具有高光热转换效率（photothermal conversion efficiency, pce）的生物相容性光热剂。
6.因此，设计一种多功能近红外改性碳点/二硫化钼复合材料应用于生物成像和对抗细菌感染领域有巨大的发展前景和研究价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种近红外碳点/二硫化钼复合材料，该复合材料制备方法简单便捷并且不需要昂贵耗材，制得的复合材料生物相容性良好且在近红外区域有吸收，可用于生物成像和多重协同抗菌领域。
8.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种近红外碳点/二硫化钼复合材料，由以下步骤制备得到：步骤1，将氨基氮源、羧基碳源和含铜化合物加至二甲基亚砜中，溶解后转移至反应釜中进行水热反应，反应产物冷却后过滤，滤液用乙醇沉淀，离心后经洗涤得到铜掺杂近
红外碳点；步骤2，将n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和季铵盐加至2
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(n-吗啡啉)乙磺酸（mes）缓冲液中进行活化反应，然后加入铜掺杂近红外碳点搅拌进行反应，反应液经离心、洗涤后得到季铵盐改性铜掺杂近红外碳点；步骤3，将硫源和钼源溶解在去离子水中，混合液转移至反应釜中进行水热反应，产物经离心、洗涤后重悬于水中，冷冻干燥得到二硫化钼纳米花；将二硫化钼纳米花溶解在乙醇中，然后加入支化聚乙烯亚胺（bpei），搅拌反应，产物经洗涤后得到改性二硫化钼；步骤4，将季铵盐改性铜掺杂近红外碳点的水溶液滴加至改性二硫化钼的水溶液中，剧烈搅拌反应，产物经洗涤，得到所述近红外碳点/二硫化钼复合材料。
9.在步骤1中，氨基氮源、羧基碳源、含铜化合物与二甲基亚砜的比例为每3~6 g氨基氮源、1~2 g羧基碳源、0.25~0.5 g含铜化合物用二甲基亚砜15~30 ml溶解；水热反应的条件为160~180 ℃、4~8 h。
10.所述羧基碳源为柠檬酸、透明质酸、酒石酸、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、蔗糖、抗坏血酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）中的一种或几种。
11.所述氨基氮源为尿素、苯并咪唑、乙醇胺、三（羟甲基）氨基甲烷、乙二胺四乙酸、间苯二胺、对苯二胺、乙二胺、聚乙烯亚胺、精氨酸、赖氨酸、三聚氰胺、盐酸氨基脲中的一种或几种。
12.所述含铜化合物为氯化铜、乙酸铜、硫酸铜、硝酸铜、溴化铜中的一种或几种。
13.在本发明的一个实施例中，将氨基氮源、羧基碳源和含铜化合物加入到二甲基亚砜中，先在室温下磁力搅拌10~30 min，使其混合均匀，并溶解。
14.作为优选，所述过滤是通过微孔过滤器（0.22 μm）实现。
15.其中，所述离心是在8000~10000 rpm的条件下离心8~15 min。
16.在步骤2中，季铵盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：4：4，2
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(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液的浓度为0.1 mol/l。
17.作为优选，所述铜掺杂近红外碳点溶液是将铜掺杂近红外碳点先溶于去离子水中，使其形成均一溶液，然后加入到氨基和羧基活化后的季铵盐溶液中并进行磁力搅拌以得到季铵盐改性铜掺杂近红外碳点溶液。
18.进一步地，所述铜掺杂近红外碳点溶液，其浓度为5 mg/ml。
19.其中，所述搅拌反应，其搅拌速度为600~800 rpm。
20.进一步地，所述搅拌时间为14~18 h。
21.在步骤3中，所述二硫化钼纳米花的制备过程为：用30~60 ml去离子水溶解0.6~0.9 g钼源和1.0~1.4 g硫源，将其转移至反应釜中180~220 ℃反应20~26 h，产物离心，用去离子水和乙醇反复洗涤，将产物重悬浮并冰冻干燥得到二硫化钼纳米花。
22.所述硫源为硫代乙酰胺、硫脲、半胱氨酸、甲硫氨酸、单质硫、四硫代钼酸铵中的一种或几种。
23.所述钼源为钼酸钠、钼酸铵、四硫代钼酸铵中的一种或几种。
24.所述支化聚乙烯亚胺修饰的二硫化钼的制备过程为：将制得的二硫化钼纳米花0.4~0.8 g分散在160~220 ml乙醇溶液中，加入4~8 ml 86 mmol/l支化聚乙烯亚胺的乙醇溶液，将混合的混悬液在剧烈搅拌下于40~80
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c保持4~8 h，最后通过乙醇和去离子水充分
洗涤并在-20 ℃下保存，冷冻干燥，得到支化聚乙烯亚胺修饰的二硫化钼。
25.作为优选，所述去离子水溶解钼源、硫源是超声3 min后所得均匀溶液。
26.进一步地，所述剧烈搅拌是使用机械搅拌器对其进行搅拌。
27.在步骤4中，所述具有多重杀菌性能的近红外碳点/二硫化钼复合材料的制备过程为：分别配制季铵盐改性的铜掺杂近红外量子点和支化聚乙烯亚胺修饰的二硫化钼的水溶液，将二者混合，剧烈搅拌，产物具有多重杀菌性能的近红外碳点/二硫化钼复合材料用去离子水洗涤，重悬浮后置于-20 ℃保存，冷冻干燥于真空罐中保存。
28.作为优选，所述两种溶液混合是将季铵盐改性的铜掺杂近红外碳点先溶于去离子水中，使其形成均一溶液，然后逐滴加入到支化聚乙烯亚胺修饰的二硫化钼溶液中，并大力搅拌，进行反应。
29.进一步地，所述季铵盐改性的铜掺杂近红外碳点溶液，其浓度为1 mg/ml。
30.进一步地，所述支化聚乙烯亚胺修饰的二硫化钼溶液，其浓度为1 mg/ml。
31.其中，所述大力搅拌是使用机械搅拌器对其进行搅拌。
32.所述具有多重杀菌性能的近红外碳点/二硫化钼复合材料，其平均粒径为250~280 nm，在近红外区域有吸收。
33.上述近红外碳点/二硫化钼复合材料在制备生物成像产品中的应用。
34.上述近红外碳点/二硫化钼复合材料在制备抗菌产品中的应用。
35.本发明以氨基氮源、羧基碳源和含铜化合物为原料，二甲基亚砜为溶剂，通过溶剂热一步反应得到可光热、光动力双重抗菌的铜掺杂近红外碳点；然后，在一定条件下将季铵盐修饰到铜掺杂近红外碳点表面，得到可光热、光动力、季铵盐多重抗菌的改性铜掺杂近红外碳点；最后，将季铵盐修饰的铜掺杂近红外碳点通过静电吸附作用与改性二硫化钼结合，得到具有优异生物相容性以及高效杀菌性的具有多重抗菌性能的近红外碳点/二硫化钼复合材料。使用小鼠成纤维细胞l929探究其在生物成像领域的应用，使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌探究其在多重抗菌领域的应用，与其它基于碳点的抗菌材料相比，本发明利用铜掺杂使该复合材料具有光动力杀菌性能且具有增强的光热效应但不会引起细胞毒性问题，在生物医用领域实现多重杀菌且可实现细胞成像，该近红外碳点/二硫化钼复合材料具有良好的生物相容性，低细胞毒性，良好的杀菌性能且不会产生细菌耐药性等问题，因此在未来的生物成像以及抗菌领域具有广阔的应用前景。
36.基于纳米材料的光疗法具有较小侵入性、较少副作用以及高时空选择性、低毒性的优势且具有高空间分辨率和组织穿透深度，因此在生物医用领域发挥了越来越大的作用。本发明制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料在近红外区域有吸收，铜的掺杂使其具有光动力性能，因此可采用光疗法杀灭细菌。此外，季铵盐的修饰增强了材料的正电性，并且其长烷基链可与细菌细胞膜的亲水性部分结合，从而轻易破坏细菌的细胞膜使其内容物泄漏，从而达到增强的杀菌效果。在808 nm激光照射下，近红外碳点/二硫化钼复合材料会产生局部过高热以及活性氧，当复合材料与细菌接触后，季铵盐会引起细菌细胞膜的损伤，使得细菌对激光照射后产生的过高热和活性氧更加敏感，从而损伤细菌的细胞膜、dna和线粒体，诱导细菌死亡。
37.与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）本发明所制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料，首先采用溶剂热的方法一步
合成铜掺杂近红外碳点，简化了实验过程，提高了制备过程效率，其次将季铵盐修饰的铜掺杂近红外碳点与改性二硫化钼通过静电作用结合，方法简便，易于合成。
38.（2）本发明所制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料，具有良好的生物相容性和低毒性等，在生物医用领域具有较大的发展前景。
39.（3）本发明所制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料，具有优越的荧光性能，且具有激发波长依赖性，在生物成像领域可实现多色成像。
40.（4）本发明所制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料，具有多重杀菌性能，杀菌效果优异且不会产生耐药性。
41.（5）本发明所制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料，具有较高的光热转换效率，光热性能优异。
附图说明
42.图1是近红外碳点/二硫化钼复合材料的透射电镜图；图中显示近红外碳点/二硫化钼复合材料成功制备，粒径约265 nm。
43.图2是近红外碳点/二硫化钼复合材料的zeta电位图；图中表明近红外碳点/二硫化钼复合材料的电荷电位约为11.1 ev。
44.图3是近红外碳点/二硫化钼复合材料的xrd图谱；图中近红外碳点/二硫化钼复合材料表现出碳点的（002）特征吸收峰以及二硫化钼纳米花的（100）（103）（110）特征吸收峰。
45.图4是近红外碳点/二硫化钼复合材料的紫外-可见光谱图；表明近红外碳点/二硫化钼复合材料在近红外区域有吸收。
46.图5是近红外碳点/二硫化钼复合材料的红外图谱，图中显示在3434 cm-1
处的特征吸收峰归因于o-h或n-h的伸缩振动；在1619 cm-1
处的特征吸收峰归因于c=n的伸缩振动；在1101 cm-1
处的特征吸收峰归因于c-oh的剪切振动；在890和795 cm-1
处的特征吸收峰归因于c-h的弯曲振动。
47.图6是近红外碳点/二硫化钼复合材料在不同激发波长下的荧光光谱图；表明近红外碳点/二硫化钼复合材料具有激发波长依赖性。
48.图7是近红外碳点/二硫化钼复合材料经808 nm激光照射后温度变化图；图中表明600 μg/ml的近红外碳点/二硫化钼在808 nm激光照射下10 min温度可升至53.5℃，相比对照组有了明显升高，其光热转换效率约73.38 %。
49.图8是近红外碳点/二硫化钼复合材料经808 nm激光照射后ros检测探针二苯基苯并呋喃（dpbf）的uv-vis图，其在410 nm处具有特殊吸收，一旦被氧化，吸收强度降低。图中表明，经808 nm激光照射后，随着照射时间的增加，dpbf的吸收强度逐渐降低，说明近红外碳点/二硫化钼复合材料具有优异的光动力效果。
50.图9是近红外碳点/二硫化钼复合材料经808 nm激光照射后大肠杆菌菌落数图；图中表明近红外碳点/二硫化钼复合材料在808 nm激光照射（l）后可有效抑制细菌的生长，并且浓度越高抗菌性能越好，表明近红外碳点/二硫化钼复合材料具有优异的多重杀菌性能。
51.图10是近红外碳点/二硫化钼复合材料经808 nm激光照射后金黄色葡萄球菌菌落数图；图中表明近红外碳点/二硫化钼复合材料在808 nm激光照射（l）后可有效抑制细菌的生长，并且浓度越高抗菌性能越好，表明近红外碳点/二硫化钼复合材料具有优异的多重杀
菌性能。
52.图11是近红外碳点/二硫化钼复合材料在488 nm、543 nm下的细胞成像图，在激光共聚焦荧光显微镜下，经材料处理过的细胞呈现出明亮的绿色、红色荧光。表明近红外碳点/二硫化钼复合材料具有优异的细胞成像性能。
具体实施方式
53.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
54.实施例1近红外碳点/二硫化钼复合材料的制备步骤1，称取3 g尿素、1 g柠檬酸、0.25 g氯化铜置于干净烧杯中，加入15 ml二甲基亚砜溶解，在室温下以800 rpm磁力搅拌30 min。将溶液转移至聚四氟乙烯水热反应釜中，置于160℃的恒温烘箱中反应6 h。反应产物冷却至室温后，用0.22 μm滤头过滤，将滤液转移至离心管中，并用乙醇将其沉淀，10000 rpm离心，得到铜掺杂近红外碳点。用去离子水和乙醇反复洗涤，重悬浮后置于-20℃下保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
55.步骤2，称取2-（n-吗啉）乙磺酸0.26 g，配置成12 ml缓冲液。称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.26 g、n-羟基琥珀酰亚胺0.15 g、椰油酰胺丙基甜菜碱0.1 g，在12 ml 2-（n-吗啉）乙磺酸缓冲液中反应4 h活化氨基和羧基。加入5 mg/ml的铜掺杂碳点溶液约4 ml，继续搅拌14 h，将所得产物离心，并用去离子水、乙醇各洗涤3次，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥后即可得到季铵盐改性铜掺杂近红外碳点。
56.步骤3，称取1.0 g钼酸钠和1.4 g硫代乙酰胺，用40 ml去离子水溶解，超声振动3 min得到均匀溶液，并将其转移至聚四氟乙烯水热反应釜中，在200℃条件下反应24 h，待反应结束冷却至室温，将所得产物用去离子水和乙醇各洗涤3次，重悬浮后冷冻干燥，得到二硫化钼纳米花黑色粉末；称取0.2 g二硫化钼于三颈烧瓶，加入200 ml乙醇，封口，超声溶解，加入4 ml 86mmol/l的bpei溶液，于60℃油浴加热下大力搅拌4 h，得到的产物用乙醇和去离子水反复洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
57.步骤4，称取0.02 g支化聚乙烯亚胺改性后的二硫化钼纳米花，用20 ml去离子水超声溶解；另取0.001 g季铵盐改性的铜掺杂近红外碳点，用1 ml去离子水超声溶解。将溶解后的碳点溶液逐滴加入到改性二硫化钼纳米花溶液中，剧烈搅拌1 h，将产物用去离子水洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
58.本实施例制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料的透射电镜图如图1所示，图中显示出近红外碳点/二硫化钼复合材料成功制备，粒径约265 nm。
59.本实施例制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料的zeta电位图如图2所示，图中显示出近红外碳点/二硫化钼复合材料的电荷电位为11.1 ev，显正电。
60.本实施例制备的近红外碳点/二硫化钼复合材料的xrd图谱如图3所示，图中显示出近红外碳点在2θ为23.7
°
处出现特征吸收峰，且表现出二硫化钼的（100）（103）（110）特征吸收峰。
min得到均匀溶液，并将其转移至聚四氟乙烯水热反应釜中，在200℃条件下反应24 h，待反应结束冷却至室温，将所得产物用去离子水和乙醇各洗涤3次，重悬浮后冷冻干燥，得到二硫化钼纳米花黑色粉末；称取0.2 g二硫化钼于三颈烧瓶，加入200 ml乙醇，封口，超声溶解，加入4 ml 86mmol/l的bpei溶液，于60℃油浴加热下大力搅拌4 h，得到的产物用乙醇和去离子水反复洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
72.步骤4，称取0.02 g支化聚乙烯亚胺改性后的二硫化钼纳米花，用20 ml去离子水超声溶解；另取0.001 g季铵盐改性的铜掺杂近红外碳点，用1 ml去离子水超声溶解。将溶解后的碳点溶液逐滴加入到改性二硫化钼纳米花溶液中，剧烈搅拌1 h，将产物用去离子水洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
73.实施例3近红外碳点/二硫化钼复合材料的制备步骤1，称取3 g尿素、1 g柠檬酸、0.25 g氯化铜置于干净烧杯中，加入15 ml二甲基亚砜溶解，在室温下以800 rpm磁力搅拌30 min。将溶液转移至聚四氟乙烯水热反应釜中，置于180℃的恒温烘箱中反应6 h。反应产物冷却至室温后，用0.22 μm滤头过滤，将滤液转移至离心管中，并用乙醇将其沉淀，10000 rpm离心，得到铜掺杂近红外碳点。用去离子水和乙醇反复洗涤，重悬浮后置于-20℃下保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
74.步骤2，称取2-（n-吗啉）乙磺酸0.26 g，配置成12 ml缓冲液。称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.26 g，n-羟基琥珀酰亚胺0.15 g、椰油酰胺丙基甜菜碱0.1 g，在12 ml 2-（n-吗啉）乙磺酸缓冲液中反应4 h活化氨基和羧基。加入5 mg/ml的铜掺杂碳点溶液约4 ml，继续搅拌14 h，将所得产物离心，并用去离子水、乙醇各洗涤3次，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥后即可得到季铵盐改性铜掺杂近红外碳点。
75.步骤3，称取1.0 g钼酸钠和1.4 g硫代乙酰胺，用40 ml去离子水溶解，超声振动3 min得到均匀溶液，并将其转移至聚四氟乙烯水热反应釜中，在200℃条件下反应24 h，待反应结束冷却至室温，将所得产物用去离子水和乙醇各洗涤3次，重悬浮后冷冻干燥，得到二硫化钼纳米花黑色粉末；称取0.2 g二硫化钼于三颈烧瓶，加入200 ml乙醇，封口，超声溶解，加入4 ml 86mmol/l的bpei溶液，于60℃油浴加热下大力搅拌4 h，得到的产物用乙醇和去离子水反复洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。
76.步骤4，称取0.02 g支化聚乙烯亚胺改性后的二硫化钼纳米花，用20 ml去离子水超声溶解；另取0.005 g季铵盐改性的铜掺杂近红外碳点，用1 ml去离子水超声溶解。将溶解后的碳点溶液逐滴加入到改性二硫化钼纳米花溶液中，剧烈搅拌1 h，将产物用去离子水洗涤，重悬浮后置于-20℃冰箱保存，冷冻干燥并于真空罐中保存。