一种细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法与应用

1.本发明属于纳米材料制备技术领域，更具体地，涉及一种细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法与应用，该细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜具有近红外吸收功能、及光热转换性能，且生物相容性良好，尤其能够应用于抗肿瘤治疗。


背景技术：

2.肿瘤严重威胁人类的健康，光热疗法(photothermal therapy,ptt)以其选择性高和侵袭性小等独特的优势，成为被广泛研究的一种新型肿瘤治疗方法。ptt是光热材料在近红外光(波段：780～1100纳米)的照射下将光能转换为热量，使得肿瘤组织局部温度升高，杀死肿瘤细胞，并诱导抗肿瘤免疫效应。然而，由于光的组织穿透性有限、光热材料的光热转换效率及光稳定性较差、光热材料的肿瘤蓄积能力不足等限制了ptt的效果。
3.近年来，随着纳米技术的不断发展，具有独特光学性能的纳米材料已应用于肿瘤ptt中，如金纳米材料、碳纳米管、半导体纳米粒以及有机聚合物纳米材料等。研究发现，cus纳米粒具有成本低、制备简单、光热性能稳定等优势，从众多材料中脱颖而出，成为了光热治疗中的研究热点，广泛应用于抗肿瘤治疗。
4.cus纳米粒常用合成方法是配体法，常用的配体剂有柠檬酸钠、聚维酮、明胶等。然而，利用上述配体剂制备cus纳米粒通常需要高温等条件，且得到的cus不容易进行后修饰以增强其肿瘤靶向性及生物相容性等。光热材料的生物安全性是临床ptt应用的关键，而配体剂对于光热材料cus纳米粒的生物相容性具有很大的影响。近年来，以蛋白质为配体的蛋白质生物矿化技术用于指导无机纳米粒子的合成。由于蛋白富含丰富的氨基、羧基、巯基等官能团，其多种金属离子结合位点可通过与金属离子的配位作用调控纳米晶体的生长，为构建功能性金属硫化物提供了另一种方法，以满足生物医学应用的要求。现有技术利用配体剂制备得到的cus纳米粒，往往会采用挤压或者超声方式将生物膜(如肿瘤细胞膜、红细胞膜等)修饰到cus纳米粒表面，以赋予cus纳米粒生物学仿生功能，但这些现有方式较为繁琐、且可能破坏膜蛋白本身，影响功能的实现。其它化学物质修饰纳米粒的情景，也往往需要进一步采用物理或化学方法，即，先合成相应的化学物质，再采用物理或化学反应使化学物质修饰到纳米粒表面，同样存在工艺较为繁琐、且可能破坏材料功能的实现。
5.细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,omvs)是一种主要由革兰阴性菌分泌而来且不具有复制能力的30-200nm的囊泡。omvs包含来自细菌的抗原和多种病原相关分子模式如脂多糖、外膜蛋白和脂蛋白等，是一种很有前景的免疫佐剂。此外，由于omvs具有易制备、生物相容性较好、稳定性良好以及独特肿瘤靶向能力等，已广泛用于抗肿瘤药物递送的研究。
6.因此，研究开发以omvs为配体的纳米硫化铜，制备方法简单易实现，并可丰富纳米硫化铜的性能，具有重要的临床应用价值。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法与应用，其中通过以纳米硫化铜为基体，并首次以细菌外膜囊泡为配体，使配体细菌外膜囊泡直接位于纳米硫化铜上，相应得到细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，具有免疫激活作用，并且，在近红外光的照射下，具有较强的光热转换效果，能够实现肿瘤的免疫/光热协同治疗。此外，本发明合成方法操作简便，反应过程绿色无污染，制备得到的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜具有形态规则、近红外吸收功能、优良的光热转换性能和良好的生物相容性；同时，该细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜整体可发挥免疫激活作用，并具备肿瘤靶向能力。本发明将制备得到的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜用于肿瘤的光热和免疫治疗，具有良好的临床应用前景。
8.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，其特征在于，包括纳米硫化铜基体，以及直接位于在该基体上的配体细菌外膜囊泡。
9.作为本发明的进一步优选，所述细菌外膜囊泡优选为大肠杆菌来源的细菌外膜囊泡、或减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡。
10.作为本发明的进一步优选，所述细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的整体尺寸为30～200nm。
11.按照本发明的另一方面，本发明提供了上述细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
12.(s1)以铜盐作为铜源材料，硫化钠为硫源材料，分别配制铜盐水溶液和硫化钠水溶液；
13.(s2)将细菌外膜囊泡分散于磷酸盐缓冲液中，得到细菌外膜囊泡溶液；
14.(s3)将所述铜盐水溶液加入到所述细菌外膜囊泡溶液中，进行孵育；接着，将所述硫化钠水溶液滴加到孵育后的溶液体系中，搅拌反应后，离心、洗涤得到细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜。
15.作为本发明的进一步优选，所述步骤(s3)中，所述搅拌反应是在20℃～25℃的温度条件下进行的，反应时间为24h～36h。
16.作为本发明的进一步优选，所述步骤(s1)中，所述铜盐具体为醋酸铜，所述铜盐水溶液具体是通过将醋酸铜溶于去离子水中得到的，所述醋酸铜的物质的量与所述去离子水的体积之比为0.01:1mmol/ml～0.02:1mmol/ml；
17.或者，所述铜盐具体为氯化铜，所述铜盐水溶液具体是通过将氯化铜溶于去离子水中得到的，所述氯化铜的物质的量与所述去离子水的体积之比为0.01:1mmol/ml～0.02:1mmol/ml；
18.或者，所述铜盐具体为硫酸铜，所述铜盐水溶液具体是通过将硫酸铜溶于去离子水中得到的，所述硫酸铜的物质的量与所述去离子水的体积之比为0.01:1mmol/ml～0.02:1mmol/ml；
19.所述步骤(s1)中，所述硫化钠水溶液是通过将九水合硫化钠溶于去离子水中得到的，所述九水合硫化钠的物质的量与所述去离子水的体积之比为0.1:1mmol/ml～0.2:1mmol/ml；
20.所述步骤(s3)中，所述铜盐水溶液的用量与所述硫化钠水溶液的用量满足：铜盐水溶液中的铜元素与硫化钠水溶液中硫元素两者的物质的量之比为1:1～1:4。
21.作为本发明的进一步优选，所述步骤(s2)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5mmol/l～9mmol/l；
22.所述步骤(s3)中，所述孵育的孵育时间为30～60min；
23.所述步骤(s3)中，所述离心所采用的离心转速为5000～6000rpm/min，离心时间为15～30min。
24.按照本发明的又一方面，本发明提供了上述细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜在制备抗肿瘤药物中的应用。
25.作为本发明的进一步优选，所述抗肿瘤药物具体为光热抗肿瘤药物，该光热抗肿瘤药物的光作用波段优选为近红外光波段；优选的，所述肿瘤为乳腺癌、口腔鳞癌或皮肤癌。
26.作为本发明的进一步优选，所述抗肿瘤药物具体为抗肿瘤免疫激活药物；优选的，所述抗肿瘤药物具体为能够实现光热/免疫联合治疗的抗肿瘤药物。
27.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明设计合成的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，是首次以细菌外膜囊泡为配体，配合纳米硫化铜为基体，使配体细菌外膜囊泡直接位于纳米硫化铜上，相应得到的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜整体，既能够作为光热材料应用于抗肿瘤治疗(例如，在近红外光的照射下)，又能够作为免疫药物应用于抗肿瘤治疗，尤其可实现肿瘤的光热/免疫联合治疗。
28.本发明中细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的合成，不同于现有技术中将细菌外膜囊泡通过挤压或者超声方式修饰到以聚维酮、明胶、柠檬酸钠等为配体制备的硫化铜纳米粒表面(之所以需要合适的配体制备硫化铜纳米粒，是因为配体能够稳定cu离子、s离子，得到cus纳米晶，否则将只能得到cus沉淀)，本发明是先将细菌外膜囊泡在铜源(即铜盐)水溶液中进行孵育，孵育完成后再向其中滴加硫源(即硫化钠)水溶液，搅拌反应后即可生成细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，从而简单高效地将omvs应用于纳米递药系统中。对于得到的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，其中的细菌外膜囊泡成分直接位于纳米硫化铜上，除细菌外膜囊泡外不存在其它配体。omvs含有丰富的蛋白结构，其中的金属离子结合位点可通过与金属离子的配位作用调控纳米晶体的生长，因此在omvs与铜盐水溶液共孵育完成后，通过加入硫源水溶液，即可有效生成得到细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜整体材料。而若采用挤压或者超声方式，除了工艺较为繁琐外，还极有可能在合成过程中，破坏omvs蛋白的拓扑结构，影响omvs的功能。另外，本发明在研发过程中也尝试了将细菌外膜囊泡在硫源水溶液中进行孵育，但由于硫源水溶液会影响细菌外膜囊泡的形态、造成负面影响，因此最终确认了先将细菌外膜囊泡在铜源水溶液中进行孵育、孵育后再向其中滴加硫源水溶液的合成工艺。
29.具体说来，本发明能够取得以下有益效果：
30.(1)本发明的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜具有肿瘤靶向能力，具有良好的生物相容性，且具有稳定的光热转换及免疫佐剂性能；
31.(2)本发明的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜尤其可实现肿瘤光热/免疫协同治疗效果，同时对生物体无明显毒副作用。
32.(3)本发明中的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜通过简单的合成方法即可获得，合成方法尤其可在室温条件下进行；此外，与金这一贵金属相比，本发明中的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，其基体为纳米硫化铜，由低成本的cu、s构成，成本大大降低。
33.在应用时，例如可将本发明得到的细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜分散在任何适于临床应用的生理盐水(如0.9％的氯化钠溶液)或缓冲液(如ph＝7-9的磷酸盐缓冲液)中，以注射剂的方式施用至生物体中(注射可以为静脉注射、瘤内注射等方式)；这些细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜既具有免疫激活效果，并且在近红外光的照射下，能够将光能转换为热能，实现肿瘤的光热治疗，尤其可以利用光热/免疫协同治疗抑制肿瘤生长。
34.综上，本发明以细菌外膜囊泡为配体，通过简便、绿色无污染的方法，制备得到细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜，具有形态规则、近红外吸收功能、光热转换性能和生物相容性良好的特点，能够在肿瘤部位有效富集，实现靶向肿瘤的光热和免疫治疗。
附图说明
35.图1为实施例1中制备所得cus-omvs的透射电镜图片。
36.图2为实施例1中制备所得cus-omvs的紫外-可见-近红外吸收光谱。
37.图3为实施例2中制备所得cus-omvs的透射电镜图片。
38.图4为实施例2中制备所得cus-omvs的紫外-可见-近红外吸收光谱。
39.图5为实施例3中制备所得cus-omvs的透射电镜图片。
40.图6为实施例3制备所得cus-omvs在功率为1w/cm2的1064nm近红外光照射下的升温曲线图。
41.图7为实施例4中制备所得cus-omvs的透射电镜图片。
42.图8为实施例5中不同浓度的cus-omvs的升温曲线图。
43.图9为实施例6中不同浓度的cus-omvs在近红外光照射下对乳腺癌细胞增殖能力的影响。
44.图10为实施例7中cus-omvs对bmdcs的激活作用；其中，图10中的a、b、c分别为bmdcs激活相关共刺激分子cd80、cd86和mhcⅱ表达变化(图中横轴自左向右均依次为对照组1、对照组2、实验组、对照组3)。
45.图11为实施例8中cus-omvs逆极化m2型巨噬细胞的效果；其中，图11中的a、b分别为cus-omvs逆极化m2型巨噬细胞后m1相关表面特征分子cd80和cd86表达变化，图11中的c为cus-omvs逆极化m2型巨噬细胞后m2相关表面特征分子cd206表达变化(图中横轴自左向右均依次为对照组1、对照组2、实验组)。
46.图12是实施例9中cus-omvs在荷瘤小鼠体内的分布结果；其中，图12中的a为活体成像结果，图12中的b为cus-omvs在荷瘤小鼠不同组织中的分布结果。
47.图13为实施例10中cus-omvs的体内光热/免疫治疗效果；其中，图13中的a为激光照射治疗组的小鼠原位肿瘤升温图，图13中的b为不同治疗组的小鼠原位肿瘤生长曲线，图13中的c为不同治疗组对小鼠存活时间的影响结果图。
48.图14为实施例11中cus-omvs的毒性研究；其中，图14中的a对应小鼠体重，图14中的b对应小鼠血清中谷丙转氨酶含量，图14中的c对应小鼠血清中肌酐含量。
49.图15为实施例12中cus-omvs对scc-7小鼠口腔鳞癌模型中肿瘤生长的抑制结果。
50.图16为实施例13中cus-omvs对b16-f10黑色素瘤模型中肿瘤生长的抑制结果。
具体实施方式
51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
52.本发明中细菌外膜囊泡为配体的纳米硫化铜(以下简记为：cus-omvs)的制备方法，可包括以下步骤：
53.步骤1：将醋酸铜溶于去离子水中，搅拌至完全溶解，得到醋酸铜溶液；
54.步骤2：将九水合硫化钠溶于去离子水中，搅拌至完全溶解，得到硫化钠水溶液；
55.步骤3：将细菌外膜囊泡分散于磷酸盐缓冲液中；
56.步骤4：将醋酸铜溶液加入到细菌外膜囊泡中，孵育；
57.步骤5：将硫化钠溶液滴加至步骤4溶液中，室温搅拌反应，离心、洗涤得到cus-omvs。
58.后文实施例所采用的主要试剂及材料来源如下：
59.醋酸铜、九水合硫化钠和氯化钠(国药控股北京有限公司)；酵母提取物、胰蛋白胨(oxoid公司，英国)；增强型bca蛋白检测试剂盒、beyogoldtm真空滤器(碧云天生物技术有限公司)；透析袋(源叶)；cck8(同仁，日本)；胰酶、胎牛血清(gibco life technologies公司，美国)；1640培养基、dmem(1x)培养基、青霉素-链霉素双抗(hyclone公司，美国)；96孔板、100mm培养皿均购自corning；酶标仪(上海三科仪器有限公司)；流式细胞仪(cytoflex，美国)；小鼠乳腺癌4t1细胞系、scc-7小鼠口腔鳞癌细胞系、b16-f10黑色素瘤细胞系购自american type culture collection(manassas,va,usa)；balb/c小鼠、c57/6j小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
60.实施例1：一种以大肠杆菌nissle 1917外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法，具体步骤为：
61.(1)称取1.2mg的醋酸铜，加入0.3ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
62.(2)称取5.76mg的九水合硫化钠，加入0.12ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
63.(3)将大肠杆菌nissle 1917来源的细菌外膜囊泡分散于9mmol/l的磷酸盐缓冲液中；(4)将醋酸铜溶液加入到细菌外膜囊泡中，孵育1h；
64.(5)将硫化钠溶液滴加至步骤4溶液中，室温搅拌反应12h，离心、洗涤得到cus-omvs。
65.该实施例制备的cus-omvs的透射电镜图片如图1所示，图中显示cus-omvs的粒径为30～200nm；cus-omvs的紫外-可见-近红外吸收光谱如图2所示，由图可知，本发明cus-omvs在近红外区有较强的吸收。
66.实施例2：一种以大肠杆菌nissle 1917外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法，具体步骤为：
67.(1)称取1.2mg的醋酸铜，加入0.3ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
68.(2)称取2.88mg的九水硫化钠，加入0.06ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
69.(3)将大肠杆菌nissle 1917来源的细菌外膜囊泡分散于5mmol/l磷酸盐缓冲液中；
70.(4)将醋酸铜溶液加入到细菌外膜囊泡中，孵育0.5h；
71.(5)将硫化钠溶液滴加至步骤4溶液中，室温搅拌反应12h，离心、洗涤得到cus-omvs。
72.该实施例制备的cus-omvs的透射电镜图片如图3所示，图中显示cus-omvs的粒径为30～200nm；cus-omvs的紫外-可见-近红外吸收光谱如图4所示，由图可知，本发明cus-omvs在近红外区有较强的吸收。
73.实施例3：一种以减毒沙门氏菌(鸟苷四磷酸合成缺陷)外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法，具体步骤为：
74.(1)称取1.2mg的醋酸铜，加入0.3ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
75.(2)称取5.76mg的九水合硫化钠，加入0.12ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
76.(3)将减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡分散于9mmol/l磷酸盐缓冲液中；
77.(4)将醋酸铜溶液加入到细菌外膜囊泡中，孵育1h；
78.(5)将硫化钠溶液滴加至步骤4溶液中，室温搅拌反应12h，离心、洗涤得到cus-omvs。
79.该实施例制备的cus-omvs的透射电镜图片如图5所示，图中显示cus-omvs的粒径为30～200nm；cus-omvs的光热升温曲线如图6所示，由图可知，cus-omvs分散液的温度随激光照射时间延长逐步升高，呈现时间依赖性，这说明cus-omvs具有良好的光热转换性能。
80.实施例4：一种以减毒沙门氏菌(鸟苷四磷酸合成缺陷)外膜囊泡为配体的纳米硫化铜的制备方法，具体步骤为：
81.(1)称取1.2mg的醋酸铜，加入0.3ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
82.(2)称取2.88mg的九水硫化钠，加入0.06ml去离子水，搅拌10min至完全溶解；
83.(3)将减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡分散于5mmol/l磷酸盐缓冲液中；
84.(4)将醋酸铜溶液加入到细菌外膜囊泡中，孵育0.5h；
85.(5)将硫化钠溶液滴加至步骤4溶液中，室温搅拌反应12h，离心、洗涤得到cus-omvs。
86.该实施例制备的cus-omvs的透射电镜图片如图7所示，图中显示cus-omvs的粒径为30～200nm。
87.实施例5：不同浓度cus-omvs的光热升温效果
88.取实施例1制备得到的cus-omvs，配置成50μg/ml的分散母液，分别稀释成10、30μg/ml的分散液，不同浓度的cus-omvs分散液在1064nm波长的激光器以0.76w/cm2功率照射5min，用热成像仪记录温度变化，结果如图8所示；
89.实验结果，在相同的激光照射条件下，不同浓度cus-omvs溶液均呈现一定的升温现象，并且随着cus-omvs含量的增加，其温度升高更显著，呈现浓度依赖性，说明cus-omvs在1064nm激光照射下具有较好的光热转换性能。
90.实施例6：实施例1制备的cus-omvs在近红外光照射下对乳腺癌细胞增殖能力的影响
91.取对数生长期的4t1细胞，用0.05％胰酶消化2min，用完全培养基终止消化，以
1000r/min的转速离心3min，弃去上清，加入9ml完全培养基轻轻吹打使成单个细胞悬液，将此细胞悬液进行细胞计数，调整细胞浓度，以2
×
104个/ml的细胞密度铺于96孔板中，即不同浓度cus-omvs组分别为0、2、5、10、20、30μg/ml。12h后弃去培养液，换不含血清的dmem后加不同浓度cus-omvs，每孔20μl，于孵箱中培养12h。12h后，吸弃培养液，并用pbs洗3次，换新鲜不含血清的dmem，在1064nm激光(0.76w/cm 2
，5min)照射后，继续培养24h。终止培养后，每孔加入10μl cck8溶液，避光孵育2-4h后，用酶标仪于450nm波长处检测各组吸光度值，并计算细胞的存活率。
92.实验结果，无激光照射条件下，不同浓度cus-omvs对乳腺癌细胞增殖能力无明显影响，说明cus-omvs对乳腺癌细胞无明显毒性；在激光照射条件下，低浓度cus-omvs即对乳腺癌细胞增殖能力有一定程度抑制，并且随着cus-omvs浓度的增加，其对乳腺癌细胞增殖的抑制能力明显增强，具有一定的浓度依赖性，说明cus-omvs在1064nm激光照射下对乳腺癌细胞具有较好的光热杀伤效果。实验结果见图9。
93.实施例7：实施例1制备的cus-omvs对bmdcs的激活作用
94.用1ml rpmi 1640培养基从5-6周龄雌性balb/c小鼠股骨和胫骨的骨髓腔中冲洗骨髓细胞。用尼龙网过滤细胞悬浮液，离心得到细胞沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，用pbs洗涤1次，离心，所得细胞在含有10ng/ml gm-csf和10ng/ml il-4的rpmi 1640培养基中培养6d，获得未成熟的bmdcs。在对应孔中分别加pbs、omvs、cus-omvs、lps处理24h。终止细胞培养后，收集各组细胞，加入抗cd11c、抗cd80和抗cd86抗体孵育30min，最后通过流式细胞仪检测bmdcs的激活情况。按7.5μg/ml(蛋白量)加入cus-omvs的bmdcs作为实验组，pbs处理的bmdcs作为对照组1，按7.5μg/ml(蛋白量)加入细菌外膜囊泡的bmdcs作为对照组2，加入200ng/ml lps处理的bmdcs作为对照组3。
95.实验结果，omvs和cus-omvs显著增加了cd80

bmdcs、cd86

bmdcs(如图10中的a和图10中的b所示)和mhcⅱ
bmdcs(如图10中的c所示)的比例相对于阴性对照pbs组，且稍强于阳性对照lps组。以上结果说明cus-omvs有效激活dcs发挥免疫激动剂的作用。
96.实施例8：实施例1制备的cus-omvs逆极化m2型巨噬细胞的效果
97.用1ml rpmi 1640培养基从5-6周龄雌性balb/c小鼠股骨和胫骨的骨髓腔中冲洗骨髓细胞。用尼龙网过滤细胞悬浮液，离心得到细胞沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，用pbs洗涤1次，离心，所得细胞在含有20ng/ml m-csf的rpmi 1640培养基中培养5d，获得未成熟的bmdms。未成熟的bmdms经过20ng/ml il-4处理24h即得到m2型bmdms。在对应孔中分别加pbs、omvs、cus-omvs处理24h。终止细胞培养后，收集各组细胞，加入抗cd206、抗cd80和抗cd86抗体孵育30min，最后通过流式细胞仪检测m2型bmdms逆极化效果。按7.5μg/ml(蛋白量)加入cus-omvs的bmdms作为实验组，pbs处理的bmdms作为对照组1，按7.5μg/ml(蛋白量)加入细菌外膜囊泡的bmdms作为对照组2。
98.实验结果，omvs和cus-omvs显著增加了cd80

bmdms和cd86

bmdms的比例相对于阴性对照pbs组(如图11中的a和图11中的b所示)，显著降低了cd206

bmdms的比例(如图11中的c所示)。以上结果说明cus-omvs可逆极化m2型bmdms为m1型，改善免疫抑制微环境。
99.实施例9：通过4t1小鼠乳腺癌原位瘤动物模型检测实施例1制备得到的cus-omvs在肿瘤组织中的蓄积
100.(1)小鼠：spf级balb/c雌性小鼠，5-6周龄，18～22g；
101.(2)乳腺癌原位模型的构建：取对数生长期的4t1乳腺癌细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至1
×
107个/ml，于小鼠右侧乳腺脂肪垫处注射50μl细胞悬液；
102.(3)待肿瘤体积长至100-150mm3，将荷瘤小鼠随机分为2组，即
①
ir780标记的omvs处理的小鼠作为对照组1、
②
ir780标记的cus-omvs处理的小鼠作为实验组，每组3只；
103.(4)给药方式为尾静脉注射；
104.(5)给药后24h后，将两组小鼠分别置于小动物成像仪；检测荷瘤小鼠体内ir780荧光的分布。
105.(6)待活体成像完毕后，处死小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤进行成像及称重。
106.实验结果见图12，其中，图12中的a结果显示cus-omvs与omvs一样能靶向蓄积于肿瘤组织，表明以omvs为配体制备得到的cus-omvs仍具备omvs靶向肿瘤组织的能力；图12中的b结果更进一步证实相比于正常组织(心、肝、脾、肺、肾)，cus-omvs在肿瘤部位能有效蓄积。
107.实施例10：通过4t1小鼠乳腺癌原位瘤动物模型检测实施例1制备得到的cus-omvs的体内光热/免疫治疗效果
108.(1)小鼠：spf级balb/c雌性小鼠，5-6周龄，18～22g；
109.(2)乳腺癌原位模型的构建：取对数生长期的4t1乳腺癌细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至1
×
107个/ml，于小鼠右侧乳腺脂肪垫处注射50μl细胞悬液；
110.(3)待肿瘤体积长至50-100mm3，将荷瘤小鼠随机分为6组，即
①
pbs处理的小鼠作为对照组1、
②
omvs处理的小鼠作为对照组2、
③
cus-omvs处理的小鼠作为对照组3、
④
pbs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组4、
⑤
omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组5、
⑥
cus-omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为实验组，每组6只；
111.(4)给药方式为尾静脉注射；
112.(5)给药后24h后，将
④⑤⑥
组小鼠的肿瘤部位分别置于1w/cm
2 1064nm近红外光条件下照射10min；检测荷瘤小鼠经激光照射后瘤内温度随时间变化关系。
113.(6)各组处理完毕后，按正常喂养方式喂养，每隔一天记录一次肿瘤体积，观察周期为15天。
114.实验结果见图13，
⑥
cus-omvs 近红外激光照射组，荷瘤小鼠经激光照射后肿瘤温度随时间的增加而增加，结果如图13中的a所示，而
④
、
⑤
组小鼠经激光照射后肿瘤温度随时间的增加无明显增加。各治疗组小鼠在治疗后肿瘤生长曲线存在明显差异，cus-omvs 近红外激光照射组小鼠肿瘤体积明显小于
①②③④⑤
组，而其他五组肿瘤体积增长趋势无显著性差异，
②③⑤
组对肿瘤体积有一定抑制效果(如图13中的b所示)，且cus-omvs 近红外激光照射组可延长小鼠的存活时间(如图13中的c所示)。以上结果表明，本发明制备得到的cus-omvs具有良好的光热/免疫治疗效果。
115.实施例11：实施例1制备得到的cus-omvs的毒性研究
116.(1)小鼠：spf级balb/c雌性小鼠，5-6周龄，18～22g；
117.(2)乳腺癌原位模型的构建：取对数生长期的4t1乳腺癌细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整
浓度至1
×
107个/ml，于小鼠右侧乳腺脂肪垫处注射50μl细胞悬液；
118.(3)待肿瘤体积长至50-100mm3，将荷瘤小鼠随机分为6组，即
①
pbs处理的小鼠作为对照组1、
②
omvs处理的小鼠作为对照组2、
③
cus-omvs处理的小鼠作为对照组3、
④
pbs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组4、
⑤
omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组5、
⑥
cus-omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为实验组，每组6只；
119.(4)给药方式为尾静脉注射；
120.(5)给药后24h后，将
④⑤⑥
组小鼠的肿瘤部位分别置于1w/cm
2 1064nm近红外光条件下照射10min；
121.(6)各组处理完毕后，按正常喂养方式喂养，每隔一天记录一次小鼠体重，观察周期为15天。
122.实验结果表明，各治疗组小鼠在治疗后体重无明显差异(如图14中的a所示)，且各治疗组小鼠的谷丙转氨酶(如图14中的b所示)和肌酐(如图14中的c所示)无明显变化，表明近红外激光和cus-omvs未对小鼠产生明显副作用。
123.实施例12：通过scc-7口腔鳞癌小鼠移植瘤动物模型检测实施例1制备得到的cus-omvs的体内光热/免疫治疗效果
124.(1)小鼠：spf级balb/c雄性小鼠，5-6周龄，18～22g；
125.(2)口腔鳞癌小鼠移植瘤模型的构建：取对数生长期的scc-7细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至5
×
107个/ml。每只小鼠皮下注射0.2ml细胞悬液；
126.(3)待肿瘤体积长至50-100mm3，将荷瘤小鼠随机分为6组，即
①
pbs处理的小鼠作为对照组1、
②
omvs处理的小鼠作为对照组2、
③
cus-omvs处理的小鼠作为对照组3、
④
pbs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组4、
⑤
omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组5、
⑥
cus-omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为实验组，每组6只；
127.(4)给药方式为尾静脉注射；
128.(5)给药后24h后，将
④⑤⑥
组小鼠的肿瘤部位分别置于1w/cm
2 1064nm近红外光条件下照射10min；检测荷瘤小鼠经激光照射后瘤内温度随时间变化关系。
129.(6)各组处理完毕后，按正常喂养方式喂养，每隔一天记录一次肿瘤体积，观察周期为15天。
130.实验结果见图15，各治疗组小鼠在治疗后肿瘤生长曲线存在明显差异，cus-omvs 近红外激光照射组小鼠肿瘤体积明显小于
①②③④⑤
组，而其他五组肿瘤体积增长趋势无显著性差异，
②③⑤
组对肿瘤体积有一定抑制效果。以上结果表明，本发明制备得到的cus-omvs具有良好的光热/免疫治疗效果。
131.实施例13：通过b16-f10黑色素瘤动物模型检测实施例1制备得到的cus-omvs的体内光热/免疫治疗效果
132.(1)小鼠：spf级c57/6j雌性小鼠，5-6周龄，18～22g；
133.(2)小鼠黑色素瘤模型的构建：取对数生长期的b16-f10黑色素瘤细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至1
×
107个/ml，每只小鼠皮下注射50μl细胞悬液；
134.(3)待肿瘤体积长至50-100mm3，将荷瘤小鼠随机分为6组，即
①
pbs处理的小鼠作
为对照组1、
②
omvs处理的小鼠作为对照组2、
③
cus-omvs处理的小鼠作为对照组3、
④
pbs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组4、
⑤
omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为对照组5、
⑥
cus-omvs 近红外激光照射处理的小鼠作为实验组，每组6只；
135.(4)给药方式为尾静脉注射；
136.(5)给药后24h后，将
④⑤⑥
组小鼠的肿瘤部位分别置于1w/cm
2 1064nm近红外光条件下照射10min；检测荷瘤小鼠经激光照射后瘤内温度随时间变化关系。
137.(6)各组处理完毕后，按正常喂养方式喂养，每隔一天记录一次肿瘤体积，观察周期为15天。
138.实验结果见图16，各治疗组小鼠在治疗后肿瘤生长曲线存在明显差异，cus-omvs 近红外激光照射组小鼠肿瘤体积明显小于
①②③④⑤
组，而其他五组肿瘤体积增长趋势无显著性差异，
②③⑤
组对肿瘤体积有一定抑制效果。以上结果表明，本发明制备得到的cus-omvs具有良好的光热/免疫治疗效果。
139.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。