一种分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用的制作方法

1.本发明属于动物分子标记筛选和应用领域，具体涉及一种分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用。所述分子标记与猪总产仔数和产活仔数性状相关。本发明的分子标记从mthfr基因中筛选得到。


背景技术：

2.我国是一个养猪大国，随着消费水平的不断提高，我国居民对猪肉的需求量也在不断增加。与此同时，在养猪生产中，母猪的产仔数与养殖者的经济效益密切相关，且母猪的产仔数是衡量一头母猪繁殖性状的重要的指标之一(焦晓鹏2021)。因此，提高母猪的产仔数，可以减少母猪的饲养数量，提高生产水平，对猪场的生产和发展具有重要影响。由于母猪繁殖性状的遗传力较低，所以通过表型选择取得的遗传进展较小。通过分子标记辅助选择，可以显著提高育种效率。
3.亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，mthfr)，在叶酸的代谢过程中发挥着重要功能，叶酸在母猪的妊娠早期非常重要，通过补充叶酸可以提高胚胎的存活率从而提高产仔数(guay et al 2002)。在人上已经发现了很多mthfr基因的多态位点，他们可能会导致相应酶的缺乏。mthfr的多态性可能会影响dna的合成，抑制甲基化反应，从而影响正常的生殖功能(guo et al 2016)。
4.竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)技术是一种灵活、经济、准确的snp检测方法，被广泛应用于各个领域。kasp首先针对snp位点不同的碱基设计两条对应的特异正向引物，每条正向引物上带有特异序列，该序列可与荧光标记结合。同时合成通用的反向引物并进行pcr扩增。随着pcr循环数增加，扩增子数量呈指数增长，荧光探针更多地退火到新合成的互补链上，发出荧光。不同颜色荧光即反映不同snp类型，通过酶标仪读取pcr产物中不同的荧光信号即可报告不同的snp类型。本发明通过iswine数据库找到mthfr基因的2个snp位点，在国内丹系大白母猪群体中(n＝505)通过kasp技术鉴定到该snp位点并进行了基因分型。进一步利用sas软件对该snp位点与猪繁殖性状进行关联分析，结果表明该基因上的2个snp位点与猪的总产仔数和产活仔数显著相关。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于寻找mthfr基因的片段作为分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用。
6.具体地，本发明的技术方案如下所述：
7.本发明获得了mthfr基因的突变位点在猪繁殖性状关联分析检测中的应用。它是基于505头已记录总产仔数、产活仔数性状数据的丹系大白母猪耳组织样品dna基因分型产生的结果，在基因分型结果里，mthfr基因上06号染色体上的71867916位碱基处存在一个等位基因(c/t)的突变，在06号染色体上的71869798位碱基处存在一个等位基因(g/c)的突
变，这两个多态位点能影响总产仔数和产活仔数。
8.具体地，申请人提供了mthfr基因的两个snp分子标记在猪繁殖性状中总产仔数和产活仔数性状关联分析检测中的应用，所述猪品种为丹系大白猪，所述猪繁殖性状为总产仔数和产活仔数，
9.其中：
10.mthfr-1位点分子标记的核苷酸序列如下所示：
11.gccgggaccgggaggcggaaggtgggacacggtagcctcacgcgaagggtctcagggcgcagggtcactggcctcgggctccttctcgttgtgggggggcrtgttgagaagctcaaatgtgtcctccaccacctgccagaggcagttgtccagcggaaactcgttgtccaccaggttgaccaggaagtagttgtcgtggat
12.上述序列中的101位的碱基r是c或t，其中tt基因型的1胎总产仔数显著低于cc基因型和tc基因型，2胎产活仔数显著低于tc基因型；
13.mthfr-2位点分子标记的核苷酸序列如下所示：
14.gattatccacgaatggcctctcgtgccaggctgggagctctcagagggcaggggcctggctctgtctgcgtgtctgtctggcacaatgcctggattggcgrggcgctccgtgattgccggatggtggcataaatgtggcgccctcggacccggtgacccaggctggcccctaccttcacatccacgatgtgataattcact
15.上述序列中的101位的碱基r是g或c，cc基因型的1胎总产仔数和2胎产活仔数都显著低于cg基因型。
16.上述mthfr-1和mthfr-2的两个位点处于连锁不平衡状态。mthfr-1和mthfr-2基因型组合与总产仔数显著关联，其tc-gg基因型是丹系大白猪母猪繁殖性状的有利基因型。
17.与此同时本发明设计了两个kasp基因分型引物组合的应用，所述猪品种为丹系大白猪，所述猪繁殖性状为总产仔数和产活仔数，所述mthfr-1位点的kasp引物组合的核苷酸序列如序列表seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示，mthfr-2位点的kasp引物组合的核苷酸序列如序列表seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8所示。
18.申请人提供了mthfr基因的两个突变位点在猪繁殖性状中总产仔数和产活仔数性状关联分析检测中的应用，所述的应用按照以下步骤：
19.从猪(丹系大白猪)耳组织中提取基因组dna。登录iswine数据库查找猪mthfr基因(gene id:enssscg00000003428)的snp信息，筛选最小等位基因频率较高的snp位点，mthfr-1位点即06号染色体上的71867916位的c/t等位基因突变(或称碱基替换，其核苷酸序列如图1和序列表seq id no:1所示)，对该snp位点设计特异kasp引物，所述引物的dna序列如序列表seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5所示；所述mthfr-2位点即06号染色体上的71869798位的g/c等位基因突变(或称碱基替换，其核苷酸序列如图2和序列表seq id no:2所示)，对该snp位点设计特异kasp引物，所述引物的序dna列如序列表seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8所示。以丹系大白猪母猪基因组dna为模板进行扩增，鉴定这些snp位点并进行基因分型，最后将这些snp位点与丹系大白猪母猪的繁殖性状进行关联分析。
20.更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
21.图1：本发明的总体技术流程示意图。
22.图2：是从iswine数据库中获取的包含mthfr-1突变位点的mthfr扩增序列,其中r为突变位点。
23.图3：是从iswine数据库中获取的包含mthfr-2突变位点的mthfr扩增序列,其中r为突变位点。
具体实施方式
24.对序列表序列的说明：
25.序列表seq id no：1：是本发明筛选的分子标记mthfr-1的核苷酸序列，序列长度为201bp，在该序列的第101bp碱基处存在一个等位基因c/t的突变。
26.序列表seq id no：2：是本发明筛选的分子标记mthfr-2的核苷酸序列，序列长度为201bp，在该序列的第101bp碱基处存在一个等位基因g/c的突变。
27.序列表seq id no：3(具体序列：gaa ggt gac caa gtt cat gct agg aca cat ttg agc ttc tca aca g
28.)，序列表seq id no：4(具体序列：gaa ggt cgg agt caa cgg att gag gac aca ttt gag ctt ctc aac aa
29.)：是实施猪mthfr基因上mthfr-1位点c/t突变(即本发明克隆seq id no：1序列的101位的碱基替换)基因型分型的正向引物序列。
30.序列表seq id no：5(具体序列：tgg cct cgg gct cct tct cgt t
31.)：是实施猪mthfr基因上mthfr-1位点c/t突变(即本发明克隆seq id no：1序列的101位的碱基替换)基因型分型的反向引物序列。
32.序列表seq id no：6(具体序列：gaa ggt gac caa gtt cat gct ggc aat cac gga gcg ccc)，序列表seq id no：7(具体序列：gaaggt cgg agt caa cgg att ggc aat cac gga gcg ccg)：是实施猪mthfr基因上mthfr-2位点g/c突变(即本发明克隆seq id no：2序列的101位的碱基替换)基因型分型的正向引物序列。
33.序列表seq id no：8(具体序列：gtc tgt ctg gca caa tgc ctg gat)：是实施猪mthfr基因上mthfr-2位点g/c突变(即本发明克隆seq id no：2序列的101位的碱基替换)基因型分型的反向引物序列。
34.实施例1：猪mthfr基因snps的获得及多态性检测方法的建立
35.登录iswine网站，查找猪mthfr基因的snp位点，最终筛选到mthfr基因的两个snp位点：mthfr-1和mthfr-2，这两个突变位点分别位于猪6号染色体上的71867916位和71869798位。下载该snp位点及其前后各100bp的序列，并设计对应的kasp引物。其中：扩增mthfr-1位点的正向引物1的dna序列如seq id no：3所示，即，mthfr-1-f1：gaa ggt gac caa gtt cat gct agg aca cat ttg agc ttc tca aca g，正向引物2dna序列如seq id no：4所示，即，mthfr-1-f2：gaa ggt cgg agt caa cgg att gag gac aca ttt gag ctt ctc aac aa，反向引物的dna序列如seq id no：5所示，即，mthfr-1-r：tgg cct cgg gct cct tct cgt t。扩增得到一个201bp长的目的片段(该片段的序列如seq id no：1所示(见图1)。mthfr-2位点的正向引物1的dna序列如seq id no：6所示，即，mthfr-2-f1：gaa ggt gac caa gtt cat gct ggc aat cac gga gcg ccc，正向引物2的dna序列如seq id no：7所示，即，mthfr-2-f2：gaa ggt cgg agt caa cgg att ggc aat cac gga gcg ccg，反向引物
的dna序列如seq id no：8所示，即，mthfr-2-r：gtc tgt ctg gca caa tgc ctg gat。扩增得到一个201bp长的目的片段(该片段的核苷酸序列如seq id no：2所示(见图2)。
36.利用kasp技术对snp位点进行分型，针对snp位点不同碱基设计两条对应的正向引物上带有特异序列，可与荧光标记结合，同时合成通用的反向引物进行pcr扩增。第一轮pcr，能够和模板互补的正向引物得到延伸，无法和模板互补的正向引物无法延伸；第二轮pcr，正向引物互补的特异性序列得以延伸，这步完成把通用标签序列引入与snp对应的pcr产物。随着pcr循环数增加，扩增子数量呈指数增长，荧光探针更多地退火到新合成的互补链上，并发出荧光。不同颜色荧光即反映不同snp类型，通过酶标仪可读取pcr产物中不同的荧光信号即可报告不同的snp类型。
37.实施例2：本发明筛选的分子标记在丹系大白猪群中的多态性分布
38.取505头丹系大白猪的dna样品，利用实施例1设计的引物序列对其进行基因性进行分型，505个dna样中有少量未成功分型。统计各snp位点的基因频率及基因型频率，结果如表1所示。
39.表1猪mthfr基因snp位点的遗传多态性
[0040][0041]
结果表明：上述两个多态位点处均存在3种基因型。其中：对于mthfr-1位点，c等位基因频率为0.66，所以c是优势等位基因。对于mthfr-2位点，g等位基因频率为0.64，所以g是优势等位基因(见表1)。
[0042]
实施例3：本发明的分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用
[0043]
为了判定猪mthfr基因上的两个snp位点与猪繁殖性状是否相关，选择广西某农牧有限公司的505头处于分娩或哺乳期的丹系大白猪母猪为试验材料，采用实施例1建立的kasp基因分型方法进行多态性检测，并分析丹系大白猪mthfr基因的两个snp位点不同基因型与猪繁殖性状的相关关系。采用sas统计软件(sas大学版)自编程序进行关联分析，采用固定线性模型进行计算。具体模型如下：
[0044]
y＝μ g p m e
[0045]
式中y为性状表型值(主要包括总产仔数、产活仔数、有效活仔数、5日龄活仔数等性状)，μ为表型的群体均值，g为基因型效应，p为胎次效应，m为配种季节和年份效应(配种季节根据当地四季划分为4个水平)，e为残差效应。在进行分析时，将群体分为1胎、2胎和≥3胎(经产)的3个组进行分析，在对1胎和2胎进行分析时不考虑胎次效应，对经产的群体加入胎次作为固定效应。各群体的具体分析模式如下：
[0046]
1胎/2胎：y＝μ g m e
[0047]
≥3胎：y＝μ g p m e
[0048]
在对产活仔数、有效活仔数和5日活仔数进行分析时，加入总产仔数作为协变量进行分析。
[0049]
在mthfr-1位点进行不同基因型与繁殖性状间的关联分析，统计分析结果总结于
表2。
[0050]
表2mthfr-1位点基因型繁殖性状的统计分析表
[0051][0052]
表2注：字母不同代表同行数据有差异，小写字母表示差异显著(p《0.05)，大写字母表示差异极显著(p《0.01)。
[0053]
由表2可以看出，在丹系大白猪中，tt基因型的1胎总产仔数显著低于cc和tc型(p《0.05)；tt基因型的2胎产活仔数显著低于tc型(p《0.01)。
[0054]
在mthfr-2位点进行不同基因型与繁殖性状间的关联分析，统计分析结果总结于表3。
[0055]
表3mthfr-2位点基因型繁殖性状的统计分析表
with infertility.zhonghua nan ke xue,2016,22(2):171-4。