纳米碳材料在清除自由基中的应用

1.本发明属于纳米碳材料应用技术领域，具体涉及纳米碳材料在清除自由基中的应用。


背景技术：

2.自由基是一种缺电子不稳定物质，极易抢夺其它物质的电子导致目标分子性质的巨大改变。自由基在人体中源源不断地产生，对人体的重要组分如蛋白质，rna，dna等有着强烈的负面影响。尽管人体内有各种清除自由基的机制，但由于现代生活中诱导自由基产生的方式越来越多，人体内的自由基清除机制接近饱和，额外使用高效抗自由基产品对于清除自由基格外重要。
3.事实上，天然存在的抗氧化组分，如维生素c，维生素e、还原性谷胱甘肽、胡萝卜素和花青素、虾青素等都具有良好的自由基清除效果。但是，在清除自由基方面，高效与稳定往往是矛盾的，高效清除自由基的组分稳定性差，不利于商业化；稳定的产品效果不佳。在寻找二者平衡点的同时，富勒烯吸引了相关科研人员的关注。
4.富勒烯具有丰富的π共轭结构，有具有完美的几何构型，在清除自由基方面兼具高效与稳定的性质，被认为是新一代抗衰老、抗氧化产品的代表。但是作为一种由纯碳组成的球形分子，富勒烯既疏水又疏油(在水中的溶解度仅为10-24
mol/l)，与其它成分的相容性极差。利用有机合成的方法在富勒烯表面修饰有机官能团是解决富勒烯溶解性的常用方式，目前针对富勒烯表面修饰的工作已经较为成熟，可以在富勒烯表面精准修饰烷基、羧基、乙氧基和金刚烷等官能团，以改良富勒烯的溶解性。但相关工艺繁琐昂贵，且需要用到大量有机溶剂，为产品提纯环节带来巨大压力。
5.因此，寻找一类替代难溶的富勒烯和昂贵的富勒烯衍生物的材料应用于清除自由基领域，并表现出优异的性能，有望成为该领域的全新突破口。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明提供纳米碳材料在清除自由基中的应用。本发明特定的纳米碳材料具有良好的水溶性和稳定性，应用于清除自由基表现出高效的清除能力。
7.本发明的技术方案如下：
8.纳米碳材料在清除自由基中的应用，所述纳米碳材料为柠檬酸-甲酰胺碳材料或柠檬酸-四乙烯五胺碳材料中的一种或两种的组合；所述柠檬酸-甲酰胺碳材料是以柠檬酸为碳源，甲酰胺作为修饰组分，经热解制备得到；所述柠檬酸-四乙烯五胺碳材料是以柠檬酸为碳源，四乙烯五胺作为修饰组分，经热解制备得到。
9.根据本发明优选的，所述纳米碳材料应用于体内或体外的自由基清除。
10.根据本发明，所述纳米碳材料的应用方式包括以下任意一种：
11.1)应用于清除自由基的药物、制剂及其它商业化衍生产品，如化妆品、敷料、保健
品等；
12.2)应用于体外自由基清除、检测及其它模拟实验；
13.3)应用于医学治疗。
14.根据本发明，所述自由基为氧自由基(如羟基自由基等)或非氧自由基(如dpph自由基)中的一种或几种。
15.根据本发明优选的，所述纳米碳材料的制备方法包括步骤：将碳源柠檬酸与修饰组分甲酰胺或四乙烯五胺混合均匀，然后进行热解，经后处理得到纳米碳材料。
16.优选的，柠檬酸的质量与甲酰胺或四乙烯五胺的体积比为0.6-1:1g/ml。
17.优选的，修饰组分为四乙烯五胺时，柠檬酸先溶于水后，再缓慢加入四乙烯五胺，混合至完全溶解后再进行热解；所述柠檬酸的质量和水的体积比为0.1-0.3g/ml。
18.优选的，修饰组分为甲酰胺时，热解温度为180～260℃，优选为220～250℃；热解时间为10～30min，优选为15～25min；修饰组分为四乙烯五胺时，先于160-200℃下热解2-5h，然后升温至220-260℃热解2-5h。
19.优选的，所述热解是在搅拌的条件下进行；当修饰组分为四乙烯五胺时，使用机械搅拌，搅拌速率为100-700rpm，优选为200-500rpm；当修饰组分为甲酰胺时，热解需要冷凝回流，并使用磁力搅拌，搅拌速率为100-700rpm，优选为200-500rpm。
20.优选的，所述后处理方法选自以下方法之一：
21.i、当修饰组分为甲酰胺时，后处理方法包括步骤：
22.热解后所得反应液加水过滤、所得滤液渗析、冻干，即得纳米碳材料；或者，热解后所得反应液经不良溶剂沉淀、过滤、干燥，即得纳米碳材料；
23.ii、当修饰组分为四乙烯五胺时，后处理方法包括步骤：热解后所得反应液加水过滤、所得滤液渗析、冻干，即得纳米碳材料。
24.进一步优选的，所述的加水所用水的质量均为柠檬酸质量的0.5～20倍，优选为2～16倍。
25.进一步优选的，所述渗析所用渗析袋的截留分子量均为100-1000da。渗析袋内装入需要进行渗析的滤液，渗析袋外为去离子水。
26.进一步优选的，所述渗析的时间均为3～14天，优选为5～12天。
27.进一步优选的，所述的不良溶剂为丙酮。
28.进一步优选的，所述干燥是于25～55℃、压强为80～400mbar下真空干燥1～5天；进一步优选的，干燥压强为100～350mbar，干燥时间为2～4天。
29.本发明的技术特点及有益效果：
30.1.本发明柠檬酸-甲酰胺碳材料或柠檬酸-四乙烯五胺碳材料的制备方法简单，成本低廉，绿色环保，适用于工业化生产。后处理工艺精细且多样，可以获得不同类型、不同性质的产品。所得碳材料为类富勒烯纳米碳材料，且稳定易储存。
31.2.本发明所得碳材料模拟富勒烯分子结构，但与c
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相比，具有更好的溶解性，与其它成分的相容性好，应用前景广阔。
32.3.本发明经过精细的工艺优化，制备了特定种类的碳材料，相比现有其它碳材料应用于清除自由基具有显著的自由基清除能力，以较低的浓度即可实现自由基的有效清除，且清除效率极高，可以作为富勒烯在清除自由基方面的替代物。
附图说明
33.图1实施例1,3,5制备的纳米碳材料的tem图像；a.实施例1制备的a款柠檬酸-甲酰胺碳材料，b.实施例3制备的b款柠檬酸-甲酰胺碳材料和c.实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料。
34.图2为实施例1制备的a款柠檬酸-甲酰胺碳材料的羟基自由基清除活性(esr模拟实验)图。
35.图3为实施例3制备的b款柠檬酸-甲酰胺碳材料的羟基自由基清除活性(esr模拟实验)图。
36.图4为实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料载不同浓度下的羟基自由基清除活性(esr模拟实验)图。
37.图5为实施例1,3,5制备的纳米碳材料与现有纳米碳材料的清除自由基能力对比图。
38.图6为实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料在不同浓度下的dpph自由基清除活性(esr模拟实验)图。
39.图7为实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料的清除速率对比图。
具体实施方式
40.为更好地理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
41.实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
42.实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.实施例1
44.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：取64ml甲酰胺于蓝帽瓶中；称取60克柠檬酸，搅拌下加入到甲酰胺中(或加入后立即持续轻微振荡，直至固体溶解)，充分溶解后配制成柠檬酸浓度为0.9375g/ml的柠檬酸甲酰胺溶液；将配制好的溶液转移至单口圆底烧瓶中，冷凝回流下200℃下，进行磁力搅拌，搅拌速率为300rpm，热解15分钟；待反应液冷却至室温后，反应液加600g水过滤，所得滤液进行渗析，渗析所用渗析袋的截留分子量为100da，渗析袋内装入滤液，渗析袋外为去离子水，室温渗析7天；渗析结束，将渗析袋内的溶液转出、冻干，即得a款柠檬酸-甲酰胺碳材料。
45.实施例2
46.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：取80ml甲酰胺于蓝帽瓶中；称取60克柠檬酸，搅拌下加入到甲酰胺中(或加入后立即持续轻微振荡，直至固体溶解)，充分溶解后配制成柠檬酸浓度为0.75g/ml的柠檬酸甲酰胺溶液；将配制好的溶液转移至单口圆底烧瓶中，冷凝回流下180℃下，进行磁力搅拌，搅拌速率为300rpm，热解25分钟；待反应液冷却至室温后，反应液加400g水过滤，所得滤液进行渗析，渗析所用渗析袋的截留分子量为100da，渗析袋内装入滤液，渗析袋外为去离子水，室温渗析10天；渗析结束，将渗析袋内的溶液转出、冻干，即得a款柠檬酸-甲酰胺碳材料。
47.实施例3
48.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：取64ml甲酰胺于蓝帽瓶中；称取60克柠檬酸，搅拌下加入到甲酰胺中(或加入后立即持续轻微振荡，直至固体溶解)，充分溶解后配制
成柠檬酸浓度为0.9375g/ml的柠檬酸甲酰胺溶液；将配制好的溶液转移至单口圆底烧瓶中，冷凝回流下200℃下，进行磁力搅拌，搅拌速率为300rpm，热解15分钟；待反应液冷却至室温后，转移至圆底烧瓶中，搅拌下加入大量丙酮(》700ml)，继续搅拌半小时左右以充分沉淀；抽滤(滤纸)，取固体(粉末状)，于45℃、压强为160mbar下真空干燥2天即得b款柠檬酸-甲酰胺碳材料。
49.实施例4
50.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：取80ml甲酰胺于蓝帽瓶中；称取60克柠檬酸，搅拌下加入到甲酰胺中(或加入后立即持续轻微振荡，直至固体溶解)，充分溶解后配制成柠檬酸浓度为0.75g/ml的柠檬酸甲酰胺溶液；将配制好的溶液转移至单口圆底烧瓶中，冷凝回流下180℃下，进行磁力搅拌，搅拌速率为300rpm，热解25分钟；待反应液冷却至室温后，转移至圆底烧瓶中，搅拌下加入大量丙酮(》700ml)，继续搅拌半小时左右以充分沉淀；抽滤(滤纸)，取固体(粉末状)，于45℃、压强为160mbar下真空干燥2天即得b款柠檬酸-甲酰胺碳材料。
51.实施例5
52.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：将5g柠檬酸溶解到30ml水中(常温机械搅拌，三口烧瓶置于油浴锅中)，缓慢加入6ml四乙烯五胺，溶解完全溶液为淡黄色透明溶液，油浴锅加热到180℃，冷凝回流条件下搅拌处理3.5小时，继续升温到235℃、冷凝回流条件下搅拌处理3.5小时，搅拌速率为300rpm。反应结束，立刻取出三口烧瓶，冷却到180℃开始加入少量水，直到温度低于60℃(防止暴沸和结块)，加水总量控制在80ml，过滤后，将滤液用100da渗析袋渗析，渗析袋内装入需要进行渗析的滤液，渗析袋外为去离子水，2天换一次水，室温渗析7天，转移至蓝帽瓶，冻干，即得柠檬酸-四乙烯五胺碳材料。
53.实施例6
54.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：将5g柠檬酸溶解到30ml水中(常温机械搅拌，三口烧瓶置于油浴锅中)，缓慢加入6.5ml四乙烯五胺，溶解完全溶液为淡黄色透明溶液，油浴锅加热到180℃，冷凝回流条件下搅拌处理3.5小时，继续升温到240℃、冷凝回流条件下搅拌处理3小时，搅拌速率为500rpm。反应结束，立刻取出三口烧瓶，冷却到180℃开始加入少量水，直到温度低于60℃(防止暴沸和结块)，加水总量控制在65ml，过滤后，将滤液用500da渗析袋渗析，渗析袋内装入需要进行渗析的滤液，渗析袋外为去离子水，2天换一次水，室温渗析5天，转移至蓝帽瓶，冻干，即得柠檬酸-四乙烯五胺碳材料。
55.实施例7
56.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：将5g柠檬酸溶解到30ml水中(常温机械搅拌，三口烧瓶置于油浴锅中)，缓慢加入7ml四乙烯五胺，溶解完全溶液为淡黄色透明溶液，油浴锅加热到180℃，冷凝回流条件下搅拌处理3.5小时，继续升温到245℃、冷凝回流条件下搅拌处理2小时(反应过程中隔30min取出少量反应物溶于水观察荧光颜色)，搅拌速率为300rpm。反应结束，立刻取出三口烧瓶，冷却到180℃开始加入少量水，直到温度低于60℃(防止暴沸和结块)，加水总量控制在50ml，过滤后，将滤液用100da渗析袋渗析，渗析袋内装入需要进行渗析的滤液，渗析袋外为去离子水，2天换一次水，室温渗析12天，转移至蓝帽瓶，冻干，即得柠檬酸-四乙烯五胺碳材料。
57.对比例1
58.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：将1g柠檬酸和3.67g 1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐分散于20超纯水中，60℃旋蒸除去超纯水得到胶状物，然后氩气保护下，将胶状物在240℃搅拌回流1小时，冷却后加入30ml超纯水并将该分散液置于截留分子量为1000da的透析袋中透析7天，冻干成粉。
59.对比例2
60.一种纳米碳材料的制备方法，包括步骤：取12g富勒烯炭灰于1000ml圆底烧瓶中，将其放入盛有冰水的烧杯中，搅拌下将事先混合好的400ml浓硝酸/浓硫酸混合液(体积比为1:3)缓慢滴加到圆底烧瓶中，酸滴加完后，继续搅拌30min。停止搅拌，超声2h，将圆底烧瓶置于油浴锅中，100℃下加热24h。待样品自然冷却至室温后，将其重新置于冰水中，搅拌下缓慢加入4l去离子水，用k2co3中和至≥7，离心(12500转，30min)，除去沉淀,将上清液转移至100da的渗析袋中，渗析12天。旋蒸浓缩后冻干成粉。
61.试验例1
62.将实施例1、实施例3和实施例5制备的纳米碳粉末溶于水中(浓度为0.1mg/ml)，将溶液滴在纯碳膜铜网上使用高分辨透射电子显微镜进行观察，其图像分别如图1a、b、c所示。由图1a可知，实施例1所述的制备工艺得到的a款柠檬酸-甲酰胺碳材料为球形颗粒，尺寸小于5nm；由图1b可知，实施例3所述的制备工艺得到的b款柠檬酸-甲酰胺碳材料为球形颗粒，尺寸在10-30nm；由图1c可知，实施例5所述的制备工艺得到的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料为球形颗粒，尺寸小于2nm。上述纳米碳材料外观均为类富勒烯结构。
63.试验例2
64.将实施例1制备的a款柠檬酸-甲酰胺碳材料溶于水中，配置浓度为0.1mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中分别依次加入40μl h2o2水溶液(10.0mmol/l)、40μl dmpo水溶液(0.2mmol/l)、40μl feso4·
7h2o水溶液(0.25mmol/l)，然后进行esr测试。测试结果如图2所示，其中，空白对照是不加入纳米碳材料的样品。由图可知，a款柠檬酸-甲酰胺碳材料在0.1mg/ml浓度下即可展现出显著的清除羟基自由基的能力。
65.试验例3
66.将实施例3制备的b款柠檬酸-甲酰胺碳材料溶于水中，配置浓度为0.1mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中分别依次加入40μl h2o2水溶液(10.0mmol/l)、40μl dmpo水溶液(0.2mmol/l)、40μl feso4·
7h2o水溶液(0.25mmol/l)，然后进行esr测试。测试结果如图3所示，其中，空白对照是不加入纳米碳材料的样品。由图可知，b款柠檬酸-甲酰胺碳材料在0.1mg/ml浓度下即可展现出显著的清除羟基自由基的能力。
67.试验例4
68.将实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料溶于水中，配置浓度分别为0.008mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.035mg/ml、0.065mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中分别依次加入40μl h2o2水溶液(10.0mmol/l)、40μl dmpo水溶液(0.2mmol/l)、40μl feso4
·
7h2o水溶液(0.25mmol/l)，然后进行esr测试。测试结果如图4所示，其中，空白对照是不加入纳米碳材料的样品。由图可知，柠檬酸-四乙烯五胺碳材料在0.008mg/ml浓度下即可展现出显著的清除羟基自由基的能力，且其自由基清除能力随纳米碳材料浓度的增大而增大。
69.试验例5
70.分别将实施例1制备的a款柠檬酸-甲酰胺碳材料、实施例3制备的b款柠檬酸-甲酰胺碳材料、实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料、对比例1和对比例2制备的材料溶于水中，配置浓度为0.1mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中分别依次加入40μl h2o2水溶液(10.0mmol/l)、40μl dmpo水溶液(0.2mmol/l)、40μl feso4
·
7h2o水溶液(0.25mmol/l)，然后进行esr测试，测试结果如图5所示。由图可知，纳米碳材料都具有一定清除羟基自由基的能力，但本发明制备的纳米碳材料普遍具有较强的性能。
71.试验例6
72.将实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料溶于水中，配置浓度分别为0.65mg/ml、1.3mg/ml、3.25mg/ml、和6.5mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中加入0.5ml dpph的甲醇溶液(1mmol/l)，然后进行esr测试，测试结果如图6所示。其中，空白对照是不加入纳米碳材料的样品。由图可知，柠檬酸-四乙烯五胺碳材料在0.65mg/ml浓度下即可展现出显著的清除dpph自由基的能力，且其自由基清除能力随纳米碳材料浓度的增大而增大。
73.试验例7
74.将实施例5制备的柠檬酸-四乙烯五胺碳材料溶于水中，配置浓度为0.65mg/ml溶液；取1ml样品溶液于比色管中，再向比色管中加入0.5ml dpph的甲醇溶液(1mmol/l)，然后立刻、静置1h和静置5h后进行esr测试。测试结果如图7所示，其中，空白对照是不加入纳米碳材料的样品。柠檬酸-四乙烯五胺碳材清除羟基自由基的速率较快，在1h内即可达到平衡状态。