一株羊驼源纳米抗体及其应用

一株羊驼源纳米抗体及其应用
1.交叉引用
2.本技术要求于2021年9月16日提交的、申请号为202111087998.x、发明名称为“一株羊驼源纳米抗体及其应用”的发明专利申请的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，更具体地，涉及一种与sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防、治疗和/或检测新冠病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

[0004][0005]
中和抗体，该药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。sars-cov和sars-cov-2 病毒表面都具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,s)，该s蛋白能与宿主细胞受体蛋白 ace2相互作用并触发膜融合，因此阻断s蛋白与ace2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。
[0006]
然而旨在阻断病毒与宿主细胞受体的抗体策略，仍需要进一步优化和升级。一方面，新冠病毒这样的rna病毒具有易突变、易发生免疫逃逸等特点，单一特异性抗体很难满足长久的治疗需求。另外，常规的单克隆抗体因其分子量过大，在实际应用中也存在一定的缺陷。


技术实现要素：

[0007]
发明目的
[0008]
本发明的目的在于提供一种与sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。本发明的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与sars-cov-2rbd蛋白的结合能力强，能有效抑制sars-cov-2感染，该纳米抗体具有分子量小(～15kda)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的cdr3区的优点，可以雾化给药，能直达肺部，起效更快，为新冠或其他冠状病毒感染提供了潜在的治疗策略。
[0009]
解决方案
[0010]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0011]
第一方面，本发明提供了一种与sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的cdr：
[0012]
氨基酸序列如seq id no:1(即，gftldyyaig)所示的cdr1，
[0013]
氨基酸序列如seq id no:2(即，cissnnstyyadsvkg)所示的cdr2，
[0014]
以及氨基酸序列如seq id no:3(即，epdysgvyyytcgwtdfgs)所示的cdr3。
[0015]
进一步地，所述重链可变区还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1、cdr2 和cdr3按顺序交错排列。
[0016]
在一个优选的实施方案中，所述fr1-4的氨基酸序列分别如seq id no:4(即， qvqlqesggglvqpggslrltcaps)、seq id no:5(即，wfrqapgkeregvs)、 seq id no:6(即，rftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa)和seq id no:7 (即，wgqgtqvtvss)所示。
[0017]
进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示：
[0018][0018]
其中，下划线部分分别为框架区fr1-4，标黑部分分别为重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
[0019]
第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码所述的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
[0020]
进一步地，所述多核苷酸为dna或mrna。
[0021]
进一步地，所述多核苷酸具有如seq id no:9所示的核苷酸序列：
[0022]
caggtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtgcagcctggggggtct ctgagactcacctgtgcaccctctggattcactttggattattatgccataggctgg ttccgccaggccccagggaaggagcgtgagggggtctcatgtattagtagtaataa tagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacg ccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccgt ttattactgtgcagcagaaccagactatagcggtgtttactactacacctgcggatg gactgactttggttcctggggccaggggacgcaggtgaccgtgagctct。
[0023]
第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含所述的多核苷酸。
[0024]
进一步优选地，所述多核苷酸还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。
[0025]
第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含所述的核酸构建体。
[0026]
第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。
[0027]
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的与 sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0028]
进一步优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
[0029]
进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。
[0030]
进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。
[0031]
进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
[0032]
第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的与sars-cov-2rbd结合的羊
驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防、治疗和/或检测新冠病毒感染的药物中的应用。
[0033]
优选地，所述新冠病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株。
[0034]
进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma (p.1)、kappa(b.1.617.1)和/或delta(b.1.617.2)毒株。
[0035]
第八方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒感染的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的与sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。
[0036]
优选地，所述新冠病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株。
[0037]
进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma (p.1)、kappa(b.1.617.1)和/或delta(b.1.617.2)毒株。
[0038]
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
[0039]
第九方面，本发明提供了一种检测新冠病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的与sars-cov-2rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
[0040]
优选地，所述新冠病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株。进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta (b.1.351)、gamma(p.1)、kappa(b.1.617.1)和/或delta(b.1.617.2)毒株。
[0041]
有益效果
[0042]
本发明针对新冠病毒进行纳米抗体药物开发，通过用sars-cov-2s蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体等，筛选到以高亲和力特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体，本文命名为s43纳米抗体。本发明的s43纳米抗体能以高亲和力与sars-cov-2rbd结合，其结合常数为1.2e-10
±
1.4e-11m，并且在假病毒中和实验中，能以高中和活性中和sars-cov-2假病毒，这些均表明：s43纳米抗体是能够以高亲和力与sars-cov-2rbd结合的、并具有高中和活性的新型冠状病毒 (sars-cov-2)羊驼源纳米抗体。
[0043]
本发明为新型冠状病毒(包括原始毒株以及一系列变异毒株)的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。
附图说明
[0044]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0045]
图1是本发明实施例1的sars-cov-2s蛋白分子筛层析和sds-page鉴定结果示意
图；
[0046]
图2是本发明实施例1的sars-cov-2rbd蛋白分子筛层析和sds-page鉴定结果示意图；
[0047]
图3是本发明实施例4的s43纳米抗体的分子筛层析和sds-page鉴定结果示意图；
[0048]
图4是本发明实施例5测定的s43纳米抗体结合sars-cov-2rbd的动力学曲线示意图；其中，虚线是指原始数据，实线是指拟合后的动力学曲线；
[0049]
图5是本发明实施例6测定的s43纳米抗体中和vsv-sars-cov-2假病毒感染的效果示意图，其中，其中，a为s43纳米抗体中和原始毒株sars-cov-2wt的假病毒感染的效果图；b为s43纳米抗体中和sars-cov-2变异毒株alpha(b.1.1.7)的假病毒感染的效果图；c为s43纳米抗体中和sars-cov-2变异毒株beta(b.1.351)的假病毒感染的效果图；d为s43纳米抗体中和sars-cov-2变异毒株gamma(p.1)的假病毒感染的效果图；e 为s43纳米抗体中和sars-cov-2变异毒株kappa(b.1.617.1)的假病毒感染的效果图；f 为s43纳米抗体中和sars-cov-2变异毒株delta(b.1.617.2)的假病毒感染的效果图。
[0050]
图6显示了本发明实施例9中所检测的s43纳米抗体在雾化前、后对新冠病毒原始毒株假病毒的中和活性。
[0051]
图7显示了本发明实施例10中所检测的s43纳米抗体在小鼠体内预防新冠病毒感染的功效。
具体实施方式
[0052]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0053]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0054]
以下，对本发明进行详述。
[0055]
定义
[0056]“纳米抗体”，即“重链单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(vhh， variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。
[0057]
由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。
[0058]
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与sars-cov-2 rbd蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，
并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
[0059]
本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品，例如，trizol购自invitrogen，superscript ii first-strand synthesis system forrt-pcr试剂盒购自invitrogen。
[0060]
一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pcaggs载体购自miaolingplasmid，293f细胞、hek293t细胞等购自 atcc；电感受态e.coli tg1细胞购自lucigen，vcsm13辅助噬菌体购自stratagene、质粒pmes4购自addgene；protein a芯片购自ge healthcare；vero细胞购自atcc ccl81。
[0061]
一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成，例如，本发明中的引物(sed id no:14～19)由北京擎科生物科技有限公司合成。
[0062]
本发明的sars-cov-2s蛋白、sars-cov-2rbd蛋白为发明者实验室获得(参见实施例1)。
[0063]
实施例1：sars-cov-2s和sars-cov-2rbd的表达与纯化
[0064]
在sars-cov-2s蛋白编码序列(如seq id no:10所示)的3’端连上三聚体标签(如 seq id no:11所示)和8个组氨酸标签(hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子 (tga)，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体中，转染至293f 细胞中，进行sars-cov-2s-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(histrap
tm excel(ge))和凝胶过滤层析(superose
tm 6increase 10/300gl(ge))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白sars-cov-2s-his。sars-cov-2s-his蛋白的sds-page鉴定大小约为200kd，结果如图1。
[0065]
同样地，在sars-cov-2rbd蛋白编码序列(如seq id no:12所示)的3’端连上6 个组氨酸标签(hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子(tga)，通过限制性内切酶位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体中，转染至293f细胞中，进行sars-cov-2 rbd-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(histrap
tm excel((ge healthcare))和凝胶过滤层析(superdex
tm 200increase 10/300gl column(gehealthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白sars-cov-2rbd-his。sars-cov-2 rbd-his蛋白的sds-page鉴定大小为30kd左右，结果如图2。
[0066]
在sars-cov-2rbd蛋白编码序列(如seq id no:12所示)的3’端连上人源fc标签 (hfc)的编码序列(如seq id no:13所示)及翻译终止密码子，通过连接ecori和xhoi 构建入pcaggs载体中，转染至293f细胞中，进行sars-cov-2rbd-hfc蛋白的表达。
[0067]
实施例2：羊驼免疫和抗体文库构建
[0068]
实施例1中制备的带有6个组氨酸标签的sars-cov-2s蛋白200μg，用pbs稀释至终体积1ml，加1ml完全弗氏佐剂乳化5min，皮下多点注射进行免疫。之后每两周进行一次免疫，并改用mf59水溶性佐剂乳化s蛋白，第五次免疫后的第12天，采集 50-60ml的血液，分离pbmcs(外周血单个核细胞)。将分离的pbmcs加入1ml trizol (购自invitrogen)，按照说明书的步骤提取总rna。以提取的总rna为模板，使用 superscript ii first-strand synthesis system for rt-pcr试剂盒(购自invitrogen)，用随机引物oligo-dt
12-18
引物合成cdna。以cdna为模板，使用特异性引物call001和call002 (引物如表1)进行pcr试验，对700bp大小的条带进行切胶并回收。纯化后的dna作为模板，使用巢式引物vhh-back和pmcf
进行巢式pcr，来扩增纳米抗体(vhhs)序列，回收纯化大小在400bp左右vhhs序列。
[0069]
使用双酶切法，通过限制性酶切位点pstⅰ和bsteⅱ，将vhhs片段连接入质粒pmes4。将纯化的克隆载体和电感受态e.coli tg1细胞混合，使用电转仪(bio-rad电转化仪 micropulser)将克隆载体转化入电感受态e.coli tg1细胞，全部涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，37℃过夜培养后，收集所有的菌落于lb培养基中，离心并弃上清，用 lb重悬细胞，此为抗体文库。
[0070]
表1、反应引物
[0071][0072][0073]
实施例3：噬菌体展示技术筛选特异性的纳米抗体
[0074]
取实施例2已转染重组质粒的e.coli tg1，以感染复数(multiplicity of infection,moi) 约为20的比例，加入vcsm13辅助噬菌体，过夜培养后，4000rpm离心，取上清，0.22 μm的膜过滤后，按体积比1:4加入peg6000/nacl，混合后，4℃下放置至少1小时，8000
×
g 离心30min，弃上清，沉淀用pbs重悬，即为收集的噬菌体颗粒，测定噬菌体效价。
[0075]
将2
×
10
11
个上述收集的噬菌体与等体积的5％(w/v)脱脂牛奶混合，加到包被有 sars-cov-2s-his抗原的96孔板中，室温孵育1h后，用0.2m甘氨酸洗脱特异性的噬菌体，并用tris-hcl(ph 9.1)中和洗脱的噬菌体。然后用该噬菌体感染e.coli tg1细胞，并对噬菌体进行扩增。再次准备包被有sars-cov-2s-his抗原的96孔板，进行第2轮淘选，来富集表达有特异性纳米抗体的噬菌体，共进行3轮淘选。每轮淘选后，从长有菌落的琼脂平板上随机挑选不同单一菌落，在37℃摇床中培养，随后加入vcsm13辅助噬菌体过夜扩培，第二天离心培养液，取噬菌体上清进行elisa实验(采用sars-cov-2 rbd-his蛋白作为包被抗原)，当od
450nm
》0.2时，判定为阳性反应，取对应的克隆，使用特异性引物mp57和gⅲ对质粒进行测序(引物如表2)，获得其质粒中编码vhhs的序列。通过序列测定，获得s43的核心编码序列。
[0076]
表2、反应引物
[0077][0078]
实施例4：s43纳米抗体的表达
[0079]
为了使s43的重链可变区更加完整，在实施例3获得的s43的核心编码序列的5’端连上qvqlq的编码序列(caggtgcagctgcag)，3’端连上qvtvss的编码序列 (caggtgaccgtgagctct)，得到如seq id no:9的核苷酸序列，即本技术的s43纳米抗体的编码序列，然后在其后连上6个组氨酸标签(hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码子tga，通过限制性酶切位点ecori和xhoi，将其构建入pcaggs载体中，转染293f细胞，培养5天后，收集上清，经过5000rpm离心30min后，经过0.22μm滤膜过滤后，经镍离子亲和层析(histrap tm excel((ge healthcare))和凝胶过滤层析 (superdex
tm 75increase 10/
(2.56pg/ml)与1.6x10
4 tcid
50
实施例6获得的一系列sars-cov-2原始毒株及变异毒株的假病毒分别混合，在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种vero细胞(购自atccccl81)的96孔板中。孵育18～20小时后，通过cq1 confocal quantitative image cytometer (yokogawa)检测。根据带gfp荧光的细胞数，计算抗体对上述一系列sars-cov-2原始毒株及变异毒株的假病毒的中和能力，其结果分别如图5a～5f所示，结果统计如表4。
[0096]
表4、s43纳米抗体对新冠病毒的假病毒中和效果
[0097][0098]
*其中，ic
50
(μg/ml)a为s43纳米抗体的半抑制浓度。
[0099]
由表4可知，s43纳米抗体能以高中和活性中和上述一系列sars-cov-2原始毒株及变异毒株的假病毒。
[0100]
综上，s43纳米抗体能够作为高中和活性的新型冠状病毒(sars-cov-2)羊驼源纳米抗体。
[0101]
实施例8：s43纳米抗体中和sars-cov-2活病毒感染的检测
[0102]
本实施例中，通过基于细胞病变效应(cpe)的活病毒中和试验，测定纳米抗体s43 对新冠病毒活病毒的中和效果；具体程序如下：
[0103]
将纳米抗体s43以2倍倍比稀释至第11个梯度，每个梯度4个重复孔，每孔50μl，将各稀释液与等体积的100tcid
50
的sars-cov-2原始毒株或其变异毒株alpha、beta 和delta于37℃孵育；1小时后，将混合物加入到悬浮的vero细胞中，并在37℃下继续孵育3天；观察和记录细胞病变情况；使用graphpad prism 7.0计算该纳米抗体抑制新冠病毒活病毒感染的ic
50
。
[0104]
上述实验重复了两次，均在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(bsl3) 中进行。
[0105]
纳米抗体s43对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒的中和效果见以下表5。
[0106]
表5、s43纳米抗体对新冠病毒活病毒的中和效果
[0107][0108]
表5结果显示：本发明纳米抗体s43对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒均具有良好的抑制效果。
[0109]
实施例9：s43纳米抗体雾化前后稳定性的检测
[0110]
使用aerogen solo(aerogen inc.,chicago,usa)雾化器，将纳米抗体s43进行雾化，然后使用含有20ml pbs的全玻璃skc(eighty four,pa,usa)收集雾化后的抗体，并按实施例7所述进行假病毒中和试验。
[0111]
结果如图6所示，图6结果表明：本发明的纳米抗体s43在雾化前、后对新冠病毒原始毒株的假病毒的中和活性保持稳定，提示该纳米抗体适于通过雾化途径给药。
[0112]
实施例10：s43纳米抗体在体内预防新冠病毒感染的效果检测
[0113]
本实施例中，在7-8周的雌性balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公
司)中，检测本发明纳米抗体s43预防新冠病毒感染的功效；具体程序如下：
[0114]
1)对7-8周的雌性balb/c小鼠进行麻醉，滴鼻感染重组腺病毒ad5-hace2(按照 jing sun et al.,“generation of a broadly useful model for covid-19pathogenesis, vaccination,and treatment”cell.2020aug 6；182(3):734-743中描述的方法制得)；
[0115]
2)第5天，对小鼠进行给药和攻毒；
[0116]
具体地，纳米抗体s43通过滴鼻方式进行给药：将5只小鼠麻醉后，用移液枪往小鼠鼻孔滴注50μl 2mg/ml的纳米抗体s43，给药剂量为5mg/kg；此外，对另外5只小鼠通过滴鼻的方式给予200μl的pbs，作为对照组；
[0117]
给药后6小时，再次将小鼠麻醉，滴鼻感染新冠病毒原始毒株的活病毒(5
×
10
5 tcid
50
)；
[0118]
3)第10天，解剖小鼠，取肺组织，提rna，测病毒载量。
[0119]
上述实验在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(bsl3)中进行。
[0120]
结果如图7所示，图7结果显示，本发明的纳米抗体s43能有效降低肺部病毒载量，有效预防小鼠感染新冠病毒。
[0121]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。