miRNA-133在调节绵羊胚胎毛囊发育中的应用

mirna-133在调节绵羊胚胎毛囊发育中的应用
技术领域
1.本发明属于生物学技术领域，尤其涉及mirna-133在调节胚胎毛囊发育中的应用。


背景技术：

2.苏博美利奴是中国自主培育的超细羊毛品种，其平均羊毛纤维直径在17-19
ꢀµ
m，超过了80 nm 的标准纺织品支数。而且，苏博美利奴羊生产的羊毛细而薄，质地轻，光泽好，是一种高档纺织材料，因此该品种对细毛羊产业影响深远。
3.羊毛的生长发育受毛囊（hfs）控制，毛囊是附着在皮肤上的微小器官，具有复杂的形态、复杂的结构和周期性的生长模式。毛囊在妊娠期间开始发育并完全成熟，因此出生后hf的数量不会增加。因此，研究胚胎毛囊的发育的标志物以及毛囊发育的机制将有助于更好的培育苏博美利奴羊新品种，增加羊毛产量。
4.microrna（mirna）是一类长度约为19-25nt的内源性非编码rna，广泛参与基因转录后调控活动，具有高度序列保守性、表达时序性和组织特异性。研究表明mirna参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、脂肪代谢等，具有重要的基因表达调控作用。目前，关于microrna在毛囊发育中的功能尚不完全清楚，因此本发明对mirna-133在毛囊发育中的表达情况和功能进行研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供mirna-133在调节胚胎毛囊发育中的应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了 mir-133抑制剂在制备促进绵羊毛囊发育的生物制剂中的应用，所述mir-133抑制剂为mir-133 inhibitor，所述mir-133 inhibitor的序列如seq id no.4所示。
7.优选地，所述mirna-133抑制剂促进绵羊真皮成纤维细胞增殖并且促进绵羊成纤维细胞中毛囊发育相关基因的表达。
8.优选地，所述毛囊发育相关基因为acvr1b、notch1和tgfβ2。
9.其次，本发明提供了mir-133抑制剂在制备促进绵羊真皮成纤维细胞增殖的生物制剂中的应用，所述mir-133抑制剂为mir-133 inhibitor，所述mir-133 inhibitor的序列如seq id no.4所示。
10.其次，本发明提供了mir-133抑制剂在制备促进绵羊真皮成纤维细胞中毛囊发育相关基因表达的生物制剂中的应用，所述mir-133抑制剂为mir-133 inhibitor，所述mir-133 inhibitor的序列如seq id no.4所示；所述毛囊发育相关基因为acvr1b、notch1和tgfβ2。
11.其次，本发明提供了mir-133促进剂在制备抑制绵羊毛囊发育的生物制剂中的应用，所述mir-133促进剂为mir-133 mimic，所述mir-133 mimic的序列如seq id no.5和seq id no.6所示。
12.优选地，所述mirna-133促进剂抑制绵羊真皮成纤维细胞增殖并且抑制绵羊成纤维细胞中毛囊发育相关基因的表达。
13.优选地，所述毛囊发育相关基因为acvr1b、notch1和tgfβ2。
14.其次，本发明提供了mir-133促进剂在制备抑制绵羊真皮成纤维细胞增殖的生物制剂中的应用，所述mir-133促进剂为mir-133 mimic，所述mir-133 mimic的序列如seq id no.5和seq id no.6所示。
15.其次，本发明提供了mir-133抑制剂在制备促进绵羊真皮成纤维细胞中毛囊发育相关基因表达的生物制剂中的应用，所述mir-133促进剂为mir-133 mimic，所述mir-133 mimic的序列如seq id no.5和seq id no.6所示；所述毛囊发育相关基因为acvr1b、notch1和tgfβ2。
16.本发明的有益效果是：1.本发明通过测序和荧光定量pcr确定了 mir-133在e105时，表达量会显著的升高。
17.2.本发明通过实验发现，抑制mir-133的表达能够有效的促进绵羊真皮成纤维细胞的增殖并且能够有效的促进毛囊发育相关基因acvr1b、notch1和tgfβ2的表达。
18.3.本发明通过实验发现，过表达mir-133能够有效的抑制绵羊真皮成纤维细胞的增殖并且能够有效的抑制毛囊发育相关基因acvr1b、notch1和tgfβ2的表达。
附图说明
19.图1为测序筛选结果；a为差异表达mirna的热图，b为mirna维恩图，c为组间的de-mirna，d为de-mirna的维恩图（up 表示显着上调的基因； down 表示显着的下调基因）；图2为mir-133的基因测序和荧光定量pcr的结果；图3为过表达和抑制mir-133后mir-133的表达情况；图4为转染mir-133模拟物及抑制物后cck-8检测的sdf的增殖水平；a为过表达mir-133后sdf的增殖情况，b为抑制内源性mir-133后sdf细胞的增殖情况；*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；图5为mir-133对acvr1b在sdf中mrna及蛋白水平表达的影响；a为过表达和抑制内源性mir-133后acvr1b的mrna表达情况；b为mir-133调控acvr1b的蛋白表达图；*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；图6为mir-133对notch1在sdf中mrna及蛋白水平表达的影响；a为过表达和抑制内源性mir-133后notch1的mrna表达情况；b为mir-133调控notch1的蛋白表达图；*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；图7为mir-133对tgfβ2在sdf中mrna及蛋白水平表达的影响；a为过表达和抑制内源性mir-133后tgfβ2的mrna表达情况；b为mir-133调控tgfβ2的蛋白表达图；*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)。
具体实施方式
20.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所
举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
21.实施例1实验动物和样品制备（1）所选用的受试个体选自新疆科创繁育中心羊群，使用来自苏博美利奴公羊（3 岁；mfd，19.0
±
0.4 μm）的新鲜精子对18只健康的苏博美利奴母羊（2-3 岁；平均纤维直径 (mfd)，18.1
±
0.5 μm）进行人工授精；（2）受精日被指定为胚胎第0天(e0)，之后，我们在四个不同的胚胎日（即 e65、e85、e105 和 e135）从12只怀孕的母羊身上收集胚胎，并且立即收集胚胎皮肤组织；（3）同时，我们收集d7和d30出生后羔羊的皮肤组织收集，深度约为2cm2
×
3 mm，上述六个发育阶段中的每一个生成三个生物学重复。
22.（4）将收集到的所有18个皮肤组织样本使用1
×
pbs冲洗，之后将样品切成小块，迅速放入液氮中，随后在-80
°
c下储存用于rna提取。
23.实施例2筛选差异mirna（1）使用mirneasy mini kit试剂从18个皮肤组织中分离总rna，使用通过qubit
®ꢀ
2.0荧光计和nanodrop one 分光光度计测定rna浓度和质量，同时，使用agilent 2100 bioanalyzer评估总rna样品的完整性；（2）将rna完整性数评分》7的样本用于测序，使用qiaseq mirna library kit按照qiaseq mirna library kit guide合成双末端文库，然后用pcr纯化和富集产物以创建最终的cdna文库；（3）纯化的文库通过qubit
®ꢀ
2.0 荧光计进行量化，并通过agilent 2100 bioanalyzer进行验证，以确认插入大小并计算摩尔浓度；（4）簇由cbot从稀释至10 pm的文库中生成，然后在 illumina novaseq 6000（illumina，usa）上测序，得到的结果如图1所示。
24.从图1中可以看出，本发明通过测序选出了15个de-mirna是与stage a相关的候选mirna，22个de-mirna是与stage b相关的候选mirna，从中我们选出mir-133进行后续实验。
25.实施例3（1）使用edger软件对样本进行差异基因分析，得到p值后进行多重假设检验校正。通过控制 fdr（false discovery rate）来确定 p 值的阈值。同时，还根据fpkm值计算了差异表达倍数，即倍数变化，其中q值≤0.05且倍数变化≥2的基因被认为是差异表达的；（2）从差异mirna中挑选出mir-133进行qrt-pcr验证；（3）使用trizol试剂提取总rna，根据poly(a) tailing kit的方案将poly(a)尾添加到mirna中；（4）使用primescripttm rt试剂盒与gdna eraser和基因特异性引物或随机引物用于生成 cdna；（5）使用mircute plus mirna qpcr kit进行mirna的qrt-pcr检测，引物序列如下：mir-133
f：cgttggtccccttcaaccagctgt，seq id no.1；u6f：ctcgcttcggcagcaca，seq id no.2；r：aacgcttcacgaatttgcgt，seq id no.3；反应条件为：95℃ 15 分钟； 94℃ 20 s，60℃ 34s，进行45个循环；（6）qrt-pcr实验一式三份进行， 2
−
δδct
方法用于确定相对表达量，实验得到的结果如图2所示。
26.从图2中可以看出，qrt-pcr 结果和 rna-seq 结果一致。其中，e65时，rt-pcr的结果为1，mirna-seq的结果为676.17；e85时，rt-pcr的结果为0.47，mirna-seq的结果为35.20；e105时，rt-pcr的结果为44.95，mirna-seq的结果为3436.68；e135时，rt-pcr的结果为6.52，mirna-seq的结果为133.80；d7时，rt-pcr的结果为2.83，mirna-seq的结果为101.64；d30时，rt-pcr的结果为2.90，mirna-seq的结果为115.02。
27.在e85时，mir-133的表达量降低；而在e105时mir-133的表达量显著的升高；在e135时，mir-133的表达量则显著下降；之后，在d7和d30，mir-133的表达量无显著变化。
28.实施例4设计mir-133模拟物和抑制物并验证（1）mir-133 inhibitor的序列如下：sense :acagcugguugaaggggaccaa，seq id no.4；mir-133 mimic的序列如下：，sense :uugguccccuucaaccagcugu，seq id no.5；antisense agcugguugaaggggaccaauu，seq id no.6；mimic-nc的序列如下：sense :uuguacuacacaaaaguacug，seq id no.7；antisense guacuuuuguguaguacaauu，seq id no.8;inhibitor-nc的序列如下：sense :caguacuuuuguguaguacaa，seq id no.9；（2）将绵羊真皮成纤维细胞接种于6孔培养板中，待绵羊真皮成纤维细胞生长汇合度达80%时，进行细胞转染，具体转染步骤参照lipofectamine3000说明书；（3）将稀释好的mir-133 mimic，mir-133 inhibitor和阴性对照分别与脂质体混匀，静置15-20min，将混合物滴加到6孔板，6h后换完全培养基，转染48h后收集细胞进行rna提取，转染72h后收集细胞进行rna提取；（4）提取rna后，进行逆转录和qrt-pcr检测转染mir-133 mimic和mir-133 inhibitor 后，细胞中mir-133的表达情况，得到的结果如图3所示。
29.从图3中可以看出，mir-133 mimic的相对表达量为2.550
ꢀ±ꢀ
0.171，mir-133 inhibitor的相对表达量为0.693
ꢀ±ꢀ
0.026，可以看出转染mir-133 mimic有效的促进了mir-133的表达量，转染mir-133 inhibitor有效的抑制了mir-133的表达量。
30.实施例5过表达和抑制后mir-133对于绵羊真皮成纤维细胞增殖的影响
（1）将转染mir-133 mimic，mir-133 inhibitor以及mir-133 mimic-nc36h后的绵羊真皮成纤维细胞使用0.25%胰酶消化；（2）加入工作培养基终止消化后，离心弃去培养基，加入适量的维持培养基制备单细胞悬液；（3）按照600
µ
l/孔（约2
×
103个细胞）接种至24孔板中进行培养，每组设置4个时间点，分别为24h、48h、72h和96h；（4）分别在培养24、48、72h和96h后对24孔板每孔给予60
µ
l cck-8溶液，放回培养箱中继续培养2h后，将培养孔中的液体转移至96孔板（100
µ
l/孔）每个样品设置6个重复；（5）然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，以od值代表绵羊真皮成纤维细胞的相对增殖水平，绘制细胞增殖曲线，实验得到的结果如图4所示和表1所示。
31.表1 不同组间od值的差异mir-133mimicmimic-ncmir-133inhibitorinhibitor-nc24h0.1410.1610.1570.16148h0.1680.1720.1710.15972h0.2190.2460.2260.23196h0.3570.4210.3830.349从表1和图4中可以看出，与阴性对照组相比，转染了mir-133 mimic在24、72和96小时的细胞增殖水平均极显著降低于mimic-nc组(p《0.01)(图4a)。然而，转染了mir-133 inhibitor 48和96小时的细胞增殖水平较inhibitor-nc极显著升高(p《0.01)。该实验结果表明，过表达 mir-133能够有效的抑制绵羊真皮成纤维细胞的增殖，而抑制mir-133能够有效的促进绵羊真皮成纤维细胞的增殖。
32.实施例6mir-133对于毛囊发育相关蛋白acvr1b、notch1和tgfβ2的影响（1）将绵羊真皮成纤维细胞接种于6孔培养板中，待绵羊真皮成纤维细胞生长汇合度达80%时，进行细胞转染，具体转染步骤参照lipofectamine3000说明书；（2）将稀释好的mir-133 mimic，mir-133 inhibitor和阴性对照分别与脂质体混匀，静置15-20min，将混合物滴加到6孔板，6h后换完全培养基，转染48h后一部分，去除培养基，pbs清洗后，收集细胞进行rna提取；rna提取和检测步骤参见实施例3，acvr1b、notch1和tgfβ2的引物序列如下：acvr1bf: cggtcttgtgtactgggagattgc, seq id no.10;r: aatggaagggtcagagggcactag, seq id no.11notch1f: tatctgcatgcctggctacg, seq id no.12；r: gtccacgtcatactggcaca, seq id no.13；tgfβ2f: agcggagcgacgaggaatactac, seq id no.14;r: cactgagccagagggtgttgtaac, seq id no.15;（3）另一部分去除培养基，使用pbs清洗细胞后，加入蛋白裂解液，使其与细胞充分
接触，冰上放置，期间使用移液枪轻轻吹打细胞2-3次，每次10s；（4）收集细胞至1.5ml离心管中，在冰上放置5min，期间剧烈振荡3-4次，每次30s；（5）12000rpm，4℃离心5min，取上清即可进行后续的western操作；（6）按照下表配置sds-pag：表1 5%浓缩胶和10%分离胶配置5%浓缩胶for1gelfor2gelddh2o1.4ml2.7ml0.5mtrisph6.8250μl500μl30�rylamide330μl670μl10%sds20μl40μl10%aps20μl40μltmem2μl4μl10%分离胶for1gelfor2gelddh2o1.9ml4.0ml1.5mtrisph8.81.3ml2.5ml30�rylamide1.7ml3.3ml10%sds50μl100μl10%aps50μl100μltmem2μl4μl（7）将电泳液加入到电泳槽中，将变性好的蛋白样品每孔按蛋白总量50μg按顺序加入至胶孔中，同时在每组两侧加入适量预染蛋白marker，设定恒压80v，30min，待loading buffer的蓝色指示带到达分离胶时加大电压为120v，至跑完全程；（8）将凝胶自胶板中取出，按照“三明治”结构，将转膜夹组装好，夹紧放置转膜槽中，加满转膜液，于冰上转膜，转膜参数设定为：恒流200ma，120min；（9）转膜完成后将膜取出置于封闭液中，常温摇床上封闭1h；（10）将pvdf膜按照需要的分子量剪开，将膜完全孵育到特定的一抗中，4℃孵育过夜。
33.（11）自一抗中取出条带，tbst洗涤3min
×
3次，将条带放到相应的二抗中，摇床上缓慢摇晃常温孵育1h，孵育完成后用摇床上高速tbst洗涤10min
ꢀ×
3次；（12）洗膜完成后将膜放在发光仪中，滴加ecl化学发光液，将发出的条带拍照、保存，实验得到的结果如图5-7所示。
34.从图5-7中可以看出，过表达mir-133后，acvr1b、notch1和tgfβ2基因的表达量均极显著低于对照组，而且相应的蛋白表达量也低于对照组组；抑制mir-133后，notch1的表达量极显著高于对照组，tgfβ2的表达量显著高于对照组，acvr1b的差异无统计学意义；同时，抑制mir-133后，acvr1b、notch1和tgfβ2的蛋白表达量均高于对照组；上述结果说明，过表达mir-133能够有效的抑制acvr1b、notch1和tgfβ2基因的mrna水平和蛋白水平表达；抑制mir-133能够有效的促进notch1和tgfβ2的mrna水平和蛋白水平表达，并且有效的促进acvr1b的蛋白表达。
35.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。