一种代谢性脑病和心律失常疾病的斑马鱼模型及其应用

1.本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种药物筛选斑马鱼模型及其构建方法与应用，可以用于筛选用于治疗代谢性脑病和心律失常疾病的药物。


背景技术：

2.代谢性脑病和心律失常疾病(trmea)是近年来新发现的一种人类遗传病，最早报道于2016年。该病患者的初次发病时间为2个月到8岁之间，主要临床症状包括代谢综合征、脑病、心律失常、发育迟缓、横纹肌溶解症等，临床症状复杂多样。
3.目前还没有专门预防和治疗代谢性脑病和心律失常疾病的药物，主要原因是因为该遗传病于近几年才被发现，缺少相关疾病动物模型和药物筛选方法。为了研发能精准治疗该代谢性脑病和心律失常疾病的药物，建立一种稳定、易操作、高通量的特异性动物模型已经十分迫切，该模型对于推动药物筛选和后续药效检验至关重要。
4.斑马鱼作为一种常见的模式动物，与人类基因相似度高达85％左右，并且具有养殖便利、生长周期短、繁殖能力强、胚胎透明便于观察，给药方式简单等优势，被广泛用于器官发育、心血管疾病以及药物筛选等生物医学的科学研究。通过突变斑马鱼相关基因来建立一种代谢性脑病和心律失常疾病模型，对于筛选治疗trmea及相关疾病的药物具有重要价值和临床意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于筛选改善、治疗代谢性脑病和心律失常trmea疾病药物的斑马鱼模型及其构建方法；从而弥补现有技术的不足。
6.本发明首先提供tango2基因的一种用途，是在制备代谢性脑病和心律失常疾病(trmea)斑马鱼模型中的应用；
7.本发明再一个方面提供一种构建代谢性脑病和心律失常疾病(trmea)斑马鱼模型的方法，是对斑马鱼受精卵的tango2基因进行突变后，突变的受精卵孵化后获得斑马鱼模型；
8.更进一步，所述的斑马鱼模型，是通过自交获得的tango2基因纯合突变体。
9.作为优选，所述的tango2基因突变，是在tango2基因的第二个外显子上进行基因编辑操作；
10.所述的基因编辑，作为一个实施例的具体记载，为crispr-cas9系统进行的基因编辑；
11.更进一步的，所述的crispr-cas9系统进行的基因编辑时，其使用的一种具体的sgrna,其grna对应的核苷酸序列为ggagctactaatgtacctgt；
12.本发明另一个方面还提供一种筛选治疗trmea疾病药物的方法，是使用所构建的tango2基因突变体斑马鱼作为模型动物来筛选药物。
13.本发明以斑马鱼tango2为目的基因，利用基因组编辑技术，在野生型斑马鱼受精
卵中显微注射体外合成的tango2特异性sgrna和cas9 mrna，利用特异性引物逐代筛选获得tango2基因特异性敲除的纯合子突变体斑马鱼。本发明能够得到遗传稳定的tango2缺失突变体斑马鱼，利用斑马鱼胚胎透明性和突变体斑马鱼幼鱼致死、心律不齐、肌肉损伤、运动迟缓等与trmea疾病患者相似的症状，使得该突变体能够用于评价各种药物对trmea疾病的治疗作用。该斑马鱼动物模型的构建方法对trmea疾病治疗药物的筛选具有特异性和重要生理意义。
附图说明
14.图1：野生型斑马鱼与tango2突变体斑马鱼12日龄幼鱼表型图。
15.图2：野生型斑马鱼与tango2突变体斑马鱼生存曲线结果图。
16.图3：野生型斑马鱼与tango2突变体斑马鱼12日龄幼鱼行为学结果图。
17.图4：野生型斑马鱼与tango2突变体斑马鱼12日龄幼鱼心率结果和心律不齐结果图。
18.图5：野生型斑马鱼与tango2突变体斑马鱼12日龄幼鱼肌肉损伤结果图。
具体实施方式
19.本发明所提供的tango2基因突变体斑马鱼模型的构建方法，是通过crispr-cas9系统构建tango2突变体斑马鱼模型；但还可以采用其它常规的基因编辑方法来获得斑马鱼tango2基因突变体。
20.本发明构建斑马鱼tango2基因突变体的一种具体方法，包括如下的步骤：
21.1)tango2突变体斑马鱼的构建
22.以斑马鱼tango2基因为目的序列，在第二个外显子附近设计并合成靶位点grna序列。使用puc53载体构建体外转录模板，进行体外转录、纯化回收，获得sgrna。
23.其中斑马鱼tango2基因，现有技术中公开的一种具体的ncbi编号为445324，含有9个外显子和8个内含子；
24.在本发明方法中，还可以通过在tango2基因的其它外显子或内含子进行基因编辑，从而使tango2基因发生突变并引起疾病。
25.使用所述的sgrna和cas9 mrna，共同显微注射入斑马鱼受精卵来进行基因编辑。
26.其中sgrna的一种具体序列为ggagctactaatgtacctgt，但还可以是其它能够起到类似效果的sgrna。
27.培养注射后的受精卵，提取基因组dna为模版，根据tango2序列设计引物，鉴定确认注射后斑马鱼基因型，筛选获得p0代tango2突变体斑马鱼。
28.将p0代tango2突变体斑马鱼与野生型斑马鱼交配，收集胚胎获取基因组dna进行基因型鉴定，筛选获得稳定遗传的f1代tango2杂合突变体斑马鱼；通过对基因组dna进行测序，分析所获得的具体tango2突变位点。
29.将f1代tango2杂合突变体斑马鱼进行自交，筛选获得纯合突变的f2代tango2突变体斑马鱼。将f2代纯合突变体斑马鱼进行自交，获得f3代纯合子斑马鱼，所获得的该f3代tango2突变体斑马鱼，作为疾病模型用于trmea疾病药物筛选。
30.tango2杂合突变体斑马鱼自交所获得的纯合子斑马鱼能正常发育，但纯合子斑马
鱼自交的后代均于发育早期死亡，因此该疾病模型以tango2杂合突变体来保种和维持。
31.本发明的tango2基因突变斑马鱼作为动物模型进行代谢性脑病和心律失常疾病的药物筛选。
32.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
33.实施例1构建tango2突变体斑马鱼模型
34.通过人tango2基因序列，在ncbi上比对获得斑马鱼tango2基因序列，根据crispr/cas9敲除方法原理，在tango2第二外显子上设计并合成靶点grna序列为：ggagctactaatgtacctgt。
35.使用等量grna进行配对获得grna引物双链，利用puc57载体构建体外转录模板，使用t7 rna聚合酶进行sgrna体外转录，进一步纯化回收，获得sgrna。
36.体外转录体系为：线性化模版2μg，5x转录缓冲液8μl，10x二硫素糖醇溶液4μl，10x核糖核苷酸缓冲液4μl，rna酶抑制剂2μl，t7 rna聚合酶4μl，depc补充到40μl体系。37℃条件下反应4小时。
37.配制sgrna和cas9 mrna混合工作液，显微注射入斑马鱼受精卵一细胞期动物级，其中sgrna与cas9 mrna使用比例为1:5。
38.培养注射后的受精卵，48小时后收集30枚以上胚胎提取基因组dna。根据tango2序列设计基因型鉴定引物，分别为正向引物：taactcactgtcacatctcttc；反向引物：gcatgattcagcatccactggac。通过pcr扩增和2％琼脂糖凝胶电泳区分筛选，饲养至成鱼。
39.基因组dna提取步骤如下：1.0m tris-hcl(ph 8.8)、0.5m edta(ph 8.0)和20％tween-20配制组织裂解液，按蛋白酶k：裂解液(v：v＝1:200)加入蛋白酶k，每个ep管中加入20μl提取混合液，65℃裂解30分钟后，95℃处理10分钟使蛋白酶k失活。
40.pcr扩增体系为：95℃ 5min，95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min为一个循环，进行30个循环，最后72℃ 10min。
41.剪尾提取基因组dna，pcr扩增筛选获得成功敲除tango2基因的p0代突变体。将p0代tango2突变体斑马鱼与野生型斑马鱼交配，收集胚胎获取基因组dna进行基因型鉴定，筛选获得稳定遗传的f1代tango2突变体斑马鱼。
42.筛选获得可遗传f1代突变体后，提取胚胎rna并反转录获得cdna，在第一外显子上设计特异性引物，其中：
43.正向引物：5
′‑
atgtgcatcatcttcttgaagttcgacc-3
′
；
44.反向引物：5
′‑
ggggtgtttagctcctcgttattg-3
′
；
45.通过rt-pcr扩增和测序的方法，鉴定sgrna是否工作，分析获得具体tango2突变位点。
46.将f1代tango2突变体斑马鱼进行自交，剪尾提取基因组dna后，筛选获得纯合突变的f2代tango2突变体斑马鱼，即为tango2突变体斑马鱼。
47.保留并饲养杂合的f2代tango2突变体斑马鱼，用于保种和获得纯合的tango2突变体斑马鱼。
48.实施例2tango2突变体斑马鱼的表型分析
49.让野生型斑马鱼和第一代tango2纯合斑马鱼分别自交，收集受精卵后，观察斑马鱼发育周期、身体形态、活跃度、翻正反映、鱼鳔大小、捕食能力等多方面生理特征，受精后
第7天检测斑马鱼心跳节律，受精后第12天检测斑马鱼心跳次数、运动轨迹、肌肉损伤情况、脑病理形态，对tango2基因突变疾病药物筛选模型有效性进行验证。
50.具体表型如下：
51.1)疾病模型的形态学观察：随着生长发育进程的进行，tango2突变体斑马鱼逐渐出现死亡、翻正反应能力变弱等发病症状。通过凹槽载玻片和3％甲基纤维素溶液，将斑马鱼置于体视显微镜下，调整姿势使斑马鱼侧卧，头部、身体、尾部在同一水平面，以适合观察和记录。在明场条件下，可见tango2突变体斑马鱼鱼鳔萎缩、心包水肿表型的出现，表型结果如图1所示。
52.2)生存曲线：受精后开始，每组随机选取50枚胚胎，在28.5℃恒温条件下，培养箱中培养5天后转移到幼鱼养殖盒中，转移后每天喂食两次。每天记录斑马鱼死亡数量。结果显示tango2突变体斑马鱼从受精后第5天开始出现幼鱼死亡现象，到第15天时基本全部死亡，统计结果如图2所示。
53.3)行为学分析：在受精后第12天对斑马鱼进行行为学分析。利用24孔板，每个孔中放置一条斑马鱼，10分钟黑暗条件后10分钟光照条件刺激，循环两次共计40分钟，红外示踪显示斑马鱼运动轨迹情况，记录分析斑马鱼运动轨迹和活跃度，每组重复8条幼鱼，共分析三组。结果显示tango2突变体斑马鱼运动能力明显减弱，轨迹示踪密度和活跃度明显下降，尤其在黑暗条件下tango2突变体斑马鱼活跃度远低于野生型斑马鱼。统计结果如图3所示。
54.4)心脏表型分析：同疾病模型表型方法，拍摄12日龄斑马鱼1分钟录像，统计每分钟斑马鱼心跳次数。使用苯基硫脲抑制斑马鱼黑色素形成，拍摄7日龄斑马鱼胸腔位置30s录像，使用semi-automated optical heartbeat analysis软件分析斑马鱼心律不齐指数，使用image-j软件分析斑马鱼心室舒张面积。结果显示tango2突变体斑马鱼每分钟心跳次数减少，心律不齐指数升高，心室舒张时间变长，面积增大，统计结果如图4所示。
55.5)肌肉损伤分析：使用1
×
麻醉剂麻醉12日龄斑马鱼1分钟，使用3％甲基纤维素，调整姿势后，调节olympus ix83显微镜上偏振光片，使只有肌肉折射光线并进行拍摄。同时，使用4％多聚甲醛将斑马鱼固定24小时，再经过50％、70％、90％、100％梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明，浸蜡后，用石蜡包埋进行切片。选取合格的石蜡切片进行he染色。4％多聚甲醛固定后的斑马鱼经过蛋白酶k处理后，使用0.5％鬼笔环肽染色30分钟后，使用超分辨率共聚焦激光扫描纳米显微镜拍摄。结果显示，tango2突变体斑马鱼肌肉纤维形态被破坏(图5)。
56.实施例3：tango2突变体斑马鱼的应用
57.使用实施例1构建的tango2基因突变体斑马鱼筛选治疗trmea疾病的药物，能够改善或拯救tango2突变体斑马鱼幼鱼死亡、心率失常、形态异常等表型的药物即为目的药物。
58.设置野生型对照组、tango2突变体对照组和tango2突变体药物处理组，采用24孔细胞板，每孔中放置10条斑马鱼,于28.5℃培养。用斑马鱼养殖用水，配置5mm浓度的3-吡啶羧酸酰胺溶液。在斑马鱼胚胎1日龄时按照终浓度5μm进行给药，按照使用实施例2的方法观察tango2突变体斑马鱼形态、存活、行为、心跳等表型的变化，共记录12天。结果显示，在5μm浓度的3-吡啶羧酸酰胺处理下，tango2突变体斑马鱼出现死亡症状的时间明显推迟，显示3-吡啶羧酸酰胺溶液对本发明斑马鱼模型的症状有一定缓解作用。
59.所述实施例为本发明的优选实施例，本领域内技术人员可对实施例作变更和修
改，所附权利要求解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
60.本领域内技术人员可对实施例作变更和修改不脱离本发明的精神和范围。所述变更和修改属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，本发明也包含这些改动和变型。