一种甲状腺球蛋白IgM抗体的检测试剂盒

一种甲状腺球蛋白igm抗体的检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种甲状腺球蛋白igm抗体的检测试剂盒。


背景技术：

2.桥本甲状腺炎(ht)是一种十分常见的自身免疫性疾病，起病隐匿，进展快慢不一，临床表现复杂多样，初诊时约20％表现为甲状腺功能减低，5％为轻度甲状腺功能亢进，大多数为甲状腺功能正常，但由于腺体萎缩、破坏，最终也将发展为甲状腺功能减退。ht发生甲状腺功能减退的概率随病程延长而逐渐增加，甲状腺功能减退发生率每年增加5％-7％。甲状腺自身免疫反应的机制是激活的甲状腺抗原特异性t辅助细胞诱导b细胞分泌甲状腺自身抗体，其中甲状腺球蛋白抗体(tgab)是ht的标志性抗体之一，目前检测的主要为总igg类抗体。甲状腺球蛋白(tg)其主要作用是储存和合成甲状腺激素，是一种潜在的自身抗原，当进入血液后可刺激机体产生tgab，tgab是甲状腺疾病中首先发现的自身抗体，具有高度种属特异性，可用于ht等甲状腺疾病的鉴别诊断。
3.研究发现血清tgab浓度相同的不同患者甲状腺损伤程度及进展不同，仅检测tgab水平很难评估病情严重程度。li等学者发现tg igg亚型(igg1、igg2、igg3、igg4)在不同甲状腺功能状态的ht患者中分布不同，高滴度igg1亚型预示进展为甲减可能。不同ht患者tg igg亚型(igg1、igg2、igg3、igg4)分布如何及与甲状腺功能损伤的进展具有怎样的联系，目前国内外相关报道较少，igm的研究更少。igg亚型及igm检测方法主要为间接法酶联免疫分析(elisa)，但elisa法操作灵敏度、重复性和特异性较差，线性范围窄，且常会有一些相互矛盾的结果。
4.放射配体法(rba)是利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行检测的分析法。该方法灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高，是医学研究的重要方法。因此，有必要开发高性能的rba检测试剂盒取代elisa法检测tg igg各亚型或igm。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种甲状腺球蛋白igm抗体的检测试剂盒。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种甲状腺球蛋白igm抗体的检测试剂盒，包括：
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i标记的人甲状腺球蛋白，2-巯基吡啶琼脂糖。
8.进一步地，所述检测试剂盒还包括：tbst缓冲液和牛血清白蛋白。
9.更进一步地，所述检测试剂盒还包括：阳性质控血清和阴性质控血清。
10.该试剂盒将含有2-巯基吡啶配基的琼脂糖运用到已有的放射配体法(rba)检测平台，以
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i同位素标记的甲状腺球蛋白(tg)作抗原与待测血清形成抗原抗体复合物，将2-巯
基吡啶琼脂糖与抗原抗体复合物混合震荡，利用2-巯基吡啶可直接结合igm的特点，反复洗涤，洗脱未结合的信号，读取余下抗原抗体复合物的放射性强度，从而计算出样品中igm抗体的含量指数。
11.上述检测试剂盒在制备桥本甲状腺炎检测产品中的应用。
12.2-巯基吡啶(c5h5ns)是一种有机硫化合物，亲硫性强，含有c5h5ns的琼脂糖是一种亲硫吸附填料，igm作为迄今为止实际发现的在人体循环系统中的最大抗体，具有特殊的五聚体结构，含硫量较高，包含较多的结合价能及自由巯基。c5h5ns的供电子基和吸电子基可与igm相互作用，有效的结合这种特殊的最大抗体，但对其他的较小的抗体则几乎不存在这种相互作用。本发明首次将含2-巯基吡啶琼脂糖引入rba检测平台，直接结合igm，读取抗原抗体复合物的放射性强度(cpm每分钟放射计数)，计算出样品中抗体的含量指数，建立了tg igm的直接法检测方案，减少了间接法可能导致的检测中信号的丢失。
附图说明
13.图1为tg igm的正常人界值判定结果。
14.图2为tg igm在桥本甲状腺炎患者中的分布结果。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
16.实施例1
17.一、实验材料
18.1.样本来源：
19.收集2019年11月至2022年01月在南京医科大学附属第一医院确诊的192例桥本甲状腺炎患者血清储存于-80℃。健康人105例来自招募人群[年龄(26.6
±
5.3)岁；男60例，女45例]；糖耐量检测(ogtt)空腹及2h血糖正常,排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。所有研究对象均签署知情同意。
[0020]
阳性质控血清标本为前期科研中6份tg igm阳性血清的混合样本，阴性质控血清标本取自于无自身免疫甲状腺炎家族史的健康志愿者。
[0021]
2.主要试剂及仪器:
[0022]
试剂：
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i标记的人甲状腺球蛋白(
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i-tg，北京北方生物技术研究所)；2-巯基吡啶琼脂糖(17511001，ge)；96孔pvdf板(3504，corning)；闪烁液(microscint-20，perkin-elmer)；tbst缓冲液(tris-base 2.424g，nacl 8.70g，tween-20 1.5ml，加蒸馏水定容至1000ml，调ph至7.4)；抗原缓冲液(tbst缓冲液加牛血清白蛋白0.25mg/250ml)。
[0023]
二、实验方法
[0024]
1.抗原稀释：取15ml离心管，用抗原缓冲液稀释
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i-tg至20000cpm/6ml。
[0025]
2.抗原与血清孵育过夜：取96孔平板，每孔各加5μl待测血清，再向每孔加60μl稀释后的抗原，每孔cpm值要求≥20000，每个标本和质控血清均为双复孔，室温震荡混匀1小
时，后4℃过夜。
[0026]
3.孵育96孔pvdf板：取一个96孔pvdf板，每孔加入150μl抗原缓冲液，4℃过夜。
[0027]
4.沉淀抗原抗体复合物：弃去96孔pvdf板孵育液，每孔加25μl，体积比20％的2-巯基吡啶琼脂糖，依次从96孔平板各孔中取出50μl混合液转移至96孔pvdf板上，4℃冰箱中混匀1h。
[0028]
5.放射结合测定：真空泵抽吸去pvdf过滤板各孔中液体，留取沉淀物，每孔中加200μltbst缓冲液洗涤沉淀物1次，再加150μl缓冲液重复洗涤6次，每孔加入60μl闪烁液，置βcounter计数仪上计数，每孔计数30s，得到每分钟放射计数cpm。
[0029]
6.结果计算：
[0030]
放射指数(index)＝(标本血清cpm－阴性质控cpm)/(阳性质控cpm－阴性质控cpm)。
[0031]
所有数据均采用spass26软件进行统计，对所有计量资料符合正态分布的以用均数
±
标准差表示，组间比较采用t检验。p《0.05为差异显著，具有统计学意义。
[0032]
三、实验结果
[0033]
1.2-巯基吡啶琼脂糖使用量的摸索
[0034]
使用体积比20％的2-巯基吡啶琼脂糖，用量分别为25μl，50μl，随机检测15例病人样本，观察不同添加量下cpm的读数。结果如下表。
[0035]
琼脂糖用量12345678910111213141525μl678436902107213248109416842108234904250μl5496489021654140601184178571312228844
[0036]
经配对t检验，p值为0.2323，两组之间无显著差异，考虑成本选用25μl的体系。
[0037]
2.rba检测tg igm的正常人界值判定
[0038]
取105例健康人血清进行tg igm的测定，计算放射指数，取99％百分位点为界值。计算得到阳性界值，如图1所示，阳性判断标准为≥0.029。
[0039]
3.rba检测tg igm的批内批间差异
[0040]
根据tg igm指数低、中、高在正常人和患者中选择3份血清在批内和批间各重复检测，批内和批间变异系数(coefficient of variance，cv)结果见下表。
[0041][0042]
结果显示tg igm检测指数的批内cv为5.69％～9.22％，批间cv为6.66％～
11.00％，阴阳性结果判断重复性100％。
[0043]
4.tg igm在桥本甲状腺炎患者中的分布
[0044]
对收集的192例临床桥本甲状腺炎患者血清进行tg igm的检测，阳性样本为3例。结果如图2所示。
[0045]
根据以上结果可知，本发明通过将含2-巯基吡啶琼脂糖引入rba检测平台，直接结合tg igm，读取抗原抗体复合物的放射性强度(cpm每分钟放射计数)，从而计算出样品中抗体的含量指数，首次建立了tg igm的直接法检测方案，减少了间接法可能导致的检测中信号的丢失。