FKBP5基因突变位点在高度近视早期筛查诊断中的应用

fkbp5基因突变位点在高度近视早期筛查诊断中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及fkbp5基因突变位点在高度近视早期筛查诊断中的应用，更具体地，本发明涉及fkbp5基因突变位点rs533280354在高度近视早期筛查诊断中的应用。


背景技术：

2.近视是一种由环境与遗传因素共同作用引起的屈光不正，通常按照近视的程度将近视分为三类：轻度近视、中度近视、重度近视。其中，轻度近视是指视力在3.00d(300度)以内者，中度近视是指视力在3.00d-6.00d(300度-600度)之间者，高度近视是指视力在6.00d(600度)以上者。近视是目前影响青少年人群视觉健康的主要眼病，2018年12月，由国家卫生健康委、教育部、财政部联合组织开展的全国儿童青少年近视调查结果显示，全国6岁儿童近视率高达14.5％，小学、初中、高中学生近视率分别达到36.0％、71.6％和81.0％，高三学生高度近视比率高达17.7％。高度近视是引起眼病患者眼盲和低视力的主要原因之一，给患者及其家庭带来了严重的经济负担。高度近视通常伴有眼轴延长、眼后极部的变形改变，包括巩膜变薄、脉络膜萎缩变薄等病理性改变，可伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症，是严重影响视力健康乃至生存质量的一种重要疾病。
3.高度近视的发生发展是一个涉及多因素参与的复杂过程，其具体的发病机制目前仍不清楚，大量研究表明，遗传因素在高度近视的发生发展过程中起着重要的作用，尤其在学龄前即发病的早发型高度近视，其发病受环境因素影响较小，主要由基因突变所致。高度近视严重影响人类生活质量，然而，截止到目前为止对于高度近视的治疗还非常有限。光学矫正如戴眼镜或接触镜矫正近视眼的屈光缺陷，虽然有助于暂时恢复正常或接近正常的视力，却不能有效地控制近视进展；针对部分高度近视伴有黄斑病变所采用的玻璃体手术与激光治疗，以及通过手术控制眼轴延长延缓眼底病变出现的时间并减轻其病变程度，是临床上最常采用的干预方法，这些治疗手段能使术后视力提高或保持稳定，但这些治疗并不能对所有患者有效，且手术存在一定的风险性，其远期效果也还尚待考证。此外，近视以及高度近视的诊断主要依靠屈光度的测量或者眼轴的生物学测量，目前尚未有一种可以全面筛查高度近视的工具。
4.由此可见，寻找更有效的遗传标志物和检测方法对高度近视患者和高危人群进行早期筛检、风险预测和早期干预具有重要的临床意义。若能将临床诊疗与基因检测结合，达到高度近视的早期精确诊断以及高危易感性的预判，将为高度近视的防控、患者预后的判断、早期干预等提供至关重要的理论依据。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种特发于亚洲人群的fkbp5基因上的单点变异位点rs533280354，并对其进行了实验验证，结果表明所述变异位点与高度近视之间存在显著的关联性，能够用于高度近视的早期筛查和诊断中，具有重要
的临床应用价值。
6.本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
7.本发明的第一方面提供了检测受试者样本中fkbp5基因snp位点的试剂在制备诊断高度近视易感性的产品中的应用。
8.进一步，所述snp位点为rs533280354；
9.进一步，所述高度近视易感患者中的snp位点rs533280354由g突变为a。
10.进一步，当rs533280354g》a时，受试者存在患高度近视的风险或患有高度近视。
11.进一步，所述试剂包括用于特异性扩增所述snp位点核苷酸序列的引物对。
12.进一步，所述试剂还包括利用质谱法、dna微阵列法、测序法、等位基因特异性探针杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、单链构象多态性分析、等位基因特异性扩增检测所述snp位点基因型的方法中使用的试剂。
13.进一步，所述试剂还包括特异性结合所述snp位点的核酸亲和配体或探针。
14.进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
15.进一步，作为一种可选择的实施方式，所述试剂盒还可以包括基因组dna抽提试剂、pcr反应体系试剂、dhplc相关试剂、或蛋白质抽提试剂；
16.优选地，所述pcr反应体系试剂包括dntp、mgcl2、taq dna聚合酶、pcr反应缓冲液、去离子水；
17.优选地，所述试剂盒还包括酶切常规组件，包括反应缓冲液、去离子水。
18.进一步，所述试剂盒中包括适当的容器，所述容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
19.进一步，作为一种可选择的实施方式，所述芯片包括：固相载体、以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于rs533280354所在的序列；
20.优选地，所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
21.进一步，所述寡核苷酸探针为针对本发明所述fkbp5基因snp位点rs533280354的寡核苷酸探针，可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合即可。
22.进一步，所述高度近视为亚洲人群高度近视。
23.进一步，所述测序法是指直接测序法，直接测序法检测snp位点是最直接可靠的方法，检出率高达100％，代表测序技术有焦磷酸测序(pyrosequencing)、taqman技术、微测序
(snapshot)等。该方法通过比对不同样本中的同一基因或是基因片段的pcr扩增产物的测序结果，或是重测序分析已定位的序列标签位点(sts)及表达序列标签(est)来检测snp。可以将pcr产物纯化回收后通过连接到载体上进行测序，也可以对pcr产物直接进行测序。通过序列的比对，就能够准确地检测snp的突变类型和位置。
24.进一步，所述单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，sscp)是指单链dna由于碱基序列不同可引起空间构象差异，这种差异会导致相同或相近长度单链dna电泳迁移率的不同，从而可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行有效地检测。pcr-sscp是将sscp用于pcr扩增产物的基因突变检测的方法，pcr扩增的dna片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链dna扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。目前，pcr-sscp技术被广泛应用于分子生物学的各个领域。
25.进一步，所述等位基因特异性扩增(allele-specific pcr，as-pcr)的原理如下：由于taq dna聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与snp位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与snp位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。目前，已出现了基于as-pcr改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系pcr(tetra-primer amplification refractory mutation system pcr，tetra-primer arms-pcr)、片段长度差异等位基因特异pcr(fragment length discrepant allele specific pcr,fldas-pcr)、多等位基因特异扩增(pcr amplification of multiple specific alleles,pmasa)等。
26.进一步，所述受试者样本选自受试者的血液或组织；
27.优选地，所述受试者样本选自受试者的组织；
28.更优选地，所述受试者样本选自受试者的口腔脱落细胞。
29.本发明的第二方面提供了一种诊断高度近视易感性的产品。
30.进一步，所述产品包括检测fkbp5基因snp位点基因型的试剂；
31.优选地，所述fkbp5基因snp位点为rs533280354；
32.优选地，所述高度近视易感患者中的snp位点rs533280354由g突变为a；
33.优选地，所述高度近视为亚洲人群高度近视；
34.优选地，所述检测fkbp5基因snp位点基因型的试剂包括利用质谱法、dna微阵列法、测序法、等位基因特异性探针杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、单链构象多态性分析、等位基因特异性扩增检测所述snp位点基因型的方法中使用的试剂。
35.更优选地，所述检测fkbp5基因snp位点基因型的试剂包括用于特异性扩增所述snp位点核苷酸序列的引物对；
36.优选地，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
37.本发明的第三方面提供了fkbp5基因snp位点在构建预测高度近视易感性的计算模型中的应用。
38.优选地，所述计算模型以rs878639的基因型作为输入变量；
39.优选地，所述高度近视易感患者中的snp位点rs533280354由g突变为a；
40.优选地，所述高度近视为亚洲人群高度近视。
41.进一步，在一些实施方案中，所述计算模型还可以以其他与高度近视相关的标志物作为输入变量。
42.进一步，当rs533280354g》a时，受试者存在患高度近视的风险或患有高度近视。
43.本发明的第四方面提供了fkbp5基因snp位点在构建高度近视易感的生物样品筛选系统中的应用。
44.进一步，所述snp位点为rs533280354；
45.优选地，所述高度近视易感的生物样品中的snp位点rs533280354由g突变为a；
46.优选地，所述高度近视为亚洲人群高度近视。
47.本发明的第五方面提供了一种高度近视易感的生物样品筛选系统。
48.进一步，所述系统包括：
49.(1)核酸提取装置，用于从所述生物样品中提取核酸样本；
50.(2)核酸序列确定装置，与所述核酸提取装置连接，用于对所述核酸样本进行分析，确定所述核酸样本的核酸序列；
51.(3)结果判断装置，与所述核酸序列确定装置相连，基于所述核酸样本的核酸序列与野生型fkbp5基因序列相比较，判断生物样品中是否存在snp位点rs533280354由g到a的突变，进而判断所述生物样品是否为高度近视易感的生物样品；
52.优选地，所述生物样本为受试者来源的口腔脱落细胞；
53.优选地，所述核酸样本为dna；
54.优选地，若来源于受试者的生物样品中存在snp位点rs533280354由g到a的突变，则所述生物样本为高度近视易感的生物样品。
55.此外，本发明还提供了一种诊断受试者高度近视易感性的方法。
56.进一步，所述方法包括如下步骤：
57.(1)提取受试者样本中的核酸；
58.(2)将来自受试者样本的核酸与检测rs533280354基因型的试剂接触；
59.(3)确定rs533280354的基因型；
60.(4)基于所述基因型判断受试者是否存在患高度近视的风险或是否患高度近视。
61.进一步，所述受试者为亚洲人群。
62.进一步，所述亚洲人群为中国人。
63.进一步，所述样本包括口腔脱落细胞，优选为采用口腔拭子常规取样方法采集受试者来源的口腔脱落细胞。
64.为了进一步解释本发明，对本发明中涉及到的专业术语进行如下解释：
65.术语“snp(单核苷酸多态性)”，是指dna中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该snp位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个snp位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。本发明的snp位点以“rs
‑”
方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbsnp)中确定其确切的位置、核苷酸序列。在本发明的具体实施方案中，所述snp位点为fkbp5基因上的snp位点rs533280354，所述snp位点rs533280354在ncbi中有其详细信息，详见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝rs533280354。
66.术语“样本”，是指来源于受试者任何合适的部分的任何样品。作为非限制性的实施方案，样本可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样本可以
来源于体液，例如来源于唾液、脑脊液、血液、血清、痰、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液和汗水等。特别优选采用血液样品，其包含含有dna的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。在本发明的检测步骤中，最终作为检测对象的是核酸(优选dna)或蛋白，在本发明的具体实施方式中，所述样本优选为口腔脱落细胞，更优选为采用口腔拭子常规取样方法采集受试者来源的口腔脱落细胞。
67.术语“等位基因”，是指在染色体的给定基因座存在的一对或一系列形式的基因或非基因区。在正常的二倍体细胞中，存在任一种基因的两个等位基因(每个亲本一个)，其占据同源染色体上相同的相对位置(基因座)。在一个群体中，一种基因可能存在多于两个的等位基因。snps也具有等位基因，即，表征所述snp的两个(或更多个)核苷酸。
68.术语“基因型”，是指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。
69.术语“引物”，是指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和ph)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖dna或依赖rna的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。
70.术语“snp位点的核酸亲和配体”，是指能够结合如本文中所述的snp位点或其附近序列的核酸分子。作为非限制性的实施方式，可以是例如rna、dna、pna、can、hna、lna或ana分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。
71.术语“探针”，是指可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。但是优选地是长度不少于10个核苷酸，并且优选的是长度不超过大约80个核苷酸；在一些实施方案中，探针的长度为大约20至60个核苷酸；在其他的实施方案中，探针的长度为大约20至40个核苷酸。探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。可以根据本领域技术人员已知的方法，通过标准的标记技术来标记本发明的探针，例如放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光标记等。在杂交后，可以使用已知的方法来检测探针。
72.相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
73.(1)本发明基于中国高度近视人群的万人队列研究，首次发现了一种能够用于高度近视早期筛查和诊断的变异位点，所述变异位点为fkbp5基因上的单点变异位点rs533280354，并对其进行了实验验证，进一步证明了所述变异位点与高度近视之间存在显著的关联性；
74.(2)本发明首次阐明了fkbp5基因上的单点变异位点rs533280354和高度近视之间的相关性，为本领域提供了一种预测高度近视易感性的方法，该方法可用于高度近视的早期筛查、辅助诊断和治疗中，此外，还可用于开发预防、延缓或治疗高度近视的药物中，具有重要的科学研究和临床应用价值。
附图说明
75.图1为在高度近视人群和对照人群频率差异大的变异位点分析结果图；
76.图2为在亚洲人群中特异且贡献最大的位点分析结果图；
77.图3为对fkbp5基因进行motif挖掘分析的结果图；
78.图4为对fkbp5基因进行染色质可及性和修饰性分析的结果图；
79.图5为实验设计图和荧光素酶活性检测结果图，其中，a图：实验设计图，b图：荧光素酶活性检测结果图。
具体实施方式
80.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
81.实施例与高度近视易感性相关的snp位点的筛选与实验验证
82.1、研究对象
83.分别于温州市各区县初高中、小学收集10000例高度近视人群和10000例对照人群(正常视力人群)，对上述20000例人进行口腔拭子采样。本研究经过伦理委员会同意，所有研究对象均签署了知情同意书。其中，所述高度近视人群的纳入和排除标准如下：
84.纳入标准：7-18岁高度近视与非高度近视的中小学生及部分父母；
85.排除标准：个人信息缺失或无法匹配的受试者，做过眼部手术或ok镜(角膜塑形镜)矫正的受试者。
86.2、对口腔拭子样本进行遗传物质dna的提取
87.口腔拭子dna提取试剂盒购自于北京贝瑞和康生物技术有限公司福建分公司、货号为浙杭械备20150116号。按照试剂盒说明书记载的步骤进行口腔拭子样本dna的提取，具体提取步骤如下：
88.(1)打开口腔拭子外包装，取出拭子；
89.(2)让受试者张口且保持，将口腔拭子伸入受试者口中；
90.(3)将口腔拭子置于受试者脸颊双边内侧，每边各刮十次，直至采集到足量的口腔内膜细胞；
91.(4)将口腔拭子从受试者口中取出，并置于样品瓶的保存液中，并拧紧样品瓶；
92.(5)轻轻摇匀保存液约10秒钟，确认条形码贴好后，放进回样品袋内封好；
93.(6)经酶裂解处理。在细胞裂解后，利用qiagen dna提取试剂盒从细胞组分中分离和纯化dna；
94.(7)提取dna后，将dna样本低温保存送至贝瑞测序公司进行全外显子组测序，获得高质量个体外显子组序列信息。
95.3、质量控制
96.本实验首先保留了通过了gatk vqsr(变异质量分数重校准)的度量标准，以及位于低复杂区域以外的读段。基因型深度(dp)《10、基因型质量(gq)《20的基因型以及等位基因平衡率》0.8或《0.2的杂合基因型被设置为缺失。本实验还排除了缺失率》1，病例-对照缺失率《0.995的变异位点，以及在基于合并病例对照队列的hardy-weinberg均衡(hwe)检验
中，p值《10-6的变异位点。此外，如果样本的平均召回率低(《0.9)、平均测序深度低(《10)或平均基因型质量低(《65)，则排除样本。最后，排除每个队列中转换/颠换比、杂合/纯合子比或插入/缺失率的异常值(距离平均值》4sd)。
97.x染色体近亲繁殖系数》0.8的样本被归类为雄性，x染色体近亲繁殖系数《0.4的样本被归类为雌性。从数据集中排除《0.8到》0.4之间的样本，这些样本被归类为显示不明确的性别状态。
98.为了缓解因召回率差异造成的混淆，本实验使用了一种基于位点的过滤策略。如果病例百分比与对照组相比的绝对差异超过0.007，则显示有外显子序列位点靶向的个体被排除在分析之外。基于位点的过滤导致2.42％的目标外显子序列碱基被排除在各自的分析之外，以缓解与差异召回率相关的问题。此外，本实验去除了2.36％的目标外显子序列碱基，这些碱基在召回率关联测试中达到了全基因组显著性阈值(p《1
×
10-6
)(fisher精确测试中的双侧p值)。
99.4、变异位点的注释
100.实验采用ensembl的变异效应预测软件(vep v.99)对人类基因组grch37进行变异的注释。本实验将蛋白质编码变体分为以下四类：(1)同义突变；(2)良性的错义突变；(3)破坏性的错义突变；(4)蛋白质截短变异体(ptv)。
101.5、关联性分析
102.实验进行两种类型的单变量关联分析：一种是使用(双侧)mlma、mlma-loco对所有(包括相关)样本进行分析，boltlmm和emmax test以及一项使用(双边)firth logistic回归测试的无关样本分析。firth分析包括遗传祖先(前10个pc)主要成分的协变量。将mlma-loco结果用于关联p值，将firth结果用于估计效应大小。由于遗传漂变引起的群体分化，通过线性回归获得的测试统计数据会偏大，于是校正方法被采用(如“基因组控制”)，从而可以校正被夸大的数据。外显子组广泛关联研究(exwas)首先测试忽略等位基因频率的每个变异和高度近视的关联，实验对编码变体应用了p《4.3
×
10-7
的显著性水平，对同义或非编码变体应用了p《5
×
10-8
的显著性水平。对于maf》0.05的突变位点，大约80％的幂用于检测乘性基因型相对风险为1.23的变异。为了估计magic中的中国人和英国biobank中的欧洲人之间的交叉群体遗传效应相关性，实验使用了popcorn(v1.0)软件，此软件基于汇总数据的方法，用于估计交叉群体遗传相关性。随后，使用带metal软件的反向方差加权固定效应模型对汇总水平的exwas结果进行了荟萃分析。
103.6、基序分析
104.为了检测与重要关联变异体(rs533280354)相关的序列基序，本实验使用homer软件对变异位点上游和下游的200bp区域进行基序分析。
105.7、rs533280354位点的单个g-a变异破坏了fkbp5启动子区域的klf15结合基序，从而降低了其转录性能
106.将野生型(wt)启动子序列和突变型(mut)的5'utr克隆到pgl3-basic荧光素酶载体中，在hek293细胞(人胚肾293细胞)中检测荧光素酶活性，本研究使用小干扰rna(small interfering rna，sirna)敲除klf15，然后检测wt和mt fkbp5启动子的荧光素酶活性，具体实验步骤如下：
107.野生型和突变型fkbp5启动子由华大基因(北京基因组研究所)完全合成，并使用
hindiii限制性位点插入到pgl3基本骨架中。sirna由ribobio合成。如制造商说明中所述，使用lipofectamine rnaimax转染试剂(invitrogen)将靶向klf15 mrna或sinc的sirna双链体转染到hek293细胞中。
108.孵育48小时后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)将pgl3-wt或pgl3-mut与prl-tk共转染到细胞中。
109.再孵育24小时后，使用dual-glo荧光素酶检测试剂盒(promega)测量双荧光素酶活性。
110.t检验用于比较实验组之间的荧光强度。
111.8、实验结果
112.对测序数据进行质控、比对和变异检测，共检测到3386821变异位点(不包括遗传杂合度高的hla区域)。对该队列进行关联分析，找出在高度近视人群和对照人群频率差异大的变异位点，结果见图1，结果显示在高度近视人群和对照人群频率差异大的变异位点包括fkbp5、ripor2、dock9基因上的变异位点。整合本队列与欧洲uk biobank队列中高度近视人群，发现位于fkbp5的snp rs533280354为亚洲人群中特异且贡献最大的位点(在本队列频率为1.68％，在欧洲队列为0)(见图2)。
113.去除位置上强连锁的位点后，选取在发现队列关联分析结果中最显著的位点，进一步研究了fkbp5的5'utr的基因组和染色质特征，其中包括位于fkbp5基因上的snp位点rs533280354，所述高度近视易感患者中的snp位点rs533280354由g突变为a(所述snp位点rs533280354在ncbi中有其详细信息，详见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝rs533280354)，所述突变位点位于基因fkbp5上游5'utr区域。结果见表1。
114.表1 fkbp5基因上的snp rs533280354的详细信息
[0115][0116]
对fkbp5基因进行motif挖掘分析，发现snp rs533280354突变体位于fkbp5基因5'utr中转录因子klf15的结合位点(“cccgccc”)，详见图3。
[0117]
染色质可及性和修饰性分析表明，5'utr区域在atac-seq和h3k27ac chip-seq信号中都有非常强的开放性区域。此外，klf15在fkbp5基因的rs533280354区域有一个显著的结合峰，该基因在视网膜和黄斑中高度表达，详见图4。
[0118]
将野生型(wt)启动子序列和突变型(mut)的5'utr克隆到pgl3-basic荧光素酶载体中，与pgl3-basic相比，结果显示插入的wt启动子序列在hek293细胞中表现出很强的荧光素酶活性，但具有g-a变异的mt启动子显示荧光素酶转录激活显著降低，表明了rs533280354可直接影响klf15与fkbp5启动子区域的结合。为了进一步验证上述结果，本发明使用sirna敲除klf15，然后检测wt和mt fkbp5启动子的荧光素酶活性，实验结果显示，用sirna敲除klf15后，wt启动子减少了40.9％，而mt启动子没有改变(见图5a和图5b)。以上结果和数据强烈表明了fkbp5上的rs533280354位点的单个g-a变异破坏了fkbp5启动子区域
的klf15结合基序，从而降低了fkbp5的转录性能，进而导致fkbp5的表达降低，增加了糖皮质激素受体的敏感性，糖皮质激素的过多摄入诱发高度近视的发生，上述的细胞实验进一步证明了fkbp5基因上的snp位点rs533280354的单个g-a变异是高度近视的致病突变，能够诱导高度近视的发生，也即其能够用于高度近视的筛查诊断中。
[0119]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。