一种新鲜组织保存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物样本保存技术领域，特别地，涉及一种新鲜组织保存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物样本是生命科学研究的基础，其质量在很大程度上决定着研究结果的准确性和可靠性。随着基因组学、转录组学以及蛋白质组学等研究手段的飞速进步，各种分析技术对生物样本的质量也提出了更高的要求。
3.生物样本的保存、运输极大地影响了生物样本的质量。目前生物样本及其提取产物主要有超低温和常温两大类保存方式。
4.一、超低温保存
5.相比甲醛液固定的组织，低温冻存组织中可以提取到更高质量的生物大分子，以满足现代检测技术的需要。但有研究表明，-25℃低温冻存约1年后，组织中的蛋白活性发生了显著下降。相比之下，深低温冻存(-196～-80℃)的保存效果更佳，已成为一种广为接受的生物样本长期保存方式。但深低温保存对冻存液要求高，保存条件苛刻，保存及运输成本高等降低了样本的应用价值和科研转化能力。
6.二、常温保存
7.常温保存技术利用某些特殊技术或容器将脱水干燥后的样本置于密闭环境中，隔绝水、空气、微生物等有害因素；或者向生物样本中添加保护剂，保护剂渗入组织细胞内部，使相关酶失活，从而达到常温环境下保护样本的目的。
8.随着精准治疗时代的到来，单细胞技术将在多个方面发挥它的作用，如人类细胞图谱(human cell atlas，hca)和人类癌症图谱网路(human tumor atlas network，htan)等大规模单细胞测序计划，以及肿瘤、免疫、微生物、神经科学等领域的应用。单细胞测序(single-cell sequencing)是指获取单个细胞遗传信息的测序技术，即对单个细胞水平上，对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析。该技术能够揭示单个细胞独有的基因结构和基因表达状态，包括结构变异、拷贝数变异、rna表达水平等数据，使不同细胞类型得以精确区分，并有助于科学家在但细胞水平进行分子机制的研究。
9.单细胞测序对样本新鲜度要求极高，如果采样后无法立即进行细胞悬液制备，如需要运输，或需要暂存与后续样本同批实验等，就需要对样本进行合适条件的保存/运输，否则可能无法保证样本最原始组织细胞状态，对后续结果产生一定影响。
10.因此，在单细胞测序中，应综合考虑样本类型、经济、空间、时间等各个方面的因素，选择最佳保存方式，保护样本质量，进而保证实验的顺利完成，然而目前仍然缺乏行之有效的保存液以满足实际中的需要。


技术实现要素：

11.为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种新的用于新鲜组织样本的保存液及
保存方法，以实现保持组织样本具有高细胞活性和基因信息的完整，维持组织的空间结构，同时不改变组织细胞基因的表达。
12.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
13.本发明第一方面提供一种新鲜组织保存液，所述新鲜组织保存液中包括离子缓冲液、组织细胞合成代谢营养物质、糖类化合物、抗氧化和抗细胞凋亡剂，其中，所述离子缓冲液中阴离子包括酸根离子和氢氧根离子；所述组织细胞合成代谢营养物质包括氨基酸、核苷和/或核苷酸；所述糖类化合物为单糖、二糖和多糖中的至少一种；所述抗氧化和抗细胞凋亡剂包括维生素、维生素衍生物、谷胱甘肽和/或别嘌呤醇，所述新鲜组合保存液的ph为7.2～7.6。
14.在本发明中，所述离子缓冲液用于维持组织细胞渗透压、缓冲和调节酸碱度。在本发明的一些实施方案中，所述离子缓冲液中阳离子包括钠离子和/或钾离子。在本发明的一些实施方案中，所述酸根离子选自包括碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、甲酸根、乙酸根、高锰酸根、锰酸根、盐酸根、氯酸根、亚氯酸根、草酸氢根、草酸根的组中的至少一种。由此，用于制备所述离子缓冲液的物质包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、甲酸钠、乙酸钠、高锰酸钠、锰酸钠、盐酸钠、氯酸钠、亚氯酸钠、草酸氢钠、草酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、甲酸钾、乙酸钾、高锰酸钾、锰酸钾、盐酸钾、氯酸钾、亚氯酸钾、草酸氢钾和草酸钾。
15.在本发明的一些实施方案中，所述氨基酸选自谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、络氨酸、天冬酰胺、亮氨酸中的至少一种。
16.在本发明的一些实施方案中，所述核苷选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和胸苷中的一种。
17.在本发明中，所述糖类化合物可以是一种单糖、双糖或聚糖，也可以是同种类糖或不同种类糖的混合物，例如为多种单糖的混合物，或者多种双糖的混合物，或者多种多糖的混合物，或者是一种或多种单糖与一种或多种双糖的混合物，或者是一种或者多种单糖与一种或多种多糖的混合物，或者是一种或多种双糖与一种或多种多糖的混合物，或者是一种或多种单糖、一种或多种双糖与一种或多种多糖的混合物。在本发明的一些实施方案中，所述单糖选自包括阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖的组中，所述双糖选自包括有蔗糖、海藻糖、乳糖的组中，所述多糖为葡聚糖和/或淀粉。
18.在本发明的一些实施方案中，所述维生素选自维生素a、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸或烟酰胺)、维生素b6(吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺)、维生素b7(生物素)、维生素b9(叶酸)、维生素b12(钴胺素、羟基钴胺或甲基钴胺)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d(胆利钙素)、维生素e(生育酚或三双键生育酚)和维生素k(叶绿醌)中的至少一种。在本发明的一些优选实施方案中，所述维生素选自核黄素、烟酰胺、维生素c、维生素d、水溶性维生素e叶酸中的至少一种。
19.在本发明的一些优选实施方案中，所述新鲜组织保存液中，所述离子缓冲液中阳离子包括钠离子和钾离子，阴离子包括盐酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子和氢氧根离子；所述组织细胞合成代谢营养物质包括甘氨酸、亮氨酸和腺苷；所述糖类化合物为葡萄糖、淀粉和海藻糖；所述抗氧化和抗细胞凋亡剂包括维生素b9、维生素c和谷胱甘肽。
20.在本发明的一些更优选实施方案中，所述新鲜组织保存液包括氯化钾0.1-0.4g/
l、磷酸氢钠0.1-0.4g/l、磷酸二氢钠0.1-0.4g/l、氢氧化钾0.1-0.4g/l、葡萄糖1.0-4.0g/l、淀粉10.0-40.0g/l、海藻糖10.0-40.0g/l、甘氨酸10-30mg/l、亮氨酸10-30mg/l、腺苷10-30mg/l、谷胱甘肽0.1-1.0mg/l、叶酸0.1-1.0mg/l、维生素c 0.1-1.0mg/l。
21.本发明第二方面提供本发明第一方面任一所述的新鲜组织保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
22.s1，将各物质加入至容器中；
23.s2，用无核酸酶水进行定容；
24.s3，将配制好的溶液的ph调节至7.2～7.6。
25.本发明第三方面提供本发明第一方面任一所述的新鲜组织保存液在保存新鲜组织中的应用。
26.在本发明的一些实施方案中，所述新鲜组织选自包括心、脑、肾、肝、肺、胃、肠、脾、体组织、肿瘤组织的组中的至少一种。
27.本发明的有益效果
28.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
29.(1)本发明的新鲜组织保存液，组分简单，易于制备，原材料易获得，价格低廉，使用效期长。
30.(2)本发明的新鲜组织保存液能够维持组织细胞的活性，同时不改变组织细胞的基因表达及细胞形态，保存后的组织样本无需复苏就能直接用于后续实验。
31.(3)利用本发明的新鲜组织保存液进行生物样本保存，与传统的超低温冻存(-80℃或液氮)不同，可以有效实现人和动物的新鲜组织的低温保存(2-8℃)及运输，极大降低了保存及运输成本。
附图说明
32.图1示出了本发明实施例2中新鲜组织保存液#1～#3和macs tissue storage solution保存组织24小时后rna检测结果，a：新鲜组织保存液#1；b：新鲜组织保存液#2；c：新鲜组织保存液#3；d：新鲜组织保存液#4；e：新鲜组织保存液#5；f：cn111418581a保存液；g：macs tissue storage solution。
33.图2示出了本发明实施例2中新鲜组织保存液#1～#3和macs tissue storage solution保存组织48小时后rna检测结果，a：新鲜组织保存液#1；b：新鲜组织保存液#2；c：新鲜组织保存液#3；d：cn111418581a保存液；e：macs tissue storage solution。
34.图3示出了本发明实施例2中新鲜组织保存液#1～#3和macs tissue storage solution保存组织72小时后rna检测结果，a：新鲜组织保存液#1；b：新鲜组织保存液#2；c：新鲜组织保存液#3；d：macs tissue storage solution。
35.图4示出了本发明实施例2中新鲜组织保存液#1～#3和macs tissue storage solution保存组织72小时后dna检测结果，m：dna marker；a：新鲜组织保存液#1；b：新鲜组织保存液#2；c：新鲜组织保存液#3；d：新鲜组织保存液#4；e：新鲜组织保存液#5；f：cn111418581a保存液；g：macs tissue storage solution。
36.图5示出了本发明实施例3中心、脑、肾、胃、肠、脾组织在新鲜组织保存液#1和macs tissue storage solution中保存24小时后rna检测结果。
37.图6示出了本发明实施例3中心、脑、肾、胃、肠、脾组织在新鲜组织保存液#1和macs tissue storage solution中保存48小时后rna检测结果。
38.图7示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在新鲜组织保存液#1中保存后解离细胞存活率(ao/pi染色)检测结果。
39.图8示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在macs tissue storage solution中保存后解离细胞存活率(ao/pi染色)检测结果。
40.图9示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在新鲜组织保存液#1和macs tissue storage solution中保存72小时后解离细胞ao/pi染色检测结果。
41.图10示出了本发明实施例5中小鼠脾肝组织在新鲜组织保存液#1保存0小时、48小时后组织rna-seq结果。
42.图11示出了本发明实施例5中小鼠脾肝组织在macs tissue storage solution保存0小时、48小时后组织rna-seq结果。
43.图12示出来了本发明实施例6中小鼠心组织在新鲜组织保存液#1中保存48小时后oct包埋切片染色结果。
44.图13示出来了本发明实施例6中小鼠脑组织在新鲜组织保存液#1中保存48小时后oct包埋切片染色结果。
45.图14示出了本发明实施例7中人肺癌、结直肠癌、乳腺癌在新鲜组织保存液#1中保存48h后解离单细胞活率结果。
46.图15示出了本发明实施例7中人肺癌、结直肠癌、乳腺癌在macs tissue storage solution中保存48h后解离单细胞活率结果。
47.图16示出了本发明实施例7中人肺癌、结直肠癌、乳腺癌在新鲜组织保存液#1中保存48h后解离细胞ao/pi染色检测结果。
具体实施方式
48.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
49.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
50.关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
51.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
52.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
53.实施例
54.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
55.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
56.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
57.下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(j.萨姆布鲁克、m.r.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
58.实施例1不同新鲜组织保存液配制
59.按照表1所示分别进行不同新鲜组织保存液的配制
60.表1新鲜组织保存液#1-#5配制表
61.[0062][0063]
进一步地，按照中国发明专利申请cn111418581a公布的配方配制组织保存液。配方如表2所示：
[0064]
表2 cn111418581a保存液配制表
[0065]
序号组分名称浓度
1氢氧化钾5-6g2磷酸二氢钠3-5g3无水硫酸镁0.5-1g4乳糖酸30-40g5棉子糖15-20g6羟乙基淀粉50-60g7腺苷1-2g8别嘌呤醇0.2-0.5g9谷胱甘肽0.5-2g11无核酸酶水补足至1000ml12氢氧化钠、盐酸调节ph值至7.4
[0066]
将上述溶液充分混匀后于2-8℃保存。
[0067]
实施例2小鼠肝脏组织保存后核酸降解评估
[0068]
取c57bl小鼠新鲜肝脏组织，切割成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量0.25g
±
10％的组织块，分别保存于2ml实施例1制备的新鲜组织保存液#1～#5、cn111418581a保存液以及商品化组织保存液macs tissue storage solution中，置于2-8℃冰箱保存，分别于保存24小时、48小时、72小时取组织进行组织样本dna、rna提取。agilent2100生物分析仪进行rna检测，采用琼脂糖凝胶电泳检测组织dna。
[0069]
结果发现，小鼠肝脏组织在新鲜组织保存液#1～#3保存24小时，组织rna均没有发生明显降解，此结果与cn111418581a保存液和macs tissue storage solution相比，保存效果相当，而新鲜组织保存液#4～#5保存24小时后，组织rna均发生了明显降解(如图1所示)，小鼠肝脏组织在新鲜组织保存液#1～#3保存48小时，组织rna仍没有发生明显降解，比较完整，此结果与macs tissue storage solution相比，保存效果相当，而利用cn111418581a保存液保存48小时后，肝脏组织rna发生明显降解(如图2所示),因此不再进行后续保存测试。组织在新鲜组织保存液#1～#3和macs tissue storage solution中保存72小时后，新鲜组织保存液#1中rna降解不明显，而在新鲜组织保存液#2、新鲜组织保存液#3和macs tissue storage solution中，组织rna均发生了明显降解(如图3所示)。琼脂糖凝胶电泳结果均显示小鼠肝脏组织在7种保存液保存72小时后dna均未发生降解(如图4所示)。
[0070]
由上质检结果可知，新鲜组织保存液#1效果优于新鲜组织保存液#2～#5、cn111418581a保存液和macs tissue storage solution，因此以下实施例中均选择新鲜组织保存液#1作为测试保存液，同时利用macs tissue storage solution作为对照。
[0071]
实施例3小鼠其他脏器组织保存后rna完整性测试
[0072]
分别取balb/c小鼠心脏、脑、肾、胃、肠、脾组织，处理成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别保存于2ml新鲜组织保存液#1及macs tissuestoragesolution中，2-8℃保存。分别于24小时、48小时取样进行组织样本rna提取，agilent 2100生物分析仪检测rna完整性。
[0073]
结果显示，心、脑、肾、胃、肠、脾组织在新鲜组织保存液#1中保存24小时、48小时后，组织rna均未发生明显降解，此结果与macstissuestoragesolution保存结果相当(如图
5和图6所示)。
[0074]
实施例4小鼠组织保存后细胞活性检测
[0075]
取balb/c小鼠肝、脑、心、肠组织分别处理成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别保存于2ml新鲜组织保存液#1及macs tissue storage solution中，2-8℃保存。分别于24小时、48小时、72小时取组织进行单细胞解离，并进行ao/pi染色，以荧光细胞计数仪检测细胞存活率。
[0076]
结果如图7和图8所示，24小时内，新鲜组织保存液#1及macs tissuestoragesolution保存的小鼠肝、脑、心、肠组织的活性都高于90％，保持了非常高的细胞活性；48小时内，新鲜组织保存液#1及macs tissuestoragesolution保存的小鼠肝、脑、心、肠组织的活性都高于80％，保持了较高的细胞活性，满足单细胞转录组测序要求。但各类型组织保存72小时后，新鲜组织保存液#1保存效果明显优于macs tissuestoragesolution(图7、图8和图9)。
[0077]
实施例5 rna-seq检测小鼠新鲜组织保存后的基因表达
[0078]
取balb/c小鼠肝、肠组织分别处理成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别保存于2ml新鲜组织保存液#1及macs tissue storage solution中，2-8℃保存。分别于0小时、48小时取组织进行rna提取，使用rna-seq检测组织保存过程中的基因表达是否与新鲜组织有明显差异。
[0079]
结果如图10和图11所示，新鲜组织保存液#1保存的小鼠肝、肠组织经保存48小时后，基因表达没有显著的改变，与原始新鲜样本保持一致。同时与macs tissuestoragesolution相比，经新鲜组织保存液#1保存的组织能够更好地保持组织细胞的基因表达的一致性，可进行后续单细胞测序和空间转录组测序实验。
[0080]
实施例6小鼠组织保存后的组织细胞形态检测
[0081]
取balb/c小鼠脑、心组织分别处理成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别保存于2ml新鲜组织保存液#1中，2-8℃保存。于48小时取组织进行oct包埋，切片，he染色，使用数字病理切片扫描仪对组织进行切片扫描观察组织细胞形态。
[0082]
结果如图12和图13所示，脑、心组织经48小时保存后，组织形态完整，无病理性损伤。
[0083]
实施例7人临床组织保存
[0084]
取人新鲜临床结直肠手术、乳腺癌手术、肺癌手术样本处理成体积不大于1cm
×
1cm
×
1cm，重量偏差不大于10％的组织块，保存于2ml新鲜组织保存液#1和macs tissuestoragesolution，2-8℃保存。48小时取组织进行单细胞解离，并进行ao/pi染色，以荧光细胞计数仪检测细胞存活率。
[0085]
结果如图14、图15和图16所示，人结直肠、乳腺癌、肺癌组织经新鲜组织保存液#1保存48小时后，组织细胞存活率均高于80％，表明新鲜组织保存液#1保存人临床组织样本能在48小时内很好的维持组织细胞活性。
[0086]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。