一种2的制作方法

一种2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺
技术领域
1.本发明属于化学合成领域，更具体地说，涉及2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺。


背景技术：

2.基因疗法是当今最前沿的技术之一，在治疗肿瘤、遗传性疾病、代谢疾病，预防性传染病等方面不断取得突破性进展。其中，小核酸药物是目前发展最为迅猛的基因疗法之一，正在成为新药研发第三次浪潮中的佼佼者。未来，随着小核酸药物的应用领域和技术领域不断突破创新，技术的更新将有助于小核酸药物的发展，市场需求和市场规模将持续扩大。
3.反义寡核苷酸（asos）是一类新兴的小核酸药物，具有高选择性和亲和力特性。近年，随着基因组创药的发展，反义寡核苷酸药物被急速开发，随着第二代反义寡核苷酸药物的深入研究，人们发现在核苷酸中引入2
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o-烷基核苷，可增强与rna的亲和力，增强寡核苷酸对核酸内切与外切酶的抗性，这其中又以2
’‑
o-甲氧乙基的效果比较优越。因此，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷在医药领域具有重要的市场前景。
4.迄今为止，制备2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的方法主要有以下几种方法。
5.1．us20080234475 a1中公开的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备方法，其反应方程式如下：。
6.该方法中第一步使用三(2-甲氧基乙基)硼酸酯作为烷基化试剂，该反应对含水要求非常高，并且为高温反应。第二步使用雷尼镍脱硫，对生产设备要求比较高，对生产安全和环境保护方面来说存在很大的问题。另外，该方法中所用的原料供应商较少，且价格昂贵，不利于工业化生产。
7.2. wo2003087053 a2中公开的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备方法，其反应方程式如下：。
8.该方法中第一步使用mdpscl2作为保护基，同时保护3’与5’位的羟基，第二步利用
2-溴乙基甲基醚作为烷基化试剂，在nahmds、tbai存在下反应，第三步利用四丁基氟化铵脱保护。该方法的缺点是：mdpscl2保护基尚未工业化，价格昂贵，故无法商业化运用。并且纯化最终产物时四丁基氟化铵难以完全去除。
9.3.
ꢀ“
process research on the preparation of dmt protected 2'-o-methoxyethylguanosine for oligonucleotide synthesis in therapeutic applications”, shabbir ali s. taj, et al., nucleosides, nucleotides and nucleic acids, 27(9):1024
–
1033, 2008公开了2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备方法，其反应方程式如下：。
10.该方法中第一步中利用2-氨基腺苷为起始原料在koh存在下与2-溴乙基甲基醚反应生成中间产物，第二步中，中间产物使用腺苷脱氨酶，在磷酸钠缓冲液中反应生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。该方法的缺点是：第二步的条件比较苛刻，且原料价格比较昂贵，不利于工业化大规模生产。
11.另外，上面提到的现有技术“process research on the preparation of dmt protected 2'-o-methoxyethylguanosine for oligonucleotide synthesis in therapeutic applications”, shabbir ali s. taj, et al., nucleosides, nucleotides and nucleic acids, 27(9):1024
–
1033, 2008中还提到直接烷基化鸟苷是不可取的，因为直接烷基化导致大部分产物为碱基部分烷基化（o6烷基化）产物，该是副产物，因此该文献舍弃了使用鸟苷作为起始原料通过直接烷基化其上的2'-o，合成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
12.因此，本领域迫切需要一种适合工业化生产，对设备要求不高，原料易得，并且能够得到高纯度的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备方法。


技术实现要素：

13.为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺，该合成工艺以鸟苷为原料经一步反应制备得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷，原料便宜易得、生产效率高，工艺简单、易于放大生产、对设备要求也不高。为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：式ii所示2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺，该合成工艺包括步骤(i)：将式i所示鸟苷与烷基化试剂，在反应溶剂中，在碱存在下，反应生成式ii所示2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷，其反应方程式如下：
。
14.优选地，步骤(i)中式i所示鸟苷与所述烷基化试剂的摩尔比为1：1~1：10，更优选1：1~1：2，最优选1~1：1.5。
15.优选地，步骤(i)中式i所示鸟苷与所述碱的摩尔比为1：1~1：10，更优选1：1~1：4，最优选1~1：3。
16.优选地，步骤(i)中反应溶剂与式i所示鸟苷的体积摩尔比为5~50l/mol，更优选15~25l/mol。
17.优选地，步骤(i)中反应温度为10~100℃。
18.优选地，上述烷基化试剂选自2-氯乙基甲基醚、2-溴乙基甲基醚、2-碘乙基甲基醚、甲磺酸2-甲氧基乙酯、对甲苯磺酸2-甲氧基乙酯或对氯苯磺酸2-甲氧基乙酯。
19.优选地，当所述烷基化试剂选自2-氯乙基甲基醚或2-溴乙基甲基醚时，反应体系还包括碘催化剂。
20.优选地，所述碘催化剂选自碘化钾、碘化钠和四丁基碘化铵中的一种或多种。
21.优选地，上述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢化钠、丁基锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾和双（三甲基硅基）氨基钠中的一种或多种。
22.优选地，上述反应溶剂选自二甲亚砜，n，n-二甲基甲酰胺，n，n-二甲基乙酰胺和n-甲基吡咯烷酮中的一种或多种的组合，更优选二甲亚砜。
23.优选地，步骤(i)还包括反应完成后，对反应液进行处理，处理反应液包括：将反应液降温至5~40℃，加入不良溶剂，搅拌0.5~2小时，过滤或离心得2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷粗品。
24.优选地，上述不良溶剂选自乙腈、丙腈、丁腈、二氯甲烷、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种，更优选乙腈。
25.优选地，上述不良溶剂与式i所示鸟苷的体积摩尔比为30~300l/mol，更优选50~150l/mol。
附图说明
26.图1为实施例1得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
27.图2为实施例1得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hnmr图谱。
28.图3为实施例2得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
29.图4为实施例3得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
30.图5为实施例4得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
31.图6为实施例5得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
32.图7为实施例6得到的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的hplc图谱。
具体实施方式
33.针对现有技术中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备方法存在的缺陷，本技术发明人经过深入的研究，发现以鸟苷为原料，直接进行2'-o的烷基化可制得目标产物，该方法原料易得，工艺简单，适合工业大规模生产。在此基础上完成了本发明。
34.本发明中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：将鸟苷与烷基化试剂，在反应溶剂中，在碱存在下，反应生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷，其反应方程式如下：。
35.本发明的合成方法中，烷基化试剂的用量可为本领域进行此类反应的常规用量，优选地，式i所示鸟苷与烷基化试剂的摩尔比为1：1~1：10，更优选为1：1~1：2。碱的用量可为本领域进行此类反应的常规用量，优选地，式i所示鸟苷与碱的摩尔比为1：1~1：10，更优选为1：1~1：3。反应溶剂的用量为在反应温度下能够使反应原料完全溶解，优选反应溶剂与式i所示鸟苷的体积摩尔比为5~50l/mol。
36.本发明的合成工艺中，烷基化试剂包括但不局限于2-氯乙基甲基醚、2-溴乙基甲基醚、2-碘乙基甲基醚、甲磺酸2-甲氧基乙酯、对甲苯磺酸2-甲氧基乙酯或对氯苯磺酸2-甲氧基乙酯。碱包括但不局限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢化钠、丁基锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾或双（三甲基硅基）氨基钠。反应溶剂包括但不局限于二甲亚砜，n，n-二甲基甲酰胺，n，n-二甲基乙酰胺或n-甲基吡咯烷酮。
37.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试剂，其选自2-溴乙基甲基醚，碱，其选自双（三甲基硅基）氨基钠，碘催化剂，其选自四丁基碘化铵，和溶剂，其选自dmf。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与2-溴乙基甲基醚在反应溶剂中，在双（三甲基硅基）氨基钠和四丁基碘化铵存在下，10~40℃，更优选15~35℃，反应5-7小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
38.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试剂，其选自2-溴乙基甲基醚，碱，其选自氢氧化钾，碘催化剂，其选自碘化钾，和溶剂，其选自dmso。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与2-溴乙基甲基醚在反应溶剂中，在氢氧化钾和碘化钾存在下，40~80℃，更优选50~70℃，反应2-4小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
39.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试，其剂选自2-氯乙基甲基醚，碱，其选自氢氧化钾，碘催化剂，其选自碘化钾，和溶剂，其选自dmso。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与2-氯乙基甲基醚在反应溶剂中，在氢氧化钾和碘化钾存在下，50~80℃，更优选60~70℃，反应15-24小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
40.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试剂，其选自2-碘乙基甲基醚，碱，其选自氢氧化钠，和溶剂，其选自dmso。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与2-碘乙基甲基醚在反应溶剂中，在氢氧化钾和碘化钠存在下，10~40℃，更优选15~25℃，反应15-24小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
41.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试剂，其选自甲磺酸-2-甲氧基乙酯，碱，其选自叔丁醇钠，和溶剂，其选自dmso。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与甲磺酸-2-甲氧基乙酯在反应溶剂中，在叔丁醇钠存在下，10~40℃，更优选15~25℃，反应15-24小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
42.在本发明的一个具体实施例中，步骤（i）的反应体系包括：鸟苷，烷基化试剂，其选自甲苯磺酸-2-甲氧基乙酯，碱，其选自双（三甲基硅基）氨基钠，和溶剂，其选自dmf。在本发明的一个具体实施方式中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺包括步骤（i）：使鸟苷与甲苯磺酸-2-甲氧基乙酯在反应溶剂中，在双（三甲基硅基）氨基钠存在下，10~40℃，更优选15~25℃，反应15-24小时，生成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷。
43.本发明的合成方法中，反应是否完成可以通过本领域常用的方法监测，例如，tlc、hplc或nmr。以原料鸟苷消失时作为反应终点。
44.本发明的合成方法中，反应温度取决于进行烷基化所用反应试剂的性质。反应温度为10~100℃。
45.本发明的合成方法中，步骤(i)还包括反应完成后，对反应液进行处理，处理反应液包括：将反应液降温5~40℃，更优选15~35℃，加入不良溶剂，搅拌0.5~2小时，过滤或离心得2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷粗品。不良溶剂包括但不局限于乙腈、丙腈、丁腈、二氯甲烷、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、丙酮或乙酸乙酯，更优选乙腈。不良溶剂的用量为能够使得产物充分地从反应溶剂中析出，优选不良溶剂与式i所示鸟苷的体积摩尔比为30~300l/mol，更优选为50~150l/mol。
46.本发明中，2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷粗品可利用本领域常用的方法进行纯化，例如色谱柱纯化，优选利用反相柱进行纯化，洗脱条件为：流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%保持30分钟，得到产品。
47.本发明的合成工艺中，整个体系反应过程为非均相体系。
48.本发明的描述中，“多种”指两种或两种以上。
49.本发明中，所用试剂，例如鸟苷、烷基化试剂、碱、碘催化剂等，如未特殊说明，均市售可得。
50.本发明的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺，以鸟苷为原料一步反应合成2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷，整个工艺过程简便，效率高、易于放大生产、对设备要求不高、且原料便宜易得，避免了使用价格昂贵的保护基，酶以及重金属。
51.本发明的2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的合成工艺的最终产物收率达到35%，与现有技术接近（nucleosides, nucleotides & nucleic acids (2003), 22(5-8), 1327-1330报道2'-o-(2-甲氧乙基)报道鸟苷的收率为40%）。
52.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。具体实施例是在以本发明技术方案为
前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和操作过程。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。除非另有说明，比例和百分数按重量计。
53.下列实施例中进行hplc检测所用仪器的厂家为waters，型号为uplc hclass。进行hnmr检测所用仪器的厂家布鲁克，型号为avancelll300。进行纯化的中压色谱厂家为橙达，型号为1802。
54.实施例12'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备氮气保护，取鸟苷20.0 g于15~30℃溶解于200 ml的dmf中，加入四丁基碘化铵3.8 g和2-溴乙基甲基醚17.0 g ，降温至0~10℃，滴加1.0m双（三甲基硅基）氨基钠106ml，滴毕，回温至15~30℃，保温（15~30℃）搅拌6小时，加入2000 ml乙酸乙酯，保温（15~30℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
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o-甲氧乙基鸟苷粗品14.3 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟洗脱产品），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷6.8 g，收率28.1%，hplc纯度98.6%。产物的hplc图谱如图1所示，其中0.8分钟为产物峰。产物的hnmr图谱如图2所示，1h 核磁共振波谱归属见表1。
55.产物结构式如下式ii所示：。
56.实施例2
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2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备取鸟苷10.0 g于15~30℃溶解于200 ml的dmso中，加入氢氧化钾10.0 g和碘化钾6.0 g，升温至50~70℃，加入2-溴乙基甲基醚15.0 g，保温（50~70℃）搅拌3小时，降温至15~30℃，加入1000 ml二氯甲烷，保温（15~30℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
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o-甲氧乙基鸟苷粗品8.1 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟洗脱产品），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷3.8 g，收率31.6%, hplc纯度98.3%。产物的hplc图谱如图3所示，其中0.8分钟为产物峰。
57.实施例32'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备取鸟苷100.0 g于15~30℃溶解于1000 ml的dmso中，加入氢氧化钾79.0 g和碘化钾58.0 g，升温至60~70℃，加入2-氯乙基甲基醚67.1 g，保温（60~70℃）搅拌19小时，降温至15~30℃，加入15000 ml乙腈，保温（15~30℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
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o-甲氧乙基鸟苷粗品93.0 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟洗脱产品），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷42.4 g，收率35.2%，hplc纯度98.3%。产物的hplc图谱如图4所示，其中0.8分钟为产物峰。
58.实施例4 2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备取鸟苷20.0 g于15~30℃溶解于200 ml的dmso中，加入氢氧化钠11.3 g，控温15~25℃，加入2-碘乙基甲基醚26.4 g，保温（15~25℃）搅拌19小时，加入3000 ml四氢呋喃，保温（15~25℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
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o-甲氧乙基鸟苷粗品19.0 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷7.4 g，收率30.6%，hplc纯度97.2%。产物的hplc图谱如图5所示，其中0.8分钟为产物峰。
59.实施例5 2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备取鸟苷10.0 g于15~30℃溶解于200 ml的dmso中，加入叔丁醇钠9.7 g，控温15~25℃，加入甲磺酸-2-甲氧基乙酯12.0 g，保温（15~25℃）搅拌19小时，加入1000 ml甲基叔丁基醚，保温（15~25℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
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o-甲氧乙基鸟苷粗品10.5 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷3.6 g，收率30.1%，hplc纯度97.6%。产物的hplc图谱如图6所示，其中0.8分钟为产物峰。
60.实施例62'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷的制备取鸟苷50.0 g于15~30℃溶解于1000 ml的dmf中，降温0~10℃，滴加1m双（三甲基硅基）氨基钠四氢呋喃溶液264ml，加入对甲苯磺酸2-甲氧基乙酯81.7 g，回温至15~30℃，保温（15~30℃）搅拌19小时，加入8000 ml丙酮，保温（15~30℃）搅拌1小时，过滤，滤饼于50℃真空干燥后得到2
’‑
o-甲氧乙基鸟苷粗品51.0 g，反相柱纯化（流动相为乙腈和水，其中按体积计，乙腈5%，水95%，保持30分钟），得到2'-o-(2-甲氧乙基)鸟苷19.6 g，收率32.6%，hplc纯度98.2%。产物的hplc图谱如图7所示，其中0.8分钟为产物峰。
61.以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。