一种harzianicacid高产木霉菌株的构建方法

一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法。


背景技术：

2.harzianic acid及其衍生物是一类具有多种功能活性的木霉菌次生代谢产物，不仅能够强烈抑制多种植物病原真菌如立枯丝核菌、核盘菌、尖孢镰刀菌等的生长，也能够促进番茄、大豆、油菜和草莓等多种农作物的生长，提高其产量并改善果实营养成分。此外，harzianic acid还具有络合重金属离子(镉、铅、镍、钴等)的能力，能够提高植物在重金属污染土壤中的耐受性。因此，harzianic acid 在农业生产实践中具有重要的应用价值。然而，木霉菌次生代谢产物生物合成基因簇多处于沉默或低表达状态，目前野生状态下未发现其高产菌株，这极大地限制了harzianic acid的规模化生产和进一步应用。
3.本发明通过基因克隆了具有激活harianic acid生物合成功能的转录因子编码基因(命名为haci)，并利用其构建了在短时间液体发酵条件下(pdb、25℃、 170rpm、4天)能够大量合成harzianic acid的木霉菌株oehaci，为高产harzianicacid工程菌株的构建提供了一种新的思路和方法。


技术实现要素：

4.针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法；本发明的第二个目的是提供前述构建方法构建得到的基因工程菌。本发明利用组成型启动子ptef1，定点激活转录因子编码基因haci的超表达，大幅提高harzianic acid生物合成基因簇整体转录水平，从而获得高产 harzianic acid的木霉工程菌株
5.本发明具体通过以下技术方案实现：
6.一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，包括以下步骤：
7.(1)以野生型木霉菌株基因组dna为模板进行pcr扩增，获取haci编码序列上游片段和haci编码区部分片段，分别命名为uf和df；
8.(2)以质粒puc19-hph-ptef1为模板进行pcr扩增，获取包含潮霉素b磷酸转移酶元件hph和里氏木霉qm6a中tef1基因启动子序列的片段ptef1，命名为 hph-ptef1；
9.(3)利用重叠pcr方法将上述3个片段按以下顺序连接，uf、hph-ptef1、df,获得超表达元件，命名为uf-hph-ptef1-df；
10.(4)将步骤(3)中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素b筛选、pcr 验证和hplc检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株oehaci。
11.进一步的，所述的出发菌株野生型木霉菌株为沈氏木霉(trichoderma shenii) njau4742，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.19936，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
12.进一步的，步骤(1)中haci的序列如seq id no：1所示。
13.更进一步的，步骤(1)中uf序列如seq id no：2所示。
14.更进一步的，步骤(1)中的df序列如seq id no：3所示
15.进一步的，步骤(3)中超表达元件的序列如seq id no：4所示。
16.进一步的，步骤(4)中的转化方法为聚乙二醇(peg)介导的原生质体转化方法。
17.本发明还保护前述构建方法构建的基因工程菌。
18.有益效果
19.本发明所提供的方法能够有效地构建harzianic acid高产木霉菌株，依据此方法所构建的oehaci菌株在发酵4天即可在常规培养基pdb中摇瓶产生大量 harzianic acid(野生型菌株在此条件下无法合成该物质)，从而为规模化生产 harzianic acid提供有效开发技术和相应工程生产菌，提高该多功能活性天然产物在农业实践中的可能性。
附图说明
20.图1是harzianic acid及其衍生物化学结构式；
21.图2是定点插入超表达元件的阳性菌株的pcr验证结果；m为dl5000 dna marker；1、2是以njau4742野生型菌丝为模板的扩增片段，3、4是以为oehaci 菌丝为模板的扩增片段；
22.图3是oehaci菌株和野生型菌株发酵产物hplc检测结果；方框为harzianicacid及其衍生物。
具体实施方式
23.以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
24.本发明的出发菌株njau4742的分类命名为沈氏木霉(trichoderma shenii)，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.19936。
25.实施例1：haci基因超表达元件的构建
26.(1)超表达元件各片段的pcr扩增
27.使用如下引物：
28.uf-f:5
’‑
gttcgaatcatgcactgcc-3’；
29.uf-r:5
’‑
tctcggatccttcttgtaataccacggctgg-3’；
30.df-f:5
’‑
acaaaccgtcatggaacctcggggcgccttta-3’；
31.df-r:5
’‑
cattcggtccaggtgcttgt-3’；
32.hph-ptef1-f:5
’‑
attacaagaaggatccgagagctaccttac-3’；
33.hph-ptef1-r:5
’‑
gaggttccatgacggtttgtgtgatgtagc-3’；
34.其中，uf-f和uf-r扩增haci编码区上游片段，df-f和df-r扩增haci编码区部分片段，hph-ptef1-f和hph-ptef1-r扩增潮霉素b磷酸转移酶元件hph和里氏木霉(trichoderma reesei qm6a)中tef1基因启动子序列的片段ptef1。
35.pcr扩增体系如下：
[0036][0037][0038]
其中，njau4742基因组dna用于扩增uf和df片段的模板，质粒 puc19-hph-ptef1用于扩增hph-ptef1片段的模板。
[0039]
pcr反应条件如下：
[0040]
a.95℃预变性3min；
[0041]
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s或1min30s，进行30个循环；
[0042]
c.72℃延伸5min；
[0043]
d.10℃5min；
[0044]
其中，扩增uf和df片段时b步骤中延伸时间为40s，扩增hph-ptef1片段时b步骤中延伸时间为1min30s。
[0045]
所获得的3个片段分别经琼脂糖凝胶检测确认，并采用诺唯赞公司的 fastpure gel dna extraction mini kit进行纯化后，-20℃保存备用。
[0046]
(2)重叠pcr法获得超表达元件
[0047]
该方法分为两步，具体如下：
[0048]
第一步pcr不添加引物，扩增体系如下：
[0049]2×
phanta max master mix10μluf片段(100ng μl-1)1μldf片段(100ng μl-1)1μlhph-ptef1片段(100ng μl-1)2μl无菌双蒸水6μl
[0050]
第一步pcr反应条件如下：
[0051]
a.95℃预变性3min；
[0052]
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min30s，进行15个循环；
[0053]
c.72℃延伸5min；
[0054]
d.10℃ 5min；
[0055]
第二步pcr所用引物为uf-f和df-r，扩增体系如下：
[0056]
[0057][0058]
第二步pcr反应条件如下：
[0059]
a.95℃预变性3min；
[0060]
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min30s，进行30个循环；
[0061]
c.72℃延伸5min；
[0062]
d.10℃ 5min；
[0063]
pcr产物经琼脂糖凝胶检测确认，并采用诺唯赞公司的fastpure gel dnaextraction mini kit进行纯化后，获得haci基因超表达元件，分装为500ngμl-1 并置于-20℃保存备用。
[0064]
实施例2：oehaci菌株的构建
[0065]
(1)njau4742原生质体的制备
[0066]
按每个平板100μl将新鲜的njau4742孢子悬液均匀涂布于贴有玻璃纸的 pda培养基上，28℃黑暗培养10h后收集刚萌发的孢子，置于含有20ml的溶液 a(1.2m山梨醇、0.1m磷酸二氢钾、0.15g lysing enzyme from trichodermaharzianum[sigma,l1412]、ph＝5.6)的离心管中，28℃、100rpm黑暗条件下培养2h。裂解完成后，于4℃、3000rcf离心10min，弃去裂解液并使用5ml 4℃预冷的溶液b(1m山梨醇、50mm氯化钙、10mm tris-hcl、ph＝7.5)进行重悬。重悬完成后，再次经4℃、3000rcf离心并弃去重悬液，加入1ml预冷的溶液b。随后取样进行镜检并稀释，分装至每份5
×
107个原生质体，-80℃保存备用。
[0067]
(2)peg介导的原生质体转化
[0068]
在无菌离心管中依次加入以下成分：
[0069]
njau4742原生质体200μlpeg溶液50μlhaci超表达元件10μl
[0070]
其中peg溶液配方为25％peg6000、50mm氯化钙、10mm tris-hcl、ph＝ 7.5；
[0071]
将反应液混匀，冰浴20min，随后加入2ml peg溶液并混匀，室温放置5min。最后加入3ml溶液b并混匀，涂布于含有1m蔗糖、100μg ml-1
的pda平板上， 28℃培养3天。待菌落形成后，将每个菌落转接至新的含有100μg ml-1
的pda 平板继续培养3天待验证。
[0072]
(3)定点插入突变株的pcr鉴定
[0073]
取0.5mm2大小区域的菌丝，采用phire plant direct master mix(thermo scientific)试剂盒进行pcr验证，验证引物如下：
[0074]
正向引物:5
’‑
tcacccagccaatgcctaa-3’；
[0075]
反向引物:5
’‑
agtgctcttccaactaccgc-3’；
[0076]
pcr扩增体系如下：
[0077]2×
phanta max master mix25μl正向引物(10μm)2μl反向引物(10μm)2μl
模板(50ngμl-1)1μl无菌双蒸水20μl
[0078]
其中，模板为试剂盒中菌丝裂解液(详情参考phire plant direct master mix 说明书)；
[0079]
pcr反应条件如下：
[0080]
a.95℃预变性3min；
[0081]
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，进行30个循环；
[0082]
c.72℃延伸5min；
[0083]
d.10℃ 5min；
[0084]
经琼脂糖凝胶电泳确认片段大小正确的pcr产物送至南京擎科生物科技有限公司(tsingke)进行dna测序。测序结果确认正确的菌株经3轮单孢分离纯化并验证后，获得遗传稳定的oehaci菌株(图2)。
[0085]
实施例3：高效液相色谱(hplc)法检测harzianic acid的合成
[0086]
(1)液体发酵条件
[0087]
将njau4742野生型和oehaci菌株孢子液分别接种至pdb培养基(bddifco)中，接种浓度为1
×
105ml-1
，于25℃、170rpm条件下液体发酵4天。发酵结束后，通过8层无菌纱布将真菌菌体去除，将发酵液保存至-80℃备用。
[0088]
(2)hplc检测样本制备
[0089]
取20ml(1)中发酵液，加入20ml乙酸乙酯，经12000rcf离心10min，吸取上层乙酸乙酯有机相至新的离心管，重复2次。随后，利用旋转蒸发仪将有机相蒸干，加入2ml hplc级甲醇充分溶解，获得检测样本。
[0090]
(3)hplc检测条件
[0091]
hplc仪器为agilent technologies 1260infinity ii(美国)；液相分析柱为 poroshell 120ec-c18 4μm(4.6
×
150mm)；流动相a为乙腈，流动相b为超纯水 0.1％甲酸；流速为0.8ml min-1；线性梯度洗脱条件为0-18min从10％流动相a至100％的流动相a；检测波长360nm；柱温30℃。
[0092]
结果显示，njau4742野生型无法在该条件下合成harzianic acid，而oehaci 菌株能够产生大量harzianic acid及其衍生物(图3)。
[0093]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。