利用乳酸抑制阴道有害菌并保护乳杆菌的调节阴道微生态的组合物及护理方法与流程

1.本发明涉及调节阴道微生态的组合物及护理方法。


背景技术：

2.阴道炎是广大女性易患的最常见的妇科疾病，其中常见的细菌性阴道炎具有易感染、治疗周期长、易复发等特点。众所周知，阴道里最多的微生物是乳杆菌，它占到阴道菌群总量的80-90％，数量可达8000万个/毫升，其功能主要是保护阴道不受外来菌的侵袭，维持阴道里的弱酸环境，分泌抗菌物质，是阴道的“健康卫士”，医学上常以阴道分泌物中乳杆菌的数量来确定阴道的清洁度及判断阴道自洁功能的好坏。
3.女性护理液通常用来对女性的私密部位进行清洁、护理、消除不良气味、或者抑制或杀灭阴部的致病微生物等等。通过使用女性护理液来维持正常阴道微生态菌群，尤其是在维持乳杆菌优势地位下抑制阴道有害菌，对预防阴道炎具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种调节阴道微生态的组合物。本发明的目的还在于，提供调节阴道微生态的护理方法。
5.本发明可通过如下技术方案实现。
6.方案1.一种调节阴道微生态的组合物，其包含乳酸0.5-2％(w/w)和癸基葡糖苷5-40％(w/w)，且ph值为4.0-4.5，所述组合物为外用洗液的形式。
7.方案2.根据方案1所述的调节阴道微生态的组合物，其中，乳酸含量为0.5-1％(w/w)。
8.方案3.根据方案1或2所述的调节阴道微生态的组合物，其中，ph值为4.0-4.2。
9.方案4.根据方案1至3中任一项所述的调节阴道微生态的组合物，其中，乳酸含量为1％(w/w)，且ph值为4.2。
10.方案5.根据方案1至4中任一项所述的调节阴道微生态的组合物，其中，所述乳酸为选自l-乳酸和dl-乳酸中的一种或多种。
11.方案6.根据方案5所述的调节阴道微生态的组合物，其中，所述乳酸为dl-乳酸。
12.方案7.根据方案1至6中任一项所述的调节阴道微生态的组合物，其中，癸基葡糖苷含量为20-40％(w/w)。
13.方案8.根据方案1至7中任一项所述的调节阴道微生态的组合物，其还包含选自另外的表面活性剂、保湿剂、增稠剂、皮肤调理剂、螯合剂和溶剂中的一种或多种。
14.方案9.根据方案1至8中任一项所述的调节阴道微生态的组合物，其还包含甘油1-20％(w/w)、黄原胶0.1-2％(w/w)、海藻糖0.1-2％(w/w)、苯甲酸钠0.1-2％(w/w)、泛醇0.01-2％(w/w)、edta二钠0.001-1％(w/w)、以及余量的水。
15.方案10.一种调节阴道微生态的护理方法，包括将根据方案1至9中任一项所述的
调节阴道微生态的组合物施用于阴道。
16.方案11.根据方案10所述的护理方法，其中，所述组合物的用量为1-2ml。
17.方案12.根据方案10所述的护理方法，其中，所述组合物以稀释的形式施用。
18.本发明人经过细致的研究发现，在本发明的一些实施方式中，通过含有特定量的乳酸、配合癸基葡糖苷使ph为特定范围的调节阴道微生态的组合物，以外用洗液的形式，作为女性护理液，能够在抑制阴道有害菌的同时维持乳杆菌的优势地位，由此有助于维持正常的阴道微生态菌群平衡。
附图说明
19.图1是显示不同ph条件下卷曲乳杆菌生长情况的图。
20.图2a和2b是显示不同乳酸含量条件下卷曲乳杆菌生长情况的图。
21.图3a和3b是显示不同乳酸含量对av、bv相关菌株生长的影响的图。
22.图4a和4b是显示不同乳酸含量对vvc相关菌株生长的影响的图。
23.图5a是显示卷曲乳杆菌与本发明的组合物接触的10-4
稀释梯度平板涂布结果的图。
24.图5b是显示卷曲乳杆菌与本发明的组合物接触0到120分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
25.图6a是显示大肠埃希氏菌与本发明的组合物接触的10-2
稀释梯度平板涂布结果的图。
26.图6b是显示大肠埃希氏菌与本发明的组合物接触0到10分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
27.图7a是显示无乳链球菌与本发明的组合物接触的10-2
稀释梯度平板涂布结果的图。
28.图7b是显示无乳链球菌与本发明的组合物接触0到10分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
29.图8a是显示金黄色葡萄球菌与本发明的组合物接触的10-2
稀释梯度平板涂布结果的图。
30.图8b是显示金黄色葡萄球菌与本发明的组合物接触0到120分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
31.图9a是显示阴道加德纳菌与本发明的组合物接触的10-2
稀释梯度平板涂布结果的图。
32.图9b是显示阴道加德纳菌与本发明的组合物接触0到10分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
33.图10a是显示白假丝酵母菌与本发明的组合物接触的10-2
稀释梯度平板涂布结果的图。
34.图10b是显示白假丝酵母菌与本发明的组合物接触0到120分钟后平板上菌落形成的个数的数据统计图。
35.图11a-11e是显示本发明的组合物在浓度梯度稀释至10％、20％、30％、40％、50％，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母的生长抑
制作用的图。
36.图12是显示本发明的组合物在不同含量时对不同面积卫生巾渗透能力的影响的图。
37.图13是显示不同女性护理产品对卷曲乳杆菌的接触抗菌效果的图。
具体实施方式
38.除非上下文中有相反说明，否则本文中的术语具有如下含义。
39.术语“具有”、“包含”和“包括”应解释为开放式的，表明存在所列举的要素但不排除未列举的任何其他一个或多个要素的存在、出现或添加。
40.本文叙述的所有范围包括列举两个值之间的范围的那些端点，除非另有相反说明。不管是否指出，本文所列举的所有值包括用于测量该值的给定技术的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
41.术语“约”在限定数值时，表示所规定数值的
±
5％。
42.百分数“％”，除另有说明外，表示重量/重量(w/w)的百分数。
43.在一方面，本发明提供了调节阴道微生态的组合物。
44.在一些实施方式中，调节阴道微生态的组合物中，乳酸的含量(w/w)可以为约0.5-2％，诸如为约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％，优选为约0.5-1％，更优选为约1％。在一些实施方式中，调节阴道微生态的组合物的ph值可以为约4.0-4.5，诸如为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5，优选为约4.0-4.4，更优选为约4.0-4.2，特别为约4.2。通过将乳酸含量和ph控制在特定范围，可以使乳杆菌，特别是卷曲乳杆菌，不受到显著抑制，同时还能对阴道微生态av、bv等微生物发挥抑菌功效。
45.一方面，通过针对乳酸对阴道微生态需氧菌性阴道炎(av)、细菌性阴道病(bv)及外阴阴道假丝酵母菌病(vvc)相关菌种生长抑制作用进行研究，本发明人发现，关于av、bv相关菌种，0.1％(w/w)及以上的乳酸可对av、bv相关菌种诸如大肠埃希氏菌(e.coli)、粪肠球菌(e.faecalis)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、阴道加德纳菌(g.vaginalis)和无乳链球菌(s.agalactiae)生长具有抑制作用。更特别地，0.5％(w/w)及以上的乳酸可显著抑制上述菌群的生长。关于vvc相关菌种，0.1％(w/w)及以上的乳酸可对vvc相关菌种诸如白假丝酵母菌(c.albicans)和光滑假丝酵母菌(c.glabrata)生长具有抑制作用。
46.另一方面，本发明人还进一步发现，在浓度大于2％(w/w)的乳酸的情况中，卷曲乳杆菌基本不再生长。
47.在一些实施方式中，调节阴道微生态的组合物中，乳酸的含量(w/w)更优选为0.5-1％，特别是1％。如此可以在维持乳杆菌生长状态时发挥抑制av、bv相关菌株的作用，并且可以抑制白假丝酵母菌(c.albicans)和光滑假丝酵母菌(c.glabrata)的生长。
48.作为乳酸的非限制性示例，可以使用不同旋光性的乳酸，例如可以使用选自l-乳酸、d-乳酸、dl-乳酸中的一种或多种。优选地，可以使用选自l-乳酸和dl-乳酸中的一种或多种。鉴于dl-乳酸的成本低于l-乳酸，可以更优选地使用dl-乳酸。
49.在一些实施方式中，调节阴道微生态的组合物的ph值为约4.0-4.5，诸如为约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5等，特别地可以为约4.0-4.4，优选为约4.0-4.2，更特别
为约4.2。本发明人通过研究发现，卷曲乳杆菌在ph小于4.0时生长受到抑制。
50.调节阴道微生态的组合物，根据需要，还可以含有表面活性剂、保湿剂、皮肤调理剂、增稠剂、螯合剂、溶剂等组分。这些组分可以使用本领域常用的试剂。在一些实施方式中，通过含有这些组分，调节阴道微生态的组合物可以进一步提供附加的优点，诸如，清洁功效，防止阴道分泌物、汗液、尿液和粪便污染的积聚，消除不良气味的产生及扩散；同时配方低敏、无刺激、温和，保护外阴皮肤湿润-滋养私处皮肤。
51.作为表面活性剂的非限制性示例，优选地使用癸基葡糖苷，由于其呈碱性，在与乳酸配合时会发生酸碱中和，可有利地与乳酸配合，共同实现所需ph值。其含量(w/w)优选为约5-40％，诸如为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％等，特别地可以为约20-40％。根据需要，也可进一步附加地使用另外的表面活性剂，诸如硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、脂肪酸山梨坦等。
52.作为保湿剂的非限制性示例，可以使用聚乙二醇、透明质酸、甘油、海藻糖、苯甲酸钠等。优选地，可以使用甘油、海藻糖、苯甲酸钠等。可以单独使用一种，也可以组合使用多种。调节阴道微生态的组合物优选含有甘油约1-20％(w/w)、海藻糖约0.1-2％(w/w)和苯甲酸钠约0.1-2％(w/w)。
53.作为皮肤调理剂的非限制性示例，可以使用维生素b6、玻尿酸、烟酰胺、泛醇等。可以单独使用一种，也可以组合使用多种。优选地，可以使用泛醇。其含量优选为约0.01-2％(w/w)。
54.作为增稠剂的非限制性示例，可以使用黄原胶、羟乙基纤维素、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等。可以单独使用一种，也可以组合使用多种。优选地，可以使用黄原胶。其含量优选为约0.1-2％(w/w)。
55.作为螯合剂的非限制性示例，可以使用edta二钠、egta二钠、dtpa、cdta、eddha和heedta等。可以单独使用一种，也可以组合使用多种。优选地，可以使用edta二钠。其含量优选为约0.001-1％(w/w)。
56.作为溶剂的非限制性示例，可以使用生理盐水、pbs(例如1
×
pbs)和水等。优选地，可以使用水。其含量优选为约50-80％(w/w)。
57.在一些实施方式中，所述调节阴道微生态的组合物优选不含有杀菌剂。
58.在一些实施方式中，所述调节阴道微生态的组合物优选不含有另外的ph调节剂。所述另外的ph调节剂可以为酸类ph调节剂，诸如无机酸类ph调节剂，例如乙酸、盐酸等，和有机酸类ph调节剂，例如柠檬酸；也可以为碱类ph调节剂，诸如无机碱类ph调节剂，例如氢氧化钠等，和有机碱类ph调节剂，例如三乙醇胺等。
59.在一些实施方式中，所述调节阴道微生态的组合物具有如下组成：乳酸0.5-2％(w/w)、癸基葡糖苷5-40％(w/w)、甘油1-20％(w/w)、黄原胶0.1-2％(w/w)、海藻糖0.1-2％(w/w)、苯甲酸钠0.1-2％(w/w)、泛醇0.01-2％(w/w)、edta二钠0.001-1％(w/w)、以及余量的水。
60.本发明的组合物为外用洗液的形式，可作为女性护理液使用。
61.通过使用本发明的组合物，作为女性护理液，可任选地进一步提供附加的优点，诸如，可以满足清洁功效，防止阴道分泌物、汗液、尿液和粪便污染的积聚，消除不良气味的产生及扩散；同时配方应低敏、无刺激、温和，保护外阴皮肤湿润-滋养私处皮肤。
62.在又一方面，本发明提供了一种调节阴道微生态的护理方法，包括将本发明的组合物(作为女性护理液)施用于阴道。
63.本发明进一步提供了所述组合物在制备用于调节阴道微生态的试剂中的用途。
64.在一些实施方式中，本发明的组合物，即使在使用时稀释至10％，仍然具有抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母的生长效果。
65.在一些实施方式中，调节阴道微生态的组合物对乳杆菌不存在抑制作用，而对av、bv等相关微生物发挥抑菌功效。通过本发明的组合物，同样具有抑制阴道微生态常见有害菌，同时对乳杆菌无显著影响的功效，在日常使用过程中，可以维持正常阴道微生态菌群平衡的目的，实现对女性健康呵护和关怀的社会价值。
66.本发明的组合物为外用洗液的形式，可以方便地以阴道外用方式施用。例如，可通过涂抹、湿敷、喷雾、冲洗、浸泡等方式施用。在一些实施方式中，本发明的组合物可以以原液形式施用，或以稀释形式施用，诸如稀释至约10％、20％、30％、40％、50％施用。在一些实施方式中，当施用本发明的组合物时，优选的用量为约1-2ml。
67.实施例
68.下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的产品或本领域技术人员可以容易地通过常用手段制得的。本领域技术人员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
69.材料及其来源
70.菌种：
71.除标注为atcc 25922大肠埃希氏菌和标注为atcc 25923的金黄色葡萄球菌获自atcc外，其余菌株均来源于临床样品分离。
72.试剂和耗材：
73.所用试剂和耗材来源见表1。
74.表1.试剂、耗材来源
75.设备名称制造商型号哥伦比亚血平板thermopb0123amrs培养基bd288210nyc iii艾礼生物m1486双歧杆菌bs培养基索莱宝la5620双歧杆菌bs培养基(不含琼脂)青岛海博hb0394-1tsb液体培养基bd211825l-乳酸索莱宝l8630dl-乳酸索莱宝l860115*30cm密封厌氧培养袋三菱c-41细胞培养板spl30096
76.候选关键成分的确认
77.利用酶标仪测定od
600
吸光度对于菌株生长促进进行评估，确认ph和乳酸对卷曲乳杆菌生长的影响，从而明确候选关键成分。
78.具体方法如下：
79.1)纯菌培养：利用bs固体培养基培养三批卷曲乳杆菌(l.crispatus批次1、2、3)，培养条件为37℃厌氧培养48h。
80.2)制备菌悬液：挑取新鲜培养的单菌落于1ml 1
×
pbs中充分混匀，制备吸光值od
600
为0.5的菌悬液。
81.3)培养基配制：参考培养基说明书对bs液体培养基固体进行稀释溶解，115℃灭菌15分钟。根据不同需要，利用盐酸或乳酸(例如，dl-乳酸和l-乳酸)对bs液体培养基的ph或乳酸含量的调节。
82.4)培养：向96孔板中加入190μl的bs液体培养基，加入10μl配制好的菌悬液。置于厌氧条件下培养48h后，利用酶标仪中检测od
600
吸光值，试验设置三个平行，阳性对照为正常bs液体培养基。
83.ph对卷曲乳杆菌生长的影响：
84.正常阴道微生态的ph范围为3.8-4.5，因此根据这个范围验证ph对乳杆菌的生长抑制实验。利用盐酸调节bs液体培养基的最终ph为1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0，通过酶标仪测定od
600
计算生长速率。经研究发现，卷曲乳杆菌在ph为4及以下时生长收到抑制(图1)。
85.乳酸对卷曲乳杆菌生长的影响：
86.通过向bs培养液中添加不同类型及不同浓度的乳酸，评估其对于乳杆菌生长的影响。利用dl-乳酸调节bs液体培养基的乳酸含量重量比为0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％。利用l-乳酸调节bs液体培养基的乳酸含量重量比为0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％。经研究发现，卷曲乳杆菌在dl-乳酸或l-乳酸添加量2％(w/w)及以上时基本不再生长(图2a和2b)。
87.乳酸和ph对乳杆菌的生长影响比较：
88.进一步评估乳酸含量与ph值的关系。bs培养基中乳酸含量重量比为1％时，ph为4.09-4.11(表2)，乳杆菌可以生长，而仅使用hcl调节bs液体培养的ph为4.0时，乳杆菌不再生长。表明乳酸对于乳杆菌的保护作用要高于ph，由乳酸引起的ph降低对乳杆菌的生存更友好。乳酸对菌株的抑制与ph可能存在协同作用，乳酸通过降低微生物生存环境的ph可能是其抑菌机制之一，考虑到后续同时改变ph和乳酸含量存在ph指标上的交叉，综合确认把乳酸作为关键候选成分进行对阴道微生态av、bv及vvc相关菌种生长的抑制试验。
89.表2.bs液体培养基不同乳酸含量(w/w)的ph
[0090][0091]
乳酸对阴道微生态av、bv及vvc相关菌种生长的影响：
[0092]
初步确定了乳酸对于乳杆菌生长促进的浓度后，进一步评估乳酸对阴道微生态av、bv及vvc相关菌种生长抑制作用。
[0093]
具体方法如下：
[0094]
1)纯菌培养：验证菌株及其培养条件如表3所示。
[0095]
表3.阴道微生态相关菌株及其培养条件
[0096][0097]
2)制备菌悬液：挑取新鲜培养的单菌落于1ml 1
×
pbs中充分混匀，制备吸光值od
600
为0.5的菌悬液。
[0098]
3)培养基配制：参考培养基说明书对bs液体培养基、改良nycⅲ培养基、tsb液体培养基、沙氏液体培养基固体进行稀释溶解，115℃灭菌15分钟。利用乳酸(例如，dl-乳酸和l-乳酸)调节bs液体培养基、改良nycⅲ培养基、tsb液体培养基、沙氏液体培养基的乳酸含量。
[0099]
4)培养：从96孔板中加入190μl的bs液体培养基，加入10μl配制好的菌悬液。培养48h并置于od
600
下检测吸光值，试验设置三个平行，阳性对照为正常的液体培养基。
[0100]
dl-乳酸对阴道微生态av、bv相关菌种生长的影响：
[0101]
利用dl-乳酸调节bs液体培养基、改良nycⅲ培养基、tsb液体培养基、至dl-乳酸含量重量比分别为0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％，对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌和无乳链球菌进行培养，通过酶标仪测定od
600
以反映不同菌株的生长速率，结果如图3a所示，0.1％的dl-乳酸即可对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌和无乳链球菌生长具有抑制作用，0.5％及以上的dl-乳酸含量可显著抑制以上菌群的生长。
[0102]
利用l-乳酸调节bs液体培养基、改良nycⅲ培养基、tsb液体培养基、沙氏液体培养基至l-乳酸含量重量比分别为0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％，对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌和无乳链球菌进行培养，结果如图3b所示，与dl-乳酸结果一致，0.1％的l-乳酸即可对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌和无乳链球菌生长具有抑制作用，0.5％及以上的l-乳酸含量可显著抑制以上菌群的生长。
[0103]
dl-乳酸和l-乳酸对阴道微生态vvc相关菌种生长的影响：
[0104]
利用dl-乳酸和l-乳酸调节沙氏液体培养基至乳酸含量重量比分别为0.1％、
0.5％、1.0％、1.5％、2.0％，对白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌进行培养，结果如图4a和4b所示，乳酸浓度大于0.1％时，可以对酵母菌产生抑制作用。超过1.5％及以上的dl-乳酸或l-乳酸含量时，甚至可完全抑制白假丝酵母菌。
[0105]
调节阴道微生态的组合物的一般配制方法
[0106]
表4.组合物的成分和含量
[0107][0108]
采用上表4所示的组合物成分以及含量配比，按照以下一般配制方法，配制了本发明调节阴道微生态的组合物，作为女性护理液：将a相加入主锅中。将b相各原料预先分散均匀后加入主锅中，搅拌加热至80-85℃，搅拌均匀。搅拌速度：30r/min，将c相各原料依次加入主锅中，搅拌加热至80-85℃，搅拌均匀，保温10min后开始降温。搅拌速度：30r/min。当温度降到45℃后加入d相原料，搅拌均匀，搅拌速度：30r/min。加入e相原料，搅拌均匀后，取样检测ph值，检测合格后过滤出料。进行微生物检测，检测合格后灌装。
[0109]
应理解，上述一般配制方法仅仅是示例性的，而不是限制性的，本领域技术人员可可以根据实际需要对工艺参数、操作顺序等进行适当调整、修饰、改变或改进。
[0110]
实施例1
[0111]
采用下表(配方1)所示的成分以及含量配比，按照前述一般配制方法，配制调节阴道微生态的组合物，作为女性护理液。所得组合物的ph为4.4。
[0112]
配方1
[0113][0114]
实施例2
[0115]
采用下表(配方2)所示的成分以及含量配比，按照前述一般配制方法，配制调节阴道微生态的组合物，作为女性护理液。所得组合物的ph为4.0。
[0116]
配方2
[0117][0118]
实施例3
[0119]
采用下表(配方3)所示的成分以及含量配比，按照前述一般配制方法，配制调节阴道微生态的组合物，作为女性护理液。所得组合物的ph为4.2。
[0120]
配方3
[0121][0122]
实施例4
[0123]
采用下表(配方4)所示的成分以及含量配比，按照前述一般配制方法，配制调节阴道微生态的组合物，作为女性护理液。所得组合物的ph为4.0。
[0124]
配方4
[0125][0126]
本发明调节阴道微生态的组合物，在以乳酸为主要成分的基础上，添加了表面活性剂、保湿剂、皮肤调理剂等组分。所述组合物中，癸基葡糖苷呈碱性，与配方中乳酸发生酸碱中和后，组合物的ph为约4.0-4.5。
[0127]
针对所获得的组合物，进行如下实验，用以验证该组合物的相关抑制作用。
[0128]
接触抑制试验
[0129]
针对上述组合物，进行如下的接触抑制实验，用以验证不同菌株与组合物接触一段时间后生长抑制作用。
[0130]
1.具体方法如下：
[0131]
1)该部分所用于验证菌株的培养条件如表5所示。
[0132]
表5.本发明的组合物验证所需菌株及其培养条件
[0133][0134]
2)试验操作流程具体如下：
[0135]
制备菌悬液：挑取新鲜培养的单菌落于1ml 1
×
pbs中混匀，调节od
600
吸光值为0.5的菌悬液。
[0136]
接触抑制测试：分别吸取10μl菌悬液置于90μl不经稀释的组合物(90μl组合物)和稀释1倍的组合物(45μl组合物 45μl pbs)中，设置接触不同时间。
[0137]
梯度稀释涂布：取放置不同时间的处理样本，利用1
×
pbs溶液进行10倍梯度稀释，取100μl涂布于对应固体培养基上培养。
[0138]
2.测试结果
[0139]
以下测试中将实施例3(配方3)所获得的组合物进行效果评估测试。
[0140]
2.1本发明的组合物对卷曲乳杆菌接触抗菌效果
[0141]
如图5a-5b所示，通过接触抑制实验及涂板培养48h后，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与卷曲乳杆菌瞬时接触0分钟、30分钟、60分钟后依然可以保持相同的数量级(104)，而接触120分钟后活性开始降低。本发明的组合物在与卷曲乳杆菌接触60分钟内，该组合物及其1倍稀释液对卷曲乳杆菌无明显抗菌作用。
[0142]
2.2本发明的组合物对大肠埃希氏菌接触抗菌效果
[0143]
如图6a-6b所示，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与大肠埃希氏菌接触6分钟后可以使大肠埃希氏菌的数量级显著下降4个数量级。本发明的组合物与大肠埃希氏菌接触6分钟内对其具有显著的灭菌作用。
[0144]
2.3本发明的组合物对无乳链球菌接触抗菌效果
[0145]
如图7a-7b所示，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与无乳链球菌接触6分钟后可以使无乳链球菌的数量级显著下降4个数量级。本发明的组合物与无乳链球菌接触6分钟内对其具有显著的灭菌作用。
[0146]
2.4本发明的组合物对金黄色葡萄球菌接触抗菌效果
[0147]
如图8a-8b所示，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与金黄色葡萄球菌接触120分钟后可以使金黄色葡萄球菌的数量降低一倍。本发明的组合物对金黄色葡萄球菌的杀灭率接近50％。
[0148]
2.5本发明的组合物对阴道加德纳菌接触抗菌效果
[0149]
如图9a-9b所示，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与阴道加德纳菌瞬时接触
(小于30秒)就可以使阴道加德纳菌显著下降6个数量级。本发明的组合物对阴道加德纳菌表现出及其显著的灭菌效果。
[0150]
2.6本发明的组合物对白假丝酵母接触抗菌效果
[0151]
如图10a-10b所示，本发明的组合物不稀释或稀释1倍后与白假丝酵母接触120分钟后，白假丝酵母的活性生长受到抑制。本发明的组合物对白假丝酵母具有抑菌作用。
[0152]
3.结论
[0153]
本发明的组合物，作为女性护理液，对于阴道微生态正常状态下优势菌卷曲乳杆菌的作用温和，而对于av和bv常见相关的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌具有较好的接触杀菌效果。而对于vvc常见菌株，可抑制白假丝酵母生长，具有抑菌作用。
[0154]
浓度梯度稀释后对致病菌的生长抑制作用测试试验
[0155]
女性护理液在使用时可能会受到一定程度的稀释，本试验用以检测其稀释后是否同样具有抑菌功效。即使在原始浓度时，本发明组合物对于乳杆菌作用温和，不存在接触杀菌功效，因此只需要验证对有害菌的作用。
[0156]
具体方法如下：
[0157]
1)该部分所用于验证菌株的培养条件如表6所示。
[0158]
表6.本发明的组合物验证所需菌株及其培养条件
[0159][0160]
2)制备菌悬液：挑取新鲜培养的单菌落于1ml 1
×
pbs中混匀，调节od
600
吸光值为0.5的菌悬液。
[0161]
3)培养基配制：参考培养基说明书对tsb液体培养基、改良nycⅲ培养基、沙氏液体培养基固体进行稀释溶解，115℃灭菌15分钟。与本发明的组合物进行浓度梯度混合，使培养基中本发明组合物的含量稀释至10％、20％、30％、40％、50％。
[0162]
4)培养：分别向96孔板中每孔加入含不同浓度本发明组合物的190μl的tsb液体培养基、改良nycⅲ培养基、沙氏液体培养基，加入10μl配制好的菌悬液。利用酶标仪每间隔两小时检测菌株在od
600
下的吸光值，并绘制生长曲线。
[0163]
将上述本发明的组合物梯度稀释至10％、20％、30％、40％、50％，与大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母共培养，测定抑菌效果，用1
×
pbs作为阳性对照。结果如图11a-11e所示，即使稀释至10％，本发明的组合物仍然具有抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母的生长效果。
[0164]
用量测试试验
[0165]
参考gbt8939-2008卫生巾(含卫生护垫)的标准及中国女性外阴面积范围进行覆盖率测试，以明确本发明的组合物在使用时的用量范围。
[0166]
具体方法如下：
[0167]
1)卫生巾选择及面积范围如表7所示。
[0168]
表7.常规卫生巾规格
[0169][0170]
第2类日用卫生巾的大小范围与亚洲人群外阴面积基本吻合，可以利用该系列产品来进行测试护理液覆盖面积和使用量。
[0171]
2)为可视化本发明的组合物的渗透能力和范围，本实验使用2％(m/v)结晶紫进行示踪。用量：每1000μl本发明组合物 10μl 2％(m/v)结晶紫。
[0172]
3)模拟女性护理液使用场景，清水湿润双手-滴加本发明的组合物，揉搓起泡后均匀涂抹至含侧翼型的日用卫生巾表面，根据其吸收的液体量的灰度值计算覆盖范围和使用量。
[0173]
验证结果如图12所示，大于1ml量时，测试洗液1ml 10μl结晶紫(为显色)揉搓发泡后可以覆盖第2类卫生巾常见类型面积范围，大于2ml后基本达到饱和，覆盖更加充分均匀，因此可以初步确定使用量优选在1-2ml之间。
[0174]
同类产品对比试验
[0175]
按照如下方法，将上述本发明的组合物与市场上的同类产品进行比较，以验证对卷曲乳杆菌的接触抗菌效果。
[0176]
具体方法如下：
[0177]
1)纯菌培养：利用mrs培养基培养卷曲乳杆菌(l.crispatus)，培养条件为37℃培养24h。
[0178]
2)制备菌悬液：挑取新鲜培养的单菌落于1ml 1
×
pbs中混匀，测定od
600
吸光值，调节至0.5的菌悬液。
[0179]
3)接触抑制测试：分别吸取10μl菌悬液置于90μl不经稀释的各类商品化女性护理产品中，瞬时接触(小于20秒)和接触60分钟。
[0180]
4)梯度稀释涂布：取3)过程的放置不同时间的处理样本，利用1
×
pbs溶液进行10倍梯度稀释，取100μl 10-2
稀释梯度液体涂布于mrs固体培养基上培养，用水作为阳性对照。
[0181]
通过接触抑制测试，实验结果如图13所示，本发明的组合物、蓝宝丝女性私处护理液、saforelle soin lavant doux、ziaia intimate wash gel四款洗液类产品在与卷曲乳杆菌接触60分钟后依然能保持卷曲乳杆菌的活性；步长红核薰衣草抑菌女性护理液与闺馥
苍术抗菌女性护理液在与卷曲乳杆菌瞬时接触可以保持卷曲乳杆菌的活性，但是在接触60分钟后使卷曲乳杆菌失去活性；其它女性护理液则在与卷曲乳杆菌瞬时接触后便使卷曲乳杆菌失去活性。
[0182]
通过上述各项试验表明，本发明的外用洗液形式的组合物，作为女性护理液，通过含有特定含量乳酸，与癸基葡糖钠配合，保持特定ph范围，对于阴道微生态正常状态下主要的卷曲乳杆菌的作用很温和，而对于av、bv和vvc常见相关的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母具有较好的接触抑菌效果，即使稀释至10％仍然具有对有害菌的抑菌效果。使用量1-2ml可有效覆盖外阴。本发明的组合物具有更好的维持正常阴道微生态菌群的作用，优于市场上多数主流产品。
[0183]
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。