一种二聚异喹啉生物碱化合物及其制备和用途

1.本发明属于天然药物化学领域，涉及一种二聚异喹啉生物碱化合物的制备方法及其在神经系统疾病预防或治疗中的相关应用。


背景技术：

2.异喹啉生物碱是一类重要的氮杂环生物活性天然产物，在植物界很常见。它们很可能是从酪氨酸或苯丙氨酸中提取的，并表现出广泛的结构多样性。自从19世纪初从鸦片植物中分离出第一个具有生物活性的异喹啉生物碱—吗啡以来，这类化合物引起了科学界的广泛关注。越来越多的异喹啉生物碱已从天然资源中分离和鉴定出来，各种研究报道了其抗肿瘤、抗疟疾、抗菌、抗真菌、抗寄生虫杀虫、抗病毒、抗炎、抗血小板等活性。作为在药物发现和开发过程中的先导化合物，异喹啉生物碱有很高的成功的概率，一些革命性的药物如：镇痛药吗啡，抗菌药小檗碱，止咳药可待因，治疗风湿病的青藤碱以及乙酰胆碱酯酶抑制剂加兰他敏等。因此，寻找结构新颖的生物活性异喹啉生物碱作为有前途的药物先导物在天然产物化学领域仍是一个活跃的研究方向。多巴胺受体是通过其相应的膜受体发挥作用的一种位于生物体内的受体。
3.多巴胺受体为七个跨膜区域组成的g蛋白偶联受体家族，已分离出五种多巴胺受体(d1-d5)。根据它们的生物化学和药理学性质可分为d1类(d1-like)和d2类(d2-like)。d1类受体包括d1和d5受体(在大鼠中也称d1a和d1b受体，d1a受体即d1受体，d1b受体即d5受体)。d2类包括d2、d3和d4受体。d1受体在背侧和腹侧纹状体中表达最多，其次是额叶皮层、杏仁核、嗅结节、丘脑。下丘脑和下丘脑核。一些重要的药理研究表明，d1的拮抗剂具有抗精神病以及药物成瘾的预防和治疗等作用。因此，对于d1受体的针对性的靶向药物发现是非常重要的。
4.蝙蝠葛根为防己科蝙蝠葛属植物蝙蝠葛的根茎，始载于《中国药植志》，又名北豆根。作为一种常用中药，2010年被纳入药典。现代药理研究表明其具有抗心律失常、降压作用等，主要含有大量异喹啉生物碱类成分。在前期的工作中，已经分离并发现了一些新的生物碱成分，因此，为了继续找到更多有价值的该类成分，对该植物进行了更深入的物质研究。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种二聚异喹啉生物碱化合物在制备预防或治疗多巴胺d1受体等相关疾病的药物中的用途，其中，所述化合物的结构式如下：
[0006][0007]
其中：
[0008]
r1～r8分别独立地选自为氢、卤素(f、cl、br、i中的一种)、羟基、羧基、c1～c6烷氧基、糖基、c1～c6的烷基、c2～c6的烯基中的一种。
[0009]
进一步地，r1选自甲基，r2、r5选自氢，r3、r4、r6、r7、r8羟基，所述式(a)化合物如式(i)所示
[0010][0011]
进一步地，所述化合物i的立体构型分别选自(1r,1
′
r),(1r,1
′
s),(1s,1
′
r),(1r,1
′
s)中的一种或二种以上。
[0012]
进一步地，化合物i的立体构型优选(1r,1
′
r)。
[0013]
本发明还提供一种制备上述化合物i的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0014]
(1)药材提取：北豆根干燥药材1公斤～100公斤，每公斤药材加入6～10l体积分数50％～90％的乙醇浸泡，浸泡1～24h，加热至50℃～90℃，回流提取1～5次，合并提取液，浓缩，即得北豆根提取液；
[0015]
(2)总碱制备：在上述提取液中加入0.1％～3％的硫酸调ph至1～4后，加入为酸调后的溶液体积1～3倍的乙酸乙酯萃取1～5次，每次萃取后在酸水层中均加入0.1％～3％的硫酸调ph至1～4，最后获得酸水层。然后在酸水层中加入弱碱调ph至8～10，接着加入为碱调后的溶液体积1～3倍体积的正丁醇萃取1～5次，合并1～5次获得的正丁醇层，浓缩，即得北豆根粗碱，然后通过离子交换色谱柱，脱色除杂，即得精制的总碱；
[0016]
(3)将步骤(2)所得总碱采用反相制备级hplc制备，色谱柱固定相为c18hce(5～60μm，20
×
250～100
×
250mm)，流速为10ml/min～350ml/min，体积比为0：100～100：0的(0.01％～5％)甲酸-甲醇/(0.01％～5％)甲酸-水溶液洗脱，按时间收集得到馏分f1～f8；
[0017]
(4)将步骤(3)所得子馏分f6经过反相制备级hplc制备，色谱柱为c18ce固定相(5～60μm，20
×
250～100
×
250mm)，流速为10ml/min～350ml/min，流动相为甲醇(a)和水(b，含体积分数为0.01％～2％的质量浓度为25％～28％的氨水)，洗脱梯度为0～80min，0％a～95％a，按时间收集共得到8个子馏分，分别为f6-1～f6-8；
[0018]
(5)将步骤(4)所得子馏分f6-7经过制备级hplc制备，色谱柱采用常规c18固定相
(5～60μm，4.6
×
250～50
×
250mm)，流速0.5ml/min～100ml/min，流动相为乙腈和水(各含体积分数0.01～1％的三氟乙酸)，洗脱梯度为0～60min，5％a～95％a，所得馏分再经过c18ce(5～60μm，4.6
×
250～20
×
250mm)，流动相为甲醇(a)和水(b)(各含体积分数0.1％～10％的乙酸三乙胺(乙酸与三乙胺的体积比比为1：1～1：5))，洗脱梯度为0～60min，0％a～90％a，所得馏分再继续通过c18hce固定相(5～60μm，4.6
×
250～20
×
250mm)，流速为0.5ml/min～50ml/min，流动相a为体积分数(0.01～1％)甲酸-甲醇，b为体积分数(0.01～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40min，0％a～90％a，得到化合物i；
[0019]
本发明中：所述糖基是指包括但不限于葡萄糖基、葡萄糖醛酸基、甘露糖基、半乳糖基、阿洛糖基、果糖基、山梨糖基、夫糖基、鼠李糖基、鸡纳糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、木糖基、核糖基，以及由上述单糖所形成的各种二糖基及多糖基；所述c1～c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基；c1～c6的烯基是指具有1～6个碳原子的直链或支链的烯基，具有1～6个双键的直链或支链的烯基。
[0020]
本发明的另一个目的是，提供一种新的异喹啉生物碱二聚衍生物，或其晶型、或其异构体或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物作为活性成分，或由所述的任一种或几种作为多巴胺d1受体配体，在制备预防和/或治疗与镇痛、精神分裂症等相关的神经疾病药物开发研究中。
[0021]
所述疾病包括但不限于镇痛、精神分裂症等。所述与多巴胺受体相关精神疾病包括但不限于疼痛、药物滥用、帕金森、亨廷顿、精神分裂、阿茨海默、抑郁等。
[0022]
所述药物组合物是指本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。本发明中药物组合物中活性成分(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的剂量或浓度在一个较宽的范围内调节，活性化合物的含量范围为药物组合物的1％～90％。
[0023]
显然，根据本发明的上述内容，按照本科领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
[0024]
图1化合物i的制备流程图
[0025]
图2化合物i的esi

一级质谱图
[0026]
图3化合物i的1hnmr谱图和
13
cnmr谱图
[0027]
图4化合物i的h,h-cosy和hmbc相关
[0028]
图5化合物i的d1受体拮抗活性测定：在hek-293-d1细胞上的剂量响应曲线
具体实施方式
[0029]
以下实施例旨在说明本发明而不是本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
[0030]
本发明式(ⅰ)化合物的制备实施例：
[0031]
化合物制备
[0032]
北豆根药材100公斤，
[0033]
(1)药材提取：称取100kg北豆根药材，加入1000l体积浓度为70％的乙醇，浸泡24h，60℃加热回流提取2h，抽滤后获得提取液1，将过滤后的滤渣再加入1000l体积浓度为70％的乙醇，60℃加热回流提取2h，过滤后获得提取液2，继续将过滤后的滤渣再加入1000l体积浓度为70％的乙醇，60℃加热回流提取2h，过滤后获得提取液3，合并提取液1～3，浓缩至50l，即获得北豆根提取液。
[0034]
(2)总碱制备：在北豆根提取液中加入体积浓度为1％的稀硫酸调ph至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第一次，静置分层，获得乙酸乙酯萃取层1和酸水层1，然后在酸水层1中继续加入体积浓度0.2％的稀硫酸调ph至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第二次，即得乙酸乙酯层2和酸水层2，然后在酸水层2中加入体积浓度1％的稀硫酸调ph至2～3之间，然后加入与该酸调后的提取液相同体积的乙酸乙酯萃取第三次，即得乙酸乙酯层3和酸水层3。在酸水层3中加入质量浓度为25％～28％的氨水调ph至9～10之间，加入与碱调后的样品相同体积的正丁醇萃取，静置分层，即得正丁醇层1和碱水层1，然后在碱水层1中加入质量浓度为25％～28％的氨水调ph至9～10之间，然后加入与该碱调后的提取液相同体积的正丁醇萃取第二次，即得正丁醇层2和碱水层2。然后在碱水层2中加入质量浓度为25％～28％的氨水调ph至9～10之间，然后加入与该碱调后的提取液相同体积的正丁醇萃取第三次，即得正丁醇层3和碱水层3，合并正丁醇层1～3并浓缩成浸膏，采用甲醇复溶至12l，取10ml浓缩测固含量约为500g/l，计算即得北豆根粗碱约6.0kg，占药材质量的6.0％。以此计算，取约1l甲醇复溶的粗碱样品，加入1l纯水稀释溶解，离心过滤获得上清液，然后上清液通过琼脂糖凝胶基质的离子交换q柱，脱色除杂，即得精制的总碱约500g，回收率约97％。
[0035]
(3)将步骤(2)所得总碱采用反相制备级hplc制备，色谱柱固定相为c18hce(粒径10μm，直径与高100
×
250mm)的反相柱进行分离纯化，流速300ml/min，流动相为甲醇(a)和水(b)(各含体积浓度0.1％的甲酸)，洗脱梯度为0-10min，0％b(体积比)；10-20min，10％b；20-35min，20％b；35-45min，25％b；45-60min,30％b；60-75min，90％b洗脱，按峰收集，得到8个馏分分别为f1(rt：0～17min)，f2(rt：17～24min)，f3(rt：24～28min)，f4(rt：28～32.5min)，f5(rt：32.5～38.5min)，f6(rt：38.5～52min)，f7(rt：52～62min),f8(rt：62～74min)；
[0036]
(4)将步骤(3)所得子馏分f6经过反相制备级hplc制备，色谱柱为c8ge固定相(粒径10μm，直径与高100
×
250mm)，流速300ml/min，流动相为甲醇(a)和水(b，含体积分数为0.03％的质量浓度为25％～28％的氨水)，洗脱梯度为0～30min，10％～95％a(线性梯度)，30～40min，95％a(体积比)，按峰收集，共得到8个子馏分，分别为f6-1(rt：2～7min)，f6-2(rt：7～11min)，f6-3(rt：11～13min)，f6-4(rt：13～17min)，f6-5(rt：17～22min)，f6-6(rt：22～27min)，f6-7(rt：27～31min)，f6-8(rt：31～35min)；
[0037]
(5)将步骤(4)所得子馏分f6-7经过制备级hplc制备，色谱柱采用常规c18固定相(粒径7μm，直径与高30
×
250mm)。流速30ml/min，流动相为乙腈(a)和水(b)(各含体积分数0.01～1％的三氟乙酸)，洗脱梯度为0-15min，10％-20％a(线性梯度)，15-50min，20％-40％a，50-60min，95％a(体积比)。所得馏分f6-7-7(rt：28～32min)再经过c18ce(粒径7μm，直径与高10
×
250mm)，流速3ml/min，流动相为甲醇(a)和水(b)(各含体积分数0.05％的乙酸三乙胺(乙酸：三乙胺的体积比为1：3)，ph10.5)，洗脱梯度为0-20min，10％-90％a(线性
梯度)，20-30min，90％a(体积比)。所得馏分f6-7-7-7(rt：27～28.5min)再继续通过c18hce固定相(粒径7μm，直径与高10
×
250mm)，流动相a和b分别为甲醇和水(各含体积分数0.01～1％甲酸)，洗脱梯度为0～40min，0％a～90％a(线性梯度)，收集主峰收集得到化合物1；
[0038]
(6)所述化合物i，其结构通过紫外、质谱以及核磁表征确定，信息如下：
[0039]
化合物i：4mg，c
44h46
n2o7，mw：714，白色粉末，可溶于甲醇。
[0040]1h nmr(cd3od，600mhz)δ7.16(2h,dd,j＝10.0,2.9hz,h-15
′
),7.08(2h,dd,j＝8.5,2.0hz,h-15
′
),7.02(2h,d,j＝8.5hz,h-10),7.01(1h,m,h-11
′
),6.96(1h,d,j＝2.0hz,h-17),6.99(1h,m,h-14),6.93(1h,d,j＝8.5hz,h-20),6.84(1h,d,j＝8.5hz,h-11,13),6.35(1h,dd,j＝9.5,2.0hz,h-12
′
),6.22(2h,dd,j＝10.0,2.0hz,h-14
′
),6.76(1h,s,h-5),6.73(1h,s,h-5
′
),5.84(1h,s,h-8),5.84(1h,s,h-8),3.83-3.41(2h,m,h-15),_3.47-3.21(2h,m,h-3
′
),_3.61-3.21(2h,m,h-3),3.34-2.92(2h,m,h-9),3.11-3.05(2h,m,h-4),2.82(2h,m,h-4
′
),2.28-2.21(2h,m,h-9
′
),3.80(1h,m,h-1
′
),4.28(1h,dd,j＝10.5,4.0hz,h-1),3.83-3.41(2h,m,h-15),3.78(3h,s,och3-6),3.42(3h,s,och3-7),3.76(3h,s,och3-6
′
),3.57(3h,s,och3-7
′
),2.85(3h,s,nch3-2).
[0041]
13
c nmr(cd3od，600mhz)δ65.9(ch,c-1),46.7(ch2,c-3),24.2(ch2,c-4),124.2(c,c-4a),112.8(ch,c-5),150.2(c,c-6),148.3(c,c-7),112.8(ch,c-8),125.0(c,c-8a),40.0(c-9),131.8(c,c-9a),132.3(c,c-10,14),158.9(c,c-12),118.0(c,c-11,13),65.6(ch,c-1
′
),52.7(ch2,c-3
′
),28.2(ch2,c-4
′
),129.5(c,c-4
′
a),113.0(ch,c-5
′
),154.8(c,c-6
′
),145.5(c,c-7
′
),133.4(c,c-8
′
),48.6(ch2,c-9
′
),52.8(ch2,c-10
′
),156.7(c,c-11
′
),128.7(c,c-12
′
),188.5(c,c-13
′
),127.8(c,c-14
′
),153.1(c,c c-15
′
),60.6(ch2,c-15),130.2(c,c-16),123.8(ch,c-17),144.3(c,c-18),150.0(c,c-19),118.0(ch,c-20),127.9(ch,c-21),41.2(ch3,nch3-2),56.7(ch3,och3-6),56.2(ch3,och3-7),56.3(och3-6
′
),61.3(och3-7
′
).
[0042]
活性试验实施例：
[0043]
样品制备的新化合物；hek-293-d1稳转细胞来构建参考文献(xu,f.f.；zhou,h.；liu,x.m.；zhang,x.l.；wang,z.w.；hou,t.；wang,j.x.；qu,l.l.；zhang,p.y.；piao,h.l.；liang,x.m.,label-free cell phenotypic study of ffa4 and ffa1 and discovery of novel agonists of ffa4 from natural products.rsc advances 2019,9(26),15073-15083)(所述d1为多巴胺d1受体)；多巴胺(货号：kb712097)分别购于上海思域化工科技有限公司；calcium-6荧光染料试剂盒(货号：3221567)购于moleculardevices公司，掩蔽染料amaranth(货号：a1016-50g)购于sigma公司，dmem高糖培养液(货号：c11995500bt)购于thermofisher公司，胎牛血清(货号：04000101a)购于沈阳汇佰生物科技有限公司；多聚赖氨酸(货号：p2100)购于北京索莱宝科技有限公司；平衡盐溶液hbss(货号：14065-056)和hepes(货号：15630-080)购于gibco公司；flipr专用96孔细胞培养板(货号：655090)购于greiner公司；检测平台高通量实时荧光检测系统(fliprtetra)，购于molecular devices公司。
[0044]
将处于对数生长期的hek-293-d1细胞，接种于用多聚赖氨酸(poly-d-lysine，简称pdl)涂层的flipr专用96细胞培养板中，每孔的培养液(组成：dmem 10％胎牛血清(fbs)(v/v))体积为100μl，细胞接种密度为8.0
×
104个/孔，将接种好的96孔细胞板置于细胞培
养箱中37℃培养20～24h，至细胞融合度达95％左右，进行活性检测。将培养好的细胞除去培养基并于每孔中加入100μl荧光染料溶液(calcium-6)在37℃下恒温孵育1h；除去染料溶液并于每孔加入100μl amaranth(0.5mg/ml)，室温孵育5min；
[0045]
将化合物i加入到接种hek293-d1细胞的微孔板中，化合物i配置8个浓度分别为100μm、25μm、6.25μm、1.56μm、0.39μm、0.097μm、0.024μm、0.006μm，平行3次，溶剂为含20mm hepes的hbss缓冲液，置于96孔药物板，记为药物板a；将d1激动剂多巴胺固终定浓度为50nm(溶剂为含20mm hepes的hbss缓冲液)置于96孔药物板，记为药物板b；在hek-293-d1细胞上，采用flipr进行化合物i拮抗活性表征，将药物板a和b中的样品自动加样到flipr细胞板上，每孔加入2个样品的体积各为50μl，在520nm和488nm波长下进行钙流荧光信号检测。检测结果如图5所示，化合物i能剂量依赖地拮抗多巴胺的荧光信号，且曲线是单相“s”型，其ic
50
值为8.400
±
2.006μm，说明化合物i具有d1的拮抗活性。
[0046]
目前的研究表明多巴胺d1受体与精神分裂症、疼痛、抑郁、焦虑、阿兹海默症相关。本发明的化合物对精神分裂症、疼痛、抑郁、焦虑、便秘、肠易激综合症及阿兹海默症等疾病有重要的临床应用。