一种用于诊断中枢性性早熟女童的特异性生物标记物及其筛选方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于诊断中枢性性早熟女童的特异性生物标记物及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.性早熟(precocious puberty,pp)传统上被定义为女童在8岁前乳房发育，男孩在9岁前睾丸增大≥4ml。其潜在的病理生理学主要是依赖于下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonada,hpg)轴是否启动。中枢性性早熟(central precocious puberty,cpp)主要由促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,gnrh)的持续脉搏分泌诱导，过早激活hpg轴，然而，确切的机制尚不清楚。部分性性早熟(partialprecocious puberty,ppp)主要是暴露于外周的雌激素环境导致单纯的乳房增大，当ppp女童在后期伴随骨龄的快速提前时，它演变成继发性cpp的可能性增大。cpp对女童有重要的短期和长期影响，包括成年后增加的心理社会压力、身材矮小、肥胖、心血管疾病和ii型糖尿病的风险。
3.临床上，gnrh刺激试验被认为是cpp与ppp检验的金标准。然而，该测试成本高、耗时长，需反复抽血，会让患儿产生恐惧心理。近年，一些研究者试图借助黄体生成素(luteinizing hormone,lh)，卵泡刺激素(follicular stimulating hormone,fsh))，雌二醇(estradiol,e2)等临床指标来量化pp，期望能确定能用于cpp诊断的指标阈值，但这部分研究尚存在较大的争议。有一些证据表明，pp会导致机体代谢轮廓改变。然而，cpp的临床鉴别诊断仍处于模糊的界面，缺乏强大的分子生物标志物是pp临床诊断和评估的长期瓶颈。因此寻找cpp的实验室分子生物标志物，对于cpp的早期临床诊断和治疗是至关重要的。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了一种用于诊断中枢性性早熟女童的特异性生物标记物及其筛选方法和应用。本发明筛选的用于诊断中枢性性早熟的特异性生物标志物具有良好的灵敏度和特异性，具有明显区分于pad和ad女童的优越性，具有良好的应用前景。
5.具体的，本发明涉及以下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一种用于诊断中枢性性早熟女童的特异性生物标记物，所述特异性生物标记物同时包含：谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、二羟基丙酮、蛋氨酸、次黄嘌呤、异丁酸、肌酐、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
7.本发明的第二方面，提供一种组合物在制备用于中枢性性早熟女童诊断的诊断试剂中的应用，所述组合物包含血液中生物标记物的检测试剂，所述生物标记物为谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、二羟基丙酮、蛋氨酸、次黄嘌呤、异丁酸、肌酐、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的组合。
8.本发明的第三方面，提供一种用于诊断中枢性性早熟女童的试剂盒，所述试剂盒
用来在血液中检测谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、二羟基丙酮、蛋氨酸、次黄嘌呤、异丁酸、肌酐、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的生物标记物，所述试剂盒包含与上述生物标记物中各标记物特异性结合的抗体。
9.优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
10.优选地，所述试剂盒进一步包含：二级抗体结合物，该二级抗体结合物与通过同基质反应而显色的标记物结合；与所述标记物进行显色反应的显色基质溶液；清洗液；以及酶反应终止液。
11.优选地，所述二级抗体结合物选自辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素和染料。
12.本发明的第四方面，提供一种用于诊断中枢性性早熟女童的诊断试剂，所述诊断试剂用于检测血液中谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、二羟基丙酮、蛋氨酸、次黄嘌呤、异丁酸、肌酐、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的生物标记物，该诊断试剂包括与各个所述生物标记物特异性结合的抗体。
13.本发明的第五方面，提供一种中枢性性早熟女童特异性生物标志物的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
14.s1.研究队列的纳入标准和血清样本的收集
15.选自含有性早熟和正常女童(含有青春期前女童pad，青春期女童ad)的血清样本，采用免疫化学发光法检测基础lh和gnrh激发试验，女童在8岁之前出现第二性征定义为性早熟女童(pp女童)，符合单纯乳房早发、骨龄(ba)没有提前、基础lh《0.83*、具有完整的临床数据这四个条件的定义为部分性性早熟(ppp)，符合骨龄提前(ba-ca》2)、生长速度加快、基础lh》0.83*、gnrh激发试验*(lh峰值》5.0，lh/fsh》0.6)、卵泡直径≥4mm(多个)、具有完整的临床数据这五个条件的定义为中枢性性早熟(cpp)，符合以下四个条件：临床数据不完整、ba-ca》1，但基础lh《0.83*、ba-ca》1，但基础lh》0.83*，gnrh激发试验*(lh峰值》5.0，lh/fsh《0.6)之一的定义为其他类型性早熟；
16.各术语定义如下：
17.lh:黄体生成素
18.fsh:促卵泡激素
19.ba：骨龄(诊断时)
20.ca：实际年龄(诊断时)
21.gnrh：促性腺激素释放激素
22.所有的血清样本均在清晨空腹下抽血，静置30min或以上，然后在4℃下离心，分离血清后储存在-80℃冰箱中；
23.s2.血清样品配置及nmr波谱检测
24.血清样品在4℃下解冻，并将血清与ph为7.4的磷酸盐缓冲液混合，然后涡旋10s。在4℃下以16000g离心10min，将上清液转移到5mm nmr管中；
25.血清样品的1h-nmr波谱是在配备低温探头的brukerav-600核磁共振谱仪(brukerbiospin，germany)上采集。采样参数为：质子共振频率600.13mhz；仪器工作温度298k；采用典型的带压水的cpmg
26.(carr-purcell-meiboom-gill，[rd-90
°‑
(τ-180
°‑
τ)n-acq])脉冲序列，谱宽为
12019.2hz，采集时间为1.36s，弛豫延迟为4.0s，扫描次数为64次，采样点为16k；
[0027]
s3.血清1h-nmr谱图处理
[0028]
将采集到的1h-nmr谱图使用mestrenova(version 14.1.1,mestrelab research,s.l.，spain)软件进行处理。选用δ1.33ppm处的乳酸双峰作为标准对1h-nmr谱定标。将所有单一谱图叠加得到叠加谱图，观察谱峰对齐情况，稍作部分调整，当确定所有谱峰对齐后，去除δ4.70
–
δ5.17和δ5.50
–
δ6.00的光谱区域，其余谱图区域(δ0.55
–
δ8.60)以0.002ppm等间距分段积分；
[0029]
s4.血清代谢谱代谢物的鉴定和含量变化
[0030]
根据所得的血清1h-nmr谱图谱峰信息，结合chenomx nmr suite 8.1(chenomx inc.,edbonton,ab,canada)软件和公共人类代谢组数据库hmdb(humanmetabolome database,http://www.hmdb.ca/)对谱图谱峰信息进行解析，选取重叠最少的特征峰进行相应代谢物的定量及后续分析；
[0031]
s5.cpp女童的潜在生物标志物的筛选
[0032]
1h-nmr数据采用simca(version14.0,umetrics ab,umea,sweden)软件进行多元统计学分析，包括主成分分析(principal component analysis,pca)和正交投影偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,opls-da)。采用自适应换算方法(unit variance,uv)对数据集进行缩放，使每个变量具有相同的方差。首先，进行pca分析，判断各样本(pad，ad和pp女童)的代谢轮廓与代谢轮廓重叠情况，再进一步进行opls-da分析，根据潜在生物标志物的筛选标准，筛选出pp女童的生物标志物；
[0033]
进一步寻找cpp和ppp女童潜在生物标志物，首先分别运用pca分析了cpp女童与pad和ad女童的血清代谢谱，ppp女童与pad和ad女童的血清代谢谱。进一步进行opls-da分析，根据潜在生物标志物的筛选标准，筛选出cpp女童的生物标志物与ppp女童的生物标志物；
[0034]
s6.cpp女童特异性生物标志的物确定及生物标志物群的灵敏度和特异性的分析
[0035]
将筛选得到的pp、cpp和ppp女童的血清生物标志物，进行差异代谢组分析，以获得cpp和ppp女童的特异性生物标志物，并绘制venn图，得出cpp女童和ppp女童所特有的生物标记物。
[0036]
进一步，基于随机森林的探索性受试者操作特征(receiver operating characteristic，roc)曲线分析被用于测试疾病特异性生物标志物的敏感性，并确定相应roc曲线下面积(area under roc curve，auc)和置信区间(cl)，用于评价cpp女童特异性生物标志物和ppp女童特异性生物标志物的灵敏度和特异性。
[0037]
本发明的有益效果：
[0038]
1.本发明所筛选到的生物标志物具有良好的灵敏度和特异性，具有明显能区分于pad和ad女童的优越性，能够为诊断部分性性早熟女童提供良好的参考依据。
[0039]
2.本发明所筛选到的生物标志物，可用于制备组合物，诊断试剂，或试剂盒；可应用于中枢性性早熟女童的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的中枢性性早熟女童进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
[0040]
3.本发明所涉及的生物标记物的筛选方法，灵敏度和特异性高，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0041]
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0042]
图1.研究队列的纳入标准和筛选过程。
[0043]
*取决于测量方法。本研究采用免疫化学发光法检测基础lh和gnrh激发试验。
[0044]
lh:黄体生成素；
[0045]
fsh:促卵泡激素；
[0046]
ba：骨龄(诊断时)；
[0047]
ca：实际年龄(诊断时)；
[0048]
gnrh：促性腺激素释放激素。
[0049]
图2.pad,pp,ppp,cpp和ad女童血清的平均1h-nmr谱。
[0050]
为了清晰起见，δ6.00
–
8.60(在虚线框中)的谱图区域与δ0.50
–
6.00的谱图区域相比垂直放大了20倍。
[0051]
图3.血清样本的pca得分图。
[0052]
a:pp和pad女童；
[0053]
b:pp和ad女童；
[0054]
c:cpp,pad和ad女童；
[0055]
d:ppp,pad和ad女童。
[0056]
图4.血清样本的opls-da得分图。
[0057]
a1：pp和pad女童；
[0058]
a2：pp和ad女童；
[0059]
b1：cpp和pad女童；
[0060]
b2：cpp和ad女童；
[0061]
c1：ppp和pad女童；
[0062]
c2：ppp和ad女童。
[0063]
图5.pp,ppp和cpp女童的潜在生物标志物占比维恩图。
[0064]
图6.基于特异性生物标记物的探索性roc曲线分析(a)和pls-da模型验证(b)。
[0065]
a1:cpp女童与pad女童；
[0066]
a2:cpp女童与pad和ad女童；
[0067]
a3:ppp女童与pad女童；
[0068]
a4:ppp女童与pad和ad女童；
[0069]
b1:cpp女童与pad女童；
[0070]
b2:cpp女童与pad和ad女童；
[0071]
b3:ppp女童与pad女童；
[0072]
b4:ppp女童与pad和ad女童。
具体实施方式
[0073]
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
[0074]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0075]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0076]
实施例1
[0077]
1.研究队列的纳入标准和血清样本的收集
[0078]
选自210例血清样本，其中146例来自性早熟(pp)女童，36例为青春期前(pad)女童，28例为青春期(ad)女童。pp女童中有30例确诊为中枢性性早熟(cpp)，40例确诊为部分性性早熟(ppp)，诊断标准参见图1。所有样本受试者家属均被告知了研究的目的，并书面征求了所有受试者的家属的知情同意书。所有的血清样本均在清晨空腹下抽血，静置30min，然后在4℃下以1000g离心10min。分离血清后储存在-80℃冰箱中，直至分析。
[0079]
2.血清样品配置及nmr波谱检测
[0080]
血清样品在4℃下解冻，并将400μl血清与200μl ph为7.4的磷酸盐缓冲液(其中溶质为k2hpo4、nah2po4和nacl，k2hpo4和nah2po4的摩尔比为4:1；溶剂为重水；溶液中hpo
42-和h2po
4-浓度为60mmol/l，cl-的浓度是0.9％)混合，然后涡旋10s。在4℃下以16000g离心10min，将550μl上清液转移到5mm nmr管中
[0081]
进行1h-nmr波谱图采集。
[0082]
血清样品的1h-nmr波谱是在配备低温探头的brukerav-600核磁共振谱仪(brukerbiospin，germany)上采集。采样参数为：质子共振频率600.13mhz；仪器工作温度298k；采用典型的带压水的cpmg(carr-purcell-meiboom-gill，[rd-90
°‑
(τ-180
°‑
τ)n-acq])脉冲序列，谱宽为12019.2hz，采集时间为1.36s，弛豫延迟为4.0s，扫描次数为64次，采样点为16k。
[0083]
3.血清1h-nmr谱图处理
[0084]
将采集到的1h-nmr谱图使用mestrenova(version 14.1.1,mestrelab research,s.l.，spain)软件进行处理。为了提高信噪比，所有采集到的自由感应衰减信号(fids)均充零至64k个数据点，并乘以线宽为1.0hz的指数函数。将时域信号进行傅里叶变换后，通过手动相位调整和基线校正，得到纯吸收峰和无畸变谱。选用δ1.33ppm处的乳酸双峰作为标准对1h-nmr谱定标，避免由于ph值的差异引起的谱峰漂移。将所有单一谱图叠加得到叠加谱图，观察谱峰对齐情况，稍作部分调整。当确定所有谱峰对齐后，去除δ4.70
–
δ5.17和δ5.50
–
δ6.00的光谱区域，以消除残留水和尿素信号的干扰。其余谱图区域(δ0.55
–
δ8.60)以0.002ppm等间距分段积分，所得结果参见图2。为了消除不同样品由于浓度差异而造成的谱峰强度不同，将积分段数据进行全谱面积归一化到100后导出。
[0085]
4.血清代谢谱代谢物的鉴定和含量变化
[0086]
根据所得的血清1h-nmr谱图谱峰信息，结合chenomx nmr suite 8.1(chenomx inc.,edbonton,ab,canada)软件和公共人类代谢组数据库hmdb(human metabolome database,http://www.hmdb.ca/)对谱图谱峰信息进行解析，共鉴定出60个代谢物，详细参见图2和表1。为了避免谱峰重叠的影响，我们只选取重叠最少的特征峰进行相应代谢物的定量及后续分析。
[0087]
表1.女童血清1h-nmr谱代谢物的鉴定
[0088]
[0089]
[0090]
[0091][0092]
hmdb_id：表示代谢物在hmdb数据库中的编号。
[0093]1峰的多重性：s,单峰；d,双重峰；t,三重峰；q,四重峰；dd,双重双重峰；m,多重峰。
[0094]2下划线化学位移表示用于定量分析的代谢物的特征峰。
[0095]
5.pp,cpp,ppp女童的潜在生物标志物的筛选
[0096]
归一化后的1h-nmr数据采用simca(version14.0,umetrics ab,umea,sweden)软件进行多元统计学分析，包括主成分分析(principal component analysis,pca)和正交投影偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,opls-da)。采用自适应换算方法(unit variance,uv)对数据集进行缩放，使每个
变量具有相同的方差。
[0097]
pca是一种无监督模式的识别方法，可以帮助获得样本分布概况，识别出可能的异常值。opls-da是一种有监督的识别方法，用于最大化代谢差异，用于筛选组间的差异代谢物。模型的质量通过内部交叉验证参数r2和q2进行评估，其中r2表示模型的解释能力，q2表示模型的预测能力。采用以下标准筛选显著变化的代谢物：第一个是opls-da模型的变量重要性投影(variable importance of the projection,vip)值》1；第二个是代谢物水平经过年龄因素校正(采用线性回归分析校正年龄因素)后所得到的p值《0.05。
[0098]
首先，进行pad，ad和pp女童的pca分析，结果参见图3(3a和3b)，可以发现pp女童的代谢轮廓与pad和ad女童的代谢轮廓重叠比较明显。因此，进一步进行opls-da分析，结果参见图4(4a1和4a2)，在opls-da得分图中可以发现pp女童的代谢轮廓与pad和ad女童的代谢轮廓能明显区分，模型的相关参数参见表2，表明模型具有较好的解释能力和预测能力。根据潜在生物标志物的筛选标准，共筛选出pp女童的生物标志物16个，结果参见表3。
[0099]
表2.多元统计学分析的模型质量参数总结
[0100][0101][0102]
r2x：代表多元统计分析建模时，在x轴方向模型的累积解释率。
[0103]
r2y：代表在y轴方向模型的累积解释率。
[0104]
q2：代表模型的累积预测率。
[0105]
表3.pp女童血清中潜在的生物标志物
[0106][0107][0108]
vip:opls-da模型的变量重要性投影。
[0109]
fc:折叠变化(fc＝疾病组代谢物水平/对照组代谢物水平)。
[0110]
or：似然比。
[0111]
进一步寻找cpp和ppp女童潜在生物标志物，并从血清代谢组学上区分这两种分类，首先分别运用pca分析了cpp女童与pad和ad女童的血清代谢谱，ppp女童与pad和ad女童结果参见图3(3c和3d)，可以发现两类性早熟女童的代谢轮廓与pad和ad女童的代谢轮廓有部分重叠。因此，进一步进行opls-da分析，结果参图4(4b1-4c2)，在opls-da得分图中可以发现两类性早熟女童的代谢轮廓与pad和ad女童的代谢轮廓能明显区分，模型的相关参数参见表2。根据潜在生物标志物的筛选标准，共筛选出cpp女童的生物标志物23个，ppp女童的生物标志物25个，结果参见表4。
[0112]
表4.ppp和cpp女童血清中潜在的生物标志物
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117][0118]
vip:opls-da模型的变量重要性投影。
[0119]
fc:折叠变化(fc＝疾病组代谢物水平/对照组代谢物水平)。
[0120]
or：似然比。
[0121]
6.女童特异性生物标志的物确定及生物标志物群的灵敏度和特异性的分析
[0122]
将筛选得到的pp、cpp和ppp女童的血清生物标志物，进行差异代谢组分析，以获得cpp和ppp女童的特异性生物标志物，并绘制venn图，参见图5，可以发现pp、cpp和ppp女童的生物标记物存在部分重叠，这是可以理解的，因为它们具有相似的代谢特征。其中11个生物标志物为cpp女童所特有，包括谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、二羟基丙酮、蛋氨酸、次黄嘌呤、异丁酸、肌酐、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；8个生物标志物为ppp女童所特有，包括：1-甲基组氨酸、肌醇、n,n-二甲基甘氨酸、极低密度脂蛋白、甘油、鸟氨酸、天冬酰胺和甘氨酸。
[0123]
进一步，基于随机森林的探索性受试者操作特征(receiver operating characteristic，roc)曲线分析被用于测试疾病特异性生物标志物的敏感性，并确定相应roc曲线下面积(area under roc curve，auc)和置信区间(cl)，用于评价cpp女童特异性生物标志物和ppp女童特异性生物标志物的灵敏度和特异性。结果参见图6a，cpp和pad女童之间auc因11个特异性生物标记物的组合而异，范围在0.66-0.73之间，当11个特异性生物标记物被整合时，auc达到0.721(95％cl:0.553-0.874)(图6a1)；而在cpp和pad联合ad女童中，当11个特异性生物标记物被整合时，auc为0.646(95％cl:0.526-0.757)(图6a2)。ppp女童的特异性生物标记物显示出更高的敏感性，ppp和pad女童之间的auc因8个特异性生物标记物的组合而异，范围在0.97-0.98之间，当8个特异性生物标记物被整合时auc达到0.972(95％cl:0.904-1)(图6a3)。ppp和pad联合ad女童之间的auc在8个特异性生物标记物整合时，达到0.822(95％cl:0.698-0.92)(图6a4)，上述结果表明，cpp女童和ppp女童的特异性生物标记物具有良好的敏感性和特异性。
[0124]
为了进一步验证cpp女童特异性生物标志物在区分于pad和ad女童的优越性，以疾病的特异性生物标志物为变量重建偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,pls-da)模型，结果参见图6b。得分图显示了cpp和pad女童组间的代谢轮廓差异明显，(图6b1)；cpp女童与pad和ad女童组间的代谢轮廓差异明显(图6b2)，模型参数r2和q2均大于0.9，表明以11个cpp女童的特异性生物标志物构建的pls-da模型具
有极好的预测和解释能力，结果参见表2。ppp女童特异性生物标志物在区分于pad和ad女童的pls-da模型中也获得了类似的结果，(图6b3，b4和表2)，得分图显示了ppp和pad女童组间的代谢轮廓差异明显，(图6b3)；ppp女童与pad和ad女童组间的代谢轮廓差异明显(图6b4)，模型参数r2和q2均大于0.9，表明以8个ppp女童的特异性生物标志物构建的pls-da模型具有极好的预测和解释能力，结果参见表2。表明本发明研究筛选到的cpp，ppp女童的特异性生物标志物具有明显区分于pad和ad女童的优越性。
[0125]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。