从粪便提取肠上皮细胞DNA的方法与流程

从粪便提取肠上皮细胞dna的方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域。具体地属于分离提取核酸有关的技术，涉及一种粪便提取人细胞特定dna方法。


背景技术：

2.结直肠癌(crc,肠癌)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,对男性和女性均有影响。随着人们生活习惯的改变,其发病率和死亡率均明显上升。早期肠癌患者手术5年生存率达90％以上,而中晚期患者5年生存率仅10％左右。越早被发现，肠癌就越容易治疗。因此，早发现，早诊断，早治疗对肠癌显得尤为重要。
3.目前，传统的肠癌检测方法有多种，但均存在不足。(1)粪便隐血检测(fobt/fit):临床常用，检测简便，成本低，受检者可自行取样，但灵敏度和特异性较低。(2)ct检查：对早期以及小直径病灶检出率有限，且存在辐射。(3)肠镜检查：肠癌诊断的金标准，但侵入性强，患者依从性低，有肠穿孔和麻醉风险。
4.近年来，基因诊断在人类多种肿瘤、疾病的早诊、治疗以及预后评估中受到广泛重视。其中对肠癌相关基因的研究，使得通过粪便dna检测辅助诊断结直肠癌成为一种可能。
5.肠道上皮细胞3-4天更新一次，普通人每天大约有10
10
个上皮细胞从肠壁脱落随粪便排出。在肠道肿瘤形成过程中，肿瘤细胞可一起流入结肠随粪便排出，而且肿瘤细胞比正常细胞生长快粘附力差、更易脱落。
6.进入粪便的脱落细胞中含有相应的dna，包含与肿瘤密切相关的遗传信息(如基因突变，甲基化等)，为结直肠癌早期检测提供了稳定的物质基础。通过检测这些dna标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁的存在，可以对肠道的健康状况进行评估。粪便dna检测作为一种新兴的肠癌无创筛查，其灵敏性和特异性均优于单独粪便fit潜血检测，更是一种无创、无痛，用户依从性好的筛查方式。
7.成功实施粪便脱落细胞肠癌相关基因检测的重要前提条件是：必需从粪便提取高质量的肠上皮细胞dna。从肠道内壁脱落的细胞只占粪便中很小的一部分，提取得到的肠道上皮细胞dna含量少。许多有价值的遗传标记在样本中的含量极低，传统方法和试剂盒主要设计用于从小样本制备dna，质量多小于1克的样本。因无法从大样本中制备足够数量的高浓度dna，不适用于高灵敏度和高特异性对人肠道脱离细胞做基因分析。此外，传统技术不能有效去除抑制剂。粪便中含有的大量pcr抑制性物质，如多糖、血红素化合物和胆盐。而且由于粪便中含有很多的细菌，核酸内切酶，导致样品dna容易降解，所以采集的粪便样品保存方法及保存液亦起着非常关键的作用。传统方法和试剂盒的保存方法多需要低温处理，即冷冻保存。
8.为实现稳定可靠的肠癌基因分子诊断，需要解决如何优先从粪便中提取足量且无抑制剂的肠道上皮细胞dna技术。


技术实现要素：

9.本发明针对目前粪便dna提取存在的不足之处，提供一种快速简便、低成本、可靠的人粪便特异性目标dna提取方法。
10.本发明第一方面提供一种从粪便样品中富集细胞dna的非诊断方法，包括步骤：
11.(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，
12.(2)将混合物与pvpp接触，获得去除抑制剂的dna，
13.任选的(3)将dna与离液盐接触。
14.在一个或多个实施方案中，所述细胞是肠上皮细胞。
15.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，例如-30℃至0℃，优选-20℃至-10℃。
16.在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含edta、tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。edta的浓度为0.1-5m，优选0.1-1m。tris的浓度为0.05-5m，优选0.1-1m。碱金属盐的浓度为1-200mm，优选1-50mm。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
17.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：将粪便样品与细胞裂解液以2％-50％(g/ml)混匀，冷冻孵育2-24小时，解冻后混匀。
18.在一个或多个实施方案中，粪便样品与细胞裂解液的比例优选10-30％，更优选约20％。
19.在一个或多个实施方案中，步骤(1)还包括固液分离获得上清的步骤。
20.在一个或多个实施方案中，冷冻孵育5-18小时，优选10-15小时。
21.在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：在含dna的混合物(上清)中加入终浓度1-20％(g/ml)的pvpp后孵育。所述孵育优选搅拌孵育，例如10-2000rpm，优选200-600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5-60min，优选10-30min。pvpp的终浓度优选2-10％，更优选约5％。
22.在一个或多个实施方案中，步骤(2)还包括固液分离从而移除pvpp的步骤。去除抑制剂的dna在液体中。
23.在一个或多个实施方案中，离液盐是异硫氰酸胍，其在液体中的终浓度为1.0-5.0m，优选2.0-3.0m。
24.本发明第二方面提供一种从粪便样品中分离或检测靶dna的非诊断方法，包括步骤：
25.(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，
26.(2)将混合物与pvpp接触，获得去除抑制剂的dna，
27.任选的(3)将dna与离液盐接触，
28.(4)使针对靶dna的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述dna接触，
29.(5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的dna，从而分离或检测靶dna。
30.在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含edta、tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。edta的浓度为0.1-5m，优选0.1-1m。tris的浓度为0.05-5m，优选0.1-1m。碱金属盐的浓度为1-200mm，优选1-50mm。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
31.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，例如-30℃至0℃，优选-20
℃至-10℃。
32.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：将粪便样品与细胞裂解液以2％-50％(g/ml)的比例混匀，冷冻孵育2-24小时，解冻后混匀。粪便样品与细胞裂解液的比例优选10-30％，更优选约20％。
33.在一个或多个实施方案中，步骤(1)还包括固液分离获得上清的步骤。
34.在一个或多个实施方案中，冷冻孵育5-18小时，优选10-15小时。
35.在一个或多个实施方案中，粪便样品与裂解液的比例为10％-30％。
36.在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：在含dna的混合物(上清)中加入2-20％pvpp后孵育。所述孵育优选搅拌孵育，例如10-2000rpm，优选200-600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5-60min，优选10-30min。pvpp的终浓度优选2-10％，更优选约5％。
37.在一个或多个实施方案中，步骤(2)还包括固液分离从而移除pvpp的步骤。
38.在一个或多个实施方案中，离液盐是异硫氰酸胍，其在反应液中的终浓度为5-50％，优选20-40％。
39.在一个或多个实施方案中，所述靶dna是包含sept9、sdc2或actb基因的dna片段。
40.在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸捕获探针包含seq id no:1-3中任一所示的序列。
41.在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸捕获探针捕获探针包含标记部分，例如生物素。
42.在一个或多个实施方案中，步骤(5)包括：使用结合剂选择性捕获靶dna，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针捕获探针的标记部分选择性结合。所述结合剂可以是与生物素选择性结合的试剂，例如亲和素或链霉亲和素。
43.在一个或多个实施方案中，步骤(5)中的检测靶dna是对靶dna进行甲基化检测。
44.在一个或多个实施方案中，所述结合剂与固相载体偶联，从而通过物理(例如磁性吸附或离心)或化学过程纯化靶dna。所述方法还包括使用洗脱液(例如te)从固相载体上洗脱dna的步骤。
45.本发明还提供pvpp，或pvpp和寡核苷酸捕获探针在制备用于从粪便样品中富集肠癌肿瘤细胞dna，或分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶dna的试剂盒中的用途，其中，在粪便样品经细胞裂解液处理后，将获得的含dna的混合物与pvpp接触，获得去除抑制剂的dna。
46.在一个或多个实施方案中，pvpp在所述混合物中的浓度为2-20％(g/ml)。
47.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含细胞裂解液。
48.在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含edta、tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。edta的浓度为0.1-5m，优选0.1-1m。tris的浓度为0.05-5m，优选0.1-1m。碱金属盐的浓度为1-200mm，优选1-50mm。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
49.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含离液盐，所述离液盐优选是异硫氰酸胍，其在反应液中的终浓度为5-50％，优选20-40％。
50.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含结合剂，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针的标记部分选择性结合。优选地，所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂，例如亲和素或链霉亲和素。
51.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与所述结合剂偶联的固相载体，例如磁颗粒。
52.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含dna甲基化检测所需的试剂。
53.在一个或多个实施方案中，所述靶dna是包含sept9、sdc2或actb基因的dna片段。
54.在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸捕获探针包含seq id no:1-3中任一所示的序列。
55.在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸捕获探针包含标记部分，例如生物素。
56.在一个或多个实施方案中，在粪便样品经细胞裂解液处理后，将获得的含dna的混合物与pvpp孵育。所述孵育优选搅拌孵育，例如10-2000rpm，优选200-600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5-60min，优选10-30min。
57.在一个或多个实施方案中，富集肠癌肿瘤细胞dna的方法包括以下步骤：
58.(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，
59.(2)将混合物与pvpp接触，获得去除抑制剂的dna，
60.任选的(3)将dna与离液盐接触。
61.优选地，富集肠癌肿瘤细胞dna的方法如本发明第一方面所述。
62.在一个或多个实施方案中，富集、分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶dna的方法包括以下步骤：
63.(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，
64.(2)将混合物与pvpp接触，获得去除抑制剂的dna，
65.任选的(3)将dna与离液盐接触，
66.(4)使针对靶dna的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述dna接触，富集靶dna，
67.(5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的dna，从而分离或检测靶dna。
68.优选地，富集、分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶dna的方法如本发明第二方面所述。
69.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，例如-30℃至0℃，优选-20℃至-10℃。
70.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：将粪便样品与细胞裂解液以2％-50％(g/ml)的比例混匀，冷冻孵育2-24小时，解冻后混匀。
71.在一个或多个实施方案中，粪便样品与细胞裂解液的比例优选10-30％，更优选约20％。
72.在一个或多个实施方案中，步骤(1)还包括固液分离获得上清的步骤。
73.在一个或多个实施方案中，冷冻孵育5-18小时，优选10-15小时。
74.在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：在含dna的混合物(上清)中加入2-20％pvpp后孵育。所述孵育优选搅拌孵育，例如10-2000rpm，优选200-600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5-60min，优选10-30min。pvpp的终浓度优选2-10％，更优选约5％。
75.在一个或多个实施方案中，步骤(2)还包括固液分离从而移除pvpp的步骤。
76.在一个或多个实施方案中，步骤(5)包括：使用结合剂选择性捕获靶dna，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针的标记部分选择性结合。所述结合剂例如亲和素。
77.在一个或多个实施方案中，步骤(5)中的检测靶dna是对靶dna进行甲基化检测。
78.在一个或多个实施方案中，所述结合剂与固相载体偶联，从而通过物理(例如磁性吸附或离心)或化学过程纯化靶dna。所述方法还包括使用洗脱液(例如te)从固相载体上洗脱dna的步骤。
79.本发明还提供一种从粪便样品中富集细胞dna，或分离或检测细胞中靶dna的试剂盒，包含细胞裂解液和pvpp，任选还包含离液盐。
80.在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含edta、tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。edta的浓度为0.1-5m，优选0.1-1m。tris的浓度为0.05-5m，优选0.1-1m。碱金属盐的浓度为1-200mm，优选1-50mm。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
81.在一个或多个实施方案中，所述离液盐是异硫氰酸胍。优选地，异硫氰酸胍在反应液中的终浓度为5-50％，优选20-40％。
82.在一个或多个实施方案中，所述靶dna是包含sept9、sdc2或actb基因的dna片段。
83.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含针对所述靶dna的寡核苷酸捕获探针。在一个或多个实施方案中，寡核苷酸捕获探针的序列如seq id no:1-3中任一所示。
84.在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸捕获探针包含标记部分，例如生物素。
85.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含结合剂，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针的标记部分选择性结合。优选地，所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂，例如亲和素或链霉亲和素。
86.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与所述结合剂偶联的固相载体，例如磁颗粒。
87.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含dna甲基化检测所需的试剂。
附图说明
88.图1，使用本发明方法富集的dna进行actb甲基化检测在肠癌病人及正常人粪便标本中的检测结果。
89.图2，使用本发明方法富集的dna进行sept9甲基化检测在肠癌病人及正常人粪便标本中的检测结果。
90.图3，使用本发明方法富集的dna进行sdc2甲基化检测在肠癌病人及正常人粪便标本中的检测结果。
具体实施方式
91.为了提高对粪便中来自人dna检测的有效性、准确性和特异性，发明人开发了由粪便富集和检测dna的方法。
92.本发明首先提供一种从粪便样品中富集细胞dna的方法，包括步骤：(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，和(2)将混合物与pvpp接触，和任选的(3)将dna与离液盐接触。
93.本发明还提供实施上述方法的试剂盒，包含细胞裂解液和pvpp，任选还包含离液盐。所述试剂盒还包含寡核苷酸捕获探针、结合剂，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针或其标记部分选择性结合。
94.本文中，“富集”是提高目标物质相对含量的过程，其含义涵盖分离、纯化等。通常，“纯化”和“移除”涉及将不需要的物质与目标物质(或含目标物质的混合物)分开的过程。所述分开优选利用物质的物理特性，例如质量、体积、尺寸、磁性等进行，例如离心、过滤、磁性吸附等。
95.本文中，“细胞裂解液”包含本领域已知适用于动物细胞裂解的试剂，例如edta、缓冲试剂、碱金属盐。优选的缓冲试剂是tris，优选的碱金属盐是氯化钾、氯化钠或氯化锂。
96.通常，粪便样品与细胞裂解液的比例不受限制，只要其中的细胞可以被充分裂解即可。发明人发现，以10-30％，优选约20％(g/ml)的比例混合粪便样品和细胞裂解液并冷冻孵育12小时可以有效裂解粪便样品中的动物细胞。所述冷冻优选约-20℃。
97.在细胞裂解后，本发明方法包括去除影响基因检测(如pcr等)的抑制性物质的步骤，包括采用抑制剂去除剂聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)去除粪便中含有的大量抑制性物质，如多糖、血红素化合物和胆盐。即使是少量的抑制物质存在也会影响这些用于检测如此少量目标物的分析的准确性和精密度。pvpp在样品(裂解后)中的终浓度优选2-10％，更优选约5％。加入pvpp后，对样品混合物进行搅拌孵育，例如10-2000rpm，优选200-600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5-60min，优选10-30min。
98.本文中，离液盐是对水有高亲和力的盐。优选的离液盐是异硫氰酸胍或盐酸胍，特别优选异硫氰酸胍。
99.本文方法富集的细胞dna可以直接用于后续实验，特别适用于基因突变、基因甲基化检测、杂交捕获实验。因此，本发明进一步还提供一种从粪便样品中分离、鉴定或检测靶dna的方法，包括步骤：(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含dna的混合物，(2)将混合物与pvpp接触，去除抑制剂，获得富集的dna，任选的(3)将dna与离液盐接触，(4)使针对靶dna的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述dna接触，和(5)分离或检测寡核苷酸捕获探针，从而分离、鉴定或检测靶dna。分离的靶dna用于科学实验和研究。
100.本文中，核酸“杂交”是指互补的核苷酸序列(dna与dna、dna与rna、rna与rna等)通过碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的双链分子的过程。本文所述杂交的条件没有特殊限制，只要能在寡核苷酸捕获探针和靶dna之间形成稳定碱基配对即可。示例性的杂交包括90℃变性10min和室温孵育60min的步骤。
101.为了便于后续纯化，所述寡核苷酸捕获探针包含可被结合剂选择性识别的捕获部分，例如生物素。相应的结合剂例如亲和素或链霉亲和素。通过将结合剂与固相载体偶联，可以方便地纯化寡核苷酸捕获探针以及与其杂交的靶dna。此外，为了便于检测，所述寡核苷酸捕获探针还可包含可检测标记物，例如放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。
102.在捕获sept9、sdc2或actb基因的实施例中，所述寡核苷酸捕获探针包含seq id no:1-3中任一所示的序列。
103.具体地，本发明的从粪便样品中富集特定dna的方法包括步骤：
104.(1)将粪便样品与裂解液混匀，置于-20℃冷冻过夜，室温解冻后混匀，离心，
105.(2)在上清液中加入pvpp，400rpm搅拌15min，离心去除pvpp，
106.(3)在上清液中加入异硫氰酸胍，
107.(4)与生物素偶联的捕获探针混合并杂交(90℃变性10min，室温杂交60min)
108.(5)加亲和素偶联的磁颗粒，室温孵育60min，
109.(6)分离磁颗粒并用80％乙醇洗磁颗粒3次，
110.(7)加入te，70～80℃孵育10min洗脱dna。
111.本发明方法分离的靶dna可以直接用于分子生物学实验。实施例中示例性显示了利用本发明方法捕获的sept9、sdc2或actb基因进行甲基化检测的方法，包括步骤：亚硫酸盐转化处理捕获的dna、纯化dna、甲基化pcr检测sept9和/或sdc2基因并任选检测对照基因actb。
112.因此，除了包含上述细胞裂解液、pvpp、离液盐，以及任选包含的寡核苷酸捕获探针、结合剂之外，本文所述试剂盒还可包含dna甲基化检测所需的试剂，这样的试剂包括但不限于选自以下的一种或多种：亚硫酸盐、盐酸胍、漂洗液、脱硫液、te缓冲液、甲基化检测特异引物、甲基化检测特异探针。在检测sept9的甲基化的实施方案中，引物包括seq id no:4和5，并且任选还包含用于对照actb的seq id no:8和9；探针包括seq id no:10，任选还包含用于对照actb的seq id no:12。在检测sdc2的甲基化的实施方案中，引物包括seq id no:6和7，并且任选还包含用于对照actb的seq id no:8和9；探针包括seq id no:11，任选还包含用于对照actb的seq id no:12。
113.实施例
114.实施例1，肠癌病人粪便脱落细胞sept9、sdc2及actb dna提取
115.粪便标本采集：
116.收集4例肠癌病人粪便约8g置40ml粪便样品裂解液保存。另收集4例正常人粪便做对照。所述的粪便裂解液由0.1m edta，0.5m tris，10mm nacl(ph7)，以及氨苄青霉素和链霉素配制而成。
117.粪便标本匀浆制备：
118.标本收到后，将容器在震荡器上充分混匀标本
119.将匀浆样品(45ml)转移至50ml离心管，放置在-20℃冷冻过夜
120.将冷冻粪便样品取出，室温解冻，震荡器上充分混匀
121.4500g离心30-45min
122.取12ml上清液
123.加0.6g抑制剂去除剂pvpp充分混匀后，室温400rpm搅拌15min
124.4500g离心10-20min，去除pvpp
125.吸取10ml上清液，加2.83g/10ml异硫氰酸胍
126.加5pmol sept9，sdc2及actb biotin-捕获oligo dna
127.所述目的基因sept9，sdc2及actb寡核苷酸捕获探针特异片段序列：
128.seq id no:1(sept9):biotin-cgccggaggagcccctaggccccctggctcagctg
129.seq id no:2(sdc2):biotin-ctgcactcccgacacggagttggtgctccgggaag
130.seq id no:3(actb):biotin-ccttgtcacacgagccagtgttagtacctacacc
131.90℃变性10min，室温杂交60min(摇床轻度晃动)
132.加250μl avidin-磁珠，室温60min
133.用磁力架吸附珠子，去上清液
134.750μl 80％乙醇洗磁珠3次
135.dna洗脱：40μl te，70～80℃，10min震荡混匀 磁力架，收集上清测od值定量：dna
浓度为100～200ng/μl，od260/280值1.6～2.0
136.实施例2，对优先从肠癌粪便提取特异性dna进行sept9，sdc2甲基化检测
137.取实施例1中从粪便提取的特异性dna(含sept9，sdc2及actb)0.1μg
138.1)dna经亚硫酸盐转化处理
139.在0.5ml pcr管中配制亚硫酸盐转化反应体系，具体配制体系如下:
140.dna样品
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μl
141.dna保护液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10μl
142.10m亚硫酸盐转化溶液 130μl
143.反应体系配制好后，在pcr仪设置温度变化程序进行亚硫酸盐转化
144.[95℃ 5min，60℃ 20min]x2循环4℃保持
[0145]
2)dna亚硫酸盐处理后的纯化
[0146]
经过简短离心将管中反应体系转移至干净的1.5ml离心管中
[0147]
加入1ml 6m盐酸胍和40μl磁珠，涡旋混匀10sec，室温静置5min
[0148]
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体
[0149]
加入600μl漂洗液(80％etoh/50mm tris buffer)，涡旋混匀10sec
[0150]
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体
[0151]
加入600μl脱硫液(0.3n naoh/90％etoh)，涡旋混匀10sec，室温放置15min
[0152]
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体
[0153]
加入600μl漂洗液(80％etoh/50mm tris buffer)，涡旋混匀10sec
[0154]
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体
[0155]
重复漂洗液漂洗一次
[0156]
短暂离心将残余液体收集至管底，尽量去尽液体
[0157]
室温晾干3～5min至无液体残余
[0158]
加入20～40μl预热1xte缓冲液(50℃)并混匀磁珠，室温放置3min
[0159]
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后收集洗脱产物(即为转化dna)
[0160]
3)甲基化real-time pcr检测sept9，sdc2基因甲基化
[0161]
所述pcr检测甲基化基因sept9，sdc2及对照基因actb引物及taqman探针如下
[0162]
所述real-time pcr引物序列
[0163]
seq id no:4.sept9_mf：gttagttttgtattgtaggagcg
[0164]
seq id no:5.sept9_mr：aaaaacaacgacgaaaaaacg
[0165]
seq id no:6.sdc2_mf：ttaataagtgagagggcgtcgc
[0166]
seq id no:7.sdc2_mr：cgactcaaactcgaaaactc
[0167]
seq id no:8.actb-mf：tggtgatggaggaggtttagtaagt
[0168]
seq id no:9.actb-mr：aaccaataaaacctactcctcccttaa所述taqman探针序列
[0169]
seq id no:10.sept9探针：fam-cgacgaaacccgaaccctacgcg-bhq1
[0170]
seq id no:11.sdc2探针：rox-cgtagttgcgggcggcgggagtaggc-bhq2
[0171]
seq id no:12.actb探针：cy5-tgtgtttgttattgtgtgttgggtggtggt-bhq3
[0172]
亚硫酸盐转化的dna用于real-time pcr
[0173]
各取0.25μl引物(sept9_mf,sept9_mr,sdc2_mf，sdc2_mr，actb_mf，actb_mr)
[0174]
以及0.125μl荧光探针(sept9探针，sdc2 taqman探针，actb taqman探针)，
[0175]
6μl 4x hu mp buffer
[0176]
2μl enzyme mix
[0177]
5μl亚硫酸盐转化dna
[0178]
同时取未转化dna设置为对照
[0179]
设置基因甲基化pcr反应条件
[0180]
95℃5min
[0181]
45cycles(95℃15sec，61℃30sec)
[0182]
72℃30sec
[0183]
pcr反应结束，检测荧光信号
[0184]
针对甲基化actb及甲基化sept9，sdc2的pcr在未转化肠癌病人及正常人粪便标本dna均未检测到扩增信号。
[0185]
甲基化检测actb在转化肠癌病人及正常人粪便标本dna均检测到扩增信号ct为～30(图1)。
[0186]
甲基化检测sept9、sdc2在正常人转化dna中未见有扩增信号(图2，图3)。
[0187]
甲基化检测sept9、sdc2在肠癌病人转化dna中检测到扩增信号ct为～35(图2，图3)。