褐飞虱NCS2基因或编码的蛋白作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用

褐飞虱ncs2基因或编码的蛋白作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及褐飞虱ncs2基因或编码的蛋白作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用。


背景技术：

2.细胞内钙离子是真核细胞中重要的第二信使。钙离子结合蛋白介导了细胞内钙信号传导。大多数钙离子结合蛋白含有一对或多对ef-hand结构域。ef-hand结构域对钙离子具有很高的亲和性。ef-hand结构域通常为29个氨基酸并且具有螺旋-环-螺旋的结构(tsujimoto t，jeromin a， saitoh n，roder jc，takahashi t.2002.neuronal calcium sensor 1 andactivity-dependent facilitation of p/q-type calcium currents at presynapticnerve terminals.science，295(5563)：2276-2279.)。神经钙离子感受器 (ncs)家族成员属于含有ef-hand结构域的钙离子结合蛋白。ncs基因往往在神经系统特异性高表达，主要功能是调控神经递质释放、细胞表面受体和离子通道、基因转录、神经元生长、发育以及生存(mccue hv， haynes lp，burgoyne rd.2010.the diversity of calcium sensor proteins inthe regulation of neuronal function.cold spring harbor perspectives inbiology，2(8)：a004085.)。ncs2是一个新发现的ncs家族成员，迄今为止ncs2仅存在于线虫和昆虫中。ncs2的功能也只在线虫中进行过研究，其在线虫的神经突触兴奋和抑制平衡中具有重要作用。然而，不同于线虫的ncs2蛋白结构，昆虫的ncs2蛋白只含有三个ef-hand结构域。由于昆虫ncs2蛋白功能不清，于是我们以模式昆虫褐飞虱作为研究对象解析ncs2蛋白的生理功能。褐飞虱(学名nilaparvata lugens，英文名brown planthopper)只取食水稻汁液，引起植株萎焉枯死，是当前我国乃至亚洲水稻生产的重要害虫。褐飞虱常呈现间歇猖獗态势，暴发年份虫量激增。目前对于褐飞虱爆发成灾的发生规律及灾变机制缺乏足够的理解。为了遏制褐飞虱为害水稻作物，现阶段普遍采取化学防治的手段，但往往事倍功半。杀虫剂施用在杀伤褐飞虱天敌的同时刺激了害虫繁殖，形成种群再猖獗态势，同时也加剧了环境污染，带来农产品质量安全风险。鉴于褐飞虱已成为危及我国水稻粮食安全和生态安全的最严重的生物灾害，找到有效的害虫靶标基因，通过生物防治的方法减轻目标害虫对水稻作物造成的经济损失具有重要的科学意义。褐飞虱具有系统性rnai现象，系统性rnai能够高效而且长时间地沉默宿主基因的表达，因此褐飞虱已成为运用rnai研究基因功能的新的模式昆虫。由于 ncs2基因只存在于昆虫和线虫中，因而利用该基因生产转基因植物对包括人类在内其他动物不会产生毒副作用，因而在保障粮食安全中将能够发挥重大作用。


技术实现要素：

3.本发明提供了褐飞虱ncs2基因作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用以及褐飞虱ncs2基因的dsrna和其在制备防治褐飞虱药物中的应用，该基因能够实现对环境友好
的绿色害虫防控策略，提高转基因水稻作物的抗虫性，为培育抗水稻害虫新品种提供新的基因资源。
4.具体技术方案如下：
5.本发明提供了褐飞虱ncs2基因或编码的蛋白作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用。
6.本发明提供了褐飞虱ncs2基因或编码的蛋白作为靶点在制备降低褐飞虱产卵量的药物中的应用。
7.所述ncs2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；ncs2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.优选的，所述褐飞虱为2-5龄期若虫。
9.本发明提供了一种褐飞虱ncs2基因的dsrna，所述dsrna由两条互补的序列组成，正义链的核苷酸序列如seq id no.3所示，反义链的核苷酸序列为如seq id no.3所示的序列的反向互补序列。
10.上述序列经简单缺失、修饰等变换后，仍能达到本发明所示序列基本相同的抑制效果的核苷酸序列，也应当属于本发明保护范围。
11.本发明还提供了一种防治褐飞虱的药物，其活性成分为如下(1)或 (2)中的一种：
12.(1)用于降低褐飞虱ncs2基因表达的dsrna或sirna；
13.(2)用于编码(1)中sirna的编码基因。
14.本发明还提供了一种防治褐飞虱的方法，使用所述的药物。
15.所述褐飞虱为2-5龄期若虫。
16.无论干扰低龄(2龄)若虫还是高龄(5龄)若虫，均只有约20％左右的若虫发育成为成虫。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.(1)本发明发现水稻害虫褐飞虱ncs2基因在防治褐飞虱中的作用，由于褐飞虱具有高效的rna interference(rnai)效果，可以利用这一优势干扰褐飞虱ncs2基因在虫体内的表达。通过rnai技术获得ncs2基因的dsrna，并通过显微注射的方式沉默ncs2基因后，以降低其转录水平，能够有效抑制褐飞虱个体发育、卵巢发育和降低产卵量，达到抑制害虫生长发育和生殖的能力，从而抑制褐飞虱的繁殖，实现褐飞虱的防治。
19.(2)本发明在进行ncs2基因功能研究时发现运用rnai技术干扰该基因在褐飞虱2-5龄期若虫的表达时产生了明显的致死效果。
附图说明
20.图1为本发明ncs2基因的pcr鉴定图。
21.图2为本发明合成的双链dsncs2的鉴定图。
22.图3为本发明干扰ncs2基因的2-5龄若虫的死亡率图。
23.图4为本发明干扰ncs2基因的初羽化雌成虫的产卵情况图；**表示 p＜0.01。
24.图5为本发明干扰ncs2基因的卵母细胞在卵巢中的形成情况图。
具体实施方式
25.实施例1
26.水稻害虫褐飞虱ncs2基因。
27.步骤1：褐飞虱总rna提取及ncs2基因克隆
28.将褐飞虱成虫(100mg)置于研磨管中，加入适量的二氧化硅研磨珠和1ml trizol试剂，用组织研磨仪在60hz震荡研磨3次，每次30秒，冰上静置3分钟。样品在12000rpm，4℃离心10分钟，吸取上清800μl 至新的1.5ml rnase free ep管；加入500μl氯仿，剧烈震荡30秒，室温静置3分钟。于12000rpm，4℃，离心10分钟，吸取上清液至新的1.5mlrnase free ep管，加入等体积异丙酮，温和地上下颠倒混匀30秒，室温静置20分钟。12000rpm，4℃，离心20分钟，离心管底部可见沉淀，弃上清液。沿管壁缓慢加入1ml 75％无rna酶的乙醇(v/v)洗涤。7500rpm， 4℃，离心5分钟，弃上清液，在通风厨中开盖静置，管底部沉淀呈半透明状后，加入20μl rnase free ddh2o充分溶解，用nanodrop 2000测定 rna浓度和质量。
29.步骤2：rna反转录
30.吸取1000ng步骤1中制备的rna于rnase free pcr管中，用rnasefree ddh2o补足至12μl。加入4μl 4
×
gdna wiper mix，混匀，置于pcr 仪中42℃加热2分钟。加入4μl 5
×
hiscript ii qrt supermix ii，混匀，置于pcr仪中，反应程序：50℃，15分钟；85℃，1分钟。向产物中加入 180μl ddh2o进行稀释，-20℃保存。
31.步骤3：ncs2基因片段克隆
32.首先合成如下含有t7启动子的特异性pcr引物：
33.forward：
[0034][0035]
reverse：
[0036][0037]
下划线序列为t7启动子序列。
[0038]
pcr反应体系
[0039]
试剂体积cdna1μlpcr forward primer(10μm)1μlpcr reverse primer(10μm)1μlgreen taq mix25μlddh2o22μl
[0040]
pcr反应参数：95℃，预变性3分钟；95℃，变性30秒；60℃，退火1分钟，72℃，延伸1分钟，共40个循环；72℃总延伸10分钟。pcr 产物经琼脂糖凝胶电泳确认，回收相应片段用dna胶回收试剂盒回收，再利用ta克隆试剂盒将胶回收得到的目的基因构建到pmd19-t载体上。
[0041]
步骤4：转化大肠杆菌
[0042]
从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，冰上解冻5min，将重组的 pmd19-t载体加入感受态中，轻轻震荡混匀，冰浴30min。将上述样品放入42℃水浴锅中，水浴90s，立即冰
浴2min。加入1ml无抗lb液体培养基，在37℃220rpm的摇床上培养2小时。培养好的菌液在6000rpm条件下，离心10min，弃掉部分液体，剩余100μl液体重悬浮沉淀，并涂布在含有amp

抗性的lb平板上；37℃细菌培养箱中，倒置培养12小时。将单菌落挑取至1ml含有amp

抗性的lb液体培养基中，37℃220rpm 摇床，培养3小时。吸取500μl浑浊的菌液送至生物公司测序(abi3730xl 全自动测序仪；浙江尚亚生物技术有限公司)，获得6421bp的基因ncs2 (核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如seq idno.2所示)，提取的质粒命名为pmd-ncs2。
[0043]
实施例2
[0044]
1、dsrna的合成
[0045]
运用如下含有t7启动子的特异性引物：
[0046]
forward：
[0047][0048]
reverse：
[0049][0050]
下划线序列为t7启动子序列。
[0051]
dsgfp引物序列如下
[0052]
dsgfp-f：
[0053][0054]
dsgfp-r：
[0055][0056]
以实施例1抽提的重组质粒pmd-ncs2为模板，通过上述引物pcr 扩增出一段550bp左右的高浓度dna片段(核苷酸序列如如seq id no.4 所示)，以此为模板合成dsncs2(正义链的核苷酸序列如seq id no.3所示，反义链的核苷酸序列为seq idno.3所示的序列的反向互补序列)， dsgfp合成的模板为公知序列。
[0057]
配制双链rna合成反应体系：
[0058]
atp溶液、utp溶液、ctp溶液、gtp溶液各2μl，10
×
reaction buffer 2μl，t7 rna polimerase mix 2μl，dna模板8μl。反应体系混匀，于37℃恒温培养箱孵育14h。加入1μl dnase i，37℃金属浴孵育15分钟，去除 dna模板。取1μl dsrna产物，用琼脂糖凝胶电泳检测dsrna质量，-80℃保存。
[0059]
2、dsrna显微注射
[0060]
显微注射针头制备。用微电极拉针仪(p-97micropipette puller)将 0.6mm口径毛细玻璃管制成显微注射针头，拉针仪程序为：heat＝750， pull＝300，velovcity＝150，time＝150。dsrna显微注射。将褐飞虱用co2麻醉15-30秒，用毛笔挑取褐飞虱摆放在预冷的2％琼脂糖凝胶浅槽上，虫体腹面向上。将合成的dsrna加入到显微注射针头中，并将针头固定在移动机械臂上；根据褐飞虱龄期，用解剖镊掐成适合大小，显微注射仪 (femtojet 4
×
)设定参数为：注射压900pah、注射时间0.3秒、补偿压10pah；操纵机械臂从褐飞虱胸部第二对和第三对足基部中间柔软处将dsrna注射进虫体内。将注射完成的褐飞虱放入有新鲜水稻苗的透明罐子中，用纱网封口，放在人工气候室培养观察。
[0061]
3、实施rnai后对褐飞虱生长发育的影响
[0062]
选择在水稻苗上饲育的2，3，4及5龄若虫，每头注射约100ng dsncs2。注射后放置于水稻苗观察24小时，而后转移至新的水稻苗观察褐飞虱生长发育情况并统计死亡率。结果显示，注射了dsncs2的2-5龄若虫在干扰后第二天存活率超过76％，此后很快下降，至第14天存活率只有 16-24％。而注射了dsgfp的对照组2-5龄若虫在干扰后第二天存活率超过88％，到第14天时存活率依旧达到67-86％。表明注射dsncs2和dsgfp 的褐飞虱存活率差异极显著。
[0063]
4、实施rnai后对褐飞虱生殖的影响
[0064]
选择在水稻苗上饲育的4龄若虫，每头注射约100ng dsncs2。注射后放置于水稻苗，羽化后进行雌雄虫交配，交配进行4天。然后从水稻苗上移去雌雄成虫，观察若虫在水稻苗上的孵化情况并统计孵化率。结果显示，干扰dsncs2的雌雄成虫在交配后，雌虫没有产卵，即产卵率为0；注射 dsncs2的雌成虫与注射dsgfp的雄成虫交配后，超过80％的雌虫不产卵，仅有三头雌虫产生平均18个卵。而注射了dsgfp的雌雄成虫交配后，每头雌虫平均产84个卵，其中77％的卵成功孵化为若虫。表明注射dsncs2 和dsgfp的褐飞虱雌虫的产卵率差异极其显著。注射了dsgfp的雌成虫产出的卵大多数有典型的眼点，而注射了dsncs2的雌成虫产出的卵没有典型的眼点或者眼点倒置。对注射dsncs2的雌成虫羽化后第5天的卵巢进行解剖后发现，卵巢中没有成熟的卵母细胞。而注射dsgfp的雌成虫羽化后第5天的卵巢中则充满了典型的香蕉型的成熟卵。说明干扰ncs2 基因抑制了卵母细胞在雌虫卵巢中的发育成熟。
[0065]
无论干扰低龄(2龄)若虫还是高龄(5龄)若虫，均只有约20％左右的若虫发育成为成虫。此外，干扰ncs2基因在初羽化雌成虫体内的表达，其与干扰ncs2基因的雄成虫交配后无法产卵，导致生殖失败。结果显示ncs2基因对褐飞虱的生长发育以及繁殖具有重要作用。因此，ncs2 基因可应用于水稻作物育种领域，对筛选和培育抗稻飞虱作物具有重要意义。培育能够表达褐飞虱ncs2基因的双链rna的转基因水稻品系，褐飞虱若虫以及成虫在取食水稻时可产生rnai效果，以达到抑制褐飞虱发育、突变和产卵的目标。