细胞培养基
1.本技术为申请日为2016年3月31日、申请号为201680020374.7、发明名称为“细胞培养基”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及哺乳动物细胞中的细胞培养和重组蛋白质生产领域。它具体涉及使用重组哺乳动物宿主细胞，在哺乳动物细胞培养中关于产物(例如(多)肽、抗体、抗体片段和抗体衍生分子)的最佳生产(例如滴度)和性能(例如细胞生长)的新型基础细胞培养基和新型补料培养基。
背景技术：
3.治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的大规模工业制造的哺乳动物细胞培养工艺的开发在约25年前开始。用于生产生物制药的有效生物工艺主要需要(i)高产、稳定和法规接受的(通常为哺乳动物的)细胞系，(ii)最佳细胞培养基，以支持在不同(通常为哺乳动物的)宿主细胞以及不同的培养系统和工艺模式(例如在不同的规模下以及作为例如分批、补料分批和灌注工艺)中的细胞生长和生产，和(iii)最佳的技术生物工艺，其特征在于例如通过搅拌器和气体供应的适当配置的氧气最佳供应，所有相关工艺参数的自动控制，以确保一致的产物质量，或可以从小规模工艺开发(ml至l规模)到大规模制造(》2.000l)扩大的工艺设计，而不妥协性能和产物质量。
4.在该上下文中，细胞培养基具有关键作用，并且与其天然来源相比，必须满足在技术系统中悬浮培养的哺乳动物细胞的复杂营养需求。例如，用于生物制药生产的最广泛使用的细胞系最初衍生自中国仓鼠卵巢(cho细胞)。
5.在过去，血清被用作培养基添加剂，以提供通常不存在于细胞培养基中的营养素或载体蛋白质，例如胆固醇和转铁蛋白或细胞-底物附着因子(例如纤连蛋白)、其他激素和生长因子，以及保护细胞培养基内的某些必需营养素和结合有毒组分。然而，在用于生产治疗剂的细胞培养基中，血清可以潜在地引入动物病毒，并且由于不确定的原材料来源，它可以将其他不期望的污染物(例如抗生素或蛋白酶)引入细胞培养过程内。这些化合物被成功替代，并且无血清细胞培养基已成为工业实践用于工艺开发和生物制药的重组生产。例如，cho(中国仓鼠卵巢)细胞在含有人胰岛素作为唯一的培养基蛋白质组分的无血清培养基中连续繁殖(keen和rapson，cytotechnology,oct 17(3):153-63,1995)。
6.通常用于生物制药生产的另一组培养基组分是衍生自动物来源或衍生自植物的水解产物。由于相关的安全风险，只要有可能，从该过程中去除来自动物来源的水解产物。水解产物通常含有氨基酸、小肽、无机离子、微量元素、碳水化合物和维生素的混合物，并且广泛用于用各种(必需)营养素富集培养基，以增加总体生长和生产率。除安全方面之外，另一个缺点是水解产物并非化学成分确定的事实，因此批次之间的精确组成可以改变(批次间变化性)，并且出于该原因，对工艺重现性具有负面影响。因为水解产物含有许多化合物且具有复杂(每一个细节未知)组成，它们不能容易地被替代，而不影响细胞培养性能(例如
产物产率)。筛选并随后用化学成分确定的组分替代这种不确定的原材料，同时维持一致的产物质量和高产物滴度是生物工艺开发的持久和未解决的挑战。不仅需要确定确切的化学组成，还需要确定每一种组分的确切浓度。由于安全方面，如今主要使用来自植物来源的水解产物(例如大豆水解产物)。然而，不确定的组成问题依然存在。
7.目前生物制药工艺开发旨在化学成分确定的培养基(无血清、无动物组分、化学成分确定的)。这导致进一步降低污染物的风险(例如降低衍生自未知营养素来源的有机材料、内毒素、未知金属和微量元素)，并且还促进对关于一致原材料的上游和下游加工的所有方面的控制增加，而没有与安全和批次间变化性相关的任何风险。仅最近，“化学成分确定的”(注意仍不存在明确定义这一术语的行业标准)培养基变得商业上可用于哺乳动物细胞培养，但在工业制造中的应用目前仍是有限的。
8.这种“化学成分确定的”水解产物或培养基补充物的确切组成是已知的(但通常仅对于培养基供应商)，以便不使用不确定的原材料。这些化学成分确定的培养基仍是复杂的，并且含有高达约40-50种“关键组分”。但它们由不同的构件块组成。为了设计这种复杂的“化学成分确定的”培养基，有必要尽可能地模拟植物或动物衍生的水解产物，这需要这些水解产物的广泛分级，随后为高端分析。这一领域的主要挑战通过细胞培养基中存在的化合物的巨大差异给出。
9.高性能细胞培养基的最佳设计由于许多工艺以所谓的补料分批模式执行而进一步复杂化，即将细胞培养物在基础开始培养基中接种，然后(通常在约0至3天之后)，当培养基底物由于细胞生长而耗尽时，供应浓缩补料培养基以维持生长和生产。从开始就提供所有的培养基化合物(分批模式)导致亚最佳工艺性能，因为那样细胞在开始时过量补料(例如导致不需要的副产物乳酸盐的高度形成，这转而又对细胞生长和存活率具有不利作用)。在该上下文中的主要挑战是设计最佳的分批培养基(基础细胞培养基)和最佳的补料分批培养基(补料培养基)，所述培养基在培养运行时间自始至终完全匹配细胞培养过程中的最佳生长和生产。因为活细胞浓度、细胞培养物的存活率和细胞培养过程的营养需求随著培养工艺的时间进程(在每小时至每日的基础上)显著改变，所以最佳分批和补料分批培养基(基础细胞培养基和补料培养基)的设计是艰巨的任务。由于通常设计一种补料培养基为总共持续约2-3周的发酵工艺中每一个小时和每一天提供最佳解决方案，这甚至是更加困难的。
10.使用“合理的”方法的工业哺乳动物细胞培养基设计中的技术水平已通过fletcher进行概括(fletcher t.,bioprocess international 3(1),30
–
36,2005)，并且这种方法仍可以视为工业实践中的合理的培养基设计的技术水平概念。应指出合理的培养基设计的复杂性不仅通过涉及许多组分的事实给出，还通过需要考虑的培养基化合物的特定浓度和复杂的相互作用给出。
11.根据fletcher，培养基设计中存在三种基本方法。这些是i)(单一)组分滴定(例如在滴度上定义剂量应答的实验)，ii)培养基共混(简单地共混现有(复合)培养基并鉴定最佳共混物)，iii)废培养基分析(通过废培养基相对于新鲜培养基的化学分析描述营养素耗尽；注意在此方法中不考虑在细胞基础上的特定代谢需求)，iv)自动化筛选(机器人流体处理，其中重点关注例如多孔板中的流通量)。根据fletcher，这些方法无一在各方面都是最佳的，而且每种方法具有其自己的特殊弱点。例如，i)组分滴定促使大量样品被分析，这在
工业实践中由于许多原因(例如容量、成本、资源)是不可行的，ii)培养基共混导致改善的流通量，但这种方法是弱指导性的并且在范围方面非常有限，iii)废培养基分析可以提供培养基化学如何随时间变化的重要信息，但基于通常的废培养基分析仅集中于相当有限数目的组分的事实(注意，例如，通常不执行所有20种氨基酸的完全氨基酸分析，并且仅常规测量两种最重要的氨基酸谷氨酰胺和谷氨酸盐)，它不能提供细胞培养要求的完整图像，iv)自动化筛选通过最小化培养系统来增加流通量，但依次地，因为这种小型化系统无法正确地预测大规模的细胞培养性能，所以对(正确地)建模大规模工艺具有不利作用。因此，fletcher得出结论真正的合理的培养基设计可以被描述为多维方法。代替依赖单一技术，合理的培养基设计使用几种补充方法，即doe(实验设计)和完全析因设计，其捕获多种组分的复杂相互作用并使用各种统计工具。虽然这个概念集成了以前的培养基设计概念，并且采用先进的doe方法用于最佳实验设计，但它显然缺乏细胞特异性的要求，即营养供应和细胞代谢的细胞角度。因此，仍需要改善的细胞培养基。
12.细胞培养基：
13.在哺乳动物细胞培养中，细胞培养基可以包含多至约100种化合物和更多种。例如，碳水化合物(例如通过分解代谢反应的能量生成或作为通过回补反应的构件块)、氨基酸(例如在治疗性蛋白质生产的情况下，用于细胞蛋白和产物的构件块)、脂质和/或脂肪酸(例如用于细胞膜合成)、dna和rna(例如用于生长以及细胞有丝分裂和减数分裂)、维生素(例如作为酶促反应的辅因子)、微量元素、不同的盐、生长因子、载体和转运蛋白等。需要这些组分或化合物组，以满足在技术培养环境中的哺乳动物细胞的复杂营养需求。存在经典的细胞培养基，例如dmem(达尔贝科改良伊格尔培养基)，其中所有组分和所有浓度都得到公开。这种细胞培养基的开发追溯到20世纪50年代末，并且在学术文献中得到全面描述。另一个例子是在20世纪70年代开发的ham’s f12(ham’s nutrient mixture f12)，或这种经典细胞培养的混合物/修饰，例如在20世纪70年代和80年代开发的dmem:f12(达尔贝科改良伊格尔培养基/ham’s nutrient mixture f12)。具有已知组成和浓度的另一种广泛使用的细胞培养基是rpmi。rpmi通过moore等人在20世纪70年代在roswell park memorial institute进行开发(因此是首字母缩略词rpmi)。在动物细胞培养中使用不同的变体，例如rpmi-1640。尽管这些经典培养基中的许多在几十年前开发，但这些制剂仍构成了今天发生的许多细胞培养研究的基础，并且代表了在动物细胞培养中关于具有完全已知的组成和每种化合物的完全已知浓度的培养基的技术水平。所有这些培养基都是商购可得的，并且可以从供应商(例如从sigma-aldrich)获得。由于生物制药业务不断增长，过去几年来，商业培养基供应商开发了自身的用于哺乳动物细胞培养的细胞培养基。
14.然而，与经典的细胞培养基相比，这种商业细胞培养基的确切制剂是厂商专有的。为此，这种商业培养基不能用作合理培养基设计的参考和起点，因为确切制剂是未知的(即使是对于主要化合物如氨基酸)。例如，由基础培养基(acticho p)和补料培养基(acticho补料a b)组成的商购可得培养基acticho(通过paa)根据供应商的定义是化学成分确定的(仅单一化学品，不含动物衍生的物质、生长因子、肽和蛋白胨)。但确切制剂是专有的。两种补料由浓缩氨基酸、维生素、盐、微量元素和碳源(补料a)以及以浓缩形式的选定氨基酸(补料b)组成。另一个例子是ex-cell cd cho(safc biosciences)。该培养基无动物组分，根据safc是化学成分确定的，无血清，并且制剂也是专有的。广泛用于使用cho的哺乳动物细胞
培养的第三种实例培养基是cd cho(life technologies)。该培养基无蛋白质，无血清，并且根据life technologies是化学成分确定的。它不含有动物、植物或合成来源的蛋白质/肽或不确定的裂解产物/水解产物。再次制剂是专有的。该cd cho基础培养基可以与命名为高效补料a、b和c的补料培养基组合。另外对于补料，该制剂是专有的。补料无动物来源，并且组分以较高浓度包含。补料是化学成分确定的。不使用蛋白质、脂质、生长因子、水解产物和未知组成的组分。它含有碳源、浓缩氨基酸、维生素和微量元素。商购可得的另一种补料可以由thermo fisher获得，命名为cell boost 1-6。再次，制剂是专有的。它根据thermo fisher是化学成分确定的，无蛋白质且无动物衍生的组分。cell boost 1和2含有氨基酸、维生素和葡萄糖。cell boost 3含有氨基酸、维生素、葡萄糖和微量元素。cell boost 4包含氨基酸、维生素、葡萄糖、微量元素和生长因子。cell boost 5和6含有氨基酸、维生素、葡萄糖、微量元素、生长因子、脂质和胆固醇。
15.氨基酸
16.氨基酸对蛋白质合成(对于细胞蛋白和在重组蛋白质或蛋白质衍生物质情况下的产物生产两者)具有重要的作用。例如，蛋白质通过细胞机制由单一氨基酸分子合成，以形成较大的蛋白质或蛋白质复合物。在哺乳动物细胞培养中，必需氨基酸需要与细胞培养基一起提供，因为哺乳动物细胞不能由其他前体和构件块合成必需氨基酸。氨基酸也是生物化学重要的，因为这些分子具有允许其与其他生物分子相互作用的两个官能团(氨基和酸性基团)。由于这些原因，含有氨基酸的细胞培养基通常还补充有来自不同来源的(动物衍生的、植物衍生的或化学成分确定的)各种(确定和不确定的)小肽、水解产物、蛋白质和蛋白质混合物。
17.在本发明的上下文中，发现(基础)细胞培养基和补料培养基两者中的特定氨基酸组成和新型氨基酸比率显著增加最终产物滴度。这种新的氨基酸组成和氨基酸比率显著不同于商购可得的细胞培养基(例如rpmi、dmem:f12 1:1)的技术水平，并且提供了更高的产物滴度。
18.铁和铁载体
19.铁是哺乳动物细胞培养基中(i)作为微量元素和(ii)作为铁蛋白替代物(例如铁作为铁螯合剂)的必需成分。转铁蛋白通常衍生自血浆。该化合物通常作为部分铁饱和的人转铁蛋白的冻干粉末供应。转铁蛋白是具有同源n-末端和c-末端铁结合结构域的糖蛋白，并且与几种其他铁结合蛋白(包括乳铁蛋白、黑色素转铁蛋白和卵转铁蛋白)相关。用于动物细胞培养中的转铁蛋白是商购可得的(例如，通过sigma-aldrich，cas编号11096-37-0)。存在用作转铁蛋白替代物的几种其他的铁化合物。这些以ii/iii形式，作为各种盐，作为水合/脱水形式存在。实例是磷酸铁(iii)、焦磷酸铁(iii)、硝酸铁(iii)、硫酸铁(ii)、氯化铁(iii)、乳酸铁(ii)、柠檬酸铁(iii)、柠檬酸铁铵(iii)、右旋糖酐铁或乙二胺四乙酸铁钠盐。
20.我们鉴定了胆酸亚铁(iron choline citrate)(胆酸亚铁/柠檬酸胆碱铁，cas编号1336-80-7，由于5％结晶水含量，分子量mw＝991,5g/摩尔 /-49.57g/摩尔，具有约10.2-12.4％的铁含量的铁络合物，2:3:3的铁分子：胆碱：柠檬酸盐的分子比，分子式c
33h57
fe2n3o
24
)。然而，已知其他合适的胆酸亚铁络合物，例如以1:1:1比率的铁：胆碱：柠檬酸盐，mw＝348.11g/摩尔的分子量。与商购可得的细胞培养基中使用的技术水平铁源例如
磷酸铁、焦磷酸铁或柠檬酸铁相比，胆酸亚铁的使用促进显著更高的产物滴度。这种效应也取决于培养基中的胆酸亚铁浓度。
技术实现要素：
21.本发明提供了具有新型氨基酸比率和/或胆酸亚铁作为铁载体的基础细胞培养基和补料培养基，所述培养基改善哺乳动物细胞培养工艺，例如cho培养和蛋白质生产工艺的性能，特别是产物滴度(例如单克隆抗体(mab)滴度)。还提供的是使用所述基础细胞培养基和/或补料培养基用于培养哺乳动物细胞并且产生目的蛋白质的方法。本发明还提供了包括(i)基础细胞培养基和(ii)补料培养基的培养基平台。优选地，(基础)细胞培养基和补料培养基两者均为化学成分确定的。
22.在一个方面，本发明涉及用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：约1.2-2.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸、约0.5-0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸、约1.5-2.7的l-酪氨酸/l-异亮氨酸、约1.0-1.9的l-苏氨酸/1-异亮氨酸、以及约1.0-1.9的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，其中所述基础细胞培养基具有约25至150mm的总氨基酸含量。在一个实施方案中，基础细胞培养基进一步包含相对于异亮氨酸的约1.6-2.9的摩尔比(mm/mm)的l-赖氨酸。基础细胞培养基可以进一步包含相对于异亮氨酸下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。优选地，基础细胞培养基包含各自以如上定义的所述摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。本发明的基础细胞培养基是无血清培养基，优选化学成分确定的培养基或化学成分确定和无蛋白质的培养基。在一个实施方案中，基础细胞培养基另外包含浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm、或约0.4至1.0mm的胆酸亚铁。在某些实施方案中，基础细胞培养基具有约30至约130，优选约35至约120，更优选约40至约100mm的总氨基酸含量。
23.本发明还涉及用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm、或约0.4至1.0mm的胆酸亚铁。
24.在另一个方面，本发明涉及用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：约2.3-4.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸、约0.6-1.1的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸、约1.3-2.4的l-苏氨酸/1-异亮氨酸、以及约1.1-2.0的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，其中所述补料培养基具有约100至1000mm的总氨基酸含量。在本发明的一个实施方案中，补料培养基进一步包含相对于异亮氨酸的以下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：约0.6-1.1的l-酪氨酸/l-异亮氨酸、和/或约1.1-2.1的l-赖氨酸/l-异亮氨酸。根据本发明的补料培养基可以进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：约0.3-0.6的l-色氨酸/l-异亮氨酸，约0.9-1.8的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或约0.4-0.8的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。优选地，补料培养基包括各自如上定义的所述摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。补料培养基通常是浓缩补料培养基。优选地，本发明的补料培养基是无血清培养基，更优选化学成分确定的培养基或化学成分确定和无蛋白质的培养基。在一个实施方案中，补料培养基另外包含浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm或约0.5至1.0mm，优选约0.5至0.6mm的胆酸亚铁。在一个实施方案中，补料培养基的特征在于低盐含量，优选约100mm或更少，且更优选约50mm或更少的低盐含量。在某些实施方案中，
本发明的补料培养基具有约200至约900，优选约300至约800，更优选约400至约700mm的总氨基酸含量。
25.本发明还涉及用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm或约0.5至1.0mm，优选约0.5至0.6mm的胆酸亚铁。
26.在相关方面，本发明涉及用于培养哺乳动物细胞的培养基平台，其包含如本文所述的本发明的基础细胞培养基和本发明的补料培养基。
27.本发明的基础细胞培养基和补料培养基特别适合于培养啮齿类动物或人细胞，其中所述啮齿类动物细胞优选为中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、cho-dukx b11细胞或cho谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷细胞，最优选地，细胞是cho-dg44或cho gs缺陷细胞。
28.在另外一个方面，本发明涉及生成基础细胞培养基的方法，其包括：a)提供基础细胞培养基，和b)加入根据本发明的最终摩尔比的氨基酸或将氨基酸比率调整至根据本发明的最终摩尔比。该方法可以进一步包括添加作为铁源的胆酸亚铁或调整作为铁源的胆酸亚铁的步骤，所述胆酸亚铁的浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm、或约0.4至1.0mm。
29.在另外一个方面，本发明涉及生成补料培养基的方法，其包括：提供补料培养基，并且加入根据本发明的最终摩尔比的氨基酸或将氨基酸比率调整至根据本发明的最终摩尔比。该方法可以进一步包括添加作为铁源的胆酸亚铁或调整作为铁源的胆酸亚铁的步骤，所述胆酸亚铁的浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm、或约0.5至1mm，优选约0.5至0.6mm。
30.本发明进一步涉及培养哺乳动物细胞的方法，其包括下述步骤：a)提供哺乳动物细胞，b)在本发明的基础细胞培养基中培养细胞，和c)任选地将本发明的补料培养基加入基础细胞培养基中；其中细胞在允许细胞增殖的条件下进行培养。
31.本发明进一步涉及产生目的蛋白质的方法，其包括下述步骤：a)提供包含编码目的蛋白质的目的基因的哺乳动物细胞，b)在本发明的基础细胞培养基中培养细胞，和c)任选地将本发明的补料培养基加入基础细胞培养基中，以及d)任选地从细胞培养物中分开和/或分离和/或纯化所述目的蛋白质；其中所述细胞在允许目的蛋白质表达的条件下进行培养。目的蛋白质可以是分泌蛋白质，优选地，目的蛋白质是抗体或fc-融合蛋白。
32.用于本发明的任何方法中的哺乳动物细胞可以是啮齿类动物或人细胞，优选地，啮齿类动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、duxb11细胞或cho gs缺陷细胞，最优选地，细胞是cho-dg44或cho gs缺陷细胞。将本发明的任何方法中使用的补料培养基加入在基础细胞培养基中培养的细胞中，其中(a)补料培养基基于培养物起始体积以约10-50ml/l/天加入基础细胞培养基中，(b)补料培养基在第0、1、2或3天时开始加入，和/或(c)补料培养基连续加入，或者作为推注每天几次、每天两次、每天一次、每隔一天或每隔两天加入。
33.在另外一个方面，本发明涉及包含本发明的基础细胞培养基和/或本发明的补料培养基和任选的哺乳动物细胞的套组试剂盒(kit of parts)。
34.本发明进一步涉及本发明的基础细胞培养基用于产生蛋白质的用途，其包括在适合于细胞生长和蛋白质生产的条件下，将产生目的蛋白质的哺乳动物细胞在所述培养基中培养一段时间，收获目的蛋白质，并且从培养基或细胞裂解产物中回收蛋白质。该用途可以
进一步包括在所述培养期过程中，用本发明的补料培养基供给细胞。
35.本发明进一步涉及本发明的补料培养基用于产生蛋白质的用途，其包括在适合于细胞生长和蛋白质生产的条件下，将产生目的蛋白质的哺乳动物细胞在本发明的基础细胞培养基中培养一段时间，用所述补料培养基供给细胞，收获目的蛋白质并且从培养基中回收蛋白质。
36.还提及的是胆酸亚铁在哺乳动物细胞培养基中作为铁载体的用途，其中所述胆酸亚铁以约0.2至2.0mm的浓度存在于哺乳动物细胞培养基中。
附图说明
37.图1：在不同总氨基酸浓度的分批实验中，具有和不具有最佳化的氨基酸调整的基于rpmi的基础培养基。
38.(a-d)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基4.1和培养基5.0中一式两份(n＝2)进行培养，所述培养基不具有和具有最佳化氨基酸比率，具有44mm的总氨基酸浓度，在培养基5.0中的培养物，具有最佳化氨基酸比率(44mm)，
■
在培养基4.1中的培养物，不具有最佳化氨基酸比率(44mm)。显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞和(c)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(d)乳酸盐浓度[g/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗。
[0039]
(e-h)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基4.2和培养基5.1中一式两份(n＝2)进行培养，所述培养基不具有和具有最佳化氨基酸比率，具有66mm的总氨基酸浓度，在培养基5.1中的培养物，具有最佳化氨基酸比率(66mm)，
■
在培养基4.2中的培养物，不具有最佳化氨基酸比率(66mm)。显示的是(e)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(f)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞和(g)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(h)乳酸盐浓度[g/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗。
[0040]
(i)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基4.3和培养基5.2中一式两份(n＝2)进行培养，所述培养基不具有和具有最佳化氨基酸比率，具有22或36mm的总氨基酸浓度，
■
在培养基5.2中的培养物，具有最佳化氨基酸比率(22mm)，在培养基4.3中的培养物，不具有最佳化氨基酸比率(22mm)，在培养基4.0中的培养物，不具有最佳化氨基酸比率(36mm)。显示的是(i)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗。
[0041]
(j)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基4.2和培养基5.2中一式两份(n＝2)进行培养，所述培养基不具有和具有最佳化氨基酸比率，具有22和66mm的总氨基酸浓度，
■
在培养基5.2中的培养物，具有最佳化氨基酸比率(22mm)，
●
在培养基4.2中的培养物，不具有最佳化氨基酸比率(66mm)。显示的是(j)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗。
[0042]
图2：在分批实验中基于最佳化氨基酸比率，具有-20％或-40％的单一氨基酸变化的基于rpmi的基础培养基。
[0043]
(a-d)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基5.3(具有以最佳比率的所有氨基酸，对照)和培养基5.3.1(仅单一氨基酸修改-20％)中进行培养，在培养基5.3.1(l-亮氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-缬氨酸-20％)中的培养物，
□
在培养基5.3.1(l-苯丙氨酸-20％)中的培养物，
■
在培养基5.3(具有所有氨基酸，对照)中的
培养物，
●
在培养基5.3.1(l-精氨酸-20％)中的培养物，
◆
在培养基5.3.1(l-天冬酰胺-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-天冬氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-组氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-赖氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-甲硫氨酸-20％)中的培养物，
○
在培养基5.3.1(l-脯氨酸-20％)中的培养物，
◇
在培养基5.3.1(l-丝氨酸-20％)中的培养物，
△
在培养基5.3.1(l-苏氨酸-20％)中的培养物，
▽
在培养基5.3.1(l-色氨酸-20％)中的培养物，(向左的三角形，空心)在培养基5.3.1(l-酪氨酸-20％)中的培养物。显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(c)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(d)乳酸盐浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，对照一式三份(n＝3)执行，并且测试一式两份(n＝2)运行。
[0044]
(e-g)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基5.3(具有以最佳比率的所有氨基酸，对照)和培养基5.3.1(仅单一氨基酸，例如l-亮氨酸、l-缬氨酸或l-苯丙氨酸，修改-20％)中进行培养，
■
在培养基5.3(具有所有氨基酸，对照)中的培养物，
□
在培养基5.3.1(l-苯丙氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-亮氨酸-20％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-缬氨酸-20％)中的培养物，显示的是(e-g)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，对照一式三份(n＝3)执行，并且测试一式两份(n＝2)运行。
[0045]
(h-k)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基5.3(具有以最佳比率的所有氨基酸，对照)和培养基5.3.1(仅单一氨基酸，例如l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸或l-缬氨酸，降低-40％)中进行培养，
■
在培养基5.3(具有所有氨基酸，对照)中的培养物，
●
在培养基5.3.1(l-精氨酸-40％)中的培养物，
◆
在培养基5.3.1(l-天冬酰胺-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-天冬氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-组氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-异亮氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-亮氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-赖氨酸-40％)中的培养物，
□
在培养基5.3.1(l-甲硫氨酸-40％)中的培养物，
○
在培养基5.3.1(l-苯丙氨酸-40％)中的培养物，
◇
在培养基5.3.1(l-脯氨酸-40％)中的培养物，
△
在培养基5.3.1(l-丝氨酸-40％)中的培养物，
▽
在培养基5.3.1(l-苏氨酸-40％)中的培养物，(向左的三角形，空心)在培养基5.3.1(l-色氨酸-40％)中的培养物，(向右的三角形，空心)在培养基5.3.1(l-酪氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-缬氨酸-40％)中的培养物，显示的是(h)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(i)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(j)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(k)乳酸盐浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，对照一式三份(n＝3)执行，并且测试一式两份(n＝2)运行。
[0046]
(l-o)：cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的培养基5.3(具有以最佳比率的所有氨基酸，对照)和培养基5.3.1(仅单一氨基酸，例如l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸或l-异亮氨酸，降低-40％)中进行培养，
■
在培养基5.3(具有所有氨基酸，对照)中的培养物，
○
在培养基5.3.1(l-苯丙氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-缬氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-亮氨酸降低-40％)中的培养物，
▽
在培养基5.3.1(l-苏氨酸-40％)中的培养物，在培养基5.3.1(l-异亮氨酸-40％)中的培养物。显
示的是(l)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(m)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(n)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(o)乳酸盐浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，对照一式三份(n＝3)执行，并且测试一式两份(n＝2)运行。
[0047]
图3：在分批实验中基于基础培养基中的最佳化氨基酸比率，单一氨基酸-40％的变化。(a-c)：细胞以分批方式在培养基6.4.10
–
6.4.15(仅单一氨基酸，例如l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-脯氨酸、l-色氨酸或l-酪氨酸，或两个氨基l-酪氨酸和l-赖氨酸，降低-40％)或对照培养基6.4.0.1(具有最佳化氨基酸比率)中进行培养，
■
在培养基6.4.0.1(具有所有氨基酸，对照)中的培养物，在培养基6.4.10(l-酪氨酸和l-赖氨酸-40％)中的培养物，在培养基6.4.11(l-酪氨酸-40％)中的培养物，
□
在培养基6.4.12(l-赖氨酸-40％)中的培养物，
●
在培养基6.4.13(l-甲硫氨酸-40％)中的培养物，
◇
在培养基6.4.14(l-色氨酸-40％)中的培养物，在培养基6.4.15(l-脯氨酸-40％)中的培养物。显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(c)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0048]
图4：以标准或降低的补料速率在补料分批实验中最佳化的培养基和补料培养基的效应。
[0049]
(a-c)：以标准补料速率在补料分批实验中最佳化的基础培养基和补料培养基的效应。细胞在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)、培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)、补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中进行培养。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基础培养基和补料培养基的各种组合中进行培养，
■
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
●
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
◆
在基础培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，在基础培养基(不具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(c)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0050]
(d-f)：以降低的补料速率最佳化的基础培养基和补料培养基的效应。细胞在培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)、培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)、补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中进行培养。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基础培养基和补料培养基的各种组合中进行培养。所有培养物的补料速率降低以引起培养物的强应答，
■
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率和降低的补料速率)中的培养物，
●
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
◆
在基础培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，在基础培养基(不具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物。显示的是(d)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利
妥昔单抗细胞，(e)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(f)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0051]
(g-j)：在2-l规模中最佳化的培养基和补料培养基的效应。细胞在完全控制的2l系统中在培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)、培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)、补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中进行培养。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在最佳化的基础培养基和补料培养基的各种组合中进行培养，
■
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
●
在基础培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
◆
在基础培养基6.3(不具有最佳化氨基酸比率)和补料培养基6.2(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，显示的是(g)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(h)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(i)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，(j)乳酸盐浓度[g/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0052]
(k-m)：最佳化的rpmi培养基和rpmi补料培养基的效应。细胞在rpmi基础培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)、rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)、rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)中进行培养。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在最佳化的基础培养基和补料培养基的各种组合中进行培养，
■
在rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
●
在rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
◆
在rpmi培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，在rpmi培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，显示的是(k)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(l)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(m)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0053]
(n-p)：与不具有最佳氨基酸(aa)比率或废培养基最佳化aa比率的基础和补料培养基相比，最佳化的rpmi培养基和rpmi补料培养基的效应。细胞在rpmi培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)、rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)、rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)、rpmi培养基3.5(具有废培养基补充的aa)、rpmi补料培养基3.5(具有废培养基补充的aa)中进行培养。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在rpmi基础培养基和rpmi补料培养基的各种组合中进行培养，
■
在rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
●
在rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
◆
在rpmi培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，在rpmi培养基3.1(不具有最佳化氨基酸比率)和rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
○
在rpmi培养基3.5(具有废培养基补充的aa)和rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率)中的培养物，
□
在rpmi培养基3.5(具有废培养基补充的aa)和rpmi补料培养基-3.5(具有废培养基补充的aa)中的培养物，显示的是(n)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，
(o)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(p)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0054]
图5：在补料分批实验中5或7种氨基酸 /-20％或 /-40％的变化。
[0055]
(a-c)：基于最佳化的培养基和补料中的新型氨基酸比率，5种氨基酸 /-40％的变化。与对照(具有最佳化氨基酸比率)相比，氨基酸l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸以正或负交替模式(大写或非大写aa字母)变化 /-40％。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以补料分批在培养基6.4.0.1(具有最佳化氨基酸比率，对照)、基础培养基6.4.3(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，正)、基础培养基6.4.4(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，负)、补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)、补料培养基6.4.3(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，正)、补料培养基6.4.4(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，负)中进行培养，
■
在基础培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)中的培养物，在基础培养基6.4.3和补料培养基6.4.3(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，正)中的培养物，
●
在基础培养基6.4.4和补料培养基6.4.4(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile变化 /-40％，负)中的培养物，显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(c)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0056]
(d-f)：基于最佳化的培养基和补料中的新型氨基酸比率，7种氨基酸的变化。与对照(具有最佳化氨基酸比率)相比，氨基酸l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-酪氨酸、l-赖氨酸以正或负交替模式(大写或非大写aa字母)变化 /-40％。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以补料分批在培养基6.4.0.1(具有最佳化氨基酸比率，对照)、基础培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)、基础培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)、补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)、补料培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)、补料培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)，
■
在基础培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)中的培养物，在基础培养基6.4.7和补料培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)中的培养物，
●
在基础培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)和补料培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)中的培养物，显示的是(d)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(e)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(f)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0057]
(g-h)：基于最佳化的培养基和补料中的新型氨基酸比率，7种氨基酸的变化。与对照(具有最佳化氨基酸比率)相比，氨基酸l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-酪氨酸、l-赖氨酸以正或负交替模式(大写或非大写aa字母)以降低的补料速率变化 /-20％和 /-40％。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以补料分批以降低的补料速率在培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对于对照标准补料速率以及降低的补料速率)、基础培养基6.4.5(7种氨基酸酸性phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-20％，正)、基础培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)、
基础培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)、补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)、补料培养基6.4.5(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-20％，正)、补料培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)和补料培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)中进行培养，
■
以标准补料速率在基础培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)中的培养物，
●
在基础培养基培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率，对照)和降低的补料速率中的培养物，在基础培养基6.4.5(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-20％，正)和补料培养基6.4.5(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-20％，正)中的培养物，在基础培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)和补料培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，正)中的培养物，在基础培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)和补料培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys变化 /-40％，负)中的培养物，显示的是(g)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(h)存活率[％]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，和(i)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0058]
图6：产生不同治疗分子的cho-dg44衍生细胞系的补料分批在最佳化的基础培养基6.2和补料培养基6.2(在基础培养基和补料培养基中具有最佳化氨基酸比率，不具有羟基-l-脯氨酸)中进行培养，在cho-dg44细胞中产生的fc-融合蛋白，
■
在cho-dg44细胞中产生的利妥昔单抗(igg1κ)抗体(cho2(cho-dg44)利妥昔单抗)，在cho-dg44细胞中产生的mab5/igg1κ抗体，在cho-dg44细胞中产生的mab6/igg1κ。显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]，(b)存活率[％]cho-dg44，(c)对于mab5/igg1和mab6/igg1的产物浓度[mg/l]，以及(d)产物浓度[mg/l]fc-融合蛋白和利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0059]
图7：胆酸亚铁与其他铁载体以约等摩尔量的比较。
[0060]
(a，b)cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以补料分批模式在基础培养基6.2a中(在基础培养基中具有指示的铁载体)和不具有胆酸亚铁的补料培养基6.2a中进行培养，
■
在基础培养基0.2g/l胆酸亚铁中的培养物，
●
在具有1.0g/l胆酸亚铁的基础培养基中的培养物；
◆
在具有2.0g/l胆酸亚铁的基础培养基中的培养物；在具有0.5g/l焦磷酸铁的基础培养基中的培养物； 在具有0.8g/l焦磷酸铁的基础培养基中的培养物，(实心星形)在具有1.3g/l焦磷酸铁的基础培养基中的培养物，在具有0.3g/l磷酸铁的基础培养基中的培养物，(实心五边形)在具有0.5g/l磷酸铁的基础培养基中的培养物，在具有0.7g/l磷酸铁的基础培养基中的培养物。显示的是(a)活细胞浓度[1x105细胞/ml]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞，(b)产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，所有实验都一式两份(n＝2)执行。
[0061]
(c)以补料分批模式(n＝2)，在具有不同浓度的胆酸亚铁的基础培养基6.2a和含有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基6.2a中培养的cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞的产物浓度[mg/l]，
■
在不具有胆酸亚铁的基础培养基中的培养物，
◆
在具有0.2g/l胆酸亚铁的基础培养基中的培养物；在具有0.4g/l胆酸亚铁的基础培养基中的培养物； 在具有2.0g/l
胆酸亚铁的基础培养基中的培养物。
[0062]
(d)以补料分批模式(n＝2)，在具有以约等摩尔量的胆酸亚铁或柠檬酸铁的基础培养基6.2a和补料培养基6.2a中培养的cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞的产物浓度[mg/l]，
■
在不具有胆酸亚铁的基础培养基和具有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基中的培养物，(实心星形)在具有0.2g/l胆酸亚铁的基础培养基和具有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基中的培养物；在具有0.1g/l柠檬酸铁的基础培养基和具有0.25g/l柠檬酸铁的补料培养基中的培养物。
[0063]
图8：在基于rpmi的培养基中以约等摩尔量的胆酸亚铁与柠檬酸铁的比较。以补料分批模式(n＝2)，在具有以约等摩尔量的胆酸亚铁或柠檬酸铁的基础培养基3.1和含有0.56g/l柠檬酸铁的补料培养基2中培养的cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞的产物浓度，
■
在不具有胆酸亚铁的基础培养基中的培养物，
●
在具有0.2g/l胆酸亚铁的基础培养基中的培养物； 在具有0.1g/l柠檬酸铁的基础培养基中的培养物。显示的是产物浓度[mg/l]cho2(cho-dg44)利妥昔单抗，比较(a)0.2g/l胆酸亚铁(
●
)与0.1g/l柠檬酸铁( )，(b)0.4g/l胆酸亚铁与0.2g/l柠檬酸铁(五边形)，(c)2g/l胆酸亚铁与1g/l柠檬酸铁(
●
)，以及(d)0.2g/l(
●
)和2g/l胆酸亚铁。
[0064]
图9：在2l生物反应器中，以补料分批模式，在培养基6.2a或基于rpmi的培养基中以约等摩尔量的胆酸亚铁与柠檬酸铁的比较。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以补料分批模式(n＝2)，在(a-c)具有胆酸亚铁或柠檬酸铁的基础培养基6.2a和含有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基6.2a(d)、或具有胆酸亚铁或柠檬酸铁的基础培养基3.1和含有0.25g/l柠檬酸铁的补料培养基-2中进行培养， 在具有0.2g/l胆酸亚铁的基础培养基6.2a和具有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基6.2a中的培养物，(实心星形)在具有2g/l胆酸亚铁的基础培养基6.2a和具有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基6.2a中的培养物；(实心五边形)在具有1g/l柠檬酸铁的基础培养基6.2a和具有0.56g/l胆酸亚铁的补料培养基6.2a中的培养物。
■
在具有0.2g/l胆酸亚铁的基于rpmi的基础培养基3.1和具有0.25g/l柠檬酸铁的补料培养基2中的培养物，
●
在具有2g/l胆酸亚铁的基于rpmi的基础培养基3.1和具有0.25g/l柠檬酸铁的补料培养基2中的培养物；
◆
在具有1g/l柠檬酸铁的基于rpmi的基础培养基3.1和具有0.25g/l柠檬酸铁的补料培养基2中的培养物。
[0065]
图10：产生利妥昔单抗的cho-k1 gs衍生细胞系的两个补料分批培养物在基础培养基6.2gs和补料培养基6.2gs中平行培养，两者均具有最佳化aa比率。显示的是(a)活细胞浓度[1x106细胞/ml]，(b)产生利妥昔单抗的cho-k1 gs细胞的存活率[％]和(c)在14天培养过程后的最终产物浓度[mg/l]。
具体实施方式
[0066]
定义
[0067]“包含(comprising)”或“包含(comprised)”的一般实施方案包括更具体的实施方案“由
……
组成”。此外，单数和复数形式不以限制的方式使用。在本发明的过程中使用的术语具有下述含义。
[0068]
如本文使用的，术语“细胞培养基”是培养哺乳动物细胞的培养基，其包含在优选缓冲培养基(优选ph约7.0，ph＝7.3-6.6，ph＝7.0)中的最少必需营养素和组分如维生素、
微量元素、盐、主体盐(bulk salts)、氨基酸、脂质、碳水化合物。这种细胞培养基的非限制性实例包括商购可得的培养基如rpmi、dmem:f12、dmem、hams/f12等，以及来自各种来源的专利培养基(例如培养基6.2)。细胞培养基可以是基础细胞培养基。细胞培养基也可以是向其中添加了补料培养基和/或添加剂的基础细胞培养基。如果细胞在发酵罐或生物反应器中培养，则细胞培养基也可以称为发酵液。
[0069]
如本文使用的，术语“基础培养基”或“基础细胞培养基”是如下定义的用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基。它指在其中细胞从细胞培养运行开始进行培养的培养基，并且不用作另一种培养基的添加剂，尽管各种组分可以加入培养基中。基础培养基充当任选进一步的添加剂或补料培养基可以在培养(即细胞培养运行)期间加入其中的基础。基础细胞培养基从细胞培养工艺的开始提供。一般而言，基础细胞培养基提供营养素例如碳源、氨基酸、维生素、主体盐(例如氯化钠或氯化钾)、各种微量元素(例如硫酸锰)、ph缓冲液、脂质和葡萄糖。主要主体盐通常仅在基础培养基中提供，并且必须不超过在细胞培养物中约280-350mosmo/kg的最终渗透压，使得细胞培养物能够在合理的渗透应力下生长和增殖。
[0070]
如本文使用的，术语“补料”或“补料培养基”涉及在哺乳动物细胞的培养物中用作补料的营养素浓缩物/浓缩营养素组合物。它作为“浓缩补料培养基”提供，以避免细胞培养物的稀释，通常补料培养基基于容器中的培养物起始体积(csv，意指在第0天时的起始体积)，以10-50ml/l/天，优选以15-45ml/l/天，更优选以20-40ml/l/天，且甚至更优选以30ml/l/天提供。补料速率应理解为整个补料期的平均补料速率。补料培养基通常具有较高浓度的基础细胞培养基的大多数但不是所有的组分。一般地，补料培养基取代在细胞培养期间消耗的营养素，例如氨基酸和碳水化合物，而盐和缓冲剂较不重要并且通常与基础培养基一起提供。补料培养基通常以补料分批模式加入(基础)细胞培养基/发酵液中。然而，补料可以以不同模式如连续或推注添加或经由灌注相关技术(恒化器或混合灌注系统)加入。优选地，补料培养基每天加入，但也可以更频繁地加入，例如每天两次或更不频繁，例如每隔一天。营养素的添加通常在培养期间(即，在第0天后)执行。与基础培养基相反，补料由高度浓缩的营养液(例如》6x)组成，所述营养液提供与基础培养基相似的所有组分，除了“高渗透性活性化合物”，例如主要主体盐(例如nacl、kcl、nahco3、mgso4、ca(no3)2)之外。通常，不具有或具有降低的主体盐的基础培养基的》6x倍或更高浓缩物维持化合物的良好溶解性和足够低的渗透压(例如270-1500mosmo/kg，优选310-800mosmo/kg；由于高葡萄糖、盐和最佳aa，培养基6.2补料渗透压为约1500mosmo/kg)，以便将细胞培养物中的渗透压维持在约270-550mosmo/kg，优选约280-450mosmo/kg，更优选约280-350mosmo/kg。
[0071]
细胞培养基，基础培养基和/或补料培养基两者均可以是无血清、化学成分确定或化学成分确定和无蛋白质的。如本文使用的，“无血清培养基”指用于体外细胞培养的细胞培养基，其不含来自动物来源的血清。这是优选的，因为血清可能含有来自所述动物的污染物例如病毒，并且因为血清是不确切的，并且因分批而异。根据本发明的基础培养基和补料培养基是无血清的。
[0072]
如本文使用的，“化学成分确定的培养基”指适合于体外细胞培养的细胞培养基，其中所有组分都是已知的。更具体地，它不包含任何补充物例如动物血清或植物、酵母或动物水解产物。它可以包含水解产物，只要所有组分已进行分析且其确切组成是已知的并且可以重现性制备。根据本发明的基础培养基和补料培养基优选是化学成分确定的。
[0073]
如本文使用的，“无蛋白质培养基”指不包含蛋白质(除了由待培养的细胞产生的蛋白质之外)的用于体外细胞培养的细胞培养基，其中蛋白质指任何长度的多肽，但排除单一氨基酸、二肽或三肽。具体地，生长因子例如胰岛素和胰岛素样生长因子(igf)不存在于培养基中。优选地，根据本发明的基础培养基和补料培养基是化学成分确定且无蛋白质的。
[0074]
如本文使用的，“培养基平台(medium platform)”或“培养基平台(media platform)”由从细胞培养工艺开始提供的基础细胞培养基和补料培养基组成，所述补料培养基在培养期间加入基础细胞培养基中。任选进一步的添加剂例如葡萄糖可以在细胞培养期间加入。补料培养基可以以任何种类的补料分批工艺模式(例如，连续、具有改变的补料速率或作为推注补料添加)供应。
[0075]
如本文使用的，术语“商购可得的培养基/培养基系统”指具有完全已知组成的商购可得的细胞培养基。由于需要确切的营养素组成，这些培养基充当本发明的培养基的参考。商购可得的培养基是例如dmem:f12(1:1)、dmem、hamsf12和rpmi。本文使用的商业培养基的补料培养基制备为不具有主体盐的基础培养基的12倍浓缩物。术语“商购可得的培养基系统”涉及包含商购可得的基础细胞培养基例如dmem:f12(1:1)、dmem、hamsf12和rpmi和补料培养基的系统，所述补料培养基是不具有主体盐或具有减少的主体盐的相应浓缩基础培养基(例如，12倍浓缩的)。
[0076]
如本文使用的，“1x”意指通常在特定基础培养基中使用的标准浓度，“2x”意指标准浓度的两倍，等等。补料培养基例如优选为6x至20x溶液，即用于氨基酸最佳化的基础培养基中的6至20倍标准浓度，而不考虑主体盐例如氯化钠或氯化钾。然而，技术人员将理解，细胞培养需求在例如指数生长阶段和蛋白质生产阶段期间是不同的。因此，优选地，基础培养基和补料培养基适合这些改变的需求。因此，补料培养基中的氨基酸比率通常不同于基础培养基中的氨基酸比率。
[0077]
术语“细胞培养(cell cultivation)”或“细胞培养(cell culture)”包括在所有规模中(例如从微量滴定板到大规模工业生物反应器，即从亚ml规模到》10.000l规模)、在所有不同的工艺模式中(例如分批、补料分批、灌注、连续培养)、在所有工艺控制模式中(例如非受控的、完全自动化和受控的系统，具有例如ph、温度、氧含量的控制)、在所有种类的发酵系统中(例如一次性使用的系统、不锈钢系统、玻璃制品系统)的细胞培养和发酵工艺。在本发明的优选实施方案中，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，并且是分批或补料分批培养物。
[0078]
如本文使用的，术语“补料分批”涉及细胞培养物，其中细胞连续或周期性地供给含有营养素的补料培养基。补料可以在第0天时开始细胞培养后，或者更通常在开始培养后一、两或三天开始。补料可以遵循预定的时间表，例如每天、每两天、每三天等。可替代地，可以监测培养物的细胞生长、营养素或有毒副产物，并且可以相应地调整补料。下文实验部分中描述了动物细胞培养的常见监测方法。一般而言，下述参数通常每天进行测定，并且涵盖活细胞浓度、产物浓度和几种代谢产物例如葡萄糖或乳酸(降低ph并且衍生自细胞葡萄糖转化的酸性废物代谢产物)、ph、渗透压(盐含量的量度)和铵(负面影响生长速率并且降低活生物量的生长抑制剂)。与分批培养物(不具有进料的培养物)相比，在补料模式下可以获得更高的产物滴度。通常，在某一点停止补料分批培养，并且收获且任选纯化培养基中的细胞和/或目的蛋白质。
[0079]
术语“活力”和“存活率”被同义使用，并且指如通过本领域已知的方法测定的细胞培养物中的％活细胞，例如基于自动化显微细胞计数的使用cedex装置的台盼蓝排除(innovatis ag，bielefeld)。然而，存在用于测定存活率的许多其他方法，例如用于反映活细胞的能量代谢的荧光(例如基于碘化丙啶)、量热或酶促方法，例如使用ldh乳酸脱氢酶或某些四唑盐例如阿拉玛蓝、mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物)或ttc(四唑氯化物)的方法。
[0080]
如本文使用的，术语“氨基酸”指由通用遗传密码编码的二十种天然氨基酸，通常为l-型(即l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸)。氨基酸(例如谷氨酰胺和/或酪氨酸)可以作为具有增加的稳定性和/或溶解性的二肽提供，优选含有l-丙氨酸(l-ala-x)或l-甘氨酸延伸(l-gly-x)，例如甘氨酰-谷氨酰胺和丙氨酰-谷氨酰胺。此外，半胱氨酸也可以作为l-胱氨酸提供。如本文使用的，术语“氨基酸”包括其所有不同的盐，例如(而不限于此)l-精氨酸一盐酸盐、l-天冬酰胺一水合物、l-半胱氨酸盐酸盐一水合物、l-胱氨酸二盐酸盐、l-组氨酸一盐酸盐二水合物、l-赖氨酸一盐酸盐和羟基l-脯氨酸、l-酪氨酸二钠脱水物。氨基酸的确切形式对于本发明并不重要，除非特征例如溶解性、渗透压、稳定性、纯度受损。通常且优选地，l-精氨酸用作l-精氨酸x hcl，l-天冬酰胺用作l-天冬酰胺x h2o，l-半胱氨酸用作l-半胱氨酸x hcl x h2o，l-胱氨酸用作l-胱氨酸x 2hcl，l-组氨酸用作l-组氨酸x hcl x h2o，并且l-酪氨酸用作l-酪氨酸x 2na x 2h2o，其中每种优选的氨基酸形式可以彼此独立地或一起或其任何组合选择。还包括的是包含相关氨基酸中的一种或两种的二肽。例如，l-谷氨酰胺通常以二肽(例如l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)的形式加入细胞培养基中，用于在贮存中或在长期培养期间改善的稳定性和降低的铵积累。这对于含有l-甘氨酸的二肽或其他含有l-丙氨酸的二肽也是有效的，所述二肽考虑用于计算氨基酸比率。
[0081]
如本文使用的，术语“培养基中的所有氨基酸”或“总氨基酸含量”指以mm的如上定义的“氨基酸”总和。在二肽中，每种氨基酸分开计数，因此将1mm丙氨酰-谷氨酰胺计数为1mm l-丙氨酸和1mm l-谷氨酰胺(摩尔比1:1)。同样在l-胱氨酸中，每个半胱氨酸分开计数，因此将1mm l-胱氨酸计数为2mm l-半胱氨酸(摩尔比1:2)。与基础细胞培养基相比，通常总氨基酸含量在浓缩补料培养基中高约5至20倍，优选约7至15倍，且更优选约10倍。根据本发明的基础培养基的总氨基酸含量可以为约25至150mm，优选约30至130mm，更优选约35至120mm，且甚至更优选约40至100mm。补料培养基的总氨基酸含量可以为约100至1000mm，优选约200至900mm，更优选约300至800mm，且甚至更优选约400至700mm。未被通用遗传密码直接编码的其他氨基酸，例如l-鸟氨酸、羟基l-脯氨酸或其代谢产物例如牛磺酸，可以进一步存在于基础细胞培养基或补料培养基中，但这些对于总氨基酸含量不进行计数。
[0082]
如本文使用的，术语“氨基酸比率”指与参考氨基酸的摩尔浓度相关的每种氨基酸的摩尔浓度的比率。对于与参考氨基酸相关的每一种氨基酸计算摩尔比(具有单位[mm/mm])。对于根据本发明的氨基酸比率计算，l-异亮氨酸用作参考氨基酸(尽管理论上其他氨基酸可以用作参考氨基酸，例如苯丙氨酸或甲硫氨酸)。这可以进一步称为相对于异亮氨酸的摩尔比(mm/mm)。通常，参考氨基酸可以容易地用统计学上低的标准变化来测量，并且在通常使用的培养基中以类似的浓度范围提供。
[0083]
术语“废培养基氨基酸比率调整”意指氨基酸仅基于废培养基分析进行调整，但不考虑细胞和代谢需要以及特定的细胞内或细胞外速率。因此，对于在不同天时从细胞培养上清液中取出的样品执行氨基酸分析，并且在基础和补料培养基中补充低于一定阈值的氨基酸。
[0084]
如本文使用的，术语“胆酸亚铁”涉及归入cas编号1336-80-7的化学化合物柠檬酸胆碱铁，其形成胆酸亚铁络合物。使用的常见同义词是例如柠檬酸铁胆盐、柠檬酸胆碱铁、柠檬酸胆碱、柠檬酸胆碱铁(iii)、胆碱柠檬酸铁、柠檬酸三胆碱、胆碱柠檬酸铁、2-羟基乙基-三甲基铵、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸盐、boxylato(4-)铁酸盐(1-)乙胺、2-羟基-n,n,n-三甲基-羟基(2-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸)。该化合物可以作为铁载体加入基础和补料培养基两者中。优选地，使用具有2:3:3的摩尔铁：胆碱：柠檬酸盐比率的胆酸亚铁(柠檬酸胆碱铁，cas编号1336-80-7，由于5％结晶水含量的分子量mw＝991,5g/摩尔 /-49.57g/摩尔，具有约10.2-12.4％的铁含量的铁络合物，2:3:3的铁：胆碱：柠檬酸盐的分子比率，分子式c
33h57
fe2n3o
24
，其例如可得自dr.paul lohmann gmbh kg)。然而，其他合适的胆酸亚铁结构可以基于铁浓度以等摩尔量使用，例如以1:1:1比率的铁：胆碱：柠檬酸盐，mw＝348.11g/摩尔的分子量，或以(2):3:3比率的(铁)：胆碱：柠檬酸盐，mw＝501.61g/摩尔的分子量，c
21h47
n3o
10
(不含铁的和式)。与商购可得的细胞培养基中使用的技术水平铁源(例如磷酸铁、焦磷酸铁或柠檬酸铁)相比，胆酸亚铁的使用以等摩尔量促进显著更高的产物滴度。
[0085]
术语“多肽”或“蛋白质”或“产物”或“产物蛋白质”或“氨基酸残基序列”可互换使用。这些术语“指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、糖化、乙酰化、磷酸化、氧化、酰胺化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如与其他蛋白的融合，氨基酸序列取代、缺失或插入，同时分子维持其生物功能活性。例如，可以在多肽或其潜在的核酸编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且可以获得具有相似或改良特性的蛋白质。可以例如通过对其潜在的核酸序列执行位点特异性诱变或聚合酶链反应介导的诱变来制备氨基酸修饰。术语“多肽”、“蛋白质”、“产物”和“产物蛋白质”因此还包括例如由免疫球蛋白组分(例如fc组分)和生长因子(例如白介素)组成的融合蛋白、抗体或任何抗体衍生的分子形式或抗体片段。
[0086]
术语“目的蛋白质”或“目的产物”或“目的多肽”包括蛋白质、多肽、其片段、肽、融合蛋白，所有这些都可以在选择的宿主细胞中表达。通常，目的蛋白质是重组蛋白质，即通过起因于分子克隆的重组dna编码的蛋白质。这些目的蛋白质可以是抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、以及任何其他多肽，其可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途或可以用作研究试剂。优选地，目的蛋白质是分泌蛋白质或蛋白质片段，更优选抗体或抗体片段或fc-融合蛋白。“目的产物”也可以是反义rna、trna、rrna、作为核糖核蛋白或其他调节rna的部分的其他rna。
[0087]
如本文使用的，术语“目的基因”、“所需序列”、“目的多核苷酸”或“所需基因”具有相同的含义，并且指编码目的产物的任何长度的多核苷酸序列。该基因可以进一步包括在编码序列之前(5'非编码或非翻译序列)和之后(3'非编码或非翻译序列)的调节序列。选择的序列可以是全长或截短的基因、融合或加上标签的基因，并且可以是cdna、基因组dna或dna片段。一般理解编码多肽或rna的基因组dna包括非编码区(即内含子)，其与成熟信使rna(mrna)剪接，并且因此不存在于编码相同多肽或rna的cdna中。它可以是天然序列，即天
然存在的形式，或可以是突变的，或包含衍生自不同来源的或在其他方面根据需要进行修饰的序列。这些修饰包括密码子最佳化，以最佳化所选宿主细胞中的密码子使用或加上标签。此外，它们可以包括去除或添加顺式作用位点，例如(隐蔽)剪接供体、受体位点和分支点、多聚腺苷酸化信号、tata-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、转录因子或其他调节因子的结合位点、限制性内切酶位点等，仅给出一些但非限制性实例。所选择的序列可以编码分泌、细胞质、核、膜结合的或细胞表面多肽。
[0088]
细胞培养基和氨基酸比率
[0089]
由通用遗传密码编码的20种标准氨基酸(l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸)对于蛋白质合成发挥重要作用，因为它们为细胞蛋白质和目的蛋白质(例如单克隆抗体)提供了构件块。因此，氨基酸在细胞代谢中多重相互作用。它们以特定的量从细胞培养基中摄取，它们在细胞代谢内相互转换，被导入宿主细胞蛋白或产物蛋白内，由细胞作为副产物排出，并且在各个点处连接细胞代谢分解代谢和合成代谢，例如在氨基酸代谢和柠檬酸循环之间连接。在基础和补料培养基两者中，需要为细胞培养的整个生命周期(种植、滞后期、指数生长期、转化期、稳定期、特征在于细胞存活率中的显著降低的死亡期)的最佳营养供应提供氨基酸的最佳组成、浓度和比率。然而，氨基酸的比率看起来比每种个别的氨基酸的实际确切浓度更重要。
[0090]
因此，在本发明的一个方面，提供了用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：约1.2-2.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸、约0.5-0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸、约1.5-2.7的l-酪氨酸/l-异亮氨酸、约1.0-1.9的l-苏氨酸/1-异亮氨酸、以及约1.0-1.9的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，其中所述基础细胞培养基具有约25至150mm氨基酸的总氨基酸含量。在一个实施方案中，相对于异亮氨酸的摩尔比(mm/mm)为：约1.2-2.1，优选约1.3-1.8，更优选约1.5-1.8，且甚至更优选约1.7的l-亮氨酸/l-异亮氨酸；约0.5-0.9，优选约0.6-0.9，更优选约0.6-0.8，且甚至更优选约0.7的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸；约1.6-2.6，优选约1.7-2.5，更优选约1.9-2.3，且甚至更优选约2.1的l-酪氨酸/l-异亮氨酸；约1.1-1.8，优选约1.2-1.8，更优选约1.3-1.6，且甚至更优选约1.5的l-苏氨酸/1-异亮氨酸；和约1.1-1.9，优选约1.2-1-8，更优选约1.3-1.6，且甚至更优选约1.5的l-缬氨酸/l-异亮氨酸。在某些实施方案中，本发明的培养基进一步包含相对于异亮氨酸的摩尔比为约1.6-2.9，优选约1.7-2.8，更优选约1.8-2.7，更优选约2.0至2.5，且甚至更优选约2.2的l-赖氨酸。在某些实施方案中，本发明的基础培养基进一步包含相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.3-0.5，优选约0.3-0.5，更优选约0.3-0.4，更优选约0.3-0.4，且甚至更优选约0.4的l-色氨酸；或相对于异亮氨酸的摩尔比为约1.6-3.0，优选约1.7-2.8，更优选约1.8-2.7，更优选约2.0-2.5，且甚至更优选约2.3的l-脯氨酸，或相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.4-0.7，优选约0.4-0.6，更优选约0.4-0.6，更优选约0.5-0.6，且甚至更优选约0.5的l-甲硫氨酸。在某些实施方案中，l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸相对于l-异亮氨酸的摩尔比如上定义。基础细胞培养基中的总氨基酸含量可以为约25-150mm，优选约30-130mm，更优选约35-120mm，且甚至更优选约40-100mm。
[0091]
优选地，l-亮氨酸、l-苯丙氨酸、l-苏氨酸、l-缬氨酸和l-酪氨酸以及任选进一步
的l-赖氨酸、l-色氨酸、l-脯氨酸和/或l-甲硫氨酸相对于异亮氨酸的氨基酸比率在表2a中对于基础培养基6.2提供的比率的30％、25％、20％或10％内。
[0092]
本发明的基础细胞培养基(基础培养基6.2)的更具体的示例性氨基酸比率在下表a中提供，与所选择的商业基础细胞培养基中的氨基酸比率直接比较。
[0093]
表a：关于基础细胞培养基的每种氨基酸与参考异亮氨酸(ile)的氨基酸比率。
[0094][0095]
在本发明的另一个方面，提供了用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含相对于异亮氨酸以下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：约2.3
–
4.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸、约0.6-1.1的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸、约1.3-2.4的l-苏氨酸/1-异亮氨酸、以及约1.1-2.0的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，其中所述补料培养基具有约100至1000mm氨基酸的总氨基酸含量。在一个实施方案中，相对于异亮氨酸的摩尔比(mm/mm)是：约2.4-4.0，优选约2.6-3.9，更优选约2.9-3.5，且甚至更优选约3.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸；约0.6-1.1，优选约0.7-1.0，更优选约0.8-0.9，且甚至更优选约0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸；约1.4-2.3，更优选约1.5-2.2，更优选约1.7-2.0，且甚至更优选约1.8的l-苏氨酸/1-异亮氨酸；和约1.2-2.0，优选约1.3-1.9，更优选约1.4-1.7，且更优选约1.6的l-缬氨酸/l-异亮氨酸。
[0096]
在一个实施方案中，补料培养基进一步包含相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.6-1-1的l-酪氨酸和/或相对于异亮氨酸的摩尔比为约1.1-2.1的l-赖氨酸。优选地，酪氨酸以约0.6-1.0，优选约0.7-1.0，更优选约0.7-0.9，且甚至更优选约0.8的比率存在于补料培养基中。优选地，赖氨酸以约1.2-2.0，优选约1.3-1.9，更优选约1.4-1.8，且甚至更优选约1.6的
比率存在于补料培养基中。优选地，l-酪氨酸和l-赖氨酸的摩尔比如上定义。在某些实施方案中，本发明的补料培养基进一步包含相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.3-0.6，优选约0.3-0.6，更优选约0.4-0.5，更优选约0.4-0.5，且甚至更优选约0.5的l-色氨酸；或相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.9-1.8，优选约1.0-1.7，更优选约1.1-1.6，更优选约1.2-1.5，且甚至更优选约1.4的l-脯氨酸，或相对于异亮氨酸的摩尔比为约0.4-0.8，优选约0.4-0.7，更优选约0.5-0.7，更优选约0.5-0.6，且甚至更优选约0.6的l-甲硫氨酸。在某些实施方案中，l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸相对于l-异亮氨酸的摩尔比如上定义。基础细胞培养基中的总氨基酸含量可以为约100-1000mm，优选约200至约900，更优选约300至约800，且甚至更优选约400至约700mm。
[0097]
优选地，l-亮氨酸、l-苯丙氨酸、l-苏氨酸和l-缬氨酸，以及任选进一步的l-酪氨酸、l-赖氨酸、l-色氨酸、l-脯氨酸和/或l-甲硫氨酸相对于l-异亮氨酸的氨基酸比率在表6中对于补料培养基6.2提供的比率的30％、25％、20％或10％内。
[0098]
本发明的补料培养基(补料培养基6.2)的更具体的示例性氨基酸比率在下表b中提供，与所选择的商业补料培养基中的氨基酸比率直接比较。
[0099]
表b：关于补料培养基的每种化合物与参考异亮氨酸(ile)的氨基酸比率。
[0100][0101][0102]
将补料培养基作为浓缩补料培养基加入基础细胞培养基或培养基中。例如，补料培养基可以基于培养物起始体积(csv)，以约10-50ml/l/天，优选以约15至45ml/l/天，更优
选以约20-40ml/l/天，且甚至更优选以约30ml/l/天加入。以ml/l/天(加入的以ml的体积/容器中的培养物起始体积升/天)将补料培养基加入细胞培养物的速率(体积/天)被理解为整个补料期的平均速率，并且所添加的体积可以在补料期过程中的各个添加之间变化。还在培养和/或收获终止之前约1至3天可以停止补料。优选添加小体积以避免稀释细胞培养中的其他营养素的稀释，并且尽可能维持培养体积恒定。补料培养基可以连续添加，每天几次、每天或每隔一天。优选地，从第0天、第1天或第2天开始每天或每隔一天加入所述补料培养基。
[0103]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基是无血清的，且优选化学成分确定的或化学成分确定且无蛋白质的。此外，本发明的基础细胞培养基和补料培养基适合于培养哺乳动物细胞，即它们分别是基础哺乳动物细胞培养基和哺乳动物补料培养基。本发明的基础细胞培养基和补料培养基适合于培养所有种类的哺乳动物细胞，例如啮齿类动物或人细胞，其中啮齿类动物细胞是优选的。更优选地，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(cho)，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、duxb11细胞或cho gs缺陷细胞，最优选地，细胞是cho-dg44细胞或cho gs缺陷细胞。
[0104]
包含本发明的氨基酸比率的基础细胞培养基可以进一步包含以如下文对于基础细胞培养基所述的浓度的胆酸亚铁。类似地，包含本发明的氨基酸比率的补料培养基可以进一步包含以如下文对于补料培养基所述的浓度的胆酸亚铁。
[0105]
培养基和铁载体
[0106]
在哺乳动物细胞培养中，需要铁作为微量元素。在体内，铁主要由血清中的铁蛋白和转铁蛋白结合。细胞培养基中的典型铁源是转铁蛋白。在先进的无血清或甚至无蛋白质的哺乳动物细胞培养基中，需要解决与铁有关的几个方面，例如鉴定合适的铁载体、铁的弱生物利用度、鉴定足够的生理浓度范围(由于关于铁化合物的潜在毒性在体外存在有害的自由基，而对细胞存活率具有最低限度的负面作用/不具有负面作用)、络合物结合行为(铁可以结合培养基制剂内的多种物质，并且从而可以容易地变得生物学上不可用于细胞培养)、氧化状态和最佳细胞培养性能(例如滴度)。
[0107]
在本发明中，与用于细胞培养中的已确认的铁载体相比，化合物胆酸亚铁在哺乳动物细胞培养中作为新型铁载体提供。
[0108]
因此，在另一个方面，本发明提供了用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm、或约0.4至1.0mm的胆酸亚铁。
[0109]
在另外一个方面，本发明提供了补料培养基，其包含浓度为约0.4至5.0mm、约0.4至1.0mm、或约0.5至1mm，优选约0.5至0.6mm的胆酸亚铁。
[0110]
基础培养基和补料培养基中的胆酸亚铁的浓度基于具有2:3:3的摩尔铁：胆碱：柠檬酸盐比率的胆酸亚铁(柠檬酸胆碱铁，cas编号1336-80-7，由于5％结晶水含量的分子量mw＝991,5g/摩尔 /-49.57g/摩尔，具有约10.2-12.4％的铁含量的铁络合物，2:3:3的铁：胆碱：柠檬酸盐的分子比率，分子式c
33h57
fe2n3o
24
)。然而，本发明包括其他胆酸亚铁结构，并且可以基于铁浓度以等摩尔量使用，例如以1:1:1比率的铁：胆碱：柠檬酸盐，mw＝348.11g/摩尔的分子量。这意味着例如，具有2:3:3的摩尔铁：胆碱：柠檬酸盐比率的1mm胆酸亚铁等于具有1:1:1的摩尔铁：胆碱：柠檬酸盐比率的2mm胆酸亚铁。
[0111]
胆酸亚铁作为铁载体的使用导致增加的产物滴度。另外，与确认为铁载体例如柠
檬酸铁的其他铁源相比，新型铁载体胆酸亚铁通常在化学上特征在于与柠檬酸铁相比更高的纯度。确认的铁载体例如柠檬酸铁的较高潜在的批次间变化性可以在生物制药制造中引起负面效应(例如制造中的重现性受负面影响)。胆酸亚铁可以用于基础和/或补料培养基两者中，优选将胆酸亚铁加入基础培养基和补料培养基两者中。与细胞培养基中使用的其他铁源例如磷酸铁(iii)或焦磷酸铁(iii)相比，胆酸亚铁的使用导致改善的培养性能，例如显著更高的产物滴度。根据本发明的包含胆酸亚铁的基础细胞培养基可以进一步包含如上所述的根据本发明的基础培养基的新型氨基酸比率。类似地，根据本发明的包含胆酸亚铁的补料培养基可以进一步包含如上所述的根据本发明的补料培养基的新型氨基酸比率。
[0112]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基是无血清的，优选化学成分确定的或化学成分确定且无蛋白质的。此外，本发明的基础细胞培养基和补料培养基适合于培养哺乳动物细胞，即它们分别是基础哺乳动物细胞培养基和哺乳动物补料培养基。本发明的基础细胞培养基和补料培养基适合于培养所有种类的哺乳动物细胞，例如啮齿类动物或人细胞，其中啮齿类动物细胞是优选的。更优选地，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(cho)，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、duxb11细胞或cho gs缺陷细胞，最优选地，细胞是cho-dg44细胞或cho gs缺陷细胞。
[0113]
培养基及其他组分
[0114]
用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基可以进一步包含在优选缓冲培养基中的必需营养素和组分如维生素、微量元素、盐、主体盐、脂质或脂质前体和碳水化合物。还可以将生长因子加入基础细胞培养基或补料培养基中，例如重组胰岛素样生长因子(igf)或重组胰岛素。
[0115]
合适维生素的非限制性实例是生物素(b7)、泛酸钙、氰钴胺(b12)、叶酸、肌醇、烟酰胺(b3)、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素(b2)和/或硫胺素(b1)。微量元素的非限制性实例是钼酸铵、钒酸铵、硫酸铜、硫酸镍、亚硒酸钠、硅酸钠和硫酸锌和/或氯化锌。脂质前体的非限制性实例是氯化胆碱、乙醇胺、甘油、肌醇、亚油酸、脂肪酸、磷脂或胆固醇相关化合物。
[0116]
此外，盐可以是(但不限于其)氯化钙、硝酸钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾和/或氯化钠。盐的一个功能是调整培养基中的渗透压。优选地，基础细胞培养基的渗透压不超过通常在280-350mosmo/kg之间的最佳范围。通常，浓缩补料培养基的渗透压《2000mosmo/kg，优选《1500mosmo/kg，更优选《1000mosmo/kg。补料培养基的渗透压可以更高，但在添加后不应使细胞培养中的渗透压增加超过270-550mosmo/kg，优选280-450mosmo/kg，更优选280-350mosmo/kg的最佳范围。
[0117]
优选地，其任何实施方案中的本发明的补料培养基具有降低的盐含量或低盐含量。降低的盐含量或低盐含量意指例如约100mm或更低，优选约50mm或更低的总盐浓度(例如不含氯化钠和降低浓度的氯化钾的补料培养基)。当将补料培养基与本发明的基础细胞培养基组合用作常规生长培养基时，本发明的补料培养基中降低的低盐含量是尤其优选的。
[0118]
对渗透压最重要的贡献者是钠离子、氯离子和碳酸氢盐以及葡萄糖及其他碳源，例如氨基酸。对于培养基开发者，挑战在于创建满足下述需求的高浓缩的营养素混合物和用于制造其的粉末制剂：优选地，基础培养基组合的x-倍浓缩物(对于供应链管理和监管方面的积极影响)，提供了必需营养素和不能由细胞本身以足够量合成的营养素(优选作为合
理平衡的组合物)，克服了补料浓缩物的溶解性方面，由于渗透压原因去除了主体盐，避免了毒性范围，设计出出于药物原因而需要碳载体的粉末制剂。此外，对于常见的补料分批工艺，补料培养基需要浓缩以使培养期间的培养体积最小化。生物反应器的尺寸实际上可以导致补料约束，其仅允许培养物起始体积的大约30％(25-35％)的总补料剂量。
[0119]
碳水化合物可以是但不限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖或葡糖胺等。这些碳水化合物可以直接加入基础细胞培养基和/或补料培养基中，或者可以分开加入细胞培养中。其他能源包括但不限于丙酮酸钠。
[0120]
哺乳动物细胞应该在中性ph，例如约ph 6.5至约ph 7.5，优选约ph 6.6至约ph 7.3下，更优选在约7的ph下进行培养。因此，应该将缓冲试剂加入基础细胞培养基中。对于补料培养基，ph可以略微在所述范围之外，只要补料培养基的添加不使细胞培养物的ph在该范围之外，因为补料培养基作为浓缩物加入。补料培养基中ph的优选范围为约6至约8.合适的缓冲试剂包括但不限于hepes、磷酸盐缓冲液(例如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾和/或无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钠)、酚红、碳酸氢钠(sodium bicarbonate)和/或碳酸氢钠(sodium hydrogen carbonate)。
[0121]
一般地，补料培养基包含在细胞培养期间消耗的营养素，例如氨基酸和碳水化合物，而盐和缓冲剂较不重要。一些盐因此可以从补料培养基中完全省略。
[0122]
细胞培养性能
[0123]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基或者包含本发明的化学成分确定的基础培养基和化学成分确定的补料培养基的细胞培养基平台导致改善的细胞培养性能。如本文使用的，术语“改善的细胞培养性能”包含例如显著改善的产物滴度、改善的细胞生长(例如活细胞计数、细胞存活率)、以及细胞培养过程的有利表型行为，例如不需要和有毒的副产物的降低溢流代谢(例如降低的乳酸盐形成)。它还促成细胞培养过程中降低的渗透压水平。
[0124]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基在细胞培养的时间过程期间满足哺乳动物细胞培养的细胞特异性需求和代谢需要。换言之，它满足(i)哺乳动物细胞的细胞特异性需要，(ii)在细胞培养系统中，(iii)在培养运行的整个生命周期(其为约10-20天)。培养中的哺乳动物细胞在细胞培养工艺的不同阶段具有不同的营养需求。然而，理想地，仅需要设计一种最佳基础培养基和一种(或很少的)最佳补料培养基/培养基，以允许设计坚固、安全和有效的生物工艺。本文提供的基础培养基和/或补料培养基满足了这一需要。
[0125]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基具有改善的细胞培养性能。改善的细胞培养性能的非限制性实例是产物滴度的增加、改善的活细胞浓度和/或细胞存活率。另外，可以改善细胞扩增，这是在扩大程序中用于接种训练所需的。例如，培养规模从细胞库的解冻(ml规模)到生产规模(》10.000l规模)逐步增加。每个n-x阶段的生长越好(其中n阶段意指最终生产规模，并且n-x意指在分批模式中通常的最终生产阶段之前的细胞扩增阶段)，可以发生越快和越好的对下一阶段的每次转移。具体地，更好的细胞生长和更高的活细胞浓度允许n-x培养可以以降低的运行时间(因此更快)执行。更好的细胞生长和更高的活细胞浓度也导致改善的转移，导致总体改善的性能。例如，当某一nx阶段应该用一定的种植细胞密度接种，并且活细胞浓度很高时，需要将相对低体积的细胞培养物从一个阶段转移到下一个阶段(接种物体积的转移/csv定义为分流比(spit ratio)，通常地，1:5至1:20
是常见的)。这意味着同时仅降低体积的“使用过的”细胞培养基从一个阶段转移到下一个阶段，并且可以将最大体积的“新”培养基添加到下一阶段(恒定的总体培养体积)。这也导致在最后的n阶段改善的总体细胞培养性能(例如增加的产物滴度)。利用本发明中提供的新型基础细胞培养基和补料培养基，所有这些阶段都得到改善。新型铁载体胆酸亚铁和/或新型氨基酸比率的积极效应并不限于最终生产阶段中的基础培养基和补料培养基。还显示了培养基平台的积极效应适合n-x阶段，特别是氨基酸比率。在n-x阶段中的培养基修改的情况下，这些积极效应也得以维持。例如，通常在接种训练的早期阶段中提供mtx(氨甲蝶呤)，以便维持使用重组细胞系，例如cho细胞系，优选cho-dg44细胞系的哺乳动物细胞培养中的选择压力。另外在这样的实例中，本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基或培养基平台的应用导致显著改善的活细胞浓度。
[0126]
细胞培养/补料培养基的添加
[0127]
与其中在整个培养期间不向培养物中加入浓缩的补料培养基的常规分批发酵相比，命名为“补料培养基”的营养素浓缩物的添加是标准补料分批应用所需的。与分批应用相反，众所周知由于营养素、维生素、盐和其他组分的补充，细胞培养性能例如最大活细胞计数、最终产物滴度、代谢废物累积在补料分批工艺中得到显著改善。通常，在培养时间期间加入培养物中的最大量的补料溶液取决于技术方面，以及代谢驱动的方面：生物反应器的最大体积约束待加入的总补料体积，而非技术补料剂量适合满足在培养期间的任何时间真实的细胞营养素要求。此外，取决于细胞系和工艺模式，补料添加可以以例如5-60ml补料/l/d或的恒定补料速率，例如以小规模2-80l(开发，更少的工作强度)连续添加，或例如以2000-10.000l的大规模用非连续(大规模制造，更多的工作强度)方法添加，以使污染风险最小化。在例如11天补料分批培养期间补料添加的典型间隔可以在每天几次、每天或每2-4天之间变化，并且通常取决于实际的营养素水平、生长期、培养条件如培养物的ph或营养素要求。
[0128]
乳酸盐/二氧化碳/葡萄糖
[0129]
在大多数细胞培养中，由于溢出代谢可以确定主要碳的非理想营养燃烧。这意味着主要的碳源葡萄糖被无效地利用，并且通过这促成有机酸例如乳酸的增加。乳酸的水平增加可以促成ph降至低于6.65，并且这将负面影响培养基的缓冲能力以及因此的培养物存活。由于这个原因，培养大气中的co2浓度在指数生长期开始时降低，以使培养基中的酸水平最小化。
[0130]
细胞系和细胞培养
[0131]
本发明的基础细胞培养基和/或补料培养基或培养基平台可以应用于所有的哺乳动物细胞系。然而，本发明的培养基可以进一步适合于其他真核细胞，例如酵母、植物或昆虫细胞。根据本发明的哺乳动物细胞可以是卵母细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或任何类型的分化细胞。优选地，哺乳动物细胞是人、猿、鼠、山羊、牛、绵羊、猪细胞或啮齿类动物细胞系如大鼠、兔或仓鼠。哺乳动物细胞可以是分离的原代细胞或细胞系。用于生产重组生物制药的优选细胞系或“宿主细胞”是人、猴或啮齿类动物细胞系(小鼠、大鼠或仓鼠)。优选的人细胞是per.c6或hek 293细胞。
[0132]
更优选的是啮齿类动物细胞，例如仓鼠细胞，优选bhk21、bhk tk-、中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cho-k1、cho-dxb11(也称为cho-dukx或duxb11)、cho-dukx b1、cho-s、cho-dg44
和cho谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷细胞或任何这样的细胞系的衍生物/后代。特别优选的是cho-dg44、cho-dukx、cho-k1、cho-s、cho-dg44gs缺陷细胞系和bhk21，且甚至更优选cho-dg44细胞、cho gs缺陷细胞(例如cho-k1 gs缺陷细胞)和cho-dukx细胞。此外，鼠骨髓瘤细胞，优选ns0和sp2/0细胞或任何这样的细胞系的衍生物/后代也称为生物制药蛋白质的生产细胞系。
[0133]
所有细胞和细胞系都可以用于所有种类的细胞培养中，例如，范围从塑料微量滴定板(nl至ml规模)到工业规模的不锈钢生物反应器(l至kl规模)，它们还包括任何类型的一次性使用系统和从非受控系统到完全受控系统的所有种类的工艺控制策略，包括例如先进的在线监测和先进的控制策略。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。哺乳动物细胞可以例如悬浮培养或附着至固定表面。
[0134]
可以与本发明的培养基一起使用的哺乳动物细胞的非限制性实例在表c中概括。
[0135]
表c：合适的示例性哺乳动物生产细胞系
[0136][0137]
所述生产细胞优先在允许细胞增殖的条件下培养。此外，所述生产细胞优先在有利于所需基因和/或目的蛋白质表达的条件下培养。目的蛋白质不是从细胞和/或细胞培养
上清液中分离的。优选地，目的蛋白质作为分泌多肽从培养基中回收，或者如果不含分泌信号表达，则它可以从宿主细胞裂解产物中回收。
[0138]
通常，有必要以获得目的蛋白质基本上同质的制剂的方式，使目的蛋白质纯化掉其他重组蛋白质、宿主细胞蛋白质和污染物。作为第一步，可以从培养基或裂解产物中去除细胞和/或颗粒细胞碎片。通常，目的产物然后纯化掉污染物可溶性蛋白质、多肽和核酸，例如通过在免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相hplc、sephadex色谱法、在二氧化硅或阳离子交换树脂如deae上的色谱。
[0139]
培养基的用途
[0140]
本发明的基础细胞培养基或补料培养基可以用作生长培养基，用作接种物培养基，用作细胞扩增或细胞系发育的培养基，包括转染、扩增或两者。此外，基础细胞培养基或补料培养基优选可以组合用于从表达所述目的蛋白质的哺乳动物细胞产生目的蛋白质。
[0141]
具体地，本发明的基础培养基和补料培养基可以用于培养哺乳动物细胞的方法，其包括下述步骤：a)提供哺乳动物细胞，b)在本发明的基础细胞培养基中培养细胞，和c)任选地将本发明的补料培养基加入基础细胞培养基中；其中所述细胞在允许细胞增殖的条件下培养。优选地，补料培养基也用于所述方法中。
[0142]
本发明的基础培养基和补料培养基可以进一步用于生产目的蛋白质的方法，其包括下述步骤：a)提供包含编码目的蛋白质的目的基因的哺乳动物细胞，b)在本发明的基础细胞培养基中培养细胞，和c)任选地将本发明的补料培养基加入基础细胞培养基中，和d)任选地从细胞培养物中分开和/或分离和/或纯化所述目的蛋白质；其中所述细胞在允许目的蛋白质表达的条件下培养。优选地，补料培养基用于所述方法中。补料培养基可以基于培养物起始体积(csv)，以约10-50ml/l/天，优选以约15至45ml/l/天，更优选以约20-40ml/l/天，且更优选以约30ml/l/天加入在基础细胞培养基中培养的细胞中，其中培养基可以连续加入，或者作为推注每天几次、每天两次、每天一次、每隔一天或每隔两天加入。优选地，补料培养基在第0、1、2或3天时开始加入。以ml/l/天(加入的以ml的补料体积/容器中的培养物起始体积升/天)将补料培养基加入细胞培养物的速率(体积/天)被理解为经过补料期的平均速率，并且所添加的体积可以在补料期过程中的各个添加之间变化。还在培养和/或收获终止之前约1至3天可以停止补料。
[0143]
从细胞培养物中分开目的蛋白质可以通过例如离心、过滤或本领域已知的用于从细胞或细胞碎片中分开包含蛋白质的上清液的任何其他方法来完成。如果蛋白质在细胞内产生，则这可以包括裂解。从细胞培养物中纯化目的蛋白意指通过本领域已知的方法，例如沉淀、色谱法或凝胶电泳，从复杂混合物例如细胞培养上清液或裂解产物中分离一种或几种蛋白质。
[0144]
本发明的基础培养基和补料培养基可以用于大规模细胞培养，优选100l或更多，更优选1000l或更多，或甚至更优选10000l或更多的细胞培养物。
[0145]
目的蛋白质可以是抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体或者其衍生物或片段、以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途或可以充当研究试剂的任何其他多肽。目的蛋白质可以是例如抗体，例如利妥昔单抗或fc-融合蛋白。优选地，抗体是具有seq id no:1和seq id no:2的氨基酸序列的重和轻链，或具有seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的重和轻链的单克隆igg1抗体。fc-融合蛋白优选具有seq id no:5的氨
基酸序列。
[0146]
目的蛋白质也可以是蛋白质/多肽，其用于改变在所谓的“细胞工程”的范围内的宿主细胞性质，例如抗凋亡蛋白、伴侣蛋白、代谢酶、糖基化酶及其衍生物或片段，但不限于此。
[0147]
特别地，所需蛋白质/多肽或目的蛋白质是(不限于此)例如胰岛素、胰岛素样生长因子(igf1)、hgh、tpa、细胞因子(例如白介素(il)，例如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、干扰素(ifn)α、ifnβ、ifnγ、ifnω或ifnτ、肿瘤坏死因子(tnf)例如tnfα和tnfβ、tnfγ、trail；g-csf、gm-csf、m-csf、mcp-1、vegf和纳米抗体。还包括的是促红细胞生成素或任何其他激素生长因子以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽的产生。根据本发明的方法还可以有利地用于生产抗体，例如单克隆、多克隆、多特异性和单链抗体、或其衍生的片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、fc和fc’片段、重和轻免疫球蛋白链及其恒定、可变或高变区以及fv-和fd-片段。
[0148]
如本文使用的，术语“抗体(antibody)”、“抗体(antibodies)”或“免疫球蛋白”涉及选自球蛋白中的蛋白质，其由于分化的b淋巴细胞(浆细胞)对异物(＝抗原)的宿主生物反应而形成。他们作用为特异性针对这些异物防御。存在各个类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg、igm、igy、igw。优选地，抗体是igg抗体，更优选igg1抗体。术语免疫球蛋白和抗体可互换使用。抗体包括多克隆、单克隆、单特异性、双特异性、多特异性、单链抗体、抗体的抗原结合片段(例如fab或f(ab')2片段)、二硫键连接的fv等。抗体可以是任何物种，并且包括嵌合和人源化抗体。“嵌合”抗体是其中抗体结构域或区域衍生自不同物种的分子。例如，重和轻链的可变区可以衍生自大鼠或小鼠抗体，并且恒定区衍生自人抗体。在“人源化”抗体中，仅最低限度的序列衍生自非人类物种。通常仅人抗体的cdr氨基酸残基替换为非人物种的cdr氨基酸残基，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或骆马。有时，对抗原结合特异性和亲和力具有影响的几个关键的构架氨基酸残基也被非人氨基酸残基替换。抗体可以通过化学合成、经由重组或转基因手段、经由细胞(例如杂交瘤)培养、或通过其他手段产生。
[0149]
免疫球蛋白是由两对异源二聚体组成的四聚体多肽，所述异源二聚体各自由重链和轻链形成。异源二聚体以及四聚体多肽结构两者的稳定经由链间二硫桥发生。每条链由称为“免疫球蛋白结构域”或“免疫球蛋白区域”的结构域组成，由此术语“结构域”或“区域”可互换使用。每个结构域含有约70
–
110个氨基酸并且形成紧凑的三维结构。重链和轻链两者在其n末端处含有具有较少保守序列的“可变结构域”或“可变区”，其负责抗原识别和结合。轻链的可变区也称为“vl”，并且重链的可变区也称为“vh”。
[0150]
术语“fab片段”(抗原结合片段＝fab)或“fab”由抗体重和轻链两者的可变区(vh和vl)组成，其通过相邻的恒定区(ch1和cl)结合在一起。这些可以通过蛋白酶消化例如使用木瓜蛋白酶由常规抗体形成，但相似的fab片段也可以通过基因工程同时产生。进一步的抗体片段包括“f(ab’)2片段”或“f(ab’)2”，其可以通过用胃蛋白酶的蛋白水解切割或通过基因工程制备，其中抗体的两个fab臂仍经由位于铰链区内的重链间二硫桥连接。
[0151]
由于其结晶倾向(fc＝可结晶的片段)，由抗体重链的ch2和ch3结构域组成的免疫球蛋白片段称为“fc片段”、“fc区”或“fc”。这些可以通过蛋白酶消化例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶由常规抗体形成，但也可以通过基因工程产生。fc片段的n-末端部分可能依赖
于仍存在多少铰链区的氨基酸而变化。
[0152]
术语“fc-融合蛋白”描述了含有免疫球蛋白的天然或经修饰的(例如取代、缺失、插入)fc区作为融合配偶体的多肽。fc融合蛋白可以是天然存在的蛋白质(例如抗体)或工程重组蛋白质(例如tnf受体-fc融合蛋白或与fc区融合的vh区)。fc-融合蛋白可以作为单体或作为多聚体存在，由此多肽可以具有相同或不同的序列，可能含有在两个融合配偶体和/或多肽的铰链区或经修饰的铰链区的部分之间的接头序列，或者多肽直接与ch2结构域融合。
[0153]
使用基因工程方法，能够产生仅由重(vh)和轻链(vl)的可变区组成的缩短的抗体片段。这些被称为“fv片段”(可变片段＝可变部分的片段)或“fv”。因为这些fv片段缺乏两条链通过恒定链的半胱氨酸的共价键合，所以fv片段通常是稳定的。通过例如10至30个氨基酸，优选15个氨基酸的短肽片段将重和轻链的可变区连接是有利的。以这种方式，获得通过肽接头连接的由vh和vl组成的单条肽链。这种抗体蛋白被称为“单链-fv”或“scfv”。这种scfv抗体蛋白质的实例由现有技术已知。另外，可以将多于一个vh和/或vl区连接在一起。
[0154]
近年来，已开发了各种策略用于制备作为多聚体衍生物的scfv。这预期特别导致具有改善的药物代谢动力学和生物分布性质以及增加的结合亲合力的重组抗体。为了实现scfv的多聚化，scfv被制备为具有多聚化结构域的融合蛋白。多聚化结构域可以是例如igg或卷曲螺旋结构(螺旋结构)的ch3区，例如亮氨酸拉链结构域。然而，还存在其中scfv的vh/vl区之间的相互作用用于多聚化(如双体、三体和五体)的策略。通过双体，技术人员意指二价同源二聚体scfv衍生物。将scfv分子中的接头缩短至5-10个氨基酸，导致其中发生链间vh/vl叠加的同源二聚体形成。双体可以另外通过掺入二硫桥来稳定。双体-抗体蛋白质的实例由现有技术已知。
[0155]
通过微体，技术人员意指二价、同源二聚体scfv衍生物。它由融合蛋白组成，所述融合蛋白含有免疫球蛋白，优选igg，最优选igg1的ch3区作为二聚化区域，所述二聚化区域经由铰链区(例如，也来自igg1)和连接区与scfv连接。微体-抗体蛋白质的实例由现有技术已知。
[0156]
通过三体，技术人员意指：三价同源三聚体scfv衍生物。其中vh-vl无需接头序列而直接融合的scfv衍生物导致三聚体的形成。
[0157]
本领域技术人员还熟悉所谓的微型抗体，其具有二价、三价或四价结构并且衍生自scfv。多聚化通过二聚体、三聚体或四聚体卷曲螺旋结构进行。在本发明的优选实施方案中，目的基因编码上述那些所需多肽中的任一种，优选单克隆抗体、其衍生物或片段。
[0158]
术语“抗体衍生的分子”与“抗体衍生的片段”或“抗体片段”可互换使用，并且指仅含有一个或多个抗体结构域或区域的部分和/或完整结构域或区域的多肽。抗体片段可以a)自己形成分子，b)以不同的组合彼此连接，c)与非抗体序列融合，d)与非多肽(例如放射性核素)融合或连接，或d)上述任何组合。这些多肽可以作为单体或作为多聚体存在，由此多肽可以具有相同或不同的序列。
[0159]
实施例
[0160]
材料与方法
[0161]
细胞系
[0162]
使cho细胞系(cho-dg44)适应无血清培养基条件，并且进一步用dna转染以产生与
工业制造相关的重组产物，例如单克隆抗体、融合蛋白或双/多特异性蛋白质。具体地，使用表达不同igg构建体的独立地适应无血清培养基(命名为hex i和hex ii)的两种专有bi hex(boehringer-ingelheim high expression)cho-dg44衍生的cho细胞系。这些细胞是dhfr-(二氢叶酸还原酶)缺陷的，并且氨甲蝶呤用作选择标记。如果没有另外说明，则实验中使用的细胞是表达利妥昔单抗作为重组蛋白的cho-dg44(hex ii)细胞，所述利妥昔单抗具有含有seq id no:1的氨基酸序列的重链和含有seq id no:2的序列的轻链，被分泌到培养基内。在下文中将该细胞系称为cho2、cho-dg44利妥昔单抗或cho2(cho-dg44)利妥昔单抗。
[0163]
分析方法
[0164]
通过使用cedex(类型5.00，版本2.2)自动化细胞分析仪(roche innovatis，bielefeld，德国)的台盼蓝排除法测定细胞浓度和细胞存活率。通过基于光度法的konelab 60i(thermo scientific，dreieich，德国)分析仪或通过使用hplc方法来定量培养基中产生的重组蛋白质如igg抗体的浓度。konelab 60i仪器还用于定量细胞培养上清液中的代谢产物，例如葡萄糖、乳酸(乳酸盐)、谷氨酰胺、谷氨酸盐和铵。通过使用gc 6890n/fid气相色谱仪(agilent technologies gmbh&co.kg，waldbronn，德国)测定氨基酸浓度。氨基酸分析通过来自phenomenex(aschaffenburg，德国)的ez-faast方案执行。渗透压曲线通过osmomat自动装置(gonotec gmbh，berlin，德国)分析。该方法基于特定溶液的冷冻凝固点，其与溶解颗粒的量成比例。每天用rapidlab 248/348仪器(siemens healthcare diagnostics gmbh，eschborn，德国)测定溶解二氧化碳pco2、溶解氧po2和ph。这些仪器和所需的方法是本领域众所周知的，并且用于生物制药工艺开发和制造中的工艺监测和控制。
[0165]
摇瓶培养
[0166]
摇瓶(corning b.v.life sciences，amsterdam，荷兰)一般以小规模执行，其工作体积在分批模式(在培养期间无补料添加)或补料分批模式(在培养期间具有30ml/l/d营养素补料添加的标准补料速率)中为60-500ml。在每一个实验中，在接种时的活细胞浓度通常设定为0.3x106细胞/ml。摇瓶培养衍生自相同的接种物预培养(解冻，在种子训练中的细胞扩增，就细胞年龄而言)，以确保在需要时在不同实验设置之间的可比性。对于细胞培养，标准摇瓶培养箱(infors ag，bottmingen，瑞士)以120rpm的振荡速率，37℃的温度设定点使用，并且湿度设定为70％。如上所述的分析方法用于测量每天的标准工艺参数，其为总细胞计数和活细胞计数、细胞存活率、代谢产物浓度和其他相关细胞培养参数，例如溶解氧po2(do)、溶解二氧化碳pco2(dco)含量或ph。这在整个培养过程中常规完成，以监测和控制每个实验装置的培养条件。在补料分批实验中，浓缩补料溶液在补料分批实验中加入，作为1.8ml补料/天对60ml培养物起始体积的推注添加(对应于基于培养物起始体积的30ml/l/d营养素补料速率)，从第2天开始，在不受控制的摇瓶系统中。
[0167]
分批和补料分批模式
[0168]
为了生产重组蛋白质和抗体，通常在最终生产阶段使用补料分批方法，而分批培养主要在最终生产阶段之前的细胞扩增阶段执行。一系列分批培养物在细胞扩增期间称为种子训练，意指细胞在每个扩增步骤中转移到具有较大培养体积的培养容器内。分批工艺在最终生产阶段中一般不导致高生产率，并且因此很少用于制造重组蛋白质。在补料分批工艺中，浓缩的补料培养基在培养期间加入，以用新鲜培养基补偿营养素。这些工艺实现更
高的生产率，并且因此占优势地用于重组蛋白质生产中。与分批模式相比，通过加入浓缩补料培养基补充营养素也降低了通过不需要的代谢副产物如乳酸盐或铵的细胞生长抑制。通常，补料分批工艺以比搅拌槽的最大容量低得多的体积开始，使得可以在生物反应器的培养时间内加入浓缩的营养液。
[0169]
生物反应器培养
[0170]
生物反应器实验在起始体积为1.8l的受控2-l系统(boehringer-ingelheim专利多发酵罐系统)中，或在起始体积为最大15ml的受控48-微型生物反应器系统中执行。完全受控的生物反应器以分批或补料分批模式执行。在补料分批中，浓缩的补料溶液通过补料泵从培养连续加入，通常从第1-3天起，其补料速率为30ml/l/d(基于培养物起始体积)。与摇瓶系统相似，接种密度设定为0.3x106细胞/ml。在更长时间框架内的细胞扩增遵循用于细胞生长和培养分裂的标准种子训练方案，以便确保表型稳定性。该程序确保在不同时间点的不同实验设置之间的可比性。对于典型的生物反应器培养，标准方法形式由下述组成：7.10-6.95( /-0.25)的ph范围，包括从第3天的ph偏移，30-60％的do设定点(空气饱和度)，140rpm的恒定搅拌速率(4叶片圆盘涡轮搅拌器)，以及36.5-37℃的温度设定点。如上所述的分析方法用于确定主要培养参数，例如细胞计数、细胞存活率和主要碳代谢产物浓度，以对细胞培养提供理想的营养素供应。与摇瓶实验相反，在生物反应器系统中，在线监测ph和po2。离线工艺参数和设定点完全由控制软件(siemens，munich德国)控制，使用自动闭环系统用于监测，例如ph控制、营养素进料添加、温度控制、搅拌和除气。
[0171]
实施例1
[0172]
cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在基于rpmi的基础培养基中进行培养，rpmi氨基酸(aa)比率对比具有不同总累积氨基酸量的最佳氨基酸(aa)比率。具有rpmi aa比率的培养基4(培养基4.0、4.1、4.2和4.3)和具有范围为22mm
–
66mm(在培养基4中仅37mm)的总累积氨基酸量的最佳化aa比率的培养基(培养基5.0、5.1和5.2)的培养基组成显示于表1中，并且相应的氨基酸比率显示于表2中。
[0173]
总aa浓度的微小变化是由于分子量的变化和使用的氨基酸粉末的最小变化。该实验的目的是证实在不同的总累积氨基酸水平下的最佳化氨基酸比率的影响。实验以分批模式一式两份(n＝2)执行。
[0174]
表1：培养基4.0、4.1、4.2和4.3以及培养基5.0、5.1和5.2的组成
[0175][0176]
*gln、ile和cys分别使用原液加入
[0177]
**gln和ile分别使用原液加入
[0178]
表1a：培养基4(非最佳化)和培养基5(最佳化)的氨基酸比率
[0179][0180]
表1b：组合物粉末gm rpmi 86638
[0181]
组分[g/l]磷酸氢二钠(无水)0.8氯化胆碱0.003i-肌醇0.035l-还原型谷胱甘肽0.001生物素0.0002氰钴胺(维生素b12)0.000005d-泛酸钙0.00025叶酸0.001烟酰胺0.001对氨基苯甲酸0.001吡哆醇x hcl0.001核黄素0.0002硫胺x hcl0.001d-葡萄糖3.5乙醇胺x hcl0.01563腐胺x 2hcl0.0048
亚硒酸钠0.000003458总和g/l4.37
[0182]
材料与方法：
[0183]
该实验中使用的rpmi基础培养基基于商购可得的rpmi培养基r8755(mediatech目录号90022pb或sigma aldrich目录号r8755)，其由moore及其同事最初在roswell park memorial institute开发(safc，biosciences产品信息)。对于无血清使用，它已如表1所示进行补充，含有以108.4mmol/l的主体盐累积量的氯化钠(nacl 6.0g/l)、氯化钾(kcl 0.4g/l)、硫酸镁(mgso
4 0.0488g/l)。
[0184]
分批实验在起始体积为125ml的500ml摇瓶中执行。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在培养基4、4.1、4.2或4.3(rpmi aa比率)和培养基5、5.1或5.2(最佳化aa比率)中。摇瓶培养物在36.5℃下在第0-3天时具有5％co2和从第4天具有3％co2的培养箱中温育，直到培养结束。
[0185]
氨基酸半胱氨酸在培养基5的粉末制剂中提供，但在培养基4中从原液中分开添加。为了监测和控制培养物，测量总细胞、活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压直至第7天。
[0186]
结果：
[0187]
图1(a-d)显示了在具有rpmi比率(实心正方形)和最佳化aa比率(实心圆圈)的rpmi培养基中培养的细胞的结果，即在44mm的总aa浓度时的活细胞浓度、存活率、产物浓度和乳酸盐浓度。最高的活生长和产物浓度在44mm(图1a和c)和66mm(图1e和g)的不同累积aa浓度时在具有最佳化aa比率的培养物中达到。例如，在第5和7天时，产物浓度在具有最佳化aa比率(图1c)的细胞培养物中高约2.3倍，其中最大产物浓度为166mg/l，与对于在含有rpmi比率的培养基中生长的细胞72mg/l的最大产物浓度相比。这伴随着较高数目的活细胞(图1a，在培养基5中高达2.82x106c/ml，并且在培养基4.1中高达1.13x106c/ml)。两种培养物的存活率曲线彼此良好一致，并且显示从第3天起的明确下降，从98％降至在第7天时的25％存活率(图1b)。在两种培养物中，葡萄糖浓度、铵浓度和渗透压显示类似的趋势。例如，在所有培养物的培养期内，葡萄糖浓度维持大于1.0g/l，以避免任何限制，并且将ph维持在细胞培养工艺的典型范围内。这证实所有培养物都以足够的量与主要碳源如葡萄糖一起提供，所述碳源用于细胞生长、代谢和产物形成。如预期的，代谢废物产物乳酸盐的曲线显示生长依赖模式，即增加的细胞浓度促成较高量的代谢废物乳酸盐(图1d)。应当注意乳酸生产并不总是生长相关的，并且可以进一步理解为有效葡萄糖利用的指标(例如图4j)。
[0188]
对于在含有rpmi比率(实心正方形)和最佳化aa比率(实心圆圈)的培养基中培养的细胞，类似的结果在66mm的总氨基酸浓度(图1e-h)下获得。在第5和7天时，产物浓度在具有最佳化aa比率(图g)的细胞培养物中高约3倍，其中最大产物浓度为311mg/l，与对于在含有rpmi比率的培养基中生长的细胞96mg/l的最大产物浓度相比。这伴随着增加数目的活细胞(图e，在培养基5.1中高达3.44x106c/ml，并且在培养基4.2中高达1.32x106c/ml)。两种培养物的存活率曲线显示类似模式，但培养基5.1中的培养物显示在第5天时大约1天的延长存活率(94％相对于70％培养基4.2)。两种培养物的存活率显示从第3天起的明确下降，从98％降至在第7天时的55％和25％存活率(图1f)。对于乳酸盐浓度、葡萄糖浓度、铵浓度和渗透压以及ph进展，观察到如上所述对于总氨基酸浓度为44mm的培养物类似的趋势。在总
氨基酸浓度较高的情况下(比较66mm(图1e和g)相对于44mm(图1a和c))，总体活细胞浓度和产物浓度较高，特别是对于用最佳化aa比率培养的细胞(含有rpmi比率的培养基的产物浓度：培养基4.2(66mm)相对于培养基4.1(44mm)，第5天：96
–
72mg/l＝ 24mg/l；含有最佳化aa比率的培养基的产物浓度：培养基5.1(66mm)相对于培养基5.0(44mm)，第5天：290-166mg/l＝ 123mg/l)。
[0189]
对于22和36mm总氨基酸浓度也可以观察到类似的趋势(图1i)。大约45mg/l(22mm，培养基4.3，rpmi aa比率；向右的实心三角形)的最大产物浓度随着增加的总氨基酸浓度而增加到65mg/l(36mm，培养基4.0，rpmi aa比率；实心十字形)的最大产物浓度。然而，如果如图1i所示，比较117mg/l(22mm，培养基5.2和最佳化aa比率；实心平方)相对于45mg/l(22mm，培养基4.3，rpmi比率)的最大产物浓度，则这种效应小于与最佳化氨基酸比率相关的效应。
[0190]
如由图1j可以看出的，在22mm的最低测试的总氨基酸浓度(实心正方形)下的最佳化aa比率导致比在66mm的最高测试的总氨基酸浓度(实心圆圈，最大产物浓度96mg/ml，rpmi aa比率)下的rpmi aa比率更高的生产率(最大产物浓度117mg/l，最佳化aa比率，22mm)。因此，使用具有最佳化aa比率的培养基实现了最高的生产率，其最大产物浓度为117mg/l(22mm，最佳化aa比率；图1i，j)、166mg/l(44mm，最佳化aa比率，图1c)和290mg/l(66mm，最佳化aa比率，图1e)。这显示了使aa比率最佳化强烈增加了生产率，并且这只能通过简单地增加总aa浓度补偿至极小的趋势。
[0191]
实施例2
[0192]
基于基础培养基5(基于rpmi的)的最佳化氨基酸比率，几种氨基酸作为单一组分方法在其摩尔浓度中变化 /-20％和 /-40％(计算基于最佳化aa比率的摩尔百分比)。然后，将该性能与在培养基5.3(与培养基5.0相同，但所有氨基酸个别地作为原液添加)中生长的对照培养物进行比较。所有必需的氨基酸通过浓缩原液提供，以设计不同的培养基组成。因此，培养基具有大约43-44mm的可比较的总累积氨基酸量，但不同的氨基酸比率。在一个实验中，测试了相对于对照培养基5.3的 20％和-20％单一氨基酸浓度变化(l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸盐、l-组氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸的单一组分方法)。对于与对照相比 40％和-40％的单一氨基酸浓度变化(l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸盐、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸)。实验使用基于rpmi的培养基以分批模式执行。对于所使用的特定培养基， /-20％或 /-40％的aa变化指示为(20)或(40)。
[0193]
材料与方法：
[0194]
该实验在起始体积为75ml和100ml的250ml摇瓶中执行。在所有培养中，cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在对照培养基5.3(n＝3)和经修饰的培养基5.3.1(20)(n＝2)(单一氨基酸浓度改变 /-20％)和培养基5.3.1(40)(单一氨基酸浓度改变 /-40％)中。将摇瓶在36.5℃下在培养箱(从第0至第3天提供5％co2大气，随后为3％co2，直到培养结束)中温育。葡萄糖在第2天和第4天时以及根据需要供给，以将最终葡萄糖浓度保持在2.5g/l至4.5g/l之间。l-谷氨酰胺也根据需要添加。
[0195]
培养基5.3(与培养基5.0相同，但所有氨基酸个别地作为原液加入)充当该实验的基础。总共14种氨基酸就 /-20％单一组分方法进行测试：l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨
40％。含有最佳化aa比率的这种培养基进一步最佳化用于无血清重组蛋白质生产，并且是化学成分确定的并且优于先前实验中使用的经修饰的rpmi培养基。在该实验中，单一氨基酸在分批模式降低，以证实在受控的生物反应器条件下在基础培养基中的最佳化氨基酸比率对于ph、溶解氧(do)和温度的效应。
[0206]
基于基础培养基6.2中的最佳化氨基酸比率，单一氨基酸l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-脯氨酸、l-色氨酸或l-酪氨酸在其摩尔浓度中降低了40％，或l-酪氨酸和l-赖氨酸两者均降低了20％或40％。将所得到的性能针对含有最佳化aa比率的对照培养基进行比较。比较的是在对照培养基6.2(最佳化aa比率，aa作为预混合粉末加入)和对照培养基6.4.1(最佳化aa比率，aa分别从原液中添加)中培养的细胞与在培养基6.4.9-培养基6.4.15(经修饰的aa比率，aa个别地从原液中添加)中培养的细胞。所有测试的培养基组合物都具有大约44mm的可比较的总累积氨基酸浓度。
[0207]
材料与方法：
[0208]
比较的是在对照培养基6.2(最佳化aa比率，aa作为预混合粉末加入)和对照培养基6.4.1(最佳化aa比率，aa个别地从原液中添加)中培养的细胞与在培养基6.4.9(l-赖氨酸和l-酪氨酸-20％)、培养基6.4.10(l-赖氨酸和l-酪氨酸-40％)、培养基6.4.11(l-酪氨酸-40％)、培养基6.4.12(l-赖氨酸-40％)、培养基6.4.13(l-甲硫氨酸-40％)、培养基6.4.14(l-色氨酸-40％)、培养基6.4.15(l-脯氨酸-40％)中培养的细胞。所有测试的培养基组合物都具有44-45mm的可比较的总累积氨基酸浓度。所有必需的氨基酸都通过浓缩原液提供，并且加入培养基6.4.0(与培养基6.2和6.4.1相同，但不含氨基酸)中，以制备不同的培养基组合物6.4.1和6.4.9-15。
[0209]
实验在起始体积为14ml的48-小型化生物反应器系统中执行。在所有细胞培养中，cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在分别的培养基中。生物反应器对于整个培养期在36.5℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止基于(7.20-6.80) /-0.2的ph设定点的毒性浓度。对照培养和实验运行一式两份(n＝2)执行。
[0210]
表2：基础培养基的组成(不含aa的6.2、6.3和6.4.0)
[0211]
[0212][0213]
*包括牛磺酸和l-羟基-脯氨酸
[0214]
**胰岛素可以由最终浓度为50μl/l的胰岛素样生长因子(igf)取代
[0215]
表2a：基础培养基6.2(最佳aa，aa预混合粉末)、6.3(非最佳化aa)、6.4.0.1(最佳aa，对照，aa分开添加)的氨基酸比率
[0216]
氨基酸(aa)培养基6.2培养基6.3培养基6.4.0.1总aa44mm45mm44mml-丙氨酸
‑‑‑
l-精氨酸2.132.52.1l-天冬酰胺1.820.91.8l-天冬氨酸1.310.41.3l-半胱氨酸1.571.91.6l-谷氨酸0.890.40.9l-谷氨酰胺46.4046.446.40l-甘氨酸24.7024.724.7l-组氨酸0.910.30.9l-异亮氨酸1.001.01.0l-亮氨酸1.661.01.7l-赖氨酸2.240.62.2l-甲硫氨酸0.510.30.5l-苯丙氨酸0.720.30.7l-脯氨酸2.270.52.3l-丝氨酸2.080.82.1l-苏氨酸1.460.41.5l-色氨酸0.370.10.4l-酪氨酸2.090.32.1l-缬氨酸1.490.51.5
[0217]
结果：
[0218]
在对照培养(最佳化aa比率，培养基6.4.0.1)中，在第8天时测量到317mg/l的最大产物浓度。在所有测试培养物中，与对照培养物相比，最大产物浓度降低，在第8天时范围为249至279mg/l。具体地，降低培养基中的l-赖氨酸或l-酪氨酸导致在第8天时分别为268mg/l和279mg/l的产物浓度。有趣的是，将l-赖氨酸和l-酪氨酸两者均降低40％导致249mg/l的甚至更低的产物浓度，指示附加效应或甚至协同效应(图3c，实心十字形)。降低培养基中的
l-甲硫氨酸、l-脯氨酸或l-色氨酸同样导致在第8天时降低的产物浓度(分别为265mg/l、274mg/l、277mg/l)。总之，结果显示具有最佳化氨基酸比率的培养基导致在测试培养基中的最佳生产率。
[0219]
生长曲线显示对于测试培养基和对照培养基可比较的结果(图3a和3b)。与对照培养物(实心正方形)相比，最大活细胞浓度在一些培养物中早几天，且甚至略微更高。例如，所有培养物的活细胞浓度范围为在第4天时3.7 106细胞/ml的峰值细胞密度到在第6天时2.8 106细胞/ml的更低细胞密度(对照)。所有培养物的存活率曲线显示类似的趋势，在培养第6天时具有显著降低。然而，接近培养期结束时，存活率在一些测试培养物中甚至略微更高。总之，对照培养物中的更高生产率可以通过更高的细胞比生产率加以解释。每天常规监测代谢产物和ph曲线，但未显示在培养物之间的任何差异。
[0220]
实施例4
[0221]
进一步发现，基础培养基和补料培养基两者中的新型氨基酸比率的组合显示最佳性能。最佳化氨基酸比率不仅在基础培养基(以分批模式)中，而且在补料培养基(补料分批模式)中具有效应。将细胞在具有最佳化aa比率或rpmi aa比率的基础培养基中进行培养，并且用具有最佳化aa比率或rpmi aa比率的补料培养基进行补料。
[0222]
实施例4a
[0223]
通过在具有最佳化氨基酸比率(最佳化aa比率，培养基6.2和补料6.2)或非最佳化氨基酸比率(rpmi aa比率，培养基6.3和补料6.3)的培养基中培养cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞来分析基础培养基和补料培养基的影响，对于所有培养以补料分批模式以所有四种组合以基于培养物起始体积30ml/l/d的标准补料速率。含有最佳化aa比率的基础和补料培养基6.2进一步最佳化用于无血清重组蛋白质生产，并且是化学成分确定的并且优于所使用的经修饰的rpmi培养基。在另一个实验中(在2-l生物反应器系统中，实施例4c)，增加补料溶液(补料培养基6.2.1和补料培养基6.3.1)中的最终葡萄糖浓度，以最小化通过添加原液的葡萄糖添加次数和操作者工作量(表3)。
[0224]
材料与方法：
[0225]
基础培养基6.2和培养基6.3相同地设计为包含约44mm总氨基酸，但不同的氨基酸比率(表2和2a)。同样地，补料培养基6.2和补料培养基6.3相同地设计为包含约508-511mm总氨基酸，但不同的氨基酸比率(表3和6)。为了避免增加的渗透压，将补料培养基6.2和6.3中的葡萄糖浓度降低至42g/l的最终浓度。在实验过程期间，根据需要进一步添加葡萄糖以维持葡萄糖》1g/l。
[0226]
实验在起始体积为14ml的48-小型化生物反应器系统中执行。在所有培养中，cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml如下种植在测试培养基或对照培养基中：基础培养基6.2和补料培养基6.2(最佳化aa比率，aa作为预混合粉末添加)、培养基6.3和补料培养基6.3(rpmi aa比率，aa作为预混合粉末添加)。生物反应器对于整个培养期在36.5℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止基于(7.20-6.80) /-0.2的ph设定点的毒性浓度。
[0227]
表3：补料培养基6.2和6.2.1(具有最佳aa)以及培养基6.3和6.3.1(不具有最佳aa)的组成
[0228][0229][0230]
*补料培养基6.2和6.2.1以及补料培养基6.3和6.3.1之间的差异是总葡萄糖含量。
[0231]
**不含aa的补料培养基6粉末含有6.6g葡萄糖。
[0232]
***胰岛素可以用最终浓度为250μg/l的igf取代
[0233]
结果：
[0234]
以补料分批(n＝2)在受控微生物反应器系统中，基础培养基和补料培养基中的最佳化氨基酸比率对于igg1抗体(利妥昔单抗)生产的作用显示于图4c中。在基础和补料培养基两者中，用最佳化氨基酸比率实现了在第10天时2786mg/l(在第12天时2677mg/l)的最大产物浓度。使用具有rpmi aa比率的基础培养基，但具有最佳化aa比率的补料培养基，导致在第12天时显著更低的2126mg/l的最大产物浓度。生产率在使用具有最佳化aa比率的基础培养基和具有rpmi aa比率的补料培养基的培养物中甚至进一步降低，导致在第12天时1662mg/l的最终滴度。最低产物浓度在基础和补料培养基两者中具有非最佳化氨基酸比率时实现，在第12天时具有1577mg/l的产物浓度。
[0235]
使用具有非最佳化aa比率的基础培养基，随后为具有最佳化aa比率的补料培养基略微延迟活细胞浓度，但达到几乎可比较的最大活细胞浓度。与使用具有最佳化aa比率的基础培养基的相应细胞培养物相比，细胞比生产率也略微降低(132.91mg/106细胞相对于161.3mg/106细胞)。同样地，生产率略微延迟，特别是在早期(第4-8天)时，并且在一段时间内保持较低。这显示最佳化aa比率对于基础培养基和补料培养基两者中的细胞生产率均为有益的。
[0236]
这伴随着在使用最佳化aa比率的培养基中，优选在基础和补料培养基两者中，培养物的活细胞浓度和存活率的增加。在基础培养基和补料培养基中，在具有最佳化氨基酸比率的培养基中培养的细胞的最大活细胞浓度在第8天时发现为16.6x106细胞/ml。在具有
rpmi aa比率的基础培养基和具有最佳化aa比率的进料培养基中培养细胞，导致几乎相同的16.0x106细胞/ml的最大活细胞浓度(第10天)，然而，迟约两天。因此，基础培养基中的非最佳化aa比率看起来延迟了活细胞增殖。在具有rpmi aa比率的补料培养基中培养细胞将最大活细胞浓度严重降低到在第8天时的13.3x106细胞/ml(具有最佳化aa比率的基础培养基)或11.5x106细胞/ml(具有rpmi aa比率的基础培养基)因此，补料培养基中的最佳化aa比率看起来支持更高的活细胞浓度。
[0237]
对于存活率也观察到类似的趋势(图4b)，在补料培养基中不具有最佳化aa比率的培养物中具有存活率的更早期和更严重的降低。未观察到对于任何其他测量参数的显著影响。
[0238]
总之，不具有最佳化aa比率的基础培养基的效应看起来导致降低的细胞比生产率，这不能通过使用最佳化的补料培养基来完全补偿。另一方面，不具有最佳化aa比率的补料培养基的使用导致降低的活细胞数目(图4a)和存活率(图4b)。因此，具有最佳化aa比率的补料培养基改善了存活率和活细胞浓度，并且从而增加了生产率，但也显示出对细胞比生产率的作用(161.2mg/106细胞相对于124.9mg/106细胞)。与此相反，生长、存活率和最终滴度的结果也揭示，在基础培养基和补料培养基中，最大生长和最大产物浓度明显受到最佳化aa比率的影响。
[0239]
实施例4b
[0240]
还使用最佳化氨基酸比率(最佳化aa比率，基础培养基6.2和补料6.2)或非最佳化氨基酸比率(rpmi aa比率，培养基6.3和补料6.3)来分析基础培养基和补料培养基的影响，在不受控制的摇瓶系统(ph和溶解氧不受控制)中以补料分批模式以所有四种组合以降低的补料速率。将标准补料分批补料速率从30ml/l/d(对照)调整到20ml/l/d和8ml/l/d，以避免过量补料并且因此掩蔽效应。
[0241]
材料与方法：
[0242]
cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在基础和补料培养基6.2(最佳化aa比率)或基础和补料培养基6.3(rpmi aa比)中。补料培养基6.2和补料培养基6.3含有42g/l的代谢调整的葡萄糖浓度，以确保摇瓶实验和2l生物反应器的可比较的代谢曲线(例如葡萄糖)。根据抽样间隔如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。实验和对照一式两份(n＝2)执行。
[0243]
在该实验中，具有60ml起始体积的500ml摇瓶用于在具有或不具有最佳化aa比率的基础和补料培养基中培养细胞。将摇瓶培养物在36.5℃下在培养箱(第0天至第2天为8％co2，并且从第2天为5％co2，并且从第3天为3％co2，直到培养结束)温育。补料速率对于第1天至第5天设定为20ml/l/d，并且对于第5天至第11天设定为8ml/l/d。将补料溶液每2天加入培养物中，目的是防止葡萄糖过量补料并且使由增加的葡萄糖水平引起的渗透压最小化。补料速率如下计算，例如30ml/l/d*0.06l＝1.8ml补料/天＝3.6ml补料/2天，代谢调整的补料速率20ml/l/d＝1.2ml/d＝2.4ml补料/2天。谷氨酰胺在培养期间维持》0.1g/l，主要由起始时基础培养基中增加的l-谷氨酰胺浓度而不是补料培养基补充。
[0244]
结果：
[0245]
在不受控制的摇瓶系统中以补料分批模式以降低的补料速率(n＝2)，培养基和补料中的最佳化氨基酸比率对于igg1抗体(利妥昔单抗)生产的作用。
[0246]
如果比较在基础培养基6.3中具有非最佳化氨基酸比率和在补料培养基6.2中具有最佳化氨基酸比率的培养物中897mg/l(实心菱形)与在基础培养基6.2中具有最佳化氨基酸比率和在补料培养基6.2中具有最佳化氨基酸比率的培养物中1049mg/l(实心正方形)的最大产物浓度，两者均以降低的补料速率，则可以看出基础培养基的效应(图4f)。在基础培养基中具有非最佳化氨基酸比率因此导致延迟和降低的产物形成。在基础培养基6.2中具有最佳化氨基酸比率和在补料培养基6.3中具有非最佳化氨基酸比率的培养物中641mg/l(实心圆圈)的最大产物浓度高于在基础培养基和补料培养基中具有非最佳化氨基酸比率的培养物中468mg/l(实心三角形)的最大产物浓度(图4f)。该结果清楚地证实在基础培养基中最佳化的氨基酸对最大产物滴度的积极影响。
[0247]
此外，在基础培养基和补料培养基中具有最佳化氨基酸比率的培养物中达到1049mg/l的最大产物浓度，当使用以降低的补料速率具有未最佳化aa比率的补料培养基时，所述最大产物浓度降低至641mg/l(图4f)。对于在不具有最佳化aa比率的基础培养基和具有最佳化aa比率的补料培养基(897mg/l)或不具有最佳化aa比率的补料培养基(468mg/l)中培养的细胞，发现产物生产的类似趋势。这意指存在补料培养基中最佳化的氨基酸对最大产物性能有的强积极影响，然而，当在基础和补料培养基两者中均使用最佳化aa比率时，获得最佳结果。
[0248]
存活率曲线遵循类似的趋势，其中所有培养物在第5天时从96％急剧下降(图4e)。在第5-6天时，最大活细胞浓度范围为3.8
–
9.6 106细胞/ml(图4d)。一般而言，具有最佳化aa比率的补料培养基增加了活细胞浓度(图4d)。该结果与改善的存活率(图4e)一致。
[0249]
此外，基础培养基中的最佳化氨基酸比率对细胞增殖具有积极作用。这可以从在第5天时具有(7.27x106细胞/ml，实心圆圈)或不具有(3.8x106细胞/ml，实心三角形)最佳化氨基酸比率的基础培养基和不具有最佳化氨基酸比率的补料培养基中培养的细胞的活细胞浓度的比较获得。该结果举例说明了最佳化的基础培养基对最大生长性能的积极作用。
[0250]
当使用具有最佳化aa比率的补料培养基时，对于不具有最佳化aa比率(9.6x106细胞/m，实心菱形)和具有最佳化aa比率(7.9x106细胞/ml，实心正方形)的基础培养基，最大活细胞浓度是可比较的。如果比较在具有最佳化氨基酸比率的基础培养基和具有最佳化氨基酸比率的补料培养基(7.9x106细胞/ml，实心正方形)或不具有最佳化氨基酸比率的补料培养基(7.2x106细胞/ml，实心圆圈)中培养的细胞的最大生长，则可以描述补料效应。同样地，当使用不具有最佳化aa比率的基础培养基时，对于在具有最佳化aa比率的补料培养基中培养的细胞，最大活细胞浓度为9.6x106细胞/ml，并且对于在不具有最佳化aa比率的补料培养基中培养的细胞，这降低至3.9x106细胞/ml(图4d)。
[0251]
一般而言，存在与活细胞生长良好一致的两个主要方面。首先，对于在补料中具有最佳化氨基酸比率的培养物(在基础培养基中具有或不具有最佳化氨基酸比率)，在第9天时，达到37-40％的最高剩余存活率。其次，对于在补料培养基中具有最佳化的氨基酸的培养物，从第5天起的存活率转变了大约一天。这些结果清楚地显示用最佳化的基础培养基和补料培养基可以获得更高的存活率和存活率曲线的延长。
[0252]
实施例4c
[0253]
具有和不具有最佳化氨基酸比率的基础培养基和补料培养基的影响在扩大的完全受控的2-l生物反应器系统中以标准补料分批形式进一步测试。
[0254]
2l生物反应器系统是用于商业制造的大规模生物反应器(高达12,000l规模及以上)的代表性模型。应用30ml/l/d的标准补料分批补料速率，并且补料溶液从第2天开始到第14天以连续模式补料。基于我们的经验，将其他工艺参数设定为我们的平台条件用于成功扩大，即氧转移、剪切力、co2去除、ph范围、搅动和功率输入/体积。培养基组合一式两份(n＝2)进行测试。
[0255]
材料与方法：
[0256]
实验在具有1.8l起始体积的完全受控的2l生物反应器系统中执行。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在所有培养物中以0.3x106细胞/ml种植，使用基础培养基6.2(最佳化aa比率)或基础培养基6.3(rpmi aa比率)和补料培养基6.2.1(最佳化aa比率和65g/l的适应葡萄糖浓度)或补料培养基6.3.1(rpmi aa比率和65g/l的适应葡萄糖浓度)。生物反应器对于整个培养在36.5℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止基于(在第0-3天时的6.95和在第3天
–
第14天时的6.80) /-0.20的ph设定点的毒性浓度。
[0257]
将补料溶液中的葡萄糖浓度最佳化至65g/l的最终浓度，以便使由葡萄糖过量补料引起的渗透压最小化，而且如果需要，降低来自原液的葡萄糖添加次数。补料培养基6.2和补料培养基6.2.1的设计是相同的，除了最终的葡萄糖浓度之外。同样地，补料培养基6.3和补料培养基6.3.1是相同的，除了最终的葡萄糖浓度之外。
[0258]
根据抽样间隔如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。补料培养基含有葡萄糖，但不含l-谷氨酰胺，因此根据需要从原液中添加谷氨酰胺，以使谷氨酰胺浓度保持在0.1-0.4g/l的范围内。对于整个培养，葡萄糖水平维持在》2g/l。实验一式两份(n＝2)执行。
[0259]
结果：
[0260]
一般而言，就最大滴度和活生长而言，2l系统的结果与来自以前的摇瓶实验的发现良好一致。例如，在基础培养基和补料培养基中使用最佳化氨基酸比率达到2213mg/l(实心正方形)的最大产物浓度(图4i)。在补料培养基中不具有最佳化氨基酸比率培养细胞将最大产物浓度降低至1654mg/l(实心圆圈)，如图4i所示。在不具有最佳化氨基酸比率的基础培养基中培养细胞强烈延迟产物形成。由于最佳化的补料培养基的积极效应，获得了2213mg/l(基础和补料培养基中的最佳化氨基酸比率)相对于2144mg/l(仅在补料培养基中的最佳化氨基酸比率)的相似最大产物浓度。然而，由于非最佳化的基础培养基的影响，产物形成动力学明确不同。因此，为了最佳产物浓度，最佳化氨基酸比率需要存在于基础和补料培养基两者中。
[0261]
这些观察与活细胞浓度良好一致。与在基础培养基或补料培养基中具有非最佳化氨基酸比率8.7x106细胞/ml的最大细胞峰相比，在基础培养基和补料培养基中具有最佳化氨基酸比率达到12.7x106细胞/ml的最大活细胞峰(图4g)。12.7x106细胞/ml的最大活生长峰是由于对于补料分批培养物，在基础培养基和补料培养基中的最佳化氨基酸比率对活细胞浓度的组合作用。此外，如果对于在基础培养基中不具有最佳化aa和在补料培养基中具有最佳化aa的培养物，相对于在基础培养基中具有最佳化aa和在补料培养基中不具有最佳化aa的培养物，比较来自第4-9天的指数生长期，则可以看出基础培养基的效应和补料的效应。图4g显示与未最佳化的基础培养基相比，关于最佳化的基础培养基的生长动力学更陡峭，尽管两种培养物都达到了大约8.6x106细胞/ml的相似的最大细胞峰。相比之下，使用非
最佳化的基础培养基，但最佳化的补料培养基的较慢生长动力学导致从第10天到第14天的活细胞延长。
[0262]
存活率曲线遵循如上所述的类似趋势。经过延长运行时间的最大存活率可以归于补料效应(比较在第14天时79％相对于49-54％的存活率)(图4h)。在基础培养基和补料培养基中具有最佳化aa比率、或者在基础培养基中具有最佳化aa比率和在补料培养基中不具有最佳化aa比率的细胞的存活率曲线遵循类似的趋势。其他测量参数如代谢产物和ph未显示任何显著差异。
[0263]
实施例4d
[0264]
进一步研究了基础培养基和补料培养基中的最佳化aa比率(rpmi基础培养基3.9和rpmi补料培养基3中的最佳化aa比率或rpmi基础培养基3.1和rpmi补料培养基2中的非最佳化氨基酸比率rpmi aa比率)的影响，对于使用cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞的所有四种组合以补料分批模式在rpmi环境中。rpmi是具有已知组成的商业培养基。
[0265]
rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基中的总氨基酸浓度随着将氨基酸比率调整至本发明的最佳化氨基酸比率而增加。为了排除所观察到的效应仅是由于增加的总体氨基酸浓度，在分开的实验中，rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基用不同的氨基酸比率(废培养基最佳化氨基酸比率)进行调整。
[0266]
材料与方法：
[0267]
该实验中使用的rpmi基础培养基基于商购可得的rpmi培养基r8755(mediatech目录号90022pb或sigma aldrich目录号r8755)，其由moore及其同事最初在roswell park memorial institute开发(safc，biosciences产品信息)。对于无血清使用，它已如表4所示进行补充。
[0268]
该实验在起始体积为100ml的250ml摇瓶中执行。所有培养物以0.3x106细胞/ml种植在摇瓶中的特定培养基组合物中：对照rpmi培养基3.1(不具有最佳化aa比率，总aa 10.0mm)、rpmi培养基3.9(具有最佳化氨基酸比率，总aa
–
15.2mm)、rpmi补料培养基-2(不具有最佳化氨基酸比率，总aa 124mm)、rpmi补料培养基-3(具有最佳化氨基酸比率，总aa 548mm)、rpmi培养基3.5(rpmi培养基3.1 aa，废培养基最佳化，总aa 12mm)、rpmi补料培养基3.5(rpmi补料-2 aa，废培养基最佳化，总aa 140mm)。添加用于基础培养基的废培养基最佳化的7种氨基酸为l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、以及l-酪氨酸x 2na x 2h2o和l-缬氨酸，各自以30mg/l添加，并且添加用于补料培养基的废培养基最佳化的氨基酸为l-半胱氨酸、l-甲硫氨酸、l-脯氨酸、l-苏氨酸、l-酪氨酸x 2na x 2h2o和l-缬氨酸，各自以360mg/l添加。基础培养基3.1、3.5和3.9用植物水解产物强化，以支持在培养开始时的初始生长。为此，在补料溶液中未提供水解产物。如由上文实验可以看出的(参见培养基4和培养基5)，也可以使用不含hypep的基础的基于rpmi的培养基。
[0269]
将摇瓶在36.5℃下在培养箱中(从第0天到第3天提供5％co2大气，随后为3％co2，直到培养结束)温育。每隔一天加入补料溶液，从第2-4天以30ml/l/d的补料速率，并且从第5-8天以3ml/l/d的降低补料速率。根据需要补料葡萄糖，以在培养期间将实际葡萄糖浓度维持在2-4g/l之间。每隔一天测量总细胞、活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压，直到培养结束，以监测和控制实验进展。实验一式两份(n＝2)执行。
[0270]
表4：rpmi基础培养基3.1(非最佳化aa)、3.9(最佳化aa)、3.5(废培养基分析)的组
成
[0271][0272]
表4a：基础培养基rpmi 1640(原始)，基础培养基3.1、3.9、3.5(废培养基分析)和培养基6.2的氨基酸比率
[0273]
氨基酸rpmi 1640培养基3.1培养基3.9培养基3.5培养基6.2总aa浓度6.3mm10.0mm15.2mm12mm44mml-丙氨酸
‑‑‑‑‑
l-精氨酸2.52.52.52.52.1l-天冬酰胺1.01.01.81.01.8l-天冬氨酸0.40.41.30.41.3l-半胱氨酸1.01.02.21.01.6l-谷氨酸0.40.40.90.40.9l-谷氨酰胺5.415.312.615.346.4l-甘氨酸0.40.40.40.424.7l-组氨酸0.20.20.90.20.9l-异亮氨酸1.01.01.01.01.0
l-亮氨酸1.01.01.71.01.7l-赖氨酸0.60.62.30.62.2l-甲硫氨酸0.30.30.50.80.5l-苯丙氨酸0.20.20.70.70.7l-脯氨酸0.50.52.31.12.3l-丝氨酸0.80.82.10.82.1l-苏氨酸0.40.41.51.11.5l-色氨酸0.10.10.40.50.4l-酪氨酸0.30.32.10.62.1l-缬氨酸0.50.51.51.11.5
[0274]
表5：rpmi补料培养基-2(未最佳aa)、-3(最佳aa)、-3.5(废培养基分析)的组成
[0275][0276][0277]
表5a：不含主体盐的rpmi补料预混物(1x)83480cp*：
[0278]
组分[mg/l]组分[mg/l]l-精氨酸200l-赖氨酸x hcl40l-天冬酰胺x h2o56.8l-甲硫氨酸15l-天冬氨酸20烟酰胺1d-生物素0.2l-苯丙氨酸15d-泛酸钙0.25l-脯氨酸20氯化胆碱3paba(对氨基苯甲酸)1氰钴胺0.005吡哆醇x hcl1
d-葡萄糖(无水右旋糖)**2000核黄素0.2叶酸1l-丝氨酸30l-谷氨酸20磷酸钠(二碱式)800l-谷胱甘肽，还原型1硫胺x hcl1l-甘氨酸10l-苏氨酸20l-组氨酸15l-色氨酸5羟基l-脯氨酸20l-酪氨酸2na x 2h20**14.4肌醇35l-缬氨酸20l-异亮氨酸50
ꢀꢀ
l-亮氨酸50总和mg/l3464.4
[0279]
*省略的主体盐：硝酸钙x 4h2o、硫酸镁、氯化钾、氯化钠和碳酸氢钠
[0280]
**分开添加
[0281]
表6：rpmi补料-2(非最佳化)和rpmi补料-3(最佳化aa)、rpmi补料培养基3.5(废培养基分析)、补料培养基6.2和6.2.1(最佳化aa)以及补料培养基6.3和6.3.1(非最佳化aa)的氨基酸比率
[0282][0283][0284]
在废培养基分析中，商购可得的rpmi培养基被修饰并且用各种营养素补充物强化，以避免营养素限制，且确保补料分批实验中的改善生长和产物形成。为此，根据培养基3.1的培养基配方，将aa补充物加入培养基中。在第4天和第7天时，对取自细胞培养上清液的样品执行氨基酸分析，除了l-精氨酸之外。因此发现下述七种氨基酸的浓度低于15mg/l：
l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-脯氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-酪氨酸和l-色氨酸。基于该现有技术的废培养基分析，这些氨基酸另外在基础培养基(rpmi培养基3.5)中补充。具体地，氨基酸l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸在基础培养基中另外各自以30mg/l提供(表4和图4a)。在补料培养基中，氨基酸l-甲硫氨酸、l-苏氨酸、l-脯氨酸、l-胱氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸另外各自以360mg/l提供(表5和6)。实验基本上如上所述执行，使用具有或不具有最佳化氨基酸比率的rpmi基础细胞培养基以及具有和不具有最佳化氨基酸比率的rpmi补料培养基。另外，将细胞与在rpmi基础细胞培养基或rpmi补料培养基或两者中包含废培养基氨基酸比率的rpmi基础培养基和补料培养基一起温育。
[0285]
结果：
[0286]
总之，使用产生抗体利妥昔单抗的cho2(cho-dg44)细胞，研究在rpmi基础细胞培养基和/或rpmi补料培养基中的最佳化aa比率对以补料分批模式的细胞培养性能的作用。具体地，监测细胞存活率(图4l，o)、活细胞(图4k，n)、产物滴度(图4m，p)和乳酸盐浓度(数据未显示)。
[0287]
在最终产物浓度以及产物动力学(曲线斜率)中可以看出最佳化的补料培养基或基础培养基的主要作用，如图4m所示。
[0288]
例如，与在不具有最佳化氨基酸比率的rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基中培养的对照细胞(162mg/l)相比，在两者均包含最佳化氨基酸比率的rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基中培养的细胞的产物滴度较高(259mg/l)，如图4m所示。在基础培养基中具有最佳化aa比率但在补料培养基中具有未最佳化aa比率的培养物中，最大产物滴度降低至171mg/ml。有趣的是，补料培养基中的最佳化氨基酸比率的效应直到第4天是相似的(167mg/l相对于161mg/l)，并且仅在随后的培养天中不同。此外，在非最佳化的基础培养基的情况下，产物形成和曲线动力学(曲线斜率)是延迟的，并且导致在第8天时大约152-162mg/l的最大产物浓度(在基础培养基中不具有最佳化aa比率和在补料培养基中具有或不具有最佳化的aa)。
[0289]
使用rpmi培养基系统(rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基)，可以观察到对于活细胞浓度和存活率的类似的积极效应。当最佳化氨基酸比率用于rpmi基础细胞培养基和rpmi补料培养基两者中时，获得具有大约3.5x106细胞/ml的最大活细胞浓度的最高活细胞浓度(图4k)和最高细胞存活率(图4l)。如果最佳化氨基酸比率仅在基础细胞培养基中应用，则从第6天起观察到活细胞浓度(图4k)和存活率(图4l)中的急剧下降。最大活细胞浓度对于在不具有最佳化aa比率的基础细胞培养基和具有最佳化aa比率的补料培养基中培养的细胞(2.2x106细胞/ml)较低(图4k和n)，并且对于在两者均不具有最佳化氨基酸比率的基础细胞培养基和补料培养基中培养的细胞甚至更低(最大活生长高达1.70 106细胞/ml，第4天)。总之，该实施例证实最佳化氨基酸比率对基于rpmi的培养基中的细胞培养性能的优越性，即产物滴度、活细胞浓度和细胞存活率。
[0290]
根据废培养基分析，在包括相同培养基和补充有aa的培养基的另一个实验中获得类似的结果。
[0291]
如上所述，与未经修饰的rpmi培养基系统相比，调整rpmi基础细胞培养基中的最佳化氨基酸比率显著改善了产物滴度。与在rpmi中不具有最佳化氨基酸比率的任何实现的
对照相比，在基础和补料培养基两者中包含最佳化氨基酸比率的细胞培养物中的产物滴度更高(0.406g/l相对于0.173g/l的滴度)。因此，通过根据基础培养基和补料培养基两者中的最佳化氨基酸比率调整氨基酸比率，在商业培养基系统如rpmi中，产物滴度增加约2.3倍。与在基础和补料培养基中不具有最佳化氨基酸比率的任何实现的对照相比，包含最佳化氨基酸比率的rpmi基础细胞培养基和不具有氨基酸调整的rpmi补料培养基中的产物滴度更高(0.267g/l相对于0.173g/l的滴度)。仅在rpmi补料培养基中具有最佳化氨基酸比率的培养物中的产物滴度与在基础培养基或补料培养基中不具有任何新型氨基酸比率实现的对照几乎可比较(0.159g/l相对于0.173g/l的滴度)。再次，该结果证实最佳化氨基酸比率应从培养实验开始即在基础和补料培养基两者中应用。在这种设置下，仅在补料培养基中应用最佳化氨基酸比率不足以达到最大产物滴度。
[0292]
在基础培养基和补料培养基两者中具有废培养基氨基酸比率的rpmi中的产物滴度与不具有任何氨基酸比率调整的对照(0.173g/l，实心菱形)相比更高(0.302g/l，空心正方形)，但与在rpmi培养基和rpmi补料培养基中的最佳化氨基酸比率(0.406g/l，实心正方形)相比更低。此外，在rpmi基础培养基中而不是在rpc补料培养基中具有废培养基氨基酸调整的产物滴度(0.193g/l，空心圆圈)与在基础或补料培养基中不具有最佳化氨基酸比率的对照(0.173g/l，实心菱形)相比更高，但与仅在rpmi基础培养基中的最佳化氨基酸比率(滴度0.267g/l，实心圆圈)相比明显更低(图4p)。
[0293]
因此，与在基础细胞培养基和补料培养基中的最佳化氨基酸比率(406mg/l的最大滴度)对总体细胞培养性能的影响相比，在基础细胞培养基和补料培养基中的废培养基氨基酸比率调整的效应降低(302mg/l的最大滴度)。对于仅在基础培养基中而不在补料培养基中的废培养基氨基酸比率调整，获得仅193mg/l的最大滴度。
[0294]
根据滴度，对于所有培养物实现的活细胞浓度遵循类似的趋势，在第4天时具有最大细胞峰。大多数培养物具有大约3.5x106细胞/ml的最大活细胞浓度，除了在基础培养基中没有任何补充的培养物之外(1.7-2x106细胞/ml)。在基础培养基和补料培养基两者中的最佳化氨基酸比率的细胞实现在一段时间内具有最高活细胞数目的活生长。该结果证实最佳化的基础培养基和最佳化补料的组合效应，如图4n和p所示。
[0295]
存活率曲线(图4o)遵循类似的趋势，对于大多数培养物在第4天时具有断裂，除了在基础培养基和补料培养基中具有最佳化aa比率的培养物之外。这一发现与如图4n所示的活生长模式良好一致。未观察到培养基对其他参数如代谢产物和ph的显著影响。
[0296]
实施例5
[0297]
发现某些氨基酸对就最大产物浓度、活细胞浓度和存活率而言的细胞代谢具有影响。在补料分批模式下，用无血清、化学成分确定的培养基，进一步组合分析改变这些氨基酸的影响。在两个aa组内研究了氨基酸的变化：所述两个aa组为a)l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸(5种aa)和b)l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-酪氨酸、l-赖氨酸(7种aa)。然后基于来自对照(基础培养基6.4.0.1和补料培养基6.4)的最佳化氨基酸比率，氨基酸在基础培养基和补料培养基中以正或负交替模式改变 /-20％和 /-40％。交替模式意指在基础培养基和补料培养基中以相同的方向，第一aa增加，第二aa减少，第三aa增加20％或40％等(在摩尔基础上计算的)。通过使用小写字母(降低-20％或-40％，例如his、tyr)和大写字母(增加 20％或 40％，例如his、tyr)来描述
交替模式。为了引起就最大生长和产物形成而言的强细胞反应，在一些实验中降低营养素补料速率。
[0298]
材料与方法：
[0299]
cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以标准补料速率和降低的补料速率在培养基6.4.0.1和补料培养基6.4(具有最佳化氨基酸比率)中以补料分批进行培养。将实验分成3种方法，组合测试aa变化：a)基础培养基和补料培养基中的5种aa /-40％的变化，b)基础培养基和补料培养基中的7种aa /-40％的变化，和c)在降低的补料速率下，基础培养基和补料培养基中的7种aa /-20％或 /-40％的变化。
[0300]
对于5aa设置，与在基础和补料培养基中具有最佳化氨基酸比率的对照相比，氨基酸l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸以正或负交替模式(大写或非大写aa字母)改变 /-40％。使用的培养基为：基础培养基6.4.3(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile改变 /-40％，正)、基础培养基6.4.4(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile改变 /-40％，负)、补料培养基6.4.3(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile改变 /-40％，正)、补料培养基6.4.4(5种氨基酸phe、val、leu、thr、ile改变 /-40％，负)。
[0301]
对于7aa设置，使用下述培养基：基础培养基6.4.5(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-20％，正)、基础培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-40％，正)、基础培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-40％，负)、补料培养基6.4.5(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-20％，正)、补料培养基6.4.7(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-40％，正)、补料培养基6.4.8(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-40％，负)。应该补充由于溶解性原因，在补料培养基6.4.8的交替模式中l-酪氨酸并未增加，这仅与7aa变化 40％而不是20％aa变化相关。除了缺乏增加的tyr浓度的补料培养基6.4.8之外，补料培养基中使用的氨基酸变化与所有培养物中的基础培养基相同。
[0302]
实验在起始体积为14ml的小型化生物反应器系统中执行。在所有细胞培养中，cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在基础培养基中用于补料分批培养。生物反应器对于整个培养在36.5℃下温育，并且将溶解的pco2控制在2-15％之间，以防止基于(7.20-6.80) /-0.2的ph设定点的毒性浓度。30ml/l/d的标准补料速率应用于具有5aa变化 /-40％(图5a-c)和7aa变化 /-40％(图5d-f)的培养物。在第1-5天时20ml/l/d和在第6-11天时8ml/l/d的降低补料速率应用于具有7aa变化 /-20％和 /-40％的培养物(图g-i)。将补料溶液连续加入培养物中，并且注意防止葡萄糖过量补料，并且使由增加的葡萄糖添加引起的渗透压最小化。例如，补料培养基6.4.3、补料培养基6.4.4、补料培养基6.4.7或补料培养基6.4.8含有42g/l的降低葡萄糖浓度。所有补料培养基均含有葡萄糖，但不含l-谷氨酰胺，因此根据需要从原液中添加谷氨酰胺，以使谷氨酰胺浓度保持在0.1-0.4g/l的范围内。葡萄糖也根据需要添加，以使葡萄糖水平对于整个培养保持》2g/l。根据抽样间隔如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。实验和对照一式两份(n＝2)执行。
[0303]
结果：
[0304]
在具有其他方面最佳化aa比率的培养基中，5种aa或7种aa(在标准补料速率下的 /-40％)的组合变化，且尤其是在降低的补料速率下7种aa的组合变化(在降低的补料速率
下7种aa /-20％和 /-40％)，降低细胞培养中的生产率和活生长。
[0305]
5种aa的变化：在对照培养(基础和补料培养基中的最佳化aa比率)中，在第10天时达到1909mg/l的最高最大产物浓度(图5c)。对于5种aa的变化，通过在两个方向上交替改变5种aa，最大产物浓度分别降低为1523mg/l(phe、val、leu、thr、ile /-40％，交替模式)和1799mg/l(phe、val、leu、thr、ile /-40％，交替模式)。有趣的是，产物形成显示出不同的动力学(曲线斜率)，从在第10天时的产物滴度可以看出的，1909mg/l(对照)相对于1523mg/l相对于1498mg/l(分别为phe、val、leu、thr、ile和phe、val、leu、thr、ile， /-40％，交替模式)。5种aa /-20％的组合变化显示的最大产物浓度仅略微降低(phe、val、leu、thr、ile改变 /-20％，在第10天时1806mg/l)或相当于(phe、val、leu、thr、ile改变 /-20％，在第12天时2058mg/l)对照培养物(数据未显示)。结果指示仅 /-20％的五种氨基酸的组合变化对产物形成或最大产物滴度没有显著影响。
[0306]
对于所有培养物(对照相对于培养的测试改变 /-40％)，活细胞浓度曲线遵循类似的趋势，其中最大存活峰密度在第8天时在13.8-19.4x106细胞/ml的范围内(图5a)。在基础培养基(基础培养基6.4.0.1)和补料培养基(补料培养基6.4)中具有最佳化aa比率的对照培养物中，观察到19.4x106细胞/ml的最大活细胞密度。具有改变氨基酸比率的培养物中的最大活细胞浓度相当低(phe、val、leu、thr、ile /-40％，13.8x106/ml的活细胞浓度；phe、val、leu、thr、ile /-40％，15.3x106细胞/ml的活细胞浓度)(图5a)。具有 /-20％(5种aa)的不同氨基酸的测试培养物的活生长与具有最佳化氨基酸比率的对照培养物相当(数据未显示)。
[0307]
此外，所有培养物的存活率曲线是相当可比的，显示在第8天时开始的所有培养物的存活率中的下降。有趣的是，与在第14天时对照培养物13％的存活率相比，在具有5种aa改变 /-40％(phe、val、leu、thr、ile)的氨基酸比率的培养物之一，存活率在培养期结束时(第11-14天)仍相当高，为56％(图5b)。对于具有5种aa改变 /-20％的氨基酸比率的测试培养物，所有曲线与对照都是可比较的(数据未显示)。
[0308]
7种aa的变化：对于7种氨基酸(l-苯丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-酪氨酸、l-赖氨酸) /-40％的变化，获得类似结果。例如，与在第10天时在对照培养物中测量的1909mg/l的最大产物浓度相比，在第10天时1618mg/l(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys /-40％，交替模式)或1456mg/l(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys /-40％，交替模式)的产物浓度是降低的(图5f)。这个结果与用5aa变化获得的结果良好一致。将7种aa改变 /-20％导致1861mg/l的可比较的最大产物浓度(7aa phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-20％)或具有1622mg/l的略微降低的最大产物浓度(7aa phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys改变 /-20％，负交替模式)，与在第10天时具有1909mg/l的最大产物浓度的对照培养物相比(数据未显示)。这意指7种氨基酸 /-20％的变化仅对细胞培养中的产物形成和最大产物浓度具有较小的作用。
[0309]
在第8天时，最大活细胞浓度范围为14.4-19.4x106细胞/ml(图5d)。具有7种不同氨基酸的测试培养物的活生长与使用包含改变 /-40％的5种不同氨基酸的培养基的培养物的活生长是可比较的(比较图5a和d)。同样地，7aa改变 /-40％的存活率与具有5aa改变40％的培养物是可比较的(比较图5b和5e)。再次，与培养结束时的对照相比，一种培养物(7种氨基酸phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys，改变 /-40％)显示出45％的较高存活率。
[0310]
将7种aa改变 /-20％导致包括对照培养物的所有培养物的可比较的生长曲线，其中在第8天时具有18.9
–
20.1x106细胞/ml的相似最大峰值细胞密度(数据未显示)。另外，存活率曲线对于所有培养物是可比较的，其保持相当高的95％直到培养第8天时，但随后在培养期结束时降至30％以下(数据未显示)。
[0311]
具有降低补料速率的7aa的变化：为了加强效应，使用降低的补料速率，以补料分批模式另外培养细胞。比较的是具有标准补料速率的对照培养物(培养基6.4.0.1和补料培养基6.4，标准补料)、具有降低补料速率的对照培养物(培养基6.4.0.1和补料培养基6.4，具有降低的补料速率)、以及以降低的补料速率具有改变 /-20％或 /-40％的7种氨基酸的测试培养物。以标准补料速率的对照培养物中的最大产物浓度在第10天时为1909mg/l(第12天1782mg/l，实现正方形)，并且对于具有降低补料速率的对照培养物为1611mg/l(第12天，实心圆圈)(图5i)。将7种氨基酸的浓度改变20％(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys；降低的补料速率)导致1448mg/l的最大产物浓度(第12天，实心十字形)。在具有7种aa改变 /-40％的培养物中，该滴度在第12天时进一步降低至1269mg/l(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys；降低的补料速率，实心三角形)、或999mg/l(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys；降低的补料速率，实心x)的最大产物浓度。因此，与对照培养物相比，7种关键氨基酸的aa比率的变化降低了生产率，并且当补料培养基以降低的补料速率加入时，这更为显著。
[0312]
不管补料速率如何，活细胞浓度显示出可比较的趋势(比较图5d和5g)。活细胞浓度显示出在第6和8天之间的最大细胞峰值(图5g)。例如，对照培养物显示在标准补料速率下19.4x106细胞/ml的最大活细胞浓度，并且这在降低的补料速率下略微降低至16.5x106细胞/ml。对于具有7种aa改变 /-20％(phe、val、leu、thr、ile、tyr、lys)的培养物的最大细胞浓度为大约13.5x106细胞/ml，并且对于具有7种aa改变 /-40％的培养物甚至更低，为约11x106细胞/ml。
[0313]
所有培养物的存活率曲线都遵循类似的趋势，具有在第8至10天之间开始的明确减少(图5h)。与对照培养物相比，其他参数如葡萄糖、渗透压或ph进展并未显示任何显著差异。
[0314]
实施例6
[0315]
在该补料分批实验中，对于产生不同单克隆抗体或融合蛋白作为药学相关蛋白的实例的多个cho-dg44细胞系，证实最佳化的培养基和补料培养基对细胞培养性能的影响。目的是证实最佳化的细胞培养基(在基础培养基中具有最佳化氨基酸比率和在补料培养基中具有最佳化氨基酸比率)明确促成改善的生产率用于多用途制造位点。
[0316]
材料与方法：
[0317]
该实验在起始体积为15ml的小型化生物反应器系统中执行。将表达不同治疗分子的所有cho-dg44细胞系以0.3x106细胞/ml种植在基础培养基6.2和补料培养基6.2中，两者都具有最佳化aa比率。在cho-dg44细胞中表达的治疗分子是具有含有seq id no:1的氨基酸序列的重链和含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链的利妥昔单抗，具有含有seq id no:3的氨基酸序列的重链和含有seq id no:4的氨基酸序列的轻链的mab6，具有seq id no:5的氨基酸序列的mab5和fc融合蛋白。生物反应器对于整个培养在36.5℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止从第3天起基于6.95( /-0.15)和6.80 /-0.15的ph设定点的毒性浓度。对于这种补料分批应用，应用了用于成功扩大的平台方法，其包括
30ml/l/d的标准补料速率。这意指对于从第1天直到培养结束的整个培养，每天加入营养素补料溶液。根据需要从原液中添加谷氨酰胺，以使谷氨酰胺浓度保持在0.1-0.4g/l的范围内。葡萄糖也根据需要添加，以使葡萄糖水平对于整个培养保持》0.6g/l。如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。实验和对照一式两份(n＝2)执行。
[0318]
结果：
[0319]
表达不同治疗性蛋白质的几种cho-dg44细胞系的产物浓度对于所有蛋白质都很高，但略微不同。最大产物浓度不同，对于mab6生产细胞在第11天时为8213mg/l(图6c)，对于mab5生产细胞在第11天时为4655mg/l(图6c)，对于fc融合蛋白和利妥昔单抗生产细胞在第11天时为1778-2061mg/l(图6d)。范围为1.7g/l直到》8.2g/l的这种滴度变化伴随着可变的活细胞浓度和存活率。这些结果证实表达各种不同重组蛋白的不同cho-dg44细胞能够以补料分批模式在最佳化的培养基中生长和增殖(图6a-d)。
[0320]
实施例7
[0321]
在使用培养基6.2a的摇瓶实验中，研究了不同浓度的胆酸亚铁对细胞培养性能，特别是细胞生长和产物形成的作用。发现(i)胆酸亚铁增加了产物滴度，并且(ii)新型化合物胆酸亚铁与常用的铁载体例如焦磷酸铁、磷酸铁和柠檬酸铁相比是优越的。
[0322]
材料与方法：
[0323]
实验在起始体积为100ml的250ml摇瓶中进行。将所有培养物以0.3x106细胞/ml(产生利妥昔单抗的cho2(cho-dg44)细胞)种植在基础培养基和不含胆酸亚铁的补料培养基6.2a中，所述基础培养基含有以三种不同浓度(0.2g/l、1g/l或2g/l)的)的胆酸亚铁、或焦磷酸铁(0.5g/l、0.8g/l或1.3g/l)、或以约等摩尔量的磷酸铁(0.3g/l、0.5g/l、0.7g/l)。焦磷酸铁和磷酸铁的浓度范围选择在与胆酸亚铁相同的范围内(在摩尔基础上)。例如，以1.0g/l(2.81g/l的滴度)的胆酸亚铁与以0.3g/l(2.29g/l的滴度)的磷酸铁约等摩尔，并且与以约1.3g/l(2.26g/l的滴度)的焦磷酸铁约等摩尔。
[0324]
基础培养基6.2a是与基础培养基6.2几乎相同的前体培养基，除了另外包含一些非必需辅因子和核苷酸并且不含琥珀酸，含有以仅4.8mg/l的腐胺和40mm代替44mm的总氨基酸浓度之外。此外，谷氨酰胺以较低的量添加，导致相对于异亮氨酸37.42的比率。
[0325]
在平行实验中，cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞在具有以不同浓度(0g/l、0.2g/l、0.4g/l或2g/l)的胆酸亚铁的基础培养基6.2a和含有以0.56g/l的胆酸亚铁的补料培养基6.2，或具有以0.1g/l的柠檬酸铁的基础培养基和含有以0.25g/l的柠檬酸铁的补料培养基6.2a中进行培养。柠檬酸铁(0.1g/l和0.25g/l)的浓度选择为与在基础培养基中以0.2g/l和在补料培养基中以0.56g/l的胆酸亚铁约等摩尔。
[0326]
补料培养基6.2a是与补料培养基6.2几乎相同的前体培养基，除了另外包含一些非必需辅因子和核苷酸和略微更高的碳酸氢钠，并且含有以仅33.02mg/l的腐胺和511mm代替508mm的总氨基酸浓度之外。此外，丙氨酸另外存在于培养基中，具有相对于异亮氨酸0.15的比率。
[0327]
在250ml烧瓶中具有60ml的起始体积的摇瓶在37℃下在培养箱中(从第0天到第3天提供10％co2大气，随后为3％co2一天和0％co2，直到结束培养)温育。在第二天开始，每天以30ml/l/d的补料速率加入补料溶液。根据需要补料葡萄糖，以在培养期间将实际葡萄
糖浓度维持在2-4g/l之间。每隔一天测量总细胞、活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压，直到培养结束，以监测和控制实验进展。实验一式两份(n＝2)执行。
[0328]
结果：
[0329]
使用以1.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度显著高于以0.2g/l胆酸亚铁的对照(2.81g/l相对于对照中2.07g/l的滴度)，并且甚至略微高于使用以2.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度(2.67g/l的滴度)(图7b)。此外，与以约等摩尔量的焦磷酸铁(2.24g/l-2.37g/l的滴度)或磷酸铁(2.29g/l-2.38g/l的滴度)相比，使用以2.0g/l或1.0g/l的胆酸亚铁(2.67g/l或2.81g/l的滴度)的产物滴度显著更高(图7b)。
[0330]
与对照(在基础培养基中的0.2g/l胆酸亚铁)和以不同浓度测试的最常用铁载体相比，在基础培养基中使用2.0g/l胆酸亚铁获得最大的活细胞浓度，导致改善的细胞培养性能(图7a)。在包含磷酸铁和焦磷酸铁作为铁载体的基础培养基中培养的细胞的活细胞浓度从第10天至第11天急剧下降，对细胞培养性能具有负面影响。
[0331]
在平行实验中发现了类似的结果。使用以2.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度高于不含胆酸亚铁的阴性对照培养物(3.06g/l相对于阴性对照中2.19g/l的滴度)、或在基础培养基中具有以0.4g/l(2.87g/l的滴度)或0.2g/l(2.66g/l的滴度)的胆酸亚铁的培养物(图7c)。在较低的胆酸亚铁浓度(《1g/l)下，效应看起来是浓度依赖性的，并且与不含胆酸亚铁的阴性对照相比，当胆酸亚铁以0.2g/l加入时，获得产物浓度中相当大的增加。
[0332]
此外，使用以0.1g/l的柠檬酸铁的产物滴度低于以0.2g/l的等摩尔胆酸亚铁(2.38g/l相对于2.66g/l的滴度)(图7d)。
[0333]
实施例8
[0334]
在使用基于rpmi的培养基的摇瓶实验中，研究了不同浓度的胆酸亚铁对细胞培养性能，特别是细胞生长和产物形成的作用。发现(i)胆酸亚铁增加了产物滴度，并且(ii)新型化合物铁胆酸亚铁与常用的铁载体例如柠檬酸铁相比是优越的。
[0335]
材料与方法：
[0336]
实验在起始体积为60ml的250ml摇瓶中执行。将所有培养物以0.3x106细胞/ml(产生利妥昔单抗的cho2(cho-dg44)细胞)种植在基础培养基3.1和含有以0.25g/l的柠檬酸铁的补料培养基2中，所述基础培养基3.1含有以不同浓度的胆酸亚铁(0g/l、0.2g/l、0.4g/l或2g/l)或以约等摩尔量的柠檬酸铁(0.1g/l、0.2g/l或1g/l)。0.1g/l、0.2g/l和1g/l的柠檬酸铁浓度选择为分别与基础培养基中以0.2g/l、0.4g/l和2g/l的胆酸亚铁约等摩尔。
[0337]
将摇瓶在37℃下在培养箱中(从第0天到第3天提供10％co2大气，随后为5％co2一天和0％co2，直到结束培养)温育。在第二天开始，每天以30ml/l/d的补料速率加入补料溶液。根据需要补料葡萄糖，以在培养期间将实际葡萄糖浓度维持在2-4g/l之间。每隔一天测量总细胞、活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压，直到培养结束，以监测和控制实验进展。实验一式两份(n＝2)执行。
[0338]
结果：
[0339]
使用以2.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度高于不含胆酸亚铁的阴性对照(0.244g/l相对于阴性对照中0.156g/l的滴度)、或在基础培养基具有以0.4g/l(0.217g/l的滴度)或0.2g/l(0.194g/l的滴度)的胆酸亚铁的培养物(参见图8d并且比较图8a、b和c)。因此，胆酸
亚铁的效应看起来是浓度依赖性的，并且与不含胆酸亚铁的阴性对照相比，当胆酸亚铁以0.2g/l加入时，获得产物浓度中相当大的增加。
[0340]
此外，使用以0.1g/l的柠檬酸铁的产物滴度低于以0.2g/l的等摩尔胆酸亚铁(0.184g/l相对于0.194g/l的滴度；图8a)。同样地，使用以0.2g/l的柠檬酸铁的产物滴度低于以0.4g/l的等摩尔胆酸亚铁(0.200g/l相对于0.217g/l的滴度；图8b)，并且使用以1.0g/l的柠檬酸铁的产物滴度显著低于以2.0g/l的等摩尔胆酸亚铁(0.201g/l相对于0.244g/l的滴度；图8c)。
[0341]
总体活细胞浓度显示关于胆酸亚铁和柠檬酸铁的相似曲线，但等摩尔浓度的胆酸亚铁相对于柠檬酸铁导致更高的活细胞浓度(例如，通过以1.0g/l的等摩尔柠檬酸铁获得的滴度(滴度201mg/l)明显低于用2.0g/l胆酸亚铁获得的那些(滴度244mg/l)。此外，与商业铁载体例如柠檬酸铁相比，胆酸亚铁的(等摩尔)应用导致更低的渗透压值，这就活细胞浓度和细胞存活率而言视为有利于哺乳动物细胞培养。与阴性对照(不添加胆酸亚铁)相比，胆酸亚铁仅略微增加渗透压(数据未显示)。当胆酸亚铁以渐增浓度加入时，活细胞浓度和细胞存活率仅略微改善。
[0342]
实施例9
[0343]
研究了(产生利妥昔单抗的cho2(cho-dg44))在培养基平台6.2或基于rpmi的培养基平台(基础培养基3.1和补料培养基2)中的胆酸亚铁和等摩尔柠檬酸铁对在2l生物反应器中以补料分批模式的细胞培养性能，特别是细胞生长和产物形成的作用。发现(i)胆酸亚铁增加了产物滴度，(ii)并且与常用的铁载体例如柠檬酸铁相比是优越的。因此，胆碱铁的积极效应不依赖于所应用的培养系统(例如摇瓶实验或受控的2l生物反应器或所使用的培养基)。
[0344]
材料与方法：
[0345]
实验在起始体积为1.8l的完全受控的2l生物反应器系统中执行。cho2(cho-dg44)利妥昔单抗细胞以0.3x106细胞/ml种植在所有培养物中，使用含有胆酸亚铁(0.2g/l或2.0g/l)或柠檬酸铁(1g/l)的基础培养基6.2a和含有以0.56g/l的胆酸亚铁的补料培养基6.2a(图9a-c)、或者含有胆酸亚铁(0.2g/l或2.0g/l)或柠檬酸铁(1g/l)的基于rpmi的基础培养基3.1和含有以0.25g/l的柠檬酸铁的基于rpmi的补料培养基2。柠檬酸铁的浓度范围选择在与胆酸亚铁相同的范围内(在摩尔基础上)。生物反应器对于整个培养在37℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止基于(在第0-3天时的7.07和在第3天-第14天时的6.92) /-0.17的ph设定点的毒性浓度。do设定点为60％，并且补料以30ml/l/d连续加入。根据抽样间隔如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。补料培养基含有葡萄糖，并且葡萄糖水平对于整个培养维持在》2g/l。根据需要从原液中添加谷氨酰胺，以使谷氨酰胺浓度保持在0.1-0.4g/l的范围内。实验一式两份(n＝2)执行。
[0346]
结果：
[0347]
与具有0.2g/l胆酸亚铁(2.04g/l相对于对照中1.62g/l的滴度)或1.0g/l柠檬酸铁(1.73g/l的滴度)的对照培养物相比，在基础培养基6.2a中具有以2.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度更高(图9c)。这证实胆酸亚铁对产物滴度的作用与以等摩尔浓度的柠檬酸铁相比是优越的。尽管产物浓度增加，但使用不同浓度的胆酸亚铁或等摩尔浓度的柠檬酸铁的活
细胞浓度和细胞存活率是可比较的。观察到对于用胆酸亚铁处理的培养物，在第8天时开始的活细胞浓度和存活率中略微更快的降低(图9a和b)。使用培养基平台6.2a的培养物中的总渗透压对于所有样品在可接受的范围内(280-大约400mosmo/kg，第0-12天，数据未显示)。
[0348]
同样地，与以0.2g/l胆酸亚铁(0.257g/l相对于对照中0.237g/l的滴度)或0.1g/l柠檬酸铁(0.200g/l的滴度)的对照相比，在基于rpmi的培养基中具有以2.0g/l的胆酸亚铁的产物滴度更高(图9d)。尽管产物浓度增加，但在以不同浓度的胆酸亚铁或等摩尔柠檬酸铁的基于rpmi的培养基系统中的活细胞浓度和细胞存活率是可比较的。使用基于rpmi的培养基平台的培养物中的总体渗透压略微增加(350-440mosmo/kg，第0-12天，数据未显示)。
[0349]
实施例10
[0350]
转染衍生自cho-k1(cho-k1 gs)的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷细胞系，以便使用基于谷氨酰胺合成酶的蛋白质表达系统来表达且产生利妥昔单抗作为实例蛋白质。分析了生产利妥昔单抗的这种cho-k1 gs细胞系的生长和作为实例蛋白质的利妥昔单抗的生产。发现具有改善的氨基酸比率的培养基也可以用于gs缺陷细胞系，并且所产生的目的蛋白质的量与其他细胞系的量是相当高的(参见图6c)。
[0351]
材料与方法：
[0352]
该实验在起始体积为15ml的小型化生物反应器系统中执行。将表达利妥昔单抗的cho-k1 gs细胞系以0.7x106细胞/ml种植在基础培养基6.2gs中，并且使用补料培养基6.2gs进行培养，两者都具有最佳化aa比率。与基础培养基6.2和补料培养基6.2相比，作出一些微小变化：
[0353]-基础培养基6.2gs：由于gs系统消除来自aa预混物粉末(最佳化aa比率)的谷氨酰胺，从琥珀酸1.5g/l变为琥珀酸二钠6h2o 3.43g/l制剂，并且胆酸亚铁从0.2g/l增加到1.8g/l。
[0354]-补料培养基6.2gs：葡萄糖从35.4g/l增加到83.4g/l，并且从琥珀酸5.2 6g/l变为琥珀酸二钠6h2o 12.0g/l制剂
[0355]
在cho-k1gs细胞中表达的治疗分子是具有含有seq id no:1的氨基酸序列的重链和含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链的利妥昔单抗。生物反应器对于整个培养在34.5℃下温育，并且将溶解的co2控制在2-15％之间，以防止基于6.95( /-0.25)的ph设定点的毒性浓度。对于这种补料分批应用，应用了用于成功扩大的平台方法，其包括30ml/l/d的标准补料速率。这意指对于从第1天直到培养结束的整个培养，每天加入营养素补料溶液。葡萄糖也根据需要添加，以使葡萄糖水平对于整个培养保持》0.6g/l。如上所述测量活细胞、存活率、产物浓度、葡萄糖浓度、乳酸浓度、铵浓度和渗透压。实验一式两份(n＝2)执行。
[0356]
结果：
[0357]
来自表达利妥昔单抗的cho-k1 gs细胞系的一式两份的参数活细胞密度、存活率和产物浓度与其他细胞系相比是可比较的或甚至更好。两个小规模生物反应器显示在14天补料分批培养过程后，8665mg/l和8102mg/l的高预收获产物浓度。这些结果证实使用具有最佳化aa比率的培养基，衍生自cho-k1的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷细胞系能够增殖并且以非常高的滴度产生目的蛋白质(图10a-c)。
[0358]
鉴于上文，应当理解本发明还涉及下述项目：
[0359]
项目
[0360]
1.一种用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0361]
约1.2-2.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0362]
约0.5-0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0363]
约1.5-2.7的l-酪氨酸/l-异亮氨酸，
[0364]
约1.0-1.9的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0365]
约1.0-1.9的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0366]
其中所述基础细胞培养基具有约25至150mm的总氨基酸含量。
[0367]
2.项目1的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的约1.6-2.9的摩尔比(mm/mm)的l-赖氨酸。
[0368]
3.项目1或2的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0369]
约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0370]
约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0371]
约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0372]
4.项目3的基础细胞培养基，其包含各自根据项目3的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0373]
5.一种用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0374]
约1.3-1.8的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0375]
约0.6-0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0376]
约1.7-2.5的l-酪氨酸/l-异亮氨酸，
[0377]
约1.2-1.8的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0378]
约1.3-1.6的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0379]
其中所述基础细胞培养基具有约25至100mm的总氨基酸含量。
[0380]
6.项目1或5的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的约1.8-2.7的摩尔比(mm/mm)的l-赖氨酸。
[0381]
7.项目1、2、5或6的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0382]
约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0383]
约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0384]
约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0385]
8.项目7的基础细胞培养基，其包含各自根据项目7的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0386]
9.项目5的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0387]
(a)约1.8-2.7的l-赖氨酸/l-异亮氨酸；和/或
[0388]
(b)约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0389]
约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；和
[0390]
约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0391]
10.一种用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含相对于异亮氨酸以下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0392]
约1.5-1.8的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0393]
约0.6-0.8的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0394]
约1.9-2.3的l-酪氨酸/l-异亮氨酸，
[0395]
约1.3-1.6的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0396]
约1.3-1.6的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0397]
其中所述基础细胞培养基具有约25至100mm的总氨基酸含量。
[0398]
11.项目1、5或10的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的约2.0-2.5的摩尔比(mm/mm)的l-赖氨酸。
[0399]
12.项目1、2、5、6、10或11的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0400]
约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0401]
约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0402]
约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0403]
13.项目12的基础细胞培养基，其包含各自根据项目12的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0404]
14.项目10的基础细胞培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸以下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0405]
(a)约2.0-2.5的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，和/或
[0406]
(b)约0.3-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0407]
约1.6-3.0的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；和
[0408]
约0.4-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0409]
15.项目1至14中任一项的基础细胞培养基，其中所述培养基是无血清培养基，优选化学成分确定的培养基或化学成分确定和无蛋白质的培养基。
[0410]
16.项目1至15中任一项的基础细胞培养基，其另外包含浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm或约0.4至1.0mm的胆酸亚铁。
[0411]
17.项目1至16中任一项的基础细胞培养基，其中所述基础细胞培养基具有约30至约80，优选约35至约65，更优选约40至约50mm的总氨基酸含量。
[0412]
18.一种用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基，其包含浓度为0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm或约0.4至1.0mm的胆酸亚铁。
[0413]
19.一种用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0414]
约2.3-4.2的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0415]
约0.6-1.1的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0416]
约1.3-2.4的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0417]
约1.1-2.0的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0418]
其中所述补料培养基具有约100至1000mm的总氨基酸含量。
[0419]
20.项目19的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0420]
约0.6-1.1的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和/或约1.1-2.1的l-赖氨酸/l-异亮氨酸，优选
[0421]
约0.6-1.1的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和约1.1-2.1的l-赖氨酸/l-异亮氨酸。
[0422]
21.项目19或20的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0423]
约0.3-0.6的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0424]
约0.9-1.8的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0425]
约0.4-0.8的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0426]
22.项目21的补料培养基，其包含各自根据项目21的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0427]
23.一种用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0428]
约2.6
–
3.9的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0429]
约0.7-1.0的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0430]
约1.5-2.2的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0431]
约1.3-1.9的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0432]
其中所述补料培养基具有约100至1000mm的总氨基酸含量。
[0433]
24.项目19或23的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0434]
约0.7-1.0的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和/或约1.3-1.9的l-赖氨酸/l-异亮氨酸，优选
[0435]
约0.7-1.0的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和约1.3-1.9的l-赖氨酸/l-异亮氨酸。
[0436]
25.项目19、20、23或24的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0437]
约0.4-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0438]
约1.1-1.6的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0439]
约0.5-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0440]
26.项目25的补料培养基，其包含各自根据项目25的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0441]
27.项目23的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0442]
(a)约0.7-1.0的l-酪氨酸/l-异亮氨酸，和
[0443]
约1.3-1.9的l-赖氨酸/l-异亮氨酸，和/或
[0444]
(b)约0.4-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0445]
约1.1-1.6的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；和
[0446]
约0.5-0.7的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0447]
28.一种用于培养哺乳动物细胞的补料培养基，其包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0448]
约2.9-3.5的l-亮氨酸/l-异亮氨酸，
[0449]
约0.8-0.9的l-苯丙氨酸/l-异亮氨酸，
[0450]
约1.7-2.0的l-苏氨酸/1-异亮氨酸，和
[0451]
约1.4-1.7的l-缬氨酸/l-异亮氨酸，
[0452]
其中所述补料培养基具有约100至1000mm的总氨基酸含量。
[0453]
29.项目19、23或28的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸：
[0454]
约0.7-0.9的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和/或约1.4-1.8的l-赖氨酸/l-异亮氨酸，优选
[0455]
约0.7-0.9的l-酪氨酸/l-异亮氨酸和约1.4-1.8的l-赖氨酸/l-异亮氨酸。
[0456]
30.项目19、20、23、24、28或29的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0457]
约0.4-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0458]
约1.2-1.5的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；或
[0459]
约0.5-0.6的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0460]
31.项目30的补料培养基，其包含各自根据项目30的摩尔比的l-色氨酸、l-脯氨酸和l-甲硫氨酸。
[0461]
32.项目28的补料培养基，其进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mm/mm)的下述氨基酸中的至少一种：
[0462]
(a)约0.7-0.9的l-酪氨酸/l-异亮氨酸，和
[0463]
约1.4-1.8的l-赖氨酸/l-异亮氨酸，和/或，
[0464]
(b)约0.4-0.5的l-色氨酸/l-异亮氨酸，
[0465]
约1.2-1.5的l-脯氨酸/l-异亮氨酸；和
[0466]
约0.5-0.6的l-甲硫氨酸/l-异亮氨酸。
[0467]
33.项目19至32中任一项的补料培养基，其中所述补料培养基是浓缩补料培养基，其用于基于所述培养物起始体积，以约10-50ml/l/天，优选以约15-45ml/l/天，更优选以约20-40ml/l/天，且更优选以约30ml/l/天加入所述细胞培养物中。
[0468]
34.项目19至32中任一项的补料培养基，其中所述培养基是无血清培养基，优选化学成分确定的培养基或化学成分确定和无蛋白质的培养基。
[0469]
35.项目19至34中任一项的补料培养基，其另外包含浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm或约0.5至1.0mm，优选约0.5至0.6mm的胆酸亚铁。
[0470]
36.项目19至35中任一项的补料培养基，其进一步特征在于其具有低盐含量，优选约100mm或更低，更优选50mm或更低。
[0471]
37.项目19至36中任一项的补料培养基，其中所述补料培养基具有约200至约900，优选约300至约800，更优选约400至约700mm的总氨基酸含量。
[0472]
38.一种用于培养细胞的补料培养基，其包含浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm或约0.5至1.0mm，优选约0.5至0.6mm的胆酸亚铁。
[0473]
39.一种用于培养哺乳动物细胞的培养基平台，其包含：
[0474]
a)项目1至18的基础细胞培养基，和
[0475]
b)项目19至38的补料培养基。
[0476]
40.项目1至18中任一项的细胞培养基或项目19至38中任一项的补料培养基，其中所述哺乳动物细胞是啮齿类动物或人细胞，其中所述啮齿类动物细胞优选为中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、duxb11细胞或cho gs缺陷细胞，最优选地，所述细胞是cho-dg44细胞或cho gs缺陷细胞。
[0477]
41.一种生成基础细胞培养基的方法，其包括：
[0478]
a)提供基础细胞培养基，和
[0479]
b)加入根据项目1至17的最终摩尔比的氨基酸或将氨基酸比率调整至根据项目1至17的最终摩尔比。
[0480]
42.项目41的方法，其进一步包括添加作为铁源的胆酸亚铁或调整作为铁源的胆酸亚铁的步骤，所述胆酸亚铁的浓度为约0.1至5.0mm、约0.2至2.0mm、约0.2至1.0mm、或约0.4至1.0mm。
[0481]
43.一种生成补料培养基的方法，其包括：
[0482]
a)提供补料培养基，和
[0483]
b)加入根据项目19至37的最终摩尔比的氨基酸或将氨基酸比率调整至根据项目19至37的最终摩尔比。
[0484]
44.项目43的方法，其进一步包括添加作为铁源的胆酸亚铁或调整作为铁源的胆酸亚铁的步骤，所述胆酸亚铁的浓度为约0.4至5mm、约0.4至1.0mm或约0.5至1.0mm，优选约0.5至0.6mm。
[0485]
45.项目41至44中任一项的方法，其中所述培养基是无血清培养基，优选化学成分确定的培养基或化学成分确定和无蛋白质的培养基。
[0486]
46.一种培养哺乳动物细胞的方法，其包括下述步骤：
[0487]
a)提供哺乳动物细胞，
[0488]
b)在项目1至18中任一项的基础细胞培养基中培养所述细胞，和
[0489]
c)任选地将项目19至38中任一项的补料培养基加入所述基础细胞培养基中；
[0490]
其中所述细胞在允许所述细胞增殖的条件下进行培养。
[0491]
47.一种产生目的蛋白质的方法，其包括下述步骤：
[0492]
a)提供包含编码目的蛋白质的目的基因的哺乳动物细胞，
[0493]
b)在项目1至18中任一项的基础细胞培养基中培养所述细胞，和
[0494]
c)任选地将项目19至38中任一项的补料培养基加入所述基础细胞培养基中，和
[0495]
d)任选地从细胞培养物中分开和/或分离和/或纯化所述目的蛋白质；
[0496]
其中所述细胞在允许所述目的蛋白质表达的条件下进行培养。
[0497]
48.项目47的方法，其中所述目的蛋白质是分泌蛋白质，优选地，所述目的蛋白质是抗体或fc-融合蛋白。
[0498]
49.项目46至48中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是啮齿类动物或人细胞，优选地，所述啮齿类动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1细胞、cho-dg44细胞、duxb11细胞或cho gs缺陷细胞，最优选地，所述细胞是cho-dg44细胞或cho gs缺陷细胞。
[0499]
50.项目46至49中任一项的方法，其中将项目19至38中任一项的补料培养基加入在所述基础细胞培养基中培养的细胞中，并且其中
[0500]
(a)所述补料培养基基于所述培养物起始体积，以约10-50ml/l/天，优选以约15-45ml/l/天，更优选以约20-40ml/l/天，且更优选以约30ml/l/天加入所述基础细胞培养基中，
[0501]
(b)所述补料培养基在第0、1、2或3天时开始加入，和/或
[0502]
(c)所述补料培养基连续加入，或者作为推注每天几次、每天两次、每天一次、每隔一天或每隔两天加入。
[0503]
51.项目46至50中任一项的方法，其中所述细胞培养是大规模细胞培养，优选具有100l或更多，更优选1000l或更多，或甚至更优选10000l或更多的工作体积的细胞培养。
[0504]
52.一种套组试剂盒，其包含项目1至18中任一项的基础细胞培养基和/或项目19至39中任一项的补料培养基、以及任选的哺乳动物细胞。
[0505]
53.项目1至18中任一项的基础细胞培养基用于产生蛋白质的用途，其包括在适合于细胞生长和蛋白质生产的条件下，将产生目的蛋白质的哺乳动物细胞在所述培养基中培养一段时间，收获所述目的蛋白质，并且从所述培养基或细胞裂解产物中回收所述蛋白质。
[0506]
54.项目53的用途，其进一步包括在所述培养期间，用项目19至38中任一项的补料培养基供给所述细胞。
[0507]
55.项目19至39中任一项的补料培养基用于产生蛋白质的用途，其包括在适合于细胞生长和蛋白质生产的条件下，将产生目的蛋白质的哺乳动物细胞在项目1至18中任一项的基础细胞培养基中培养一段时间，用所述补料培养基供给所述细胞，收获所述目的蛋白质并且从培所述养基中回收所述蛋白质。
[0508]
56.胆酸亚铁在哺乳动物细胞培养基中作为铁载体的用途，其中所述胆酸亚铁以约0.2至2.0mm的浓度存在于哺乳动物细胞培养基中。
再多了解一些
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