一种表达犬IL-12的重组质粒及表达犬IL-12蛋白的细胞株的制备方法和应用

一种表达犬il-12的重组质粒及表达犬il-12蛋白的细胞株的制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达犬il-12的重组质粒及表达犬il-12蛋白的细胞株的制备方法和应用。


背景技术：

2.白细胞介素-12(interleukin-12,il-12)是由美国的wistar从eb病毒转染人b淋巴母细胞系的培养液中发现的，又名细胞毒淋巴细胞成熟因子(cytotox-ic lymphocyte maturation factor,clmf),或称自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor,nksf)，是目前发现对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强和范围最广的一种细胞因子。il-12是由p35和p40两亚基通过二硫键连接形成的异源二聚体，只有两者一起作用才能得到具有生物活性的il-12。
3.il-12在犬类动物方面的研究较少，目前的研究主要是作为免疫增强剂在疾病研究中使用。jeffry cutrera等研究电穿孔介导的化疗药物博莱霉素和il-12质粒dna结合对患有肿瘤的犬类进行多周期电化疗基因治疗(ecgt)，结果显示除肉瘤外的所有检测组织型中，ecgt治疗通过抗肿瘤免疫反应诱导肿瘤消退非常有效，可以快速根除或清除大的鳞状细胞癌(doi:10.1111/jcmm.12382)。nasim akhtar等利用il12构建了内皮细胞模型，研究il12addin在犬血管肉瘤体内抑制恶行内皮细胞的肿瘤生长，结果显示il-12诱导产生的ifn-γ能抑制恶性小鼠内皮细胞增殖(doi:10.1593/neo.03334)；nina milevoj等使用电化学治疗，编码犬il12质粒转化细胞还原手术联合治疗口腔恶性黑色素瘤，结果显示电化学治疗和il-12-get联合治疗对犬口腔恶性黑色素瘤是有一定疗效的(doi:10.1016/j.rvsc.2018.11.001)。李秀锦等研究il-12对犬细小病毒vp2 dna疫苗免疫作用，结果发现il-12能增强犬细小病毒vp2 dna疫苗免疫应答(李秀锦.白细胞介素-12对犬细小病毒vp2 dna疫苗免疫增强作用的研究[j].畜牧与兽医,2010,42:189.)。
[0004]
现有技术公开了犬il-12的基因，但是未有利用犬il-12的基因进行犬il-12蛋白表达的研究，如何利用犬il-12的基因获得高表达的犬il-12蛋白也是不能显而易见知晓的。
[0005]
因此有必要找到可以高表达犬il-12蛋白的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是克服现有犬il-12蛋白制备的不足，提供一种表达犬il-12的重组质粒及表达犬il-12蛋白的细胞株的制备方法和应用。
[0007]
本发明的目的在于提供一种表达犬il-12的重组质粒。
[0008]
本发明的目的还在于提供表达犬il-12蛋白的细胞株的制备方法。
[0009]
本发明的目的还在于提供所述制备方法制备得到的表达犬il-12蛋白的细胞株，尤其是高表达犬il-12蛋白的细胞株。
[0010]
本发明的目的还在于提供一种犬il-12蛋白的制备方法。
[0011]
本发明的目的还在于提供所述制备方法制备得到的犬il-12蛋白。
[0012]
本发明的目的还在于提供所述犬il-12蛋白在促进淋巴细胞增殖中的应用。
[0013]
本发明的目的还在于提供所述犬il-12蛋白在制备犬类疾病治疗药物中应用。
[0014]
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
[0015]
本发明了首先提供了一种表达犬il-12的重组质粒，所述重组质粒为连接有核苷酸序列如seq id no:7(酶切后的igk-cail12基因片段)所示基因片段的表达载体。
[0016]
优选地，所述表达载体为pcdna3.1。
[0017]
优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0018]
本发明重组质粒中的基因片段中含有igk信号肽的核酸序列和his标签的核酸序列，为重组质粒转染后表达蛋白的分泌及纯化提供方便。
[0019]
所述重组质粒的构建方法，以核苷酸序列如seq id no:1所示的犬il-12基因为模板，利用引物合成犬il-12基因，将犬il-12基因和表达载体分别用限制性核酸内切酶nhei和noti酶切，将酶切后的犬il-12基因和表达载体用t4连接酶连接即得重组质粒；所述引物的核苷酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示。
[0020]
优选地，所述表达载体为pcdna3.1。
[0021]
所述重组质粒在制备犬il-12蛋白中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0022]
一种表达犬il-12蛋白的细胞株的制备方法，将所述重组质粒导入哺乳动物细胞系，所得细胞进行加压筛选；将加压筛选所得细胞进行单克隆的细胞的筛选及鉴定，即得表达犬il-12蛋白的细胞株。
[0023]
优选地，所述加压筛选是利用含有终浓度790～810μg/ml遗传霉素(g418)的培养基进行加压筛选。
[0024]
进一步优选地，所述加压筛选是利用含有终浓度800μg/ml g418的培养基进行加压筛选。
[0025]
优选地，所述哺乳动物细胞系为cho-k1细胞系。
[0026]
利用所述制备方法制备得到的表达犬il-12蛋白的细胞株也在本发明的保护范围之内。
[0027]
优选地，所述细胞株为高表达犬il-12蛋白的细胞株。
[0028]
所述细胞株在制备犬il-12蛋白中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0029]
一种犬il-12蛋白的制备方法，将所述细胞株培养至细胞汇合度至90～96％，取细胞，裂解，过滤去细胞碎片，将滤液纯化即的犬il-12蛋白。
[0030]
优选地，将所述细胞株培养至细胞汇合度至95％，取细胞。
[0031]
优选地，所述细胞株为高表达犬il-12蛋白的细胞株。
[0032]
优选地，所述取细胞具体为：将所述细胞株培养至细胞汇合度至90～96％，离心，取沉淀。
[0033]
优选地，所述裂解是利用含0.8～1.2wt％pmsf的细胞裂解液对细胞进行裂解。
[0034]
进一步优选地，所述裂解是利用含1wt％pmsf的细胞裂解液对细胞进行裂解。
[0035]
优选地，所述过滤是以0.4～0.5μm无菌过滤嘴过滤。
[0036]
进一步优选地，所述过滤是以0.45μm无菌过滤嘴过滤。
[0037]
优选地，所述纯化是利用蛋白纯化仪进行纯化。
[0038]
优选地，所述纯化是利用蛋白纯化仪，以溶液a1和溶液b1作为流动相，通过线性洗脱程序洗脱蛋白，进行蛋白纯化；所述溶液a1为19ml 0.5mnah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，补水至1l，nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为8～12mm，调节ph为7.4；所述溶液b1为19ml 0.5m nah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，补水至1l，nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为490～510mm，调节ph为7.4。
[0039]
优选地，所述溶液a1为19ml 0.5m nah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，补水至1l，使nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为10mm，调节ph为7.4；所述溶液b1为19ml 0.5m nah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，补水至1l，使nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为500mm，调节ph为7.4。
[0040]
进一步优选地，所述流动相溶液a1为47％、溶液b1为53％。
[0041]
利用所述犬il-12蛋白的制备方法制备得到的犬il-12蛋白也在本发明的保护范围之内。
[0042]
所述犬il-12蛋白在促进淋巴细胞增殖中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0043]
优选的，所述应用中犬il-12蛋白的浓度为200μg/ml。
[0044]
所述犬il-12蛋白在制备犬类疾病治疗药物中应用也在本发明的保护范围之内。
[0045]
一种犬类疾病治疗药物，包含所述犬il-12蛋白。
[0046]
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0047]
本发明以含有igk信号肽的核酸序列和his标签的核酸序列的基因片段与表达载体制备重组质粒，所述重组质粒导入哺乳动物细胞系并筛选得到高表达犬il-12蛋白的细胞株，本发明的高表达犬il-12蛋白的细胞株的蛋白表达量远高于未添加igk信号肽的il-12基因片段制备的重组质粒导入哺乳动物细胞系并筛选得到高表达犬il-12蛋白的细胞株。本发明为获得高表达犬il-12蛋白提供了新的方法，也为犬il-12蛋白的进一步研究和利用提供了基础。
附图说明
[0048]
图1为本发明利用引物igk-cail12和cail12进行pcr扩增的结果；其中m为marker，1～2为cail12引物扩增产物；3为cail12引物不加模板的阴性对照扩增产物，4～5为igk-cail12引物扩增产物，6为igk-cail12引物不加模板的阴性对照扩增产物。
[0049]
图2为本发明重组质粒的图谱；其中a为质粒pcdna3.1的图谱，b为cail12重组质粒的图谱，c为igk-cail12重组质粒的图谱。
[0050]
图3为本发明重组质粒菌液的pcr鉴定结果；其中a为cail12重组质粒菌液，b为igk-cail12重组质粒菌液；a、b中m1为maker dl2000，m2为maker dl5000，1～9为9个转化后挑取的单菌落菌液，10为不加菌液模板的阴性对照。
[0051]
图4为本发明菌液双酶切鉴定结果；其中m1为maker dl10000，m2为maker dl2000，1为pcdna3.1与cail12的重组质粒pcr鉴定正确的菌液，2：pcdna3.1与igk-cail12的重组质粒pcr鉴定正确的菌液。
[0052]
图5为本发明cho-k1细胞株western blotting检测结果；其中m为蛋白marker，s1为pcdna3.1组细胞培养液上清液，s2为pcdna3.1-cail12组细胞培养液上清液，s3为
pcdna3.1-igk-cail12组细胞培养液上清液，c1为pcdna3.1组细胞沉淀，c2为pcdna3.1-cail12组细胞沉淀，c3为pcdna3.1-igk-cail12组细胞沉淀。
[0053]
图6为本发明7株cail12单克隆的细胞株western blot检测的犬il-12蛋白的表达情况；a为cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的蛋白条带，b为cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值。
[0054]
图7为本发明6株igk-cail12单克隆的细胞株western blot检测的犬il-12蛋白的表达情况；a为igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的蛋白条带，b为igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值。
[0055]
图8为本发明6株cail12单克隆的细胞株和6株igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值。
[0056]
图9为本发明igk-cail12-4细胞株的重组基因的转录情况。
[0057]
图10为本发明间接免疫荧光实验结果；荧光代表蛋白表达荧光图，dapi代表核染图，merged代表荧光图和核染图的叠加。
[0058]
图11为本发明his标签蛋白标准品和纯化的犬il-12蛋白western blotting检测结果；1为浓度为32.25μg/ml的his标签蛋白标准品，2为纯化的犬il-12蛋白。
[0059]
图12为本发明浓度为32.25μg/ml的his标签蛋白标准品和纯化的犬il-12纯化的犬il-12蛋白条带的灰度值。
[0060]
图13为本发明不同浓度犬il-12蛋白下脾淋巴细胞的刺激指数测定结果。
具体实施方式
[0061]
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0062]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0063]
实施例1犬il-12基因的扩增
[0064]
1.pcr扩增
[0065]
根据核苷酸序列如seq id no:1所示的犬il-12(cail12)基因设计两对特异性引物igk-cail12和cail12，引物序列如表1，下划线标示为酶切位点。
[0066]
表1引物序列
[0067][0068]
以seq id no:1所示的cail12基因的dna序列为模板，利用引物igk-cail12和cail12进行pcr扩增。pcr反应体系(25μl)为：2x tap plus master mix，9.5μl；上游引物
(10μmol/l)，0.5μl；下游引物(10μmol/l)，0.5μl；dna模板，1μl；ddh2o，13.5μl。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸2min，运行30个循环；最后72℃在延伸10min；利用引物cail12扩增的退火温度为74℃；利用引物igk-cail12扩增的退火温度为85℃。
[0069]
将1wt％琼脂糖凝胶，与体积分数0.05％的godview核酸染料混合后倒入核酸电泳胶板内静置30min待其凝固；将pcr扩增产物进行核酸凝胶电泳，110v30min，再用紫外线照胶仪观察pcr扩增结果。
[0070]
将扩增的目的条带用洁净的刀片切下，放置于1.5ml无菌离心管中。按照omega bio-tek的琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明书对pcr扩增产物进行切胶回收、纯化，即得到纯化的pcr扩增产物。
[0071]
2.结果
[0072]
利用引物igk-cail12和cail12进行pcr扩增的结果如图1，其中，m为marker，1～2为cail12引物扩增产物；3为cail12引物不加模板的阴性对照扩增产物，4～5为igk-cail12引物扩增产物，6为igk-cail12引物不加模板的阴性对照扩增产物。
[0073]
图1结果显示：泳道1～2出现约1634bp的条带，与预期大小相符，说明成功扩增出cail12基因，泳道3～4出现约1694bp的条带，与预期大小相符，表明成功扩增出igk-cail12基因。
[0074]
实施例2重组质粒的构建
[0075]
1.酶切连接
[0076]
用限制性核酸内切酶nhei和noti分别对pcdna3.1质粒、实施例1纯化的扩增产物cail12基因和igk-cail12基因进行双酶切。
[0077]
酶切体系(20μl)为：10
×
fastdigest buffer，2μl；nhei，1μl；noti，1μl；cail12基因，2μl(igk-cail12基因，3μl)；pcdna3.1质粒，2.5μl；ddh2o，补足20μl。37℃金属浴中酶切1h，按照omega bio-tek的琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明书对酶切产物进行回收，即得到核苷酸序列如seq id no:6所示的cail12基因片段(1579bp)和核苷酸序列如seq id no:7所示的igk-cail12基因片段(1639bp)以及酶切后的pcdna3.1质粒。
[0078]
使用t4 dna酶连接cail12基因片段(seq id no：6)和酶切后的pcdna3.1质粒，16℃金属水浴锅过夜，得到cail12重组质粒；使用t4 dna酶连接igk-cail12基因片段(seq id no：7)和酶切后的pcdna3.1质粒，16℃金属水浴锅过夜，得到igk-cail12重组质粒。连接体系(10μl)为：cail12基因，2μl(igk-cail12基因，3μl)；pcdna3.1质粒，1μl；t4 dna连接酶，1μl；10
×
t4 buffer，1μl；ddh2o，补足10μl。
[0079]
重组质粒的图谱如图2所示，其中a为质粒pcdna3.1的图谱，b为cail12重组质粒的图谱，c为igk-cail12重组质粒的图谱。
[0080]
2.重组质粒鉴定
[0081]
(1)菌液pcr鉴定
[0082]
将构建的两种重组质粒分别转化至top10感受态细胞，具体的，将top10感受态从-80℃取出，置于冰上融化，将两种重组质粒各取10μl分别加入100μltop10感受态细胞中，轻轻微弹混合均匀，然后将混合物冰浴静置30min，再42℃水浴热激90s，之后再迅速插于冰上静置2min；接着将混合物加入900μllb液体培养基中，混匀，放于摇床，37℃，200r/min恒温
震荡摇菌培养1h；将培养液于室温、3000r/min下离心3min，弃去上清液，重悬菌体，将重悬后的菌液均匀涂布在含氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，待菌液完全吸收，于37℃恒温培养箱，倒置培养16h。挑取单菌落，分别接种于lb液体培养基培养14h，以各单菌落菌液为模板，利用实施例1的两对引物和反应条件分别进行pcr鉴定。
[0083]
(2)菌液pcr鉴定结果
[0084]
重组质粒菌液的pcr鉴定结果如图3所示，其中a为cail12重组质粒菌液，b为igk-cail12重组质粒菌液；a、b中m1为maker dl2000，m2为maker dl5000，1～9为9个转化后挑取的单菌落菌液，10为不加菌液模板的阴性对照。
[0085]
图3中a显示，9个单菌落中泳道2、5和9的单菌落经pcr扩增出现条带，大小约1634bp，与预期大小一致；图3中b显示，9个单菌落中泳道1～4和泳道6～9的单菌落经pcr扩增出现条带，大小约1694bp，与预期大小一致。
[0086]
(3)菌液双酶切鉴定
[0087]
参照magen公司质粒抽提试剂盒说明书对pcr鉴定正确的菌液进行质粒提取，用限制性核酸内切酶nhei和noti对质粒进行双酶切鉴定，将酶切产物置于琼脂糖凝胶中电泳(110v，30min)，紫外透射仪中观察电泳结果。
[0088]
(4)菌液双酶切鉴定结果
[0089]
菌液双酶切鉴定结果如图4所示，其中m1为maker dl10000，m2为maker dl2000，1为pcdna3.1与cail12的重组质粒pcr鉴定正确的菌液，2：pcdna3.1与igk-cail12的重组质粒pcr鉴定正确的菌液。
[0090]
图4结果显示，泳道1在1634bp和5339bp处出现两条条带，表明成功构建cail12重组质粒；泳道2在1694bp和5339bp处出现两条条带，表明成功构建igk-cail12重组质粒。
[0091]
将经pcr和双酶切鉴定正确的重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序正确的重组质粒分别命名为pcdna3.1-cail12(seq id no:8)和pcdna3.1-igk-cail12(seq id no:9)。
[0092]
实施例3表达犬il-12蛋白的细胞株的筛选及鉴定
[0093]
1.重组质粒的提取
[0094]
按照qiagen公司的质粒中提试剂盒的说明书进行去内毒素的重组质粒提取。
[0095]
将含有实施例2构建成功的重组质粒pcdna3.1-cail12和pcdna3.1-igk-cail12以及pcdna3.1空载质粒(阴性对照)的菌液进行复苏，以1％接种量接种于5ml含氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，200r/min摇床震荡培养12h，得到种子液；将摇菌好的种子液以1％接种量接种于100ml的含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养14h，然后利用试剂盒提取pcdna3.1-cail12重组质粒、pcdna3.1-igk-cail12重组质粒和pcdna3.1质粒。
[0096]
2.cho-k1细胞的复苏及传代
[0097]
从液氮罐取出冻存的cho-k1细胞，将其迅速放于37℃恒温水浴锅中静置2min，室温800rpm离心5min，在生物安全柜中进行下一步操作，用移液枪将上清液吸去，将1mlrpmi-1640培养基沿壁缓慢加入，轻轻混匀，室温800rpm离心5min，用移液枪将上清液吸去，再加入1mlrpmi-1640营养培养基(含10％胎牛血清(v/v％)和1％青链霉素(v/v％)的rpmi-1640培养基)，轻轻吹打重悬细胞并转移至60mm细胞培养皿中，再加入4mlrpmi-1640营养培养基
并充分吹打混匀，于5％co
2 37℃恒温细胞培养箱中培养。
[0098]
将细胞从培养箱中取出，表面喷洒75％酒精，放入超净台，弃去上清液，用灭菌的pbs清洗细胞2次，加入0.5ml 0.25％胰酶常温消化1min，弃胰酶，并加入含10％胎牛血清(v/v％)的rpmi 1640培养基，吹打得到单个细胞，一传三(1:3)进行细胞传代。
[0099]
3.cho-k1细胞的转染及cho-k1细胞株蛋白表达初步鉴定
[0100]
(1)cho-k1细胞的转染
[0101]
将传代至第三代、生长状态良好的cho-k1细胞在6孔细胞培养板进行铺板，待细胞生长至汇合度为70～80％时进行转染。用灭菌的pbs将细胞洗涤2遍，然后每孔加入1ml cts
tm opti-mem
tm i培养基，并用lipofectamine
tm 3000试剂(赛默飞世尔科技，l3000001)进行转染。转染液为a液和b液混合液：配置好a液和b液，将b液加入到a液中，混合，室温静置15min；
[0102]
a液：mem培养基，125μl/孔；lipofectamine
tm 3000，5.625μl/孔；
[0103]
b液：mem培养基，125μl/孔；p3000
tm reagent，5μl/孔；pcdna3.1质粒，2μl(pcdna3.1-cail12质粒，2.3μl/孔；pcdna3.1-igk-cail12质粒，1.8μl/孔)。
[0104]
pcdna3.1质粒记为pcdna3.1组；pcdna3.1-cail12质粒记为pcdna3.1-cail12组；pcdna3.1-igk-cail12质粒记为pcdna3.1-igk-cail12组。
[0105]
将转染液加入细胞培养孔中，边加边轻轻晃动混匀，使转染液均匀分布，置于5％co
2 37℃恒温细胞培养箱培养6h；然后用适量的pbs清洗细胞2次，换上含10％胎牛血清(v/v％)的rpmi-1640培养基，置于5％co
2 37℃恒温细胞培养箱培养24h；然后更换含有10％胎牛血清(v/v％)和终浓度为800μg/ml的遗传霉素(g418)的rpmi-1640培养基(加压筛选培养基)，每2～3天换一次培养基，待不添加质粒的阴性细胞孔的cho-k1正常细胞全死亡停止加压筛选，并测试pcdna3.1组、pcdna3.1-cail12组和pcdna3.1-igk-cail12组的细胞株蛋白表达情况。
[0106]
(2)cho-k1细胞株蛋白表达初步鉴定
[0107]
将pcdna3.1组、pcdna3.1-cail12组和pcdna3.1-igk-cail12组的细胞株的细胞培养液分别分离为上清液和细胞；将分离得到的细胞用1wt％pmsf细胞裂解液裂解，裂解后离心取上清，5
×
sds蛋白电泳上样缓冲液(广州鼎国生物技术有限公司，wb-0091)，100℃煮沸10min，制备蛋白样品，通过western blotting检测cho-k1细胞株中犬il-12蛋白的表达情况。
[0108]
具体的，将本实施例制备的蛋白样品以上海雅酶生物医药科技有限公司的page凝胶快速制备试剂盒(10％)配制sds-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上层胶80v，时间20min，下层胶110v，60min。电泳结束后进行电转，设置恒流为200ma，时间90min，电转结束后，pbst洗涤3次，每次5min，用含5wt％脱脂奶粉的pbst进行室温封闭2h，然后再用pbst洗涤3次，然后放入含1：10000稀释的his-tag抗体(小鼠单抗，安诺伦(北京)生物科技有限公司，cat no.10001-0-ap)，以gapdh作为内参，于4℃过夜孵育，再用pbst洗涤3次后加入含1：10000稀释的hrp-羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1h，之后再利用pbst洗涤3次，避光条件下加入ecl化学发光液，1～2min后，于化学发光成像分析系统曝光并观察结果。
[0109]
(3)结果
[0110]
cho-k1细胞株western blotting检测结果如图5所示；其中m为蛋白marker，s1为
pcdna3.1组细胞培养液上清液，s2为pcdna3.1-cail12组细胞培养液上清液，s3为pcdna3.1-igk-cail12组细胞培养液上清液，c1为pcdna3.1组细胞沉淀，c2为pcdna3.1-cail12组细胞沉淀，c3为pcdna3.1-igk-cail12组细胞沉淀。
[0111]
图5显示，c2和c3均出现了蛋白条带，说明pcdna3.1-cail12组和pcdna3.1-igk-cail12组的细胞株均成功表达犬il-12蛋白。
[0112]
4.单克隆的细胞的筛选、培养及鉴定
[0113]
(1)单克隆的细胞的筛选、培养
[0114]
将经过加压筛选所得的成功表达犬il-12蛋白的cail12阳性细胞株和igk-cail12阳性细胞株的细胞分别用pbs清洗2次，再用0.25wt％的胰酶消化。消化后进行细胞计数，用含10％胎牛血清(v/v％)、1％青链霉素(v/v％)和终浓度800μg/mlg418的rpmi-1640培养基将细胞分别稀释至1个细胞/100μl，然后将稀释的细胞分别加入96孔细胞板，每孔100μl。每日观察96孔板的各孔中是否出现单克隆的细胞，挑选单克隆的细胞继续培养，待单克隆的细胞生长至聚集成团后，然后将细胞从96孔板转移至48孔板、24孔板、12孔板、6孔板，逐步扩大培养，即得到cail12单克隆的细胞株和igk-cail12单克隆的细胞株。
[0115]
(2)单克隆的细胞株的鉴定
[0116]
以本实施例中3(2)的cho-k1细胞株蛋白表达初步鉴定方法对单克隆的细胞株的蛋白表达情况进行检测。
[0117]
将cail12单克隆的细胞株和igk-cail12单克隆的细胞株的细胞培养液分别分离为上清液和细胞；将分离得到的细胞用1wt％pmsf细胞裂解液裂解，并离心取上清，上清中加入5
×
sds蛋白电泳上样缓冲液(广州鼎国生物技术有限公司，wb-0091)，100℃煮沸10min，制备蛋白样品，通过western blotting检测单克隆的细胞株中犬il-12蛋白的表达情况。利用image j软件扫描western blot检测的蛋白条带灰度值，计算蛋白含量。
[0118]
(3)结果
[0119]
6株cail12单克隆的细胞株western blot检测的犬il-12蛋白的蛋白条带如图6所示；图6显示，6株cail12单克隆的细胞株均表达出犬il-12蛋白，且蛋白条带清晰、唯一；
[0120]
6株igk-cail12单克隆的细胞株western blot检测的犬il-12蛋白的蛋白条带如图7所示；图7显示，6株igk-cail12单克隆的细胞株均表达出犬il-12蛋白，除2号蛋白条带外，其余蛋白条带均清楚且唯一，为纯化蛋白。
[0121]
6株cail12单克隆的细胞株和6株igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值如图8所示；图8显示，igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值全部显著高于cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值，说明，igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的含量远高于cail12单克隆的细胞株，进一步说明以igk-cail12重组质粒转染并筛选的igk-cail12单克隆的细胞株优于cail12重组质粒转染并筛选的igk-cail12单克隆的细胞株。
[0122]
图8显示2号igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值最大，但图7显示2号细胞株表达的蛋白条带不唯一，蛋白不纯，不能判断其犬il-12蛋白含量是否最高，4号igk-cail12单克隆的细胞株表达的犬il-12蛋白的灰度值仅次于2号，以4号igk-cail12(igk-cail12-4)单克隆的细胞株作为表达的蛋白含量最高的细胞株。
[0123]
实施例4高表达犬il-12蛋白细胞株qpcr鉴定
[0124]
以实施例3筛选的igk-cail12-4细胞株为检测对象，测试细胞株高表达犬il-12蛋白的基因的转录水平。
[0125]
分别收集实施例3中igk-cail12-4细胞株，使用广州美基生物科技有限公司hipure unviersal rna mini kit试剂盒提取细胞总rna，再利用rna反转酶反转得到cdna，利用qrt-pcr对重组基因的转录水平进行检测。以cho-k1细胞和pcdna3.1质粒转染的cho-k1细胞(cho-k1-空载)为对照。
[0126]
igk-cail12-4细胞株的重组基因的转录情况如图9所示，图9显示，igk-cail12-4细胞株的重组基因的相关表达显著高于对照，说明本发明igk-cail12-4细胞株的重组基因可以高效表达。
[0127]
实施例5犬il-12蛋白免疫原性的检测
[0128]
1.方法
[0129]
利用间接免疫荧光实验检测犬il-12蛋白免疫原性。
[0130]
利用培养板培养cho-k1细胞、pcdna3.1质粒转染的cho-k1细胞(cho-k1-空载)、实施例3的igk-cail12-4细胞株(cho-k1-igk-cail12-4)，以含10％胎牛血清(v/v％)、1％青链霉素(v/v％)和800μg/mlg418的rpmi-1640培养基为培养基进行培养，待细胞汇合度为90％，弃培养基，用pbs清洗细胞3次；然后于4℃下，利用4℃预冷的甲醇固定细胞1h，弃甲醇，用pbs清洗细胞3次，加入现配的1v/v％曲拉通，室温下，通透细胞30min，弃曲拉通，用pbs清洗细胞3次，实验组igk-cail12-4细胞株细胞分别加入1：25稀释的兔源犬il-12多克隆抗体(cail12p70兔多抗)，对照组igk-cail12-4细胞株细胞加入空白兔血清(兔阴性对照)，对照组cho-k1细胞、pcdna3.1质粒转染的cho-k1细胞、igk-cail12-4细胞株细胞加入1：100稀释鼠源his-tag抗体，4℃过夜孵育；用pbs清洗细胞3次，兔源犬il-12多克隆抗体组使用无菌pbs以1：100稀释的fitc标记山羊抗兔igg做二抗，鼠源his-tag抗体组使用无菌pbs以1：100稀释的fitc标记山羊抗鼠igg做二抗，37℃恒温避光孵育1h。分别回收二抗，用pbs清洗细胞3次，加入适量dapi对细胞核染色3min，弃dapi，用pbs清洗细胞1次，利用倒置荧光显微镜观察染色结果。
[0131]
间接免疫荧光实验结果如图10所示，其中荧光代表蛋白表达荧光图，dapi代表核染图，merged代表荧光图和核染图的叠加。图10显示，igk-cail12-4细胞株孵育兔源犬il-12多克隆抗体或鼠源his-tag抗体并染色后皆有荧光产生，而其余对照组没有荧光产生，说明igk-cail12-4细胞株表达的犬il-12蛋白具有良好的免疫原性。
[0132]
实施例6犬il-12蛋白纯化
[0133]
以实施例3中的igk-cail12-4单克隆的细胞株继续培养细胞，待细胞汇合度至95％时，对细胞培养液进行离心，取离心后的细胞沉淀，以含1wt％pmsf的细胞裂解液对细胞进行裂解，然后通过0.45μm无菌过滤嘴过滤，去细胞碎片，将滤液(蛋白液)置于冰上备用。
[0134]
使用伯乐公司的蛋白纯化仪进行蛋白纯化。打开计算机、蛋白纯化仪和自动收集管，双击电脑chromlab应用程序，待应用程序显示stand by即可进行以下操作：
[0135]
s1.首先用超声除气的ddh2o冲洗泵a和泵b，除去无水乙醇；更换上1ml的his标签蛋白纯化柱，从泵a通入20ml用超声除气的ddh2o，速度为1ml/min，除去his标签蛋白纯化柱里的无水乙醇；
[0136]
s2.从泵a通入30ml超声除气后的溶液a1，速度为1ml/min，进行平衡，溶液a1：19ml 0.5m nah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，加入双蒸水振荡混匀后定容至1l，nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为10mm，调节ph为7.4；
[0137]
s3.从泵a通入制备好的蛋白液，速度为1ml/min，进行上样，使蛋白液中的蛋白与his标签蛋白纯化柱上的标签进行结合；
[0138]
s4.重复步骤s2，将多余的杂蛋白洗脱下来；
[0139]
s5.从泵a通入溶液a1，泵b通入溶液b1，以溶液a1和溶液b1作为流动相，通过线性洗脱程序洗脱蛋白，溶液a1为47％和溶液b1为53％时，出现洗脱峰，以此时洗脱条件进行蛋白洗脱，同时收集洗脱液；溶液b1：19ml 0.5mnah2po4，81ml 0.5m na2hpo4，nacl，咪唑，加入双蒸水振荡混匀后定容至1l，nacl浓度为0.5m，咪唑浓度为500mm，调节ph为7.4。
[0140]
s6.从泵b通入30ml溶液b1，速度为1ml/min，清洗柱子上结合的蛋白。
[0141]
s7.从泵a和泵b同时通入30ml用超声除气后的ddh2o，对仪器进行冲洗，冲洗完后再通入体积分数20％的乙醇，以充满整个系统，最后将his标签蛋白纯化柱拆下，4℃保存。
[0142]
对步骤s5收集的洗脱液进行浓缩，使用截留度30kd的超滤管充分过滤，得到浓缩蛋白，即为纯化的犬il-12蛋白。将benchmark
tm his标签蛋白标准品(赛默飞世尔科技公司，lc5606)用pbs稀释至浓度为32.25μg/ml，与浓缩后蛋白(纯化的犬il-12蛋白)一起进行western blotting，使用image j软件扫描蛋白条带灰度值，根据灰度值和标准品浓度计算浓缩蛋白含量。
[0143]
浓度为32.25μg/ml的his标签蛋白标准品，2为纯化的犬il-12蛋白。his标签蛋白标准品和纯化的犬il-12蛋白western blotting检测结果如图11所示；其中1为浓度为32.25μg/ml的his标签蛋白标准品，2为纯化的犬il-12蛋白。
[0144]
浓度为32.25μg/ml的his标签蛋白标准品和纯化的犬il-12纯化的犬il-12蛋白条带的灰度值如图12所示，根据图12中的his标签蛋白标准品和纯化的犬il-12纯化的犬il-12蛋白条带的灰度值以及his标签蛋白标准品的浓度，即可推算出纯化的犬il-12蛋白浓度为30.10μg/ml。
[0145]
实施例7淋巴细胞增殖试验
[0146]
取3只正常小鼠的脾淋巴细胞，测定实施例6纯化的犬il-12蛋白对淋巴细胞的增殖反应。
[0147]
1.淋巴细胞的制备
[0148]
整个操作于灭菌操作台上进行。具体步骤如下：
[0149]
(1)采用断颈法将小鼠处死，放置于75％酒精中静置5min；
[0150]
(2)将小鼠的脾脏取出，放于小皿中，用高压灭菌后pbs冲洗脾脏表面，并将脾脏表面脂肪剔除干净，使用灭菌后的研磨器，加入rpmi-1640培养基，研磨脾脏，颜色变成透明，然后用200目的细胞筛网过滤，滤液2000rpm/min离心10min，弃上清液，保留沉淀；
[0151]
(3)沉淀中加入5ml的红细胞裂解液，小心的吹打混匀，室温静置10min，使脾脏中的红细胞完全裂解，2000r/min离心10min，待细胞沉淀为白色即说明红细胞完全裂解；
[0152]
(4)弃上清液，加入5ml rpmi-1640培养基洗涤细胞沉淀，2000r/min离心10min；
[0153]
(5)弃上清液，加入2ml含10％fbs(v/v％)的rpmi-1640培养基，将得到的脾淋巴细胞重悬，并用血球计数板进行计数，制备5
×
105个/100μl的脾淋巴细胞悬液。
[0154]
2.淋巴细胞增殖试验
[0155]
将上一步制备的脾淋巴细胞悬液以每孔100μl加入96孔细胞板中，每只小鼠做3个重复孔，再均分为11组，然后再向第1组每孔加入100μl终浓度为10μg/ml的刀豆素(con a，阳性对照)，第2组每孔加入100μl含10％fbs(v/v％)的rpmi-1640培养基(作为阴性对照)，第3组不加脾淋巴细胞悬液，每孔加200μlrpmi-1640完全培养基(空白对照)，剩余8组每孔加入100μl，使用rpmi-1640培养基稀释的终浓度分别为40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml实施例6纯化的犬il-12蛋白(cail12蛋白，加药组/实验组)，将96孔细胞板置于37℃、5％co2培养箱中培养48h。
[0156]
培养结束后在96孔细胞板中每孔加入20μl cck8溶液，轻微震荡混匀，置于37℃、5％co2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定每孔培养基在450nm波长下的od值。按照以下公式计算刺激指数(stimulate index，si)，
[0157]
刺激指数＝刺激孔的od值/未刺激孔的od值，
[0158]
刺激孔即为加入刀豆素和cail12蛋白的细胞孔，未刺激孔即为阴性对照细胞孔。
[0159]
3.结果
[0160]
不同浓度犬il-12蛋白下脾淋巴细胞的刺激指数测定结果如图13所示，图12显示，犬il-12蛋白浓度为40μg/ml～2000μg/ml的刺激指数随着浓度的增加刺激指数先增加后降低，当犬il-12蛋白浓度为200μg/ml时，刺激指数最大且大于1，在犬il-12蛋白浓度为200μg/ml时，对脾淋巴细胞的增殖具有促进效果。
[0161]
综上可知，犬il-12蛋白在浓度为200μg/ml时具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。
[0162]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。