一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因TuRLK1及其应用

一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk以及该基因在植物抗性育种中的应用。


背景技术：

2.小麦（triticum aestivum）是一种关系国计民生的重要粮食作物，而小麦条锈病、白粉病等病害严重威胁小麦生长，极大危害小麦的产量和品质。小麦条锈病是由小麦条锈菌(puccinia striiformis f. sp. tritici，pst)引发的寄生型真菌病害；小麦白粉病则是由布氏白粉菌小麦专化型（blumeria graminis f. sp. tritici，bgt）引起的寄生型真菌病害。它们都能够危害小麦及其近缘种属，与作物叶片竞争养分并阻碍其光合作用。由于施用化学药剂对该病原菌的控制效果非常有限，而且会污染粮食以及生态环境，因而培育具有条锈病、白粉病抗性的小麦品种是最有效的应对策略。而从小麦及其近缘种属中克隆、研究其所携带的高效抗性相关基因以满足抗性育种之需，是目前的当务之急。
3.乌拉尔图小麦是普通小麦a基因组的野生祖先种，相对于普通小麦的另两个祖先种（拟斯俾尔托山羊草、粗山羊草），其植株形态以及麦穗发育等方面的特性与普通小麦更为相似。其中，乌拉尔图小麦材料g1812的全基因组序列已经测序完成，并拼接成了完整的7条染色体，注释了大量的功能基因。乌拉尔图小麦材料pi428309，对于多个小麦条锈菌菌株和小麦白粉菌菌株都具有优异的抗性。通过图位克隆、互补验证，我们在以往的工作中已经从pi428309中克隆并验证了数个抗性功能基因。其中，pm60是典型的cc-nbs-lrr蛋白，赋予了pi428309白粉病抗性功能；yru1是n端带有ankyrin结构域、c端具wrky 结构的r蛋白，决定了pi428309的条锈病抗性。这些发现为在抗性育种中充分利用pi428309奠定了基础。
4.但是，目前对小麦抗病基因的挖掘和研究还处于起步阶段，可为抗性育种直接提供的抗源基因还不够丰富，对抗性机制的了解更是较为粗浅。植物对病原菌往往具有多个层次、不同水平的防御模式，不同模式之间又存在互作效应，其中涉及大量而复杂的抗性相关基因。这些状况极不利于科学有效地利用抗性基因以培育广谱持久抗性的小麦品种。因此，为了深入理解植物抵御寄生型病原真菌的机理，进而培育优良抗性品种，也迫切需要我们克隆和探索更多的小麦抗性基因。
5.在这些背景下，本发明对乌拉尔图小麦材料pi428309接种小麦条锈菌pst前后的样品进行了转录组测序分析，发现并验证了其中一个类受体蛋白激酶基因turlk1在接种病原菌后，转录水平迅速升高。基因沉默实验证实，类受体蛋白激酶基因turlk1对于乌拉尔图小麦材料pi428309的小麦条锈病抗性基因yru1发挥抗性功能必不可少。而且，进一步的过量表达实验还证明，类受体蛋白激酶基因turlk1在小麦白粉病抗性、拟南芥白粉病抗性方面具有重要功能。本发明的工作为育种实践提供了新的高效抗源，以便在保证普通小麦的产量和品质的前提下，提高普通小麦对病原菌的抗性。通过对乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1进行的功能研究，可以更加深入理解植物抵御寄生型病原真菌的机理。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1及其应用，为小麦条锈病、白粉病抗性育种提供新颖、高效的抗源基因，以培育优良小麦抗性品种，深化对植物抗病机制的认识。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：本发明首先提供了一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1，所述乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了一种由上述的乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1所编码的蛋白，所述蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
9.本发明还提供了一种含有上述的乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1的重组载体。
10.本发明还提供了上述一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1在构建条锈病抗性小麦品种中的应用。
11.本发明还提供了上述一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1在构建白粉病抗性小麦品种中的应用。
12.本发明还提供了上述一种乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1在构建白粉病抗性拟南芥材料中的应用。
13.本发明的有益效果在于：本发明在乌拉尔图小麦pi428309中克隆得到了类受体蛋白激酶基因turlk1，其不仅能调控乌拉尔图小麦pi428309中条锈病抗性基因yru1对pst cyr33的抗性，还能在普通小麦体内发挥白粉病抗性功能，说明了该类受体蛋白激酶基因turlk1在麦类植物中存在广泛的抗病作用。此外，乌拉尔图小麦类受体蛋白激酶基因turlk1还能在拟南芥体内发挥白粉病抗性功能，说明该基因在异源植物中也能发挥抗性作用。可见，源于乌拉尔图小麦pi428309的类受体蛋白激酶基因turlk1具有在小麦白粉病、条锈病抗性中以及在异源植物中的抗性功能，其在植物抗病育种领域存在重要的运用价值。
附图说明
14.图1：乌拉尔图小麦pi428309类受体蛋白激酶turlk1与乌拉尔图小麦g1812类受体蛋白激酶triur3_02522的序列比较。
15.图2：沉默turlk1引起乌拉尔图小麦pi428309对pst cyr33的抗性显著减弱。
16.图3：bsmv:gfp和bsmv:turlk1侵染乌拉尔图小麦pi428309后接种条锈菌pst cyr33的真菌生长组织学观察。a，乌拉尔图小麦pi428309被bsmv: gfp和bsmv: turlk1侵染，接种条锈菌pst cyr33后，利用麦胚凝集素（wga）染色观察条锈菌在小麦叶片上生长2 dpi、3 dpi、5 dpi后的结构形态变化，ssv（气孔下囊）、ph（初侵染菌丝）、hmc（吸器母细胞）、h（吸器）；b，接种条锈菌2 dpi后，统计bsmv: gfp和bsmv: turlk1处理后，条锈菌的菌丝分枝（hb）、吸器母细胞（hmc）和吸器数（h）数目；c，接种条锈菌3 dpi后, 统计条锈菌侵染菌丝的长度(p 《 0.001)；d，接种条锈菌5 dpi后，统计菌丝侵染面积（p 《 0.05）。
17.图4：在普通小麦fielder的叶片上单细胞瞬时表达turlk1可显著降低其接种bgt e09后的吸器指数。
region）区域存在不同氨基酸序列的缺失。
23.实施例2 turlk1调控乌拉尔图小麦pi428309中yru1介导的条锈病抗性以乌拉尔图小麦pi428309叶片的cdna作为模板，以引物γ-turlk1-f和γ-turlk1-r进行扩增，获得pcr产物。利用限制性内切酶nhe ι对barley stripe mosaic virus rnaγ （bsmv）植物病毒载体进行酶切，得到携带酶切位点的线性化质粒，利用同源重组试剂盒vazyme clonexpress
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ii one step cloning kit c112将pcr产物构建到沉默载体bsmv中，获得了沉默载体bsmv: turlk1。以连入gfp片段的病毒载体bsmv: gfp为对照，参照 【holzberg s, brosio p, gross c, pogue gp. 2002. barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. plant j 30: 315-327】所提供的方法，侵染一叶一心期乌拉尔图小麦pi428309，病毒侵染后，取第四片叶离体接种条锈菌cy33并检测turlk1的表达水平；以对条锈菌cy33感病乌拉尔图材料g1812为阴性对照，以未被病毒侵染的乌拉尔图小麦pi428309（ck）为阳性对照。引物γ-turlk1-f和γ-turlk1-r的核苷酸序列如下：γ-turlk1-f：5
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ttttttttttttttagctagcggtggtagaagtggccagattg-3’，γ-turlk1-r：5
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gattcttcttccgttgctagcgtgtgcaggtgtctgagcacg-3’。
24.结果发现（图2），相对于对照组bsmv:gfp，bsmv: turlk1组turlk1表达量下调，沉默turlk1可引起抗条锈病乌拉尔图小麦pi428309对pst cy33感病。此实验有力的证明了turlk1参与调控乌拉尔图小麦pi428309中yru1介导的条锈病抗性。
25.接种条锈菌后在不同时间阶段进行取样，利用小麦胚芽凝集素（wga）对真菌结构进行染色，对2 dpi、3 dpi、5 dpi的条锈孢子萌发情况、菌丝长短、菌丝侵染面积大小等指数进行统计。结果发现（图3），接菌后第2天，bsmv:turlk1组的hb（菌丝分枝）数目比对照组bsmv:gfp多，分别约为2.26个和1.90个；bsmv:turlk1组的hmc（吸器母细胞）数目比对照组bmsv:gfp多，分别约为2.08个和1.82个；bsmv:turlk1组的h（吸器）数目比对照组bsmv:gfp多，分别约为1.24个和1.04个；接菌后第3天，bsmv:turlk1组的菌丝萌发长度比对照组bsmv:gfp长，分别约为113.92 μm和87.05 μm，经t检验，发现具有极显著差异；接菌后第5天，bsmv:turlk1组的菌丝侵染面积相较于对照组bsmv:gfp明显增大，分别约为17242.12 μm2和11325.74 μm2，具有极显著差异。这些结果表明，当turlk1下调时，有利于条锈菌的发育，从侧面说明了turlk1在乌拉尔图小麦条锈菌cy33抗性中发挥着重要功能。
26.实施例3 普通小麦过量表达turlk1可增强其白粉病抗性参照【shen q-h, saijo y, mauch s, biskup c, bieri s, keller b, seki h,
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lker b, somssich ie, schulze-lefert p. 2007. nuclear activity of mla immune receptors links isolate-specific and basal disease-resistance responses. science 315: 1098-1103.】所提供的方法，通过单细胞瞬时表达实验对turlk1的白粉病抗性功能进行验证。在感白粉病的普通小麦fielder的叶片上，以基因枪介导单细胞瞬时表达turlk1（以gateway系统将turlk1的编码区连入中间载体pdonr207进而转入终载体pubi-gw，扩增turlk1的编码区所用引物为turlk1-attb-f和turlk1-attb-r），表达4 h后接种bgt e09，48 h后gus染色、统计吸器指数。引物turlk1-attb-f和turlk1-attb-r的核苷酸序列如下：turlk1-attb-f：5
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ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcgaggctgctgctcg
gg-3’，turlk1-attb-r：5
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ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaggagatgaccgcctccgcccac-3’。
27.结果发现（图4），过量表达turlk1相比对照处理（过量表达pgy蛋白）可极显著地降低感病小麦fielder叶片上的白粉菌吸器指数，提高了白粉病抗性。
28.实施例4异源过量表达turlk1增强拟南芥的白粉病抗性以pearley201质粒为基本载体，构建由组成型camv 35s启动子驱动类受体蛋白激酶基因turlk1的植物表达载体pearley201-turlk1；采用冻融法转入农杆菌gv3101菌株，并通过花序浸染法对拟南芥进行遗传转化。以除草剂basta筛选阳性植株，检测阳性植株里turlk1的表达水平。以拟南芥白粉病感病突变体pad4为阴性对照。
29.为了明确异源过量表达类受体蛋白激酶基因turlk1对拟南芥白粉病抗性功能的影响，对4周龄的转基因拟南芥进行接种白粉菌实验。结果发现（图5），接菌7天后，野生型拟南芥叶片表面密布分生孢子，且不存在细胞死亡，而turlk1转基因株系的叶片的白粉菌侵染位置都有细胞死亡产生；台盼蓝染色观察也发现，turlk1转基因植株叶片上的白粉菌分生孢子梗及菌丝显著减少，且能观察到多处细胞死亡；定量接种白粉菌进而分析也发现，在4周龄的t2代阳性转基因植株上，单个白粉菌孢子萌发产生的分生孢子梗数（每个材料上计量50个单孢子菌落）显著少于野生型拟南芥（图5）。由以上数据可知，白粉菌侵染时，异源表达的turlk1可诱导拟南芥叶片发生细胞死亡，从而抑制病原菌的侵入和生长，增强拟南芥的白粉病抗性。
30.以上内容通过一般性的说明和具体的实施方案对本发明进行了详尽的阐述。对于本领域内的工作人员而言，对本发明进行某些更改和衍生是轻而易举的，因此在不偏离本发明基本内容而做任何改动都属于本发明要求保护的范畴。