一种细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法

1.本发明涉及土壤处理技术领域，具体为一种细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法。


背景技术：

2.砷污染土壤修复技术主要有固化/稳定化、土壤淋洗、热处理、植物修复法和微生物修复等方法。土壤淋洗通常是向土壤中投加淋洗剂(如有机或无机酸、碱、盐和螯合剂)，该方法不仅会破坏土壤微团聚体结构，还会导致营养元素的淋失和沉淀，以及容易引起地下水污染等二次污染问题，适用于面积小污染重的土壤治理。锰氧化物是土壤中常见的金属氧化剂和吸附剂，由于其具有零点电荷低、负电荷量高、比表面积大、表面活性强等特点，因此对土壤中和水中的重金属、过渡元素以及有机物质等都具有很强的吸附和氧化作用。锰氧化物对as(ⅲ)有极强的氧化作用，as(iii)被氧化为as(ⅵ)从而导致mn2 的释放，形成较多的吸附位点。生物锰氧化物主要是无定形或结晶性较差的矿物，拥有较大的比表面积和反应活性。有文献使用恶臭假单胞菌pseudomonas putida strain mnb1制备了生物锰氧化物，对土壤中污染物有良好的修复效果。此外，还有文献使用恶臭假单胞菌菌株制备了具有吸附性能的生物锰氧化物，可以在对环境无害条件下生产，且无需过度使用能源，具有较低的环境毒性风险，是经济高效的一种生物材料。与同时无机的锰氧化物相比，生物锰氧化物具有更高的比表面积，对污染物的吸附效率更高。通过不同技术对砷和抗生素复合污染修复的综合潜力，全方面提高修复效率，达到改善砷和抗生素复合污染的目的。
3.热处理砷污染土壤时也会破坏土壤结构，同时也面临高处理成本和运行费用等问题。固化/稳定化应用于砷污染土壤有较多的案例，如水泥固化、螯合剂稳定化、铁锰氧化物等无机材料等，但为了获得较好的修复效果，大多修复剂的投加量通常在5％以上，也面临成本高和易产生二次污染等问题。植物修复法和微生物修复法具有成本低、不破坏土壤、不引起二次污染等优点，但也存在修复效率低、修复时间长等弊端。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法，包括如下步骤：细菌菌株分离
→
菌种富集培养
→
制备磁性硅藻土材料
→
土壤修复。
7.细菌菌株的分离培养具体包括如下步骤：
8.s11驯化：首先把带有混合微生物群的水样加入到营养肉汤培养基中，培养60-72h后将营养肉汤培养基中的菌液转接到pycm培养基中继续驯化；
9.s12逐级稀释：吸取pycm中的菌液按10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，10-7
，10-8
的梯度进行稀释；
10.s13涂布：先倒好平板让其凝固，再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布器在表面均匀涂布，使菌液均匀分布，以便长出均匀的单个菌落；
11.s14板划线：配制pycm固体平板，用接种环挑取单个菌落划线到固体平板上，反复多次划线，得到纯种菌落，通过谱系鉴定命名为敏捷食酸菌whw-1。
12.细菌菌种富集培养具体包括如下步骤：
13.s21：将得到的敏捷食酸菌whw-1加入至营养肉汤培养基中培养得到菌液，转接到pycm培养基中；
14.s22：调节ph为6.0-8.0，灭菌后加入菌液，将培养基置于水平振荡器培养36-48小时。
15.步骤s5和步骤s6中pycm培养基制备方法具体为：0.8g/l蛋白胨、0.2g/l酵母浸粉、0.1g/l磷酸氢二钾、0.2g/l硫酸镁、0.2g/l硝酸钠、0.1g/l氯化钙、0.1g/l氯化铵、1g/l柠檬酸铁铵、0.2g/l硫酸锰、0.1g/l碳酸铵，调节ph＝7
±
0.2。
16.步骤s2中菌液的接种量按体积比为2-10％。
17.水平振荡器的振动频率为120-150rpm，温度为20-30℃。
18.制备磁性硅藻土材料具体包括如下步骤：
19.s31：将30g硅藻土原土与300ml浓度为5％的盐酸溶液混合并煮沸1h后抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，置于105℃真空干燥箱中烘干，再置于马弗炉中调节温度至500℃焙烧90min，冷却、研磨和过筛备用；
20.s32：按摩尔比2:1的比例称取固体fecl3·
6h2o和固体feso4·
7h2o，再按质量总和与硅藻土比例2:1称取步骤s31中的硅藻土；
21.s33：将称取好的fecl3·
6h2o、feso4·
7h2o装入500ml烧杯中，加入300ml蒸馏水搅拌溶解；
22.s34：将称取的硅藻土加入溶解后的溶液中，将烧杯置于磁力搅拌器上,温度设置为90℃,搅拌20min后,再往烧杯中加入体积比为20-30％的氨水，搅拌1h后，关闭搅拌；
23.s35：将温度调至100℃，静置2h后，取出烧杯，将烧杯内混合物加入蒸馏水用抽滤机抽滤洗涤，直至中性；
24.s36：放入恒温干燥箱中干燥2h，温度设置为105℃，冷却、研磨和过筛网后即为磁性硅藻土产物进行研磨后，收集备用。
25.步骤s31和s36中筛网的目数均为80-100目。
26.土壤修复具体包括如下步骤：
27.s41：将步骤s5中得到的细菌悬浊液分装到离心管中，在6000r/min下高速离心10min，弃去上清液；
28.s42：将其悬浮于水中，以液固比30-50％添加到复合污染土壤中，同时按投加比1-3％的比例加入磁性硅藻土材料搅拌混匀，搅拌5-30分钟；
29.s43：置于15-35℃的室温条件下，培养2-4周，让细菌诱导产生生物锰氧化物，这些生物锰氧化物氧化、吸附、固定三价砷为五价砷，同时氧化分解抗生素为二氧化碳和水，实现砷和抗生素污染土壤的修复。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明所述方法可达到修复砷和抗生素复合污染土壤的效果，本发明选取敏捷食酸菌whw-1，将该菌在富集培养基中富集培
养；然后将该菌株与含有二价锰、碳源等一同加入到复合污染土壤中，搅拌均匀，让微生物诱导产生生物锰氧化物，这些生物锰氧化物和土壤中的三价砷和抗生素发生一系列的物理-化学-生化反应，将土壤中水溶性的砷转化为稳定态，降低土壤中砷的生物有效性，从而达到砷修复的目的；细菌及其生物锰氧化物通过细胞内代谢、氧化分解等方式将抗生素转化为二氧化碳和水。同时本发明所制备的磁性材料也可达到对污染物的吸附功能，可回收反复使用。总体来说该方法工艺简单、修复时间短、处理成本低、处理范围大、无二次污染等优点。
附图说明
31.图1为本发明中敏捷食酸菌的谱系发育树。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.一种细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法，包括如下步骤：细菌菌株分离
→
菌株富集培养
→
制备磁性硅藻土材料
→
土壤修复。
35.(1)细菌菌株的分离、驯化与富集：
36.将带有混合微生物群的水样加入到营养肉汤中振荡培养，培养72h后将营养肉汤培养基中的菌液转接到pycm培养基(培养基的成分为：0.8g/l蛋白胨，0.2g/l酵母浸粉，0.1g/l磷酸氢二钾，0.2g/l硫酸镁，0.2g/l硝酸钠，0.1g/l氯化钙，0.1g/l氯化铵，1g/l柠檬酸铁铵，0.2g/l硫酸锰，0.1g/l碳酸铵，ph＝7.0
±
0.2)中继续培养。
37.逐级稀释：吸取pycm中的菌液按10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，10-7
，10-8
的菌液浓度梯度进行稀释。
38.涂布：60℃左右时倒好平板，让其凝固，冷却到室温后，将菌液倒入平板上面，迅速用涂布器在表面做来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出均匀的单个菌落。
39.平板划线：配制pycm固体平板，用接种环挑取单个菌落划线到固体平板上，反复多次划线，得到纯种菌落，最后通过谱系鉴定命名为敏捷食酸菌whw-1，谱系发育树见附图1。
40.将得到的菌株接种到营养肉汤(17-25g/l)中富集培养；
41.具体的，所述菌株为敏捷食酸菌whw-1，营养肉汤的浓度为19g/l。
42.进一步的，菌株富集培养的条件为：温度在25℃，频率为150rpm的水平振荡下，好氧富集培养5天，富集培养过程中，菌株的转接量为5％。
43.(2)磁性硅藻土制备
44.按fecl3·
6h2o：feso4·
7h2o的摩尔比比例2:1称取fecl3·
6h2o(0.1m)固体、feso4·
7h2o(0.05m)固体，然后再按照它们质量总和与硅藻土比例2:1称取硅藻土。将称取好的fecl3·
6h2o、feso4·
7h2o装入500ml烧杯中，加入300ml蒸馏水搅拌溶解，然后将称取好的硅藻土加入溶解后的溶液中，将烧杯置于磁力搅拌器上,温度设置为90℃,待搅拌
20min后，再往烧杯中加入30％(v/v)的氨水，搅拌1h后，关闭搅拌，将温度调至100℃，静置2h后，取出烧杯，将烧杯内混合物加入蒸馏水用抽滤机抽滤洗涤，直至中性。然后放入恒温干燥箱中干燥2h，温度设置为105℃，冷却、研磨和过100目筛。
45.(3)修复过程
46.修复时，按照液固比1.2(ml/g土壤)准备菌液，于6000rpm离心10min，弃去培养基成分，加水制成菌悬液；
47.取污染土壤50g，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg，以液固比40％添加到复合污染土壤中，同时按投加比2％的比例加入磁性硅藻土材料搅拌混匀，搅拌30分钟，然后置于室温条件下(25℃)，培养2周。让细菌诱导生物锰氧化物和土壤中的砷发生一系列物理-化学-生化反应，达到土壤砷污染修复的目的。表1为实施例1中砷的修复效果。
48.表1实施例1中砷的修复效率
[0049][0050]
由表1可知，本实施例通过对敏捷食酸菌whw-1和磁性硅藻土的土壤进行水浸提和醋酸浸提后砷含量有所降低，水浸提时加whw-1和磁性硅藻土由未修复的0.14mg/l降至0.06mg/l，修复效率为57.14％，修复效果良好。
[0051]
实施例2
[0052]
细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法，包括如下步骤：细菌菌株分离培养
→
细菌菌株富集培养
→
制备磁性硅藻土材料
→
土壤修复。
[0053]
(1)细菌菌种的分离、驯化与富集：
[0054]
将得到的菌株接种到营养肉汤(17-25g/l)中富集培养；
[0055]
具体的，所述菌株为敏捷食酸菌whw-1，营养肉汤的浓度为19g/l。
[0056]
进一步的，菌株富集培养的条件为：温度在25℃，频率为150rpm的水平振荡下，好氧富集培养5天，富集培养过程中，菌株的转接量为5％。
[0057]
(2)磁性硅藻土制备
[0058]
按fecl3·
6h2o：feso4·
7h2o的摩尔比比例2:1称取fecl3·
6h2o(0.1m)固体、feso4·
7h2o(0.05m)固体，然后再按照它们质量总和与硅藻土比例2:1称取硅藻土。将称取好的fecl3·
6h2o、feso4·
7h2o装入500ml烧杯中，加入300ml蒸馏水搅拌溶解，然后将称取好的硅藻土加入溶解后的溶液中，将烧杯置于磁力搅拌器上,温度设置为90℃,待搅拌20min后，再往烧杯中加入30％(体积比)的氨水，搅拌1h后，关闭搅拌，将温度调至100℃，静置2h后，取出烧杯，将烧杯内混合物加入蒸馏水用抽滤机抽滤洗涤，直至中性。然后放入恒温干燥箱中干燥2h，温度设置为105℃，冷却、研磨和过100目筛。
[0059]
(3)修复过程
[0060]
按照液固比1.2(ml/g土壤)准备菌液，于6000rpm离心10min，弃去培养基成分，加水制成菌悬液；
[0061]
取污染土壤50g，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg，同时按投加比2％的比例加入磁性硅藻土材料，加入菌液，调节含水率为35％，搅拌30分钟，然后置于室温条件下(25℃)，培养4周。让细菌诱导生物锰氧化物和土壤中的砷发生一系列物理-化学反应，达到土壤砷污染修复的目的。表2为实施例2中砷的修复效果。
[0062]
表2实施例2中砷的修复效率
[0063][0064]
由表2数据可知，本实施例中醋酸浸提砷含量由未修复的0.34mg/l降至0.16mg/l，修复效率为52.94％，修复效果良好。
[0065]
实施例3
[0066]
细菌协同磁性硅藻土修复砷和抗生素污染土壤的方法，包括如下步骤：细菌菌株分离培养
→
细菌菌株富集培养
→
制备磁性硅藻土材料
→
土壤修复。。
[0067]
(1)细菌菌种的富集：
[0068]
将得到的菌株接种到营养肉汤(17-25g/l)中富集培养；
[0069]
具体的，所述菌株为敏捷食酸菌whw-1，营养肉汤的浓度为19g/l。
[0070]
进一步的，菌株富集培养的条件为：温度在25℃，频率为150rpm的水平振荡下，好氧富集培养5天，菌株的转接量为体积比5％。
[0071]
(2)磁性硅藻土制备
[0072]
按fecl3·
6h2o：feso4·
7h2o的摩尔比比例2:1称取fecl3·
6h2o(0.1m)固体、feso4·
7h2o(0.05m)固体，然后再按照它们质量总和与硅藻土比例2:1称取硅藻土。将称取好的fecl3·
6h2o、feso4·
7h2o装入500ml烧杯中，加入300ml蒸馏水搅拌溶解，然后将称取好的硅藻土加入溶解后的溶液中，将烧杯置于磁力搅拌器上,温度设置为90℃,待搅拌20min后,再往烧杯中加入30％(v/v)的氨水，搅拌1h后，关闭搅拌，将温度调至100℃，静置2h后，取出烧杯，将烧杯内混合物加入蒸馏水用抽滤机抽滤洗涤，直至中性。然后放入恒温干燥箱中干燥2h，温度设置为105℃，冷却、研磨和过筛。
[0073]
(3)修复过程
[0074]
按照液固比1.2(ml/g土壤)准备菌液，于6000rpm离心10min，弃去培养基成分，加水制成菌悬液；
[0075]
取污染土壤50g，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg，按质量比2％加入磁性硅藻土材料，加入菌液，搅拌30分钟，然后置于室温条件下(25℃)，培养4周。让细菌诱导生物锰氧化物和土壤中的抗生素发生氧化分解反应，达到土壤抗生素污染修复的目的。表3为实施例3中抗生素的修复效果。
[0076]
表3实施例3中抗生素的修复效率
[0077][0078]
由表3数据可知，本实施例抗生素含量由未修复的2.5392mg/l降至0.7988mg/l，修复效率为68.54％。
[0079]
从上述3个实施例可以看出：通过本发明所述方法可达到修复砷和抗生素复合污染土壤的效果，本方法选取敏捷食酸菌whw-1，将该菌在富集培养基中富集培养；然后将该菌株与含有二价锰、碳源等一同加入到复合污染土壤中，搅拌均匀，让微生物诱导产生生物锰氧化物，这些生物锰氧化物和土壤中的三价砷和抗生素发生一系列的物理-化学反应，将土壤中水溶性的砷转化为稳定态，降低土壤中砷的生物有效性，从而达到砷修复的目的；细菌和生物锰氧化物通过代谢、氧化分解等方式将抗生素转化为二氧化碳和水。同时本发明所制备的磁性材料也可达到对污染物的吸附功能，处理成本低，无二次污染。
[0080]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。