血清作为在体外肝微粒体代谢体系中溶解卤代有机污染物试剂的用途

1.本发明具体涉及血清作为在体外肝微粒体代谢体系中溶解卤代有机污染物试剂的用途。


背景技术：

2.现有技术中，通过体外动物肝微粒体代谢卤代有机污染物是研究其在动物体内代谢转化机制的重要手段。现时体外肝微粒体代谢卤代有机污染物的方法包括以下步骤：1.采用有机溶剂溶解底物（卤代有机污染物）形成底物溶液，所述的有机溶剂是乙腈、甲醇或二甲基亚砜（dmso）等；2.在反应体系中加入底物溶液、磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体，并将反应体系置于适宜温度的水浴锅中预孵化5 min后，加入nadph酶再生体系，反应开始计时；3.加入冰冷的有机溶剂终止反应，涡旋，离心，浓缩，上机检测底物及其代谢产物的含量。在上述方法中，由于肝微粒体离体代谢的反应体系属于水溶性体系，而卤代有机污染物属于脂溶性化合物，因此，有机溶剂的作用是将卤代有机污染物溶解在反应体系中，换言之，将卤代有机污染物溶于有机溶剂是实现其体外肝微粒体有效代谢的必要条件。然而，所述的有机溶剂对代谢酶具有毒性，会抑制代谢酶的活性；所以，在现有技术中，通常将有机溶剂的加入体积控制在最终反应体系体积的1%以下。而且，肝微粒体中富含多种代谢酶，不同代谢酶对有机溶剂的耐受程度不同，故在有机溶剂溶解底物的反应体系中，对有机溶剂较为敏感的酶的活性优先受到抑制，因此，有机溶剂溶解底物的反应体系并不能完全反映底物在动物体内的代谢情况。
3.本发明人曾在授权专利cn113533556b中，针对氯化石蜡底物，提出一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，具体为将氯化石蜡溶于有机溶剂后向其中加入血清，然后进行肝微粒体代谢反应。该方法以有机溶剂溶解底物，并利用血清作为底物和代谢酶反应的载体，提高了氯化石蜡的代谢清除率。但是，在该反应体系中有机溶剂的存在势必会抑制代谢酶的活性，而且基于反应体系属于水溶性体系、卤代有机污染物属于脂溶性化合物、血清是水溶性物质的原因，为了反应的顺利进行，有机溶剂在该反应体系中是必须的。
4.此外，在体外代谢转化机理研究中，利用酶促动力学能够更准确地锁定主要代谢产物，从而揭示主要代谢转化途径。在酶促动力学研究中，反应体系中的底物则需要设置不同浓度（浓度差约数十倍）进行研究。但是，由于底物溶液中的有机溶剂会影响酶的活性，因此为了更好的反映出不同浓度底物的代谢情况，反应体系中需加入相同体积的底物溶液，这就需要配置不同浓度的底物溶液，导致操作繁琐。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供血清作为在体外肝微粒体代谢体系中溶解卤代有机污染物试剂的用途，解决现有技术中有机溶剂抑制代谢酶活性的问题，使体外肝微粒体代谢卤代有机污染物的反应能更加真实地模拟出肝微粒体在体内的代谢转化情况，更能真实地
反映出卤代有机污染物在动物体内的代谢特征。
6.本发明的目的之二是提供一种体外肝微粒体代谢卤代有机污染物的方法。
7.为实现上述第一发明目的，本发明采用以下方案：血清作为在体外肝微粒体代谢体系中溶解卤代有机污染物试剂的用途。
8.所述的血清为鸡血清、胎牛血清或猪血清。
9.本发明利用血清替代有机溶剂来溶解卤代有机污染物，是基于血清的复杂成分中有少量的弱极性成分；本发明即利用血清中的弱极性成分与脂溶性卤代有机污染物的“相似相溶”原理，使得卤代有机污染物溶解于血清。同时，血清也易溶于水溶性体系，且血清对代谢酶无毒，因此，血清成为体外肝微粒体代谢体系中溶解脂溶性卤代有机污染物的理想试剂。
10.为实现上述第二发明目的，本发明采用以下方案：一种体外肝微粒体代谢卤代有机污染物的方法，其特征是，包括血清与卤代有机污染物进行超声溶解的步骤。
11.所述方法具体包括以下步骤：先取卤代有机污染物的标准溶液氮吹至干，加入血清，进行超声溶解，涡旋混匀，得到底物溶液，然后进行肝微粒体代谢反应及检测。
12.在上述方法中，卤代有机污染物溶解于血清的过程必须采用超声处理，其原因是：由于血清中弱极性成分含量相对较低，且血清的粘性较大，故需采用超声溶解的方式使脂溶性的卤代有机污染物完全溶解于血清中。
13.在更具体的实施例中，如图1所示，所述方法包括以下步骤：（1）将卤代有机污染物的标准溶液氮吹至干，加入血清，然后进行超声溶解，涡旋混匀，得到底物溶液；（2）冰浴条件下，向底物溶液先后加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体和nadph酶再生体系，摇匀后得到最终反应体系，然后置于水浴中振荡反应；（3）将步骤（2）的最终反应体系置于冰浴中迅速冷却，并加入有机溶剂终止反应，静置后进行离心，取上层清液，测定卤代有机污染物及其代谢产物的含量。
14.在步骤（3）中终止后的反应体系，必须静置一段时间后，再离心；其原理：乙腈使反应体系的酶蛋白和血清蛋白变性后，需静置一段时间，使得变性的蛋白质沉淀，然后再离心，才可以得到澄清的上清液，否则离心后仍然是浑浊的溶液，导致无法上机。
15.而且，相比于现有技术，本发明以血清替代有机溶剂作为卤代有机污染物的溶剂，因此反应体系中不存在有机溶剂，使得肝微粒体中酶的活性更高，使得代谢产物的生成量更大，因此，反应体系在离心后无需浓缩也能检测到代谢产物。取离心后的上清液直接上机检测，无需溶剂的浓缩步骤，也能检测到代谢产物。
16.在本发明的优选实施例中：所述血清的含量为最终反应体系体积的0.1%~50%，更优选为0.1%~10%。
17.所述最终反应体系中卤代有机污染物的浓度为0.1~5.0 μg/ml。
18.所述最终反应体系的总体积为0.3~1.0 ml。
19.在步骤（1）中，所述超声的时间为5~20min。
20.在步骤（2）中，所述反应的时间为5~240min。
21.在步骤（2）中，所述肝微粒体为鸡肝微粒体，水浴温度为40℃。
22.在步骤（3）中，所述静置的时间为10~60min。
23.在步骤（3）中，所述离心的操作为在10000 rpm的转速下离心3 min。
24.在步骤（3）中采用超高效液相色谱-电喷雾离子源-高分辨质谱仪（uplc-esi-hrms）测定卤代有机污染物及其代谢产物的含量。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：相比于含有机溶剂（乙腈、甲醇、dmso等）的底物体系，本发明采用动物血清作为溶解卤代有机污染物的试剂，使得反应体系中对代谢酶有毒的有机溶剂的含量为零，避免有机溶剂对代谢酶活性的抑制，进而使得肝微粒体保持与动物体内类似的活性，从而更加真实地模拟出肝微粒体在体内的代谢转化情况，更能真实、确切地反映出底物在动物体内的代谢特征。
26.本发明中血清作为溶解底物的试剂，它加入量可以高达反应体系的50%，最优的是0.1%~10%，且血清对代谢产物的生成量几乎没有影响。所以，在酶促动力学实验中，在设置不同浓度底物的反应体系时，只需配置一种浓度的底物溶液，在不同反应体系中加入不同体积的底物溶液即可，即简化了操作步骤。
27.本发明为卤代有机污染物的肝微粒体离体代谢转化产物的研究提供一种有效的方法，同时也对其他脂溶性化合物的肝微粒体离体代谢转化产物的研究提供重要的方法借鉴。
28.此外，由于本发明中酶保持最高活性，使得生成代谢产物的量较大，代谢反应结束后的溶液不需要浓缩，只需简单的离心即可上机分析代谢产物，操作更简洁，更适合于大批量操作。
附图说明
29.图1为本发明进行体外肝微粒体代谢卤代有机污染物的步骤流程图。
30.图2为实施例3中单羟基代谢产物的峰面积与底物反应浓度的关系图。
具体实施方式
31.以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
32.以下实施例中采用的nadph酶再生体系为市售产品，包括solution a和solution b。
33.实施例1鸡肝微粒体离体代谢中链氯化石蜡（mccps）：血清底物体系与有机溶剂底物体系的对比实验（1）血清底物体系：取200 μl 的mccps标准溶液（100 μg/ml，异辛烷）置于1.5 ml玻璃进样瓶，用温和的氮气将有机溶剂氮吹至干后，然后加入200 μl胎牛血清，超声20 min（超声频率为40khz），涡旋，得到血清溶解的底物溶液；乙腈底物体系：取200 μl 的mccps标准溶液（100 μg/ml，异辛烷）置于1.5 ml玻璃进样瓶，用温和的氮气将异辛烷氮吹至干后，然后加入200 μl乙腈，涡旋，得到乙腈溶解的
底物溶液；（2）在冰浴条件下，取两支1.5 ml一次性离心管， 分别加入5 μl上述两种的底物溶液，然后均依次加入455 μl磷酸钾缓冲溶液（ph 7.4）、12.5 μl鸡肝微粒体、25 μl solution a和5 ul solution b，摇匀，迅速置于40℃水浴振荡反应240 min；（3）将反应的离心管迅速置于冰浴中，加入500 μl乙腈终止反应，室温静置20 min，离心（10000 rpm，3 min），取600 μl上清液至进样瓶中，用于uplc-hrms测定代谢产物的种类及含量。
34.结果显示，胎牛血清底物体系和乙腈底物体系的主要代谢产物均是单羟基代谢产物；但胎牛血清底物体系能观察到少量的二羟基代谢产物，而乙腈底物体系中观察不到该代谢产物。
35.由此判断，这可能是由于反应体系中乙腈的存在抑制了生成二羟基代谢产物的酶的活性，从而导致该代谢产物没有生成或生成量太少而无法检测；这说明了本发明采用血清代替有机溶剂制备底物体系，能够更真实、确切反映出在动物体内卤代有机污染物的代谢特征。
36.实施例2鸡肝微粒体离体代谢三氯生：血清底物体系与有机溶剂底物体系的对比实验（1）血清底物体系：取10 μl 的三氯生标准溶液（100 μg/ml，甲醇）置于1.5 ml玻璃进样瓶，用温和的氮气将有机溶剂氮吹至干后，然后加入100 μl猪血清，超声5 min，涡旋，得到血清溶解的底物溶液；甲醇底物体系：取三氯生标准溶液（100 μg/ml，甲醇）作为甲醇溶解的底物溶液；（2）在冰浴条件下，取两支1.5 ml一次性离心管，分别加入5 μl上述两种的底物溶液，然后依次加入455μl磷酸钾缓冲溶液（ph 7.4）、12.5 μl鸡肝微粒体、25 μl solution a、5 ul solution b，摇匀，迅速置于40℃水浴振荡反应30 min；（3）将反应的离心管迅速置于冰浴中，加入300 μl乙腈终止反应，室温静置30 min，离心（10000 rpm，3 min），取600 μl上清液至进样瓶中，用于uplc-hrms测定代谢产物的含量；结果显示，血清溶解底物体系和甲醇溶解底物体系的主要代谢产物均为单羟基代谢产物，但血清底物体系的单羟基代谢产物的生成率（43.0%）显著高于甲醇底物体系（6.4%）。
37.实施例3鸡肝微粒体离体代谢mccps：血清底物体系与有机溶剂-血清底物体系的对比实验（1）血清底物体系：取200 μl 的mccps标准溶液（100 μg/ml，异辛烷）置于1.5 ml玻璃进样瓶，用温和的氮气将有机溶剂氮吹至干后，然后加入200 μl鸡血清，超声20 min（超声频率为40khz），涡旋，得到血清溶解的底物溶液；取1μl的底物溶液于1.5ml一次性离心管底部，得到血清底物体系；乙腈-血清底物体系：取1 μl的mccps-乙腈溶液置于1.5ml一次性离心管底部，加入1 μl鸡血清，轻微涡旋，4℃下静置平衡12h，得到乙腈-血清底物体系；（2）在冰浴条件下，分别向上述两种底物体系中依次加入955 μl磷酸钾缓冲溶液（ph 7.4）、12.5 μl鸡肝微粒体、25 μl solution a和5 ul solution b，摇匀，迅速置于40
℃水浴振荡反应60 min；（3）将反应的离心管迅速置于冰浴中，加入500 μl乙腈终止反应，室温静置30 min，离心（10000 rpm，3 min），取600 μl上清液至进样瓶中，用于uplc-hrms测定代谢产物及其含量。
38.结果显示，血清底物体系和乙腈-血清底物体系均可生成单羟基代谢产物和二羟基代谢产物；但两种体系中两种代谢产物的生成率不同。其中，单羟基代谢产物的生成率：血清底物体系（12.7%）》乙腈-血清底物体系（8.7%）；二羟基代谢产物的生成率：血清底物体系（0.7%）》乙腈-血清底物体系（0.5%）。因此，上述结果说明了血清底物体系更能反映出卤代有机污染物在动物体内代谢的真实情况。
39.实施例4鸡肝微粒体离体代谢1,2,5,6,9,10,13,14-八氯十四烷（c
14h22
cl8）的酶促动力学实验（1）取200 μl 的1,2,5,6,9,10,13,14-八氯十四烷标准溶液（100 μg/ml，异辛烷）置于1.5 ml玻璃进样瓶，用温和的氮气将有机溶剂氮吹至干后，然后加入500 μl胎牛血清，超声5 min（超声频率为40khz），涡旋，得到底物溶液；（2）取多支1.5 ml一次性离心管，在冰浴条件下，分别加入不同体积（2.5、5、12.5、25、50μl）的底物溶液（所对应的最终反应体系中底物反应浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/ml），然后依次加入磷酸钾缓冲溶液（ph 7.4，体积范围为440~457μl）、12.5 μl鸡肝微粒体、25 μl solution a和5 ul solution b，摇匀，迅速置于40℃水浴振荡反应10 min；（3）将反应的离心管迅速置于冰浴中，加入500 μl乙腈终止反应，室温静置10 min，离心（10000 rpm，3 min），取600 μl上清液至进样瓶中，用于uplc-hrms测定代谢产物的含量。
40.结果显示，所有样品均检测到单羟基化产物，而且单羟基化代谢产物的峰面积与底物反应浓度的关系如图2所示，这与本领域已知的规律一致。本实施例的结果说明本发明以血清作为溶解卤代有机污染物的试剂对体外肝微粒体代谢反应没有明显影响，在设置不同浓度底物的反应体系时，只需配置一种浓度的底物溶液。
41.实施例5鸡肝微粒体离体代谢1,2,5,6,9,10-六氯十烷（c
10h16
cl6）：溶解底物时，未超声与超声的对比实验（1）分别取1,2,5,6,9,10-六氯十烷标准溶液（100 μg/ml，异辛烷）15 μl于两个1.5 ml一次性离心管中，用温和的氮气将有机溶剂氮吹至干后，分别加入150 μl猪血清，其中一个离心管涡旋，得到对照组的底物溶液；另一个离心管超声5min（超声频率为40khz），涡旋，得到试验组的底物溶液；（2）在冰浴条件下，上述两种底物溶液中依次加入110 μl磷酸钾缓冲溶液（ph 7.4）、12.5 μl鸡肝微粒体、25 μl solution a、5 ul solution b，摇匀，迅速置于40℃水浴振荡反应5 min；（3）将反应的离心管迅速置于冰浴中，加入500 μl乙腈终止反应，室温静置60 min，离心（10000 rpm，5 min），取600 μl上清液至进样瓶中，用于uplc-hrms测定试验组和对照组反应体系中底物的含量；
结果显示，经过超声处理的试验组反应体系中，底物的代谢清除率为90%，而对照组的反应体系中底物的代谢清除率只有26%，即试验组的代谢清除率显著高于对照组。推测这可能是由于血清中脂溶性成分含量较低，仅采用常规的涡旋溶解，底物与血清不能充分溶解，因而使肝微粒体不能有效对底物进行代谢，从而导致代谢效率低。由此判断，采用超声步骤是血清作为在体外肝微粒体代谢体系中溶解卤代有机污染物试剂的必要步骤。
42.需要指出的是，上述实施例是对本发明的说明而不是限制，本发明方案不仅能适用于上述实施例提出的氯化石蜡、1,2,5,6,9,10,13,14-八氯十四烷、1,2,5,6,9,10-六氯十烷、三氯生，还可以是其他卤代有污染机物，例如六溴环十二烷、多溴联苯醚等。
43.本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。