抗溶瘤病毒抗原抗体及其使用方法

抗溶瘤病毒抗原抗体及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月13日提交的美国临时专利申请号62/900,303的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。


背景技术：

3.免疫疗法已成为对抗多种恶性肿瘤的有效治疗选项。溶瘤病毒(oncolytic virus,ov)可以经工程化以在肿瘤组织中选择性复制和裂解肿瘤组织，与此同时保留正常的非肿瘤宿主细胞并同时恢复抗肿瘤免疫性，构成了用于治疗肿瘤的下一代免疫治疗方法。ov在不依赖特定抗原表达模式的情况下靶向恶性肿瘤的独特能力使其成为其他免疫治疗方法的有吸引力的替代方案。此外，ov可以促进肿瘤浸润淋巴细胞(til)的募集，重编程免疫抑制性肿瘤微环境(tme)，并增强全身抗肿瘤免疫。
4.遗传工程化已经使活复制病毒的设计能够不仅通过细胞进入和转录靶向而为高度肿瘤选择性的，而且还配备了报告基因以用于非侵入性监测病毒疗法的药代动力学并用于增强细胞毒活性或免疫原性细胞死亡、或免疫调节剂。目前有三种ov可商购获得以用于治疗癌症。这些包括在拉脱维亚、格鲁吉亚和亚美尼亚被批准的rigvir；在中国被批准的oncorine h101；和在美国被批准的talimogene laherparepvec(t-vec)。rigvir(riga病毒)是一种未经修饰的肠道致细胞病变人孤儿7型(echo-7)小核糖核酸病毒，已发表了关于该病毒的有限数据来描述其功效。oncorine成为中国首个被批准临床使用的溶瘤病毒，也是世界上首个获得监管部门批准的重组溶瘤病毒。它是一种减毒血清5型腺病毒载体，其缺失了病毒e1b-55k并且具有病毒e3中的四个缺失。oncorine仍然是唯一被批准用于癌症治疗的腺病毒，并且仅在与化疗联合给予时用于癌症治疗。t-vec(imlygic
tm
)于2015年获美国食品和药物管理局(fda)批准用于治疗不可切除的转移性黑素瘤，后来在欧盟被批准用于局部晚期或转移性皮肤黑素瘤，使其成为获得国家监管部门的批准并且是首个在美国获得批准的最新溶瘤病毒。t-vec是一种重组人单纯疱疹病毒1型(hsv1)，其缺失了hsv1γ34.5和病毒icp47的两个拷贝，这可加速us11的表达；并且其编码处于巨细胞病毒(cmv)启动子控制下的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的2个拷贝。t-vec目前被批准用于肿瘤内注射到皮肤高级别黑素瘤病变中，并对该适应症表现出单药功效。
5.处于临床开发中的ov包括麻疹病毒、新城疫病毒(ndv)、弹状病毒、腺病毒、牛痘病毒(vv)、疱疹病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒和逆转录病毒。
6.麻疹病毒是一种负链rna副粘病毒，其是高度融合性的并且诱导合胞体形成的广泛致细胞病变效应。细胞间融合增加了对肿瘤细胞的旁观者杀伤，并诱导免疫原性危险信号，该免疫原性危险信号可引发宿主介导的细胞抗肿瘤活性。编码碘化钠同向转运体(mv-nis)或可溶性癌胚抗原(mv-cea)的重组埃德蒙斯顿毒株麻疹病毒正在患有复发或反复发作的癌症(包括多发性骨髓瘤、卵巢癌、神经胶质瘤、乳腺癌和间皮瘤)的患者中进行i/ii期临床试验。
7.ndv是一种禽类副粘病毒，并且已作为溶瘤性或溶瘤物癌症疫苗进行了测试。ndv
毒株mth-68/h、huj和pv701已经进行了临床测试。一种基于中等毒力(mesogenic)的ndv-73t毒株的重组ndv正处于临床前测试中，该重组ndv对禽类细胞而非哺乳动物细胞的感染受损，并且编码gm-csf(medimmune，medi5395)。
8.弹状病毒是反义rna病毒，其在受纳细胞中具有快速、约12小时的裂解复制周期。进行了最佳研究的溶瘤弹状病毒水疱性口炎病毒(vsv)使用低密度脂蛋白(ldl)受体来进行细胞进入，从而使vsv可以感染几乎所有细胞类型并在多种受纳细胞中引起裂解感染。
9.腺病毒是无包膜的二十面体双链dna病毒，具有从每个衣壳顶点突出的长纤维纽结。已公布了telomelysin用于实体瘤、cg0070用于膀胱癌、dnx-2401用于恶性脑瘤的临床数据。
10.牛痘病毒(vv)是一种大型包膜双链dna病毒，其线性基因组长度为约190kb。这些病毒的减毒或肿瘤特异性靶向已经使用各种缺失和插入突变完成，其中胸苷激酶功能的丧失是临床溶瘤性牛痘病毒的共同特性。jx-594的病毒胸苷激酶缺失，tg6002的胸苷激酶和病毒核糖核苷酸还原酶双缺失，并且gl-onc1在其胸苷激酶(j2r)、血凝素ha(a56r)和f14.5l基因中具有插入突变。tk功能丧失限制了病毒在非分裂细胞中复制的能力，而病毒核糖核苷酸还原酶的缺失进一步限制了这种能力。两种旨在增强溶瘤功效的临床牛痘载体包括被设计用于提高肿瘤细胞杀伤力的转基因：jx-594，其与t-vec一样，包含gm-csf；而tg6002包含核苷类似物转化酶fcu1，该核苷类似物转化酶fcu1可将感染细胞中的5-氟胞嘧啶(5-fc)转化成5-fu。
11.hsv1是一种长约152kb的大型双链dna病毒。经临床评估的γ34.5缺陷型病毒包括现在fda批准的t-vec、hsv1716(seprehvir)、g207和rp1。提高hsv在转移性疾病中的抗癌效应的尝试涉及纳入用于同时提高抗癌免疫和抗病毒免疫的治疗性转基因，目的是在受治疗的患者中发展出适应性抗肿瘤反应。
12.柯萨奇病毒是被包裹在二十面体衣壳中的约7.4kb的单链正rna小核糖核酸病毒。溶瘤性cva21(viralytics,cavatak)源自kuykendall毒株，并且使用icam-1作为细胞进入的主要受体。肿瘤内cva21病毒注射联合派姆单抗或易普利姆玛单抗的i期测试正在进行中，以提高这些药物的整体功效。
13.呼肠孤病毒是一种双链rna病毒，无包膜，并且具有由外蛋白壳和内蛋白壳组成的二十面体衣壳。在几个i期试验(oncolytics biotech，reolysin
tm
)中研究了将作为单一疗法的呼肠孤病毒作为肿瘤内或静脉内施用。
14.逆转录病毒复制载体(tocagen、toca-511、vocimagene amiretrorepvec)编码酵母胞嘧啶脱氨酶(cd)，该cd将前药5-fc转化为抗癌药物5-fu，从而提高5-fu在肿瘤中的局部浓度并降低药物的总体全身毒性。toca-511在患有反复发作的高级别神经胶质瘤的患者中的1期试验导致总生存期为13.6个月，并且相对于外部对照在统计学上有所改善。
15.尽管最近在基于ov的疗法方面取得了进展，但仍然需要用于治疗、减轻和/或预防癌症的新的和改进的基于ov的方法以及改善癌症受试者存活率的方法。


技术实现要素：

16.提供了特异性结合牛痘病毒(vv或vacv)a56或b5抗原的抗体。还提供了包含所述抗体的融合蛋白和缀合物。还提供了包含所述抗体、融合蛋白和缀合物的药物组合物和试
剂盒。本公开的各方面进一步包括使用所述抗体、融合蛋白和缀合物，例如用于治疗目的的方法。在某些实施方案中，提供了方法，所述方法包括向患有癌症的个体施用本公开的抗体、融合蛋白或缀合物，其中所述个体包含感染了vv的癌细胞，并且其中所述抗体、融合蛋白或缀合物靶向至在被感染的癌细胞的表面上表达的vv抗原感染的癌细胞。本公开的各方面进一步包括将特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的抗体、融合蛋白或缀合物靶向个体中的癌细胞的方法。
附图说明
17.图1示出了抗体与被vv western reserve vvdd(egfp)感染的a549和caov3细胞的结合的流式细胞术数据。
18.图2示出了抗体与表达a56或b5的hek细胞(wyeth vv序列)结合的流式细胞术数据。
19.图3示出了抗体与hek-b5细胞结合的数据。绘制了在流式细胞术测定(顶部小图)或elisa(底部小图)中测试的与hek-b5结合的最高浓度的曲线图，用于兔和鼠同种型对照(分别为rb igg同种型和migg同种型)的为5μg/ml，并且抗b5 immunetech抗体it抗b5 igg(在图3中标识为抗b5 migg)以1:1000用于兔多克隆抗体(c-vv)。
20.图4示出了通过流式细胞术测量的a048抗体、immunetech抗b5抗体、it抗b5 igg(在图4中标识为it抗b5 migg)和人同种型对照如何与被vv western reserve vvdd(egfp)感染的a549细胞(顶部小图)和ht29细胞(底部小图)结合。
21.图5示出了抗体与被vv感染的细胞的结合。通过流式细胞术测试了抗体与被vvdd(egfp)感染的a549细胞的结合。所有形式都具有相似的ec50，并且未观察到与未感染细胞的结合。
22.图6示出了通过免疫荧光测得的抗体a049与被病毒感染的肿瘤组织的结合，特别是a049抗a56 higg1与被病毒感染的结直肠肿瘤组织的结合。顶部2个小图是苏木精和伊红(h&e)染色的。将这与显示出对未感染组织的某种非特异性染色的多克隆抗牛痘病毒抗体进行比较。
23.图7提供了表位分箱数据，该表位分箱数据显示了生物素化抗体与用非生物素化抗体预孵育的被vvdd(egfp)感染的细胞的结合。降低的生物素化抗体结合表明与测试抗体相似或重叠的表位。抗体a047和a049似乎结合a56上的不同表位。抗体a048和a051似乎结合b5上的不同表位。
24.图8示出了抗体与病毒粒子结合的数据。将病毒粒子(vvdd(egfp))包被在板上并与抗体或阳性对照nkp30一起孵育。除抗体a054外，所有抗体均与病毒结合。
25.图9提供了显示病毒感染中和的数据。在vvdd(egfp)感染的同时将抗体添加到a549细胞中。观察到与没有抗体的感染(
‘
无抗体’)相似的感染水平。
26.图10示出了抗体与被vvcopenhagen(yfp)感染的鼠细胞系的结合。每个被感染的细胞系中的yfp表达百分比表示被vvcopenhagen(yfp)感染的细胞的比例。抗a56-pe和抗b5-pe抗体结合被vvcopenhagen(yfp)感染的b16f10、ct26lacz和mc38细胞。
27.图11示出了抗体与在hek细胞表面表达的a56或b5抗原或被vvcopenhagen病毒感染的u20s细胞的特异性结合的免疫组织化学数据。特异于a56或b5的兔/鼠嵌合(抗体a059
和a058)和全兔igg形式(抗体a056和a073)抗体能够分别特异性地检测稳定表达的hek-a56和hek-b5细胞上的靶抗原。抗a56抗体和抗b5抗体都能够检测被vvcopenhagen感染的u2os细胞上的蛋白质表达。
28.图12示出了通过免疫组织化学从经vv处理的肿瘤中检测a56和b5。数据显示在经牛痘病毒处理的肿瘤的表面上检测到了a56和b5蛋白。
29.图13小图a：抗vv嵌合抗原受体(car)构建体的示例性设计的代表性示意图。小图b：根据本公开的实施方案的治疗方法的示意图。如图所示，ov感染癌细胞，随后在癌细胞的表面上展示ov抗原(在该示例中为a56或b5 ov抗原，它们在一些实施方案中可以是ov的天然a56或b5抗原)。用包含特异于所展示的ov抗原的car的car t细胞处理被感染的癌细胞导致了对被感染的癌细胞的破坏。由被破坏的癌细胞释放的ov感染的邻近癌细胞可继而被包含特异于所展示的ov抗原的car的car t细胞破坏。
30.图14提供了流式细胞术数据，示出了在慢病毒转导后的vv car检测。数据描述了经转导的jurkat细胞上的vv-car表达。指示特异性靶结合的car下调在所有测试的vv-car构建体中都很明显。
31.图15示出了活化的a56-car-06阳性jurkat细胞上的car和egfp表达。数据描述了a56-car-06和egfp在转导的jurkat细胞系上的共表达。在使用靶hek a56系进行培养后，可以通过门控egfp阳性群体来在scfv阴性级分中鉴定出被激活的car群体(cd69阳性)。
32.图16提供了数据，所述数据显示当与靶hek细胞系共培养时，表达vv-car的jurkat细胞的特异性激活。所有测试的vv-car都表现出对由cd69上调所指示的靶激活的特异性。当vv-car系与阴性/不相关的靶细胞系共培养时，发生了最小的交叉反应性/内源性激活。
33.图17示出了原代健康供体t细胞的a56-car-06表达的转导和富集。数据描述了根据标准临床制造方案，a56-car-06在原代人t细胞上的稳定表达。通过对car表达进行细胞分选，然后重复临床扩增，建立了经富集的a56-car-06群体。
34.图18示出了当与进行表达的靶hek-a56细胞系共培养时表达a56-car-06的人t细胞的特异性激活。在与靶hek-a56系共培养后，表达a56-car-06的原代人t细胞显示出cd69和cd137的显著上调。使用阴性/不相关的靶细胞系时观察到的交叉反应性最小。
35.图19提供了数据，所述数据表明在与靶hek-a56细胞共培养后48小时，表达a56-car-06的原代人t细胞表现出直接杀伤肿瘤的形态学迹象。
36.图20提供了数据，所述数据表明表达b5-car-011的人t细胞显示出高百分比的特异性细胞毒性。如通过相对发光单位(rlu)的降低百分比所确定的，表达b5-car-011的原代人t细胞在24小时处表现出特异性细胞裂解。
37.图21示出了
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zr-dfo-a049(抗a56抗体，dfo：去铁胺)在注射后1天、3天和5天对同一小鼠的代表性最大强度投影正电子放射断层造影术(pet)图像。肿瘤类型：hek-a56(表达a56，在左肩上)和亲代hek(不表达，在右肩上)，以及由箭头指示的脾脏和肝脏，。结果显示为每克组织所注射的剂量的百分比(％id/g)。示出了清晰的临床前a56阳性肿瘤pet成像，具有
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zr-dfo-a049在阳性肿瘤中有效和特异性积累，以及预期的放射免疫缀合物药代动力学。
具体实施方式
38.在更详细地描述本公开的抗体、组合物和方法之前，应理解抗体、组合物和方法不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以对其进行改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不旨在限制，因为抗体、组合物和方法的范围仅受所附权利要求的限制。
39.在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一和所述范围内的任何其它所述或中间值均涵盖在抗体、组合物和方法中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，，经受所述范围内的任何特别排除的极限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限之一或两者的范围也包括在抗体、组合物和方法中。
40.本文给出的某些范围的数值前面有术语“约”。术语“约”在本文中用于提供对其之前的确切数字以及接近或近似该术语之前的数字的文字支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供该具体列举的数字的实质等同物的数字。
41.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与抗体、组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述那些相似或等同的抗体、组合物和方法也可用于抗体、组合物和方法的实践或测试，但现在描述代表性的示例性抗体、组合物和方法。
42.在本说明书中引用的所有公开和专利通过引用并入本文，如同每个单独的公开或专利被具体和单独地指示通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的公开有关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本抗体、组合物和方法无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
43.应注意，如本文中和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。还应注意，可以将权利要求撰写成排除任何任选要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的诸如“单独”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的在先基础。
44.应理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的抗体、组合物和方法的某些特征也可以以组合形式提供在单个实施方案中。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的抗体、组合物和方法的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。本发明具体包含实施方案的所有组合，并在本文中公开，如同单独且明确地公开了每个组合一样，只要这些组合包含可操作的过程和/或组合物。另外，描述这种变量的实施方案中列出的所有子组合也由本抗体、组合物和方法具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个这种子组合在本文中单独和明确地公开。
45.当阅读了本公开，对本领域技术人员显而易见，本文描述和阐释的每个单个实施方案具有分开的组分和特征，其可以容易与任何其它数个实施方案的特征分开或结合，而不背离本发明的精神或范围。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。
46.抗体
47.本公开提供特异性结合牛痘病毒(vv或vacv)抗原的抗体。牛痘病毒是痘病毒家族的成员，其特征在于约192kb的双链dna基因组，该基因组编码许多使病毒能够独立于宿主细胞机制进行复制的病毒酶和因子。vv可以稳定地容纳多达25kb的经克隆的外源性dna。在结构上，其由核心区组成，该核心区由病毒dna和各种病毒酶组成，所述各种病毒酶包括被包裹在脂蛋白核心膜中的rna聚合酶和polya聚合酶。病毒的外层由双层脂质膜包膜组成。vv具有许多固有特性，所述固有特性使vv具有适用于溶瘤病毒疗法的属性，诸如对肿瘤的天然嗜性、强裂解能力、短生命周期以及快速的细胞间传播、高效的基因表达和大克隆能力。vv具有发生在细胞质中的约8小时的短生命周期，从而消除了基因组整合的风险。复制通常在感染后约2小时开始，此时宿主细胞核酸合成停止并且细胞资源被朝向病毒复制引导。细胞裂解发生在12小时与48小时之间，从而释放经包装的病毒粒子。vv不依赖于宿主的mrna转录机制，从而使其不易受宿主细胞的生物学变化的影响。与其他溶瘤病毒(ov)不同，vv不需要特定的表面受体即可进入细胞，从而使其可以感染广泛范围的细胞。
48.术语“抗体”(也可与“免疫球蛋白”可互换使用)涵盖多克隆(例如，兔多克隆)和单克隆抗体制备物，其中所述抗体可以是任何同种型的抗体或免疫球蛋白(例如，igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)、ige、igd、iga、igm等)，全抗体(例如，由四聚体构成的抗体，所述四聚体继而由重链和轻链多肽的两个二聚体构成)；单链抗体(例如，scfv)；抗体片段(例如，全链或单链抗体的片段)，其保留与化合物的特异性结合，包括但不限于单链fv(scfv)、fab、(fab')2、(scfv')2和双体抗体；嵌合抗体；单克隆抗体、人源化抗体、人抗体；和融合蛋白，其包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白。在一些实施方案中，抗体选自igg、fv、单链抗体、scfv、fab、f(ab')2、和f(ab')。抗体可以进一步与其它部分缀合，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。
49.免疫球蛋白多肽包括其他物种中的κ和λ轻链和α、γ(igg1、igg2、igg3、igg4)、δ、ε和μ重链或等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(通常为约25kda或约214个氨基酸)包含在nh2末端处的约110个氨基酸的可变区，以及在cooh末端处的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约150kda或约446个氨基酸)类似地包含可变区(约116个氨基酸)和上述重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。
50.免疫球蛋白轻链或重链可变区(分别为v
l
和vh)由被三个高变区(也称为“互补决定区”或“cdr”)中断的“构架”区(fr)构成。已经定义了构架区和cdr的范围(参见，e.kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第4版，u.s.dept.health and human services,public health services,bethesda,md(1987)；和lefranc等人，imgt,the international immunogenetics information.nucl.acids res.,2005,33,d593-d597))。不同轻链或重链的构架区的序列在一个物种内相对保守。抗体的构架区，即组成轻链和重链的组合构架区，用于定位和比对cdr。cdr主要负责结合抗原的表位。除非另有说明，否则由本公开提供的所有cdr和构架均根据kabat，出处同上定义。
51.因此，“抗体”涵盖具有一种或多种多肽的蛋白质，所述一种或多种多肽可以是可遗传编码的，例如通过免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这进而分别限定免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。在一些实施方案中，本公开的抗体是igg抗体，例如igg1抗体，诸如人igg1抗体。在一些实施方案
中，本公开的抗体包含人fc结构域。
52.已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50-70kd)。每条链的n末端限定了约100个到110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(v
l
)和可变重链(vh)分别是指这些轻链和重链。
53.抗体涵盖完整的免疫球蛋白以及许多特征明确的片段，所述片段可以遗传编码或通过用各种肽酶消化产生。因此例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键下方的抗体以产生f(ab)'2，f(ab)'2是fab的二聚体，fab本身是通过二硫键与vh-chi接合的轻链。f(ab)'2可以在温和的条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将(fab')2二聚体转化为fab'单体。fab'单体本质上是具有铰链区的部分的fab(关于其他抗体片段的更详细描述，请参见fundamental immunology,w.e.paul编辑，raven press,n.y.(1993))。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员应理解，可以化学地或通过利用重组dna方法从头合成此类fab'片段。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过对完整抗体进行修饰而产生的或使用重组dna方法从头合成的抗体片段，包括但不限于fab'2、igg、igm、iga、scfv、dab、纳米抗体、单体抗体和双体抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体选自igg、fv、单链抗体、scfv、fab、f(ab')2和fab'。
54.根据一些实施方案，本公开的抗体是单克隆抗体。“单克隆抗体”是指一种组合物，所述组合物包含一种或多种获自基本上同质的抗体群体(即，除了可能以少量存在的任何天然存在的突变外，个体抗体相同的群体)的抗体。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点，并且通常针对抗原上的单个表位。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是获自基本上同质的抗体群体，并且不要求该抗体是通过任何特定方法产生的或者是组合物中的唯一抗体。
55.在某些实施方案中，本公开的抗体是人源化抗体。如本文所用，人源化抗体是来源于非人(例如，兔、啮齿动物等)抗体并已被修饰以含有人抗体的构架和/或恒定区的至少一部分的重组多肽。人源化抗体还涵盖嵌合抗体和cdr移植抗体，在所述抗体中不同区域可能来源于不同物种。嵌合抗体可以是这样的抗体，所述抗体包含与人恒定区(例如人fc结构域)连接的来自任何来源的可变区。因此，在嵌合抗体中，可变区可以是非人的，而恒定区是人的。cdr移植抗体是这样的抗体，所述抗体包含与来自人“受体”抗体的构架区连接的来自非人“供体”抗体的cdr。例如，scfv形式的本公开的抗体可以连接至人恒定区(例如，fc结构域)以制成人免疫球蛋白。
56.一般而言，与相同抗体的非人源化版本相比，人源化抗体在人宿主中产生降低的免疫应答。可以使用多种技术使抗体人源化，包括例如cdr移植、表面改构(veneering)或表面重修、链改组等。在某些实施方案中，通过对cdr和构架残基的相互作用建模来鉴定构架取代，以鉴定对于抗原结合和用于鉴定特定位置处的不寻常构架残基的序列比较而言重要的构架残基。
57.因此，本文所述的抗体中的任何抗体都可以使用可用的方法进行人源化。将兔或小鼠cdr取代到人可变结构域构架中可导致保留它们正确空间取向，其中例如人可变结构域构架采用与cdr起源于的兔或小鼠可变构架相同或相似的构象。这可以通过从人抗体中获得人可变结构域来实现，该人抗体的构架序列表现出与cdr所来源于的兔或小鼠可变构
approach to antibody humanization.methods 36,35-42(2005)；lo,b.k.antibody humanization by cdr grafting.methods mol.biol.248,135-59(2004)；和lefranc,m.-p.p.、ehrenmann,f.、ginestoux,c.、giudicelli,v.&duroux,p.use ofdatabases and tools for antibody engineering and humanization.methods mol.biol.907,3-37(2012)中描述的那些方法；上述文献的公开内容出于所有目的整体以引用方式并入本文。
61.本公开的抗体特异性结合vv a56或vv b5抗原。如果抗体以比所述抗体与(例如，样品中的)其他物质结合更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合靶标，则所述抗体“特异性结合”或“优先结合”所述靶标。在某些实施方案中，如果抗体以例如大于或等于约104m-1
的亲和力或ka(即，以1/m为单位的特定结合相互作用的缔合速率常数)结合或缔合抗原，则所述抗体“特异性结合”所述抗原。替代地，亲和力可以定义为以m为单位(例如，10-5
m至10-13
m，或更小)进行的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)。在某些方面中，特异性结合是指抗体与抗原结合的kd小于或等于约10-5
m、小于或等于约10-6
m、小于或等于约10-7
m、小于或等于约10-8
m，或小于或等于约10-9
m、10-10
m、10-11
m、或10-12
m或更小。抗体与抗原的结合亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，通过竞争性elisa(酶联免疫吸附测定)、平衡透析、通过使用表面等离子体共振(spr)技术(例如，biacore 2000或biacore t200仪器，使用制造商所概述的一般工序)；通过放射免疫测定；等。
62.可以使用本领域已知的竞争性结合测定容易地确定本公开的抗体是否与第二抗体“竞争”结合抗原。例如，可以通过抗体竞争测定来鉴定竞争抗体。例如，第一抗体的样品可以结合到固体载体上。然后，添加被怀疑能够与这种第一抗体竞争的第二抗体的样品。两种抗体中的一种抗体被标记。如果标记的抗体和未标记的抗体结合到抗原上分离的和离散的位点，则无论是否存在可疑的竞争抗体，标记的抗体都将结合到相同的水平。然而，如果相互作用的位点相同或重叠，则未标记的抗体就会竞争，那么与抗原结合的标记的抗体的量会降低。如果未标记的抗体过量存在，那么将结合很少标记的抗体(如果有的话)。
63.出于本公开的目的，竞争性抗体是将抗体与抗原的结合降低约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、或约99％或更多的抗体。进行这种竞争测定的工序的详情是已知的，并且可以例如在harlow和lane,antibodies,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,1988,567-569,1988,isbn 0-87969-314-2中找到。可以通过使用纯化的抗体对此类测定进行定量。可以通过针对自身滴定一种抗体来建立标准曲线，即相同的抗体同时用于标记和竞争者。可以滴定未标记的竞争抗体抑制标记抗体与板结合的能力。可以绘制结果，并且可以比较实现所需的结合抑制程度所需的浓度。
64.抗vv a56抗体
65.根据一些实施方案，提供了特异性结合vv a56抗原(vv a56)的抗体。虽然牛痘病毒a56蛋白最初被表征为血凝素蛋白，但是a56还具有其他功能。a56蛋白能够结合两种病毒蛋白，即丝氨酸蛋白酶抑制剂(k2)和牛痘病毒补体控制蛋白(vcp)，并将它们锚定到受感染细胞的表面。虽然这两种蛋白质都在细胞表面处具有生物学相关功能，但是它们都不能单独定位在细胞表面处。a56-k2复合物减少了重复感染受感染细胞的病毒的量，并且还防止受感染细胞形成合胞体。a56-vcp复合物可保护受感染的细胞免受补体攻击。a56r基因的缺
失导致了对牛痘病毒毒力的不同影响。由于编码a56蛋白的基因是非必需的，因此它可以用作外源基因的插入点，并且在一些在临床开发中作为溶瘤剂的病毒中已被缺失。
66.在某些实施方案中，本公开的抗体特异性结合vv a56并与具有抗vv a56抗体中的一种或多种抗vv a56抗体(在本文中被指定为a047/a057、a049/a059/a056、a050、和a054)的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个互补决定区(cdr)的抗体竞争结合vv a56。根据一些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv a56并且包含在本文中被指定为a047/a057、a049/a059/a056、a050或a054的抗vv a56抗体的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个cdr。a047/a057、a049/a059/a056、a050、和a054抗体的可变重链(vh)多肽、可变轻链(v
l
)多肽以及cdr的氨基酸序列在下表1中提供。除非另有说明，否则本公开全文所述的所有cdr和构架区均根据kabat定义。
67.表1
–
示例性抗vv a56抗体的氨基酸序列
68.69.70.[0071][0072]
在某些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv a56并与包含以下的抗体竞争结合vv a56：
[0073]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0074]vh cdr1，其包含氨基酸序列ssywic(seq id no:3)；
[0075]vh cdr2，其包含氨基酸序列ciyagsggstyyatwakg(seq id no:4)；以及v
h cdr3，其包含氨基酸序列aysdrsggysfnl(seq id no:5)，和
[0076]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0077]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqsvdnnnyla(seq id no:6)；
[0078]vl cdr2，其包含氨基酸序列sasslas(seq id no:7)；和
[0079]vl cdr3，其包含氨基酸序列lgsydcsdadcya (seq id no:8)；
[0080]
在某些实施方案中，此类抗体包含在seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8中列出的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:1所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:2所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0081]
根据一些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv a56并与包含以下的抗体竞争结合vv a56：
[0082]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0083]vh cdr1，其包含氨基酸序列diyyis(seq id no:11)；
[0084]vh cdr2，其包含氨基酸序列ctyagssgstyyatwakg(seq id no:12)；和
[0085]vh cdr3，其包含氨基酸序列drypgtsgrvygmdl(seq id no:13)；和
[0086]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0087]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqsisdlls(seq id no:14)；
[0088]vl cdr2，其包含氨基酸序列sastlas(seq id no:15)；和
[0089]vl cdr3，其包含氨基酸序列qcnyysptygng(seq id no:16)。
[0090]
在某些实施方案中，此类抗体包含seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15和seq id no:16所示的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:9所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:10所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。在某些实施方案中，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:9所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:62所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:9所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:63所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0091]
在某些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv a56并与包含以下的抗体竞争结合vv a56：
[0092]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0093]vh cdr1，其包含氨基酸序列ssywlc(seq id no:19)；
[0094]vh cdr2，其包含氨基酸序列ciyngdgsthyaswakg(seq id no:20)；和
[0095]vh cdr3，其包含氨基酸序列dytynfytygfnl(seq id no:21)；和
[0096]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0097]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqsvniwas(seq id no:22)；
[0098]vl cdr2，其包含氨基酸序列kastlas(seq id no:23)；和
[0099]vl cdr3，其包含氨基酸序列qggypssssgwa(seq id no:24)。
[0100]
在某些实施方案中，此类抗体包含seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23和seq id no:24所示的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:17所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:18所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0101]
根据一些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv a56并与包含以下的抗体竞争结
合vv a56：
[0102]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0103]vh cdr1，其包含氨基酸序列ssywic(seq id no:27)；
[0104]vh cdr2，其包含氨基酸序列ctyngdgsthyaswakg(seq id no:28)；和
[0105]vh cdr3，其包含氨基酸序列dytdafytygfnl(seq id no:29)；和
[0106]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0107]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqstssyla(seq id no:30)；
[0108]vl cdr2，其包含氨基酸序列rasslas(seq id no:31)；和
[0109]vl cdr3，其包含氨基酸序列qtgfygssght(seq id no:32)。
[0110]
在某些实施方案中，此类抗体包含seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31和seq id no:32所示的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:25所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:26所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0111]
用于确定本公开的抗vv a56抗体是否与第二抗体“竞争”结合vv a56抗原的合适vv a56抗原包括具有下表2中所示的氨基酸序列的wyeth、western reserve和copenhagen a56抗原。
[0112]
表2-wyeth、western reserve和copenhagen vv的a56抗原序列
[0113][0114]
抗vv b5抗体
[0115]
根据一些实施方案，提供了特异性结合vv b5抗原(vv b5)的抗体。vv b5蛋白是一种42kda的i型跨膜糖蛋白，其胞外结构域由补体控制蛋白特有的四个短共有重复序列(scr)组成。在scr之后，b5具有在跨膜结构域之前的茎区，以及短细胞质尾(ct)。scr和ct对于将b5靶向至细胞外包膜病毒(eev)膜来说都是非必要的，尽管后者会影响b5至细胞表面的转运和经由内体的再循环。b5是细胞内成熟病毒(imv)包裹形成细胞内包膜病毒(iev)所必需的。
[0116]
在某些实施方案中，本公开的抗体特异性结合vv b5并与具有抗vv b5抗体中的一种或多种抗vv b5抗体(在本文中被指定为a048/a058/a073和a051)的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个互补决定区(cdr)的抗体竞争结合vv b5。根据一些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv b5并且包含在本文中被指定为a048/a058/a073或a051的抗vv b5抗体的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个cdr。a048/a058/a073和a051抗体的可变重链(vh)多肽、可变轻链(v
l
)多肽以及cdr的氨基酸序列在下表3中提供。
[0117]
表3-示例性抗vv b5抗体的氨基酸序列
[0118]
[0119][0120]
在某些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv b5并与包含以下的抗体竞争结合vv b5：
[0121]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0122]vh cdr1，其包含氨基酸序列ssyymc(seq id no:35)；
[0123]vh cdr2，其包含氨基酸序列ciytssgsayyanwakg(seq id no:36)；和
[0124]vh cdr3，其包含氨基酸序列navgssyylyl(seq id no:37)；和
[0125]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0126]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqsvagnnyls(seq id no:38)；
[0127]vl cdr2，其包含氨基酸序列svstlas(seq id no:39)；和
[0128]vl cdr3，其包含氨基酸序列qgyyndgiwa(seq id no:40)。
[0129]
在某些实施方案中，此类抗体包含seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39和seq id no:40所示的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:33所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:34所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0130]
根据一些实施方案，本公开的抗体特异性结合vv b5并与包含以下的抗体竞争结合vv b5：
[0131]
可变重链(vh)多肽，其包含
[0132]vh cdr1，其包含氨基酸序列sywmc(seq id no:43)；
[0133]vh cdr2，其包含氨基酸序列ciyggssgstyysnwakg(seq id no:44)；和
[0134]vh cdr3，其包含氨基酸序列dgstwdyfrl(seq id no:45)；和
[0135]
可变轻链(v
l
)多肽，其包含
[0136]vl cdr1，其包含氨基酸序列qasqsintnyls(seq id no:46)；
[0137]vl cdr2，其包含氨基酸序列qastles(seq id no:47)；和
[0138]vl cdr3，其包含氨基酸序列qgyytvenignp(seq id no:48)。
[0139]
在某些实施方案中，此类抗体包含seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47和seq id no:48所示的六个cdr。根据一些实施方案，所述抗体包含：可变重链(vh)多肽，其包含与seq id no:41所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；可变轻链(v
l
)多肽，其包含与seq id no:42所示的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；或两者。
[0140]
用于确定本公开的抗vv b5抗体是否与第二抗体“竞争”结合vv b5抗原的合适vv b5抗原包括具有下表4中所示的氨基酸序列的wyeth、western reserve和copenhagen b5抗原。
[0141]
表4-wyeth、western reserve和copenhagen vv的b5抗原序列
[0142][0143]
[0144]
双特异性抗体
[0145]
还提供了双特异性抗体。在某些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含本公开的抗vv a56抗体和抗vv b5抗体中的任何抗体(包括上述此类抗体中的任何抗体)的vh多肽-v
l
多肽对。双特异性抗体可包括第二抗原结合域，该第二抗原结合域特异性结合由第一抗原结合域结合的vv抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域特异性结合除由第一抗原结合结构域结合的vv抗原以外的vv抗原。
[0146]
根据一些实施方案，本公开的双特异性抗体包含特异性结合除vv抗原以外的抗原的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，除vv抗原以外的抗原是免疫细胞表面抗原。免疫细胞表面抗原的非限制性示例是免疫效应细胞表面抗原，例如t细胞表面抗原、自然杀伤(nk)细胞表面抗原、巨噬细胞表面抗原等。可由第二抗原结合结构域结合的t细胞表面抗原的示例包括但不限于t细胞刺激分子，例如cd3、cd28等。
[0147]
本公开的双特异性抗体包括具有全长抗体结构的抗体和双特异性抗体片段。如本文所用的“全长”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(hc)由众所周知的重链可变结构域和恒定结构域vh、ch1、ch2和ch3组成。全长抗体轻链(lc)由众所周知的轻链可变结构域和恒定结构域vl和cl组成。全长抗体可在一条或两条重链中缺少c末端赖氨酸。术语“fab臂”是指一个特异性结合抗原的重链:轻链对。
[0148]
全长双特异性抗体可以例如使用以下方式产生：通过在每个半分子中的重链ch3界面处引入取代以有利于具有不同特异性的两个抗体半分子体外在无细胞环境中或使用共表达形成异二聚体，以在两个单特异性二价抗体之间进行fab臂交换(或半分子交换)。fab臂交换反应是ch3结构域的二硫键异构化反应和解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的ch3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。fab臂的ch3结构域可以设计成相比于同二聚化有利于异二聚化。所得产物是具有两个fab臂或半分子的双特异性抗体，每个分子结合不同的表位。
[0149]“臼中杵(knob-in-hole)”策略(参见例如，wo 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，可以在影响ch3结构域相互作用的位置突变形成人igg中chs结构域界面的选定氨基酸，以促进异二聚体形成。具有小侧链(臼)的氨基酸被引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，具有大侧链(杵)的氨基酸被引入特异性结合第二抗原的抗体的重链。两种抗体共表达后，由于带有“臼”的重链与带有“杵”的重链优先相互作用而形成异二聚体。形成杵和臼的示例性ch3取代对是(表示为第一重链的第一ch3结构域中的修饰位置/第二重链的第二ch3结构域中的修饰位置)：t366y7f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t3945/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s和t366w/t366s_l368a_y407v。
[0150]
可以使用其他策略，例如通过在一个ch3表面取代带正电荷的残基和在第二个ch3表面取代带负电荷的残基，使用静电相互作用促进重链异二聚化，如us2010/0015133；us2009/0182127；us2010/028637或us2011/0123532中所述。在其他策略中，异二聚化可以通过以下取代(表示为第一重链的第一ch3结构域中的修饰位置/第二重链的第二ch3结构域中的修饰位置)促进：l351 y_f405a_y407v t394w、t366i_k392m_t394w/f405a_y407v、t366l_k392m_t394w/f405a_y407v、l351 y_y407a't366a_k409f、l351y_y407a/t366v_
k409f、y407a/t366a_k409f、或t350v_l351y_f405a_y407v/t350v_t366l_k392l_t394w，如在us2012/0149876或us2013/0195849中所述。
[0151]
还提供了单链双特异性抗体。在一些实施方案中，本公开的单链双特异性抗体是双特异性scfv。关于双特异性scfv的细节可以在例如zhou等人(2017)j cancer 8(18):3689-3696中找到。
[0152]
可用于从本文所述的抗体产生多特异性(例如，双特异性)抗体的方法包括但不限于ellerman,d.(2019)."bispecific t-cell engagers:towards understanding variables influencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacy and safety."methods 154:102-117；brinkmann,u.和r.e.kontermann(2017)."the making of bispecific antibodies."mabs 9(2):182-212；和suurs,f.v.等人，(2019)."a review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges."pharmacol ther 201:103-119；这些文献的公开内容出于所有目的而整体以引用方式并入本文。
[0153]
融合蛋白
[0154]
还提供了融合蛋白。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白包含与异源氨基酸序列融合的本公开的抗vv a56抗体或抗vv b5抗体中的任何抗体的链。异源氨基酸序列可以与抗体链的c末端或抗体链的n末端融合。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白包含抗体链的c末端的异源序列和抗体链的n末端的异源序列，其中异源序列可以是相同的序列或不同的序列。在核酸或多肽的上下文中使用的“异源”通常是指该核酸或多肽来自与该核酸或多肽所缔合或连接的来源不同的来源(例如，不同序列的分子、不同物种来源等)，使得该核酸或多肽是自然界中未发现的核酸或多肽。例如，在融合蛋白中，轻链多肽和报告多肽(例如，gfp、红色荧光蛋白(例如，mcherry)、萤光素酶等)被称为与彼此“异源”。类似地，来自小鼠抗体的cdr和来自人抗体的恒定区与彼此“异源”。
[0155]
抗vv a56抗体或抗vv b5抗体的链可以融合至任何感兴趣的异源序列。感兴趣的异源序列包括但不限于白蛋白、转铁蛋白、xten、同型氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物、弹性蛋白样肽，或它们的任何组合。在某些方面中，与不融合至异源序列的相同抗体相比，异源多肽在所述抗体施用于有需要的个体时增加了所述抗体的稳定性和/或血清半衰期。
[0156]
在某些实施方案中，本公开的融合蛋白包含单链抗体，例如包含本公开的抗vv a56抗体和抗vv b5抗体中的任何抗体(包括上文所述的此类抗体中的任何抗体)的vh多肽-v
l
多肽对的单链抗体(例如，scfv)。本公开的scfv包括但不限于包含下表5中列出的scfv的六个cdr的scfv，在一些实施方案中，该scfv包含：可变重链(vh)多肽，其包含与表5中列出的scfv的vh的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列；以及可变轻链(v
l
)多肽，其包含与表5中列出的scfv的v
l
的氨基酸序列具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大，或100％同一性的氨基酸序列。在表5中，多肽的区段/结构域由交替下划线表示，并且区段/结构域的身份在左栏中提供。
[0157]
表5-示例性scfv氨基酸序列
[0158]
[0159][0160]
根据一些实施方案，当融合蛋白包含单链抗体(例如，本公开的单链抗体中的任何单链抗体，包括本文所述的scfv中的任何scfv)时，融合蛋白是嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体包含单链抗体、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
[0161]
本公开的car可在各种结构域之间包括一个或多个接头序列。“可变区连接序列”是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列将重链可变区连接至轻链可变区并提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔功能，以使所得多肽保持对与包含相同的轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。可变区连接序列的非限制性示例是丝氨酸-甘氨酸接头，诸如包含氨基酸序列ggggsggggsggggs(g4s)3(seq id no:49)的丝氨酸-甘氨酸接头。在某些方面中，接头分隔一个或多个重链或轻链可变结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或一级信号传导结构域。在特定实施方案中，car包括一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方案中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或任何中介长度的氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25
个或更多个氨基酸。
[0162]
在一些实施方案中，car的抗原结合结构域之后是一个或多个间隔结构域，该间隔结构域将抗原结合结构域移动远离效应细胞表面(例如，表达car的t细胞的表面)，以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和/或活化。间隔结构域(和本文所述的任何其他间隔结构域、接头和/或类似物)可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔区可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一个实施方案中，间隔结构域包括igg1、igg4或igd的ch2和/或ch3。适合于在本文所述的car中使用的示例性间隔结构域包括源自1型膜蛋白(诸如cd8α和cd4)的胞外区的铰链区，所述铰链区可以是来自这些分子或其变体的野生型铰链区。在某些方面中，铰链结构域包括cd8α铰链区。在一些实施方案中，铰链是pd-1铰链或cd152铰链。
[0163]“跨膜结构域”(tm结构域)是融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并将car锚定到细胞(例如免疫效应细胞)的质膜的car部分。tm结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。在一些实施方案中，tm结构域源自t细胞受体、cd35、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154或pd-1的α或β链(例如，至少包含其跨膜区或功能部分)。
[0164]
在一个实施方案中，car包括源自cd8α的tm结构域。在某些方面中，car包括源自cd8α的tm结构域和短的寡核苷酸或多肽接头，例如长度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间的短的寡核苷酸或多肽接头，所述接头连接car的tm结构域和细胞内信号传导结构域。例如，甘氨酸-丝氨酸接头可以用作此类接头。
[0165]
car的“细胞内信号传导”结构域是指参与将来自car与靶分子/抗原结合的信号转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能的car部分，所述效应细胞功能为例如激活、细胞因子产生、增殖和/或细胞毒活性，包括将细胞毒因子释放到结合car的靶细胞，或由靶分子/抗原与细胞外car结构域结合引发的其他细胞反应。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指这样的蛋白质部分，该蛋白质部分转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短的部分代替全长细胞内信号传导结构域，只要它转导效应功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意味着包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。
[0166]
仅通过t细胞受体(tcr)产生的信号不足以完全激活t细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，t细胞活化由两类不同的细胞内信号传导结构域介导：通过tcr(例如，tcr/cd3复合物)启动抗原依赖性初级激活的一级信号结构域；和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。因此，本公开的car可包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“一级信号传导结构域”。
[0167]
一级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的一级信号传导结构域可能包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(或“itam”)的信号传导基序。适用于本公开的car的含有itam的一级信号传导结构域的非限制性示例包括来源于fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79α、cd79β和cd66δ的那些。在某些实施方案中，car包括cd3ζ一级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结
构域。细胞内一级信号传导和共刺激信号传导结构域可操作地连接至跨膜结构域的羧基末端。
[0168]
在一些实施方案中，car包含一个或多个共刺激信号传导结构域以增强表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子或其活性片段的细胞内信号传导结构域。适用于在特定实施方案中考虑的car的示例性共刺激分子包括tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、kd2c、slp76、trim和zap70。在一些实施方案中，car包含一个或多个选自由以下组成的组的共刺激信号传导结构域：4-1bb(cd137)、cd28和cd134；以及cd3ζ一级信号传导结构域。
[0169]
本公开的car可包含任何种类的合适结构域，包括但不限于前导序列；铰链、间隔区和/或接头结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；信号传导结构域(例如，cd3ζ结构域)；核糖体跳跃元件；限制酶序列；报告蛋白结构域；和/或类似物。可包含在本公开的car中的此类结构域的非限制性示例包括下表6中提供的那些。如本领域普通技术人员将理解的，表6中所示的结构域中的一个或多个结构域(例如，接头、铰链、跨膜、共刺激、信号传导、核糖体跳跃元件；限制酶序列；报告蛋白等)的氨基酸序列可以根据需要(例如，为了改进car的功能性等)进行修饰。
[0170]
表6-示例性car结构域的氨基酸序列
[0171]
[0172]
[0173][0174]
在某些方面中，本公开的car包含：与感兴趣的抗原(例如，vv a56抗原或vv b5抗原)结合的单链抗体(例如，本公开的scfv中的任何scfv)；来自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：cd4、cd8α、cd154和pd-1；一个或多个来自选自由以下组成的组的多肽的细胞内共刺激信号传导结构域：4-1bb(cd137)、cd28和cd134；以及来自选自由以下组成的组的多肽的细胞内信号传导结构域：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79α、cd79β和cd66δ。此类car可进一步包含在抗原结合部分与跨膜结构域(例如cd8α铰链)之间的间隔结构域。
[0175]
根据一些实施方案，提供了car，其从n末端到c末端包含本文所述的抗体的可变重链(vh)多肽、接头、所述抗体的可变轻链(v
l
)、cd8铰链区(其在一些实施方案中是延伸的cd8铰链区)、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。根据某些实施方案，提供了car，其从n末端到c末端包含本文所述抗体的可变轻链(v
l
)多肽、接头、所述抗体的
可变重链(vh)、cd8铰链区(其在一些实施方案中是延伸的cd8铰链区)、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。根据一些实施方案，提供了car，其从n末端到c末端包含本文所述的抗体的可变重链(vh)多肽、接头、所述抗体的可变轻链(v
l
)、cd28铰链区、cd28跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。根据一些实施方案，提供了car，其从n末端到c末端包含本文所述的抗体的可变轻链(v
l
)多肽、接头、所述抗体的可变重链(vh)、cd28铰链区、cd28跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。本公开的car中的任何car可包含在vh多肽的n末端的结构域。例如，前导序列(例如，gm-csfr前导序列)可以存在于本公开的car的n末端处。
[0176]
本公开的示例性抗a56 car的氨基酸序列提供于以下表7和表8中，其中表7中的car的氨基酸序列包括n末端前导序列的氨基酸序列(在此，n末端gm-csfr前导序列)，并且表8中car的氨基酸序列不包括所述前导序列的氨基酸序列。任何期望的前导序列(例如，gm-csfr前导序列)可以存在于此类car的n末端处。如本领域普通技术人员将理解的，表7和表8中所示的结构域中的一个或多个结构域(例如，接头、铰链、跨膜、共刺激、信号传导等)的氨基酸序列可以是根据需要进行修改，例如以改进car的功能性等。在表7和表8中，多肽的区段/结构域由交替下划线表示，并且区段/结构域的身份在左栏中提供。
[0177]
表7
–
car序列(包括前导序列)
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183][0184][0185]
表8
–
car序列(不包括前导序列的氨基酸序列)
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191][0192]
本公开的car可根据需要包含一个或多个附加结构域。此类附加结构域的非限制性示例包括核糖体跳跃元件、酶促结构域(例如，具有核酸酶活性(例如，限制性内切核酸酶活性)的结构域)、使得能够检测car的结构域(例如，报告蛋白结构域(例如，荧光蛋白(例如，egfp、mcherry等)、发光蛋白等))等。例如，在某些实施方案中，提供了包含核糖体跳跃元件、限制性内切酶结构域和/或报告蛋白结构域的car。下表9中提供了具有这些特征中的一个或多个特征的本公开的示例性抗a56 car的氨基酸序列。如本领域普通技术人员将理解的，表9中所示的结构域中的一个或多个结构域(例如，接头、铰链、跨膜、共刺激、信号传导、限制性酶、报告蛋白等)的氨基酸序列可以是根据需要进行修改，例如以改进car的功能性、检测等。在表9中，car部分以粗体显示，并且多肽的区段/结构域通过交替下划线指示。区段/结构域的标识在左栏中提供。
[0193]
表9
–
car序列(包括前导序列和核糖体跳跃元件、限制性酶和/或报告蛋白)
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202][0203]
在某些实施方案中，提供了包含一个或多个鼠car结构域的car。可被包括在本公开的car中的鼠car结构域的非限制性示例包括下表10中提供的鼠car结构域中的一种或多种鼠car结构域。如本领域普通技术人员将理解的，表10中所示的结构域中的一个或多个结构域(例如，前导序列、接头、铰链、跨膜、共刺激、信号传导、核糖体跳跃元件；限制酶序列；报告蛋白等)的氨基酸序列可以根据需要进行修饰。
[0204]
表10
–
鼠car结构域的氨基酸序列
[0205]
[0206][0207]
根据一些实施方案，提供了包含一个或多个鼠car结构域(例如，上表10中列出的任何结构域中的一个或多个结构域)的鼠car。本公开的鼠car的非限制性示例包括下表11中提供的那些。如本领域普通技术人员将理解的，表11中所示的结构域中的一个或多个结构域(例如，前导序列、vh、接头、v
l
、铰链、跨膜、共刺激、信号传导、核糖体跳跃元件等)的氨基酸序列可以根据需要进行修饰。在表11中，car部分以粗体显示。多肽的区段/结构域由交替下划线表示，并且区段/结构域的身份在左栏中提供。
[0208]
表11
–
鼠car的氨基酸序列
[0209]
[0210][0211][0212]
根据一些实施方案，本公开的car由单个多肽提供。在某些实施方案中，本公开的
car由两个或更多个多肽提供。当car由两个或更多个多肽提供时，car可以以任何有用的多多肽形式提供，所述多多肽形式包括通用car形式，例如生物素结合免疫受体(bbir)形式(参见例如，urbanska k,powell dj.development of a novel universal immune receptor for antigen targeting to infinity and beyond.oncoimmunology.2012；1(5):777-779.doi:10.4161/onci.19730；和urbanska k,lanitis e,poussin m等人，a universal strategy for adoptive immunotherapy of cancer through use of a novel t cell antigen receptor.2013；72(7):1844-1852.doi:10.1158/0008-5472.can-11-3890.a)；具有肽新表位(pne)的可切换car形式(参见例如，kim等人，(2015)j am chem soc.2015；137(8):2832-2835；ma等人，(2016)proc natl acad sci 113(4):e450-8；rodgers等人，(2016)proc natl acad sci.113(4):e459-e468；viaud等人，(2018)proc natl acad sci 115(46):e10898-e10906)；带亮氨酸拉链的supra car形式(参见例如，cho等人，(2108)cell 173(6):1426-1438.e11)；含有fitc-叶酸的基于car-t衔接分子(cam)的形式(参见例如，lee等人，(2019)cancer res.79(2):387-396；和lu等人，(2019)front oncol.9:151)；抗fitc-叶酸衔接子形式(参见例如，chu等人，(2018)biosci trends.12(3):298-308)；抗fitc抗体衔接子car形式(参见例如，tamada等人(2012)clin cancer res.18(23):6436-6445)；靶向fc的(例如抗cd16的)car 抗肿瘤抗体形式(参见例如，kudo等人(2014)cancer res.74(1):93-103)；等等。
[0213]
缀合物
[0214]
本公开还提供了缀合物。根据一些实施方案，本公开的缀合物包含本公开的抗体或融合蛋白中的任何抗体或融合蛋白，以及与所述抗体或融合蛋白缀合的试剂。术语“缀合的”通常是指化学键，共价或非共价的，通常是共价的，其将一个感兴趣的分子与第二个感兴趣的分子紧密结合。在某些实施方案中，与抗体或融合蛋白缀合的试剂选自化疗剂、毒素、辐射增敏剂、放射性同位素(例如，治疗性放射性同位素)、可检测标记和半衰期延伸部分。
[0215]
根据一些实施方案，所述试剂是治疗剂，例如化疗剂。感兴趣的治疗剂包括能够通过缀合物的抗体部分与抗原的特异性结合而影响缀合物结合的细胞/组织的功能的试剂。当细胞/组织的功能是病理性的时，可以采用降低所述细胞/组织的功能的试剂。在某些方面中，本公开的缀合物包含通过抑制细胞增殖和/或杀死细胞/组织来降低靶细胞/组织功能的试剂。这种试剂可以变化，并且包含细胞抑制剂和细胞毒性剂，例如，能够杀死靶细胞组织，内化到或未内化到靶细胞中的试剂。
[0216]
在某些方面中，治疗剂是细胞毒性剂，其选自烯二炔、lexitropsin、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、尾海兔素、美登木素生物碱和长春花生物碱。在一些实施方案中，细胞毒性剂是紫杉醇、多西紫杉醇、cc-1065、cpt-11(sn-38)、拓扑替康、多柔比星、吗啉代-多柔比星、根瘤毒素、氰基吗啉代-多柔比星、多拉菌素-10、棘霉素、考布他汀、加利车霉素、美登素、美登素dm1、美登素dm4、dm-1、瑞奥西汀或其它海兔毒素衍生物，如瑞奥西汀e或瑞奥西汀f、aeb(aeb-071)、aevb(5-苯甲酰基戊酸-ae酯)、aefp(抗体-内皮抑素融合蛋白)、mmae(单甲基尿嘧啶e)、mmaf(单甲基尿嘧啶f)、吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)、五加素、纺锤菌素或其任何组合。
[0217]
根据一些实施方案，所述试剂是毒素，诸如选自半海盘灵(hemiasterlin)和半海
盘灵类似物诸如hti-286的蛋白质毒素(例如，参见uspn 7,579,323；wo 2004/026293；和uspn 8,129,407，这些专利的全部公开内容以引用方式并入本文)、相思豆毒素(abrin)、番木鳖碱(brucine)、毒芹素、白喉毒素、蟾毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇(falcarinol)、伏马菌素b1、伏马菌素b2、黄曲霉毒素、毛毒素、蝎毒素(agitoxin)、卡律蝎毒素(charybdotoxin)、玛格毒素、斯罗毒素(slotoxin)、希拉毒素(scyllatoxin)、赫福毒素(hefutoxin)、钙西汀、太卡毒素、钙阻蛋白(calcicludine)、格尔德霉素、多花白树毒蛋白(gelonin)、百脉根苷(lotaustralin)、赭曲霉毒素a、棒曲霉素、蓖麻毒素、马钱子碱(strychnine)、单端孢霉烯、玉米赤霉烯酮和河豚毒素。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白a链、相思子毒素a链、蒴莲素a链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜苦参碱抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。
[0218]
在某些实施方案中，所述试剂是辐射增敏剂。如本文所用，“辐射增敏剂”是增强辐射杀死肿瘤细胞的能力的试剂。可与抗体或融合蛋白缀合的辐射增敏剂的非限制性示例包括顺铂、5-氟尿嘧啶(5-fu)、azd7762、司美替尼等。
[0219]
在某些实施方案中，试剂是放射性同位素，例如，可用于疗法和/或检测(例如，成像)。可与抗体或融合蛋白缀合的放射性同位素的非限制性示例包括但不限于
225
ac、
111
ag、
114
ag、
71
as、
72
as、
77
as、
211
at、
198
au、
199
au、
212
bi、
213
bi、
75
br、
76
br、
11
c,
13
c、
55
co、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
165
dy、
166
dy、
169
er、
18
f、
19
f、
52
fe、
59
fe、
66
ga、
67
ga、
68
ga、
72
ga、
154-158
gd、
157
gd、
159
gd、
166
ho、
120
i、
121
i、
123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
110
in、
111
in、
113m
in、
194
ir、
81m
kr、
177
lu、
51
mn、
52
mn、
99
mo、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
32
p、
33
p、
211
pb、
212
pb、
109
pd、
149
pm、
151
pm、
142
pr、
143
pr、
191
pt、
193m
pt、
195m
pt、
223
ra、
142
rb、
186
re、
188
re、
189
re、
105
rh、
47
sc、
75
se、
153
sm、
117m
sn、
121
sn、
83
sr、
89
sr、
161
tb、
94
tc、
99
tc、
99m
tc、
227
th、
201
tl、
172
tm、
127
te、
90
y、
169
yb、
175
yb、
133
x和
89
zr。
[0220]
在某些实施方案中，放射性同位素通过螯合剂(例如，双功能螯合剂)与抗体或融合蛋白缀合。双功能螯合剂可含有以稳定的配位复合物结合放射性同位素的金属螯合部分和共价连接至靶向部分(例如本公开的任何抗体或融合蛋白)的反应性官能团，使得放射性同位素可以适当地针对所需的体内分子靶标。可用于将本公开的抗体或融合蛋白与放射性同位素缀合的双功能螯合剂的非限制性示例包括p-scn-bn-dota和p-scn-bn-去铁胺。可用于将本公开的抗体或融合蛋白与放射性同位素缀合的双功能螯合剂的其他示例包括在price&orvig(2014)chem.soc.rev.43:260；和brechbiel(2008)q j nucl med mol imaging 52(2):166-173中描述的那些。
[0221]
根据一些实施方案，放射性同位素是治疗性放射性同位素。在某些实施方案中，放射性同位素是发射α的放射性同位素，例如
225
ac、
211
at、
212
bi/
212
pb、
213
bi、
223
ra、或
227
th。在其他实施方案中，放射性同位素是发射β-的放射性同位素，例如
32
p、
33
p、
67
cu、
90
y、
131
i或
177
lu。
[0222]
根据一些实施方案，所述试剂是标记试剂。“标记试剂”(或“可检测的标记”)是指试剂可检测地标记抗体或融合蛋白，使得可以在感兴趣的应用(例如，体外和/或体内研究和/或临床应用)中检测所述抗体或融合蛋白。可检测的感兴趣的标记包括放射性同位素
(例如，γ或正电子发射体)、产生可检测产物的酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等)、荧光蛋白、顺磁性原子等。在某些方面中，抗体或融合蛋白与可检测标记的特异性结合配偶体缀合(例如，与生物素缀合，使得可通过包含亲和素/链霉亲和素的可检测标记进行检测)。
[0223]
根据某些实施方案，所述试剂是可用于体内成像的标记试剂，所述体内成像为诸如近红外(nir)光学成像、单光子发射计算机断层扫描(spect)
±
ct成像、正电子发射断层扫描(pet)
±
ct成像、核磁共振(nmr)光谱学等。可用于此类应用的标记试剂包括但不限于荧光标记、放射性同位素等。在某些方面，标记试剂是多模式体内成像剂，其允许使用两种或更多种成像方法进行体内成像(例如，参见thorp-greenwood和coogan(2011)dalton trans.40:6129-6143)。
[0224]
在某些实施方案中，标记试剂是可用于近红外(nir)成像应用的体内成像剂。此类试剂包括但不限于kodak x-sight染料、pz 247、dylight 750和800荧光染料、cy 5.5和7荧光染料、alexa荧光染料680和750染料、irdye 680和800cw荧光染料。根据一些实施方案，标记试剂是可用于spect成像应用的体内成像剂，其非限制性示例包括
99m
tc、
111
in、
123
i、
201
tl和
133
xe。在某些实施方案中，标记试剂是可用于pet成像应用的体内成像剂，例如
11
c、
13
n、
15
o、
18
f、
64
cu、
62
cu、
124
i、
76
br、
82
rb、
68
ga等。
[0225]
对于半衰期延长，本公开的抗体和融合蛋白可以与(例如，通过聚乙二醇化、高糖基化等)提供改善的药代动力学特征的试剂缀合。可以提高血清半衰期的修饰是令人感兴趣的。主题抗体或融合蛋白可以是“peg化的”，因为含有一个或多个聚(乙二醇)(peg)部分。适用于蛋白质peg化的方法和试剂是本领域公知的并且可以例如在美国专利号5,849,860中找到。适合与蛋白质缀合的peg在室温下通常可溶于水，并具有通式r(o-ch
2-ch2)no-r，其中r是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基团，并且其中n是1到1000的整数。当r是保护基团时，它通常具有1至8个碳。与主题抗体或融合蛋白缀合的peg可以是直链的。与主题抗体或融合蛋白缀合的peg也可以是支链的。支链peg衍生物，例如美国专利5,643,575中描述的那些，“星形peg”和多臂peg。星形peg在本领域中有描述，包括例如美国专利6,046,305。
[0226]
当要从来源分离主题抗体或融合蛋白时，所述抗体或融合蛋白可以缀合到一个或多个有助于纯化的部分，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)、凝集素和类似物。抗体还可以结合(例如，固定到)固体支撑物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠、磁珠、测试条、膜等。
[0227]
在要在测定中检测抗体或融合蛋白的情况下，抗体或融合蛋白可含有可检测标记，例如放射性同位素(例如，
89
zr；
111
in等)、产生可检测产物的酶(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光蛋白、显色蛋白、染料(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等)；发射荧光的金属，例如
152
eu或镧系的其他金属，其通过金属螯合基团(诸如edta)附接至蛋白质；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物，例如荧光素；荧光蛋白；等等。间接标记包括对主题蛋白特异的抗体，其中该抗体可通过二抗进行检测；和特异性结合对的成员，例如生物素-亲和素等。
[0228]
上述试剂中的任何试剂都可以通过接头与抗体或融合蛋白缀合。如果存在的话，则接头分子可以具有足够的长度以允许抗体或融合蛋白和连接的试剂来在所述抗体或融合蛋白和连接的试剂之间进行某种灵活移动。接头分子可以是例如约6-50个原子长。接头
分子还可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或它们的组合。
[0229]
当接头是肽时，接头可以具有任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，gly)到20个或更多个氨基酸、2个氨基酸到15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且长度可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
[0230]
柔性接头包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物可用于感兴趣的相对非结构化的氨基酸，并可用作组分之间的中性系链。普通技术人员将认识到，与上文描述的任何试剂缀合的抗体或融合蛋白的设计可包含完全或部分柔性的接头，使得所述接头可包含柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分。
[0231]
根据一些实施方案，抗体或融合蛋白通过不可切割的接头与试剂缀合。感兴趣的不可切割的接头包括但不限于硫醚接头。可以采用的硫醚接头的示例包括4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(smcc)接头。
[0232]
在某些实施方案中，抗体通过可切割的接头与试剂缀合。根据一些实施方案，该接头是化学不稳定接头，诸如在中性ph(血流ph 7.3-7.5)下稳定但在内化到弱酸性胞内体(ph 5.0-6.5)以及靶细胞(例如，癌细胞)的溶酶体(ph 4.5-5.0)中时发生水解的酸可裂解接头。化学不稳定接头包括但不限于腙基接头、肟基接头、碳酸酯基接头、酯基接头等。在某些实施方案中，该接头是酶不稳定接头，诸如这样一种酶不稳定接头，其在血流中是稳定的，但在内化到靶细胞中时进行酶切(例如，通过靶细胞(例如，癌细胞)的溶酶体中的溶酶体蛋白酶(诸如组织蛋白酶或纤溶酶))。酶不稳定接头包括但不限于包括肽键的接头，例如，二肽基接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头，诸如马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(mc-vc-pab)接头、缬氨酰-丙氨酰基-对氨基苄氧基(val-ala-pab)接头等。化学不稳定接头、酶不稳定的和不可切割的接头是已知的并且详细描述于例如ducry&stump(2010)bioconjugate chem.)21:5-13；nolting,b.(2013)methods mol biol.1045:71-100；tsuchikama和an(2018)protein&cell 9(1):33-46；以及其他地方。
[0233]
许多策略可用于将试剂直接或通过接头间接连接到抗体或融合蛋白。例如，可以通过将接头共价附接至试剂来衍生化该试剂，其中接头具有能够与抗体或融合蛋白上的“化学柄”反应的官能团。接头上的官能团可以变化，并且可以基于与抗体或融合蛋白上的化学柄的相容性来选择。根据一个实施方案，通过将具有化学柄的非天然氨基酸掺入抗体或融合蛋白中来提供抗体或融合蛋白上的化学柄。可以用于制备本公开的缀合物的非天然氨基酸包括具有选自以下中的官能团的那些：叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基-氧基、肼、醛(例如，甲酰甘氨酸，例如，来自康泰伦特药业(catalent pharma solutions)的smartag
tm
技术)、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物和硼酸官能团。可以被并入本公开的缀合物的抗体的非天然氨基酸(可以选择该非天然氨基酸以提供感兴趣的官能团)是已知的并且描述于例如maza等人(2015)bioconjug.chem.26(9):1884-9；patterson等人(2014)acs chem.biol.9:592-605；adumeau等人(2016)mol.imaging biol.(2):153-65；以及其他地方。非天然氨基酸可以通过化学合成或重组方法掺入抗体或融合蛋白，例如，使用合适的正交氨基酰基trna合成酶-trna对来在宿主细胞中的抗体或融合蛋白翻译期间掺入
非天然氨基酸。
[0234]
存在于抗体或融合蛋白中的非天然氨基酸的官能团可以是叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基氧基、肼、醛、asaldehyde、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物、硼酸、重氮、四嗪、四唑、四环烷、碘苯或其它合适的官能团，并选择接头上的官能团与非天然氨基酸的官能团反应(或反之亦然)。仅作为一个示例，可将带有叠氮基的非天然氨基酸(例如，5-叠氮基-l-正缬氨酸等)掺入抗体或融合蛋白，并且接头-试剂部分的接头部分可包括炔官能团，使得抗体或融合蛋白和接头-试剂部分通过叠氮化物-炔环加成共价缀合。可以使用例如铜催化的叠氮化物-炔环加成反应进行缀合。
[0235]
在某些实施方案中，抗体或融合蛋白上的化学柄不涉及非天然氨基酸。通过利用例如抗体或融合蛋白的亲核官能团(诸如赖氨酸的n末端胺或伯胺，或任何其它亲核氨基酸残基)作为在与带有反应性离去基团或其它亲电子基团的部分的取代反应中的亲核试剂，可以将不含非天然氨基酸的抗体与试剂缀合。一个示例会是制备带有n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯的试剂-接头部分，并使其在水性条件下在升高的ph(约10)下或在添加非亲核碱(例如n,n-二异丙基乙胺)的极性有机溶剂诸如dmso中与抗体或融合蛋白反应。
[0236]
应当理解的是，用于将接头、试剂和/或抗体或融合蛋白彼此附接的具体方法可以取决于具体接头、试剂/或抗体或融合蛋白和为将各种组分彼此缀合而选择和采用的官能团而变化。
[0237]
产生抗体的方法
[0238]
使用本文提供的信息，本公开的抗vv a56抗体和抗vv b5抗体可以使用本领域技术人员熟知的标准技术制备。例如，编码本公开的抗体或融合蛋白的氨基酸序列的核酸序列可用于表达所述抗体或融合蛋白。本文提供的多肽序列(参见例如，表1、表3、表5至表11)可用于确定编码抗体或融合蛋白的合适核酸序列，然后使用所述核酸序列来表达一种或多种对vv a56或vv b5具有特异性的抗体。根据本领域技术人员熟知的标准方法，可以优化核酸序列以反映各种表达系统的特定密码子“偏好”。使用提供的序列信息，可以根据本领域技术人员已知的多种标准方法合成核酸。
[0239]
一旦合成了编码主题抗体的核酸，就可以根据标准方法对其进行扩增和/或克隆。实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的。适用于构建重组核酸的多种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员已知的并且是许多教科书和实验室手册的主题。
[0240]
编码本公开的抗体和融合蛋白的天然或合成核酸的表达可以通过将编码抗体或融合蛋白的核酸可操作地连接至启动子(其是组成型的或诱导型的)并将构建体掺入表达载体中以产生重组表达载体来实现。载体可适用于原核生物、真核生物或两者中的复制和整合。典型的克隆载体包含功能上适当定向的转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节编码抗体的核酸的表达的启动子。载体任选地包含含有至少一个独立终止子序列的通用表达盒、允许所述盒在真核生物和原核生物中复制的序列，例如在穿梭载体中发现的，以及用于原核和真核系统二者的选择标记。
[0241]
为了获得克隆核酸的高水平表达，通常构建表达质粒，该质粒通常包含指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子，每个都功能取向于彼此和蛋白质编码序列。在大肠杆菌中适用于此目的的调控区的例子是大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵子区——噬菌体λ的左侧启动子(p
l
)和l-阿拉伯糖(arabad)操纵
子。在大肠杆菌中转化的dna载体中包含选择标记也是有用的。此类标记的示例包括指定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素抗性的基因。使用例如大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门氏菌，用于表达抗体的表达系统是可用的。也可以使用大肠杆菌系统。
[0242]
还可以将抗体基因亚克隆到允许在抗体(例如igg、fab、scfv等)的c-末端或n-末端添加标签(例如flag、六组氨酸等)的表达载体中以促进纯化。在哺乳动物细胞中转染和表达基因的方法是本领域已知的。用核酸转导细胞可以包括，例如，将含有核酸的脂质微粒与细胞温育或将含有核酸的病毒载体与载体宿主范围内的细胞温育。本公开中使用的细胞培养物，包括来自组织(例如，肿瘤)或血液样品的细胞系和培养的细胞，是本领域公知的。
[0243]
一旦分离并克隆了编码主题抗体的核酸，就可以在本领域技术人员已知的各种重组工程细胞中表达该核酸。此类细胞的示例包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫(例如使用杆状病毒载体的那些)和哺乳动物细胞。
[0244]
可以根据本领域已知的方法完成主题抗体的分离和纯化。例如，可以通过免疫亲和纯化(或使用蛋白质l或a沉淀)，洗涤以去除非-特异性结合的材料，并洗脱特异性结合的抗体，从经基因修饰以组成型和/或诱导表达蛋白质的细胞的裂解物中，或从合成反应混合物中，分离蛋白质。分离的抗体可以通过透析和其他通常用于蛋白质纯化方法的方法进一步纯化。在一个实施方案中，可以使用金属螯合层析方法分离抗体。本公开的抗体可以包含修饰以促进分离，如上所述。
[0245]
可以以基本上纯的或分离的形式(例如，不含其他多肽)制备抗体。蛋白质可以存在于相对于可能存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)富含多肽的组合物中。可以提供纯化的抗体，使得抗体存在于基本上不含其他表达蛋白的组合物中，例如组合物的低于90％，通常低于60％，更通常低于50％由其他表达的蛋白组成。
[0246]
原核细胞产生的抗体可能需要暴露于离液剂以便正确折叠。例如，在从大肠杆菌中纯化期间，表达的蛋白质可以任选地变性然后复性。这可以例如通过将细菌产生的抗体溶解在离液剂例如盐酸胍中来实现。然后通过缓慢透析或凝胶过滤使抗体复性。或者，编码抗体的核酸可以与分泌信号序列例如pelb可操作地连接，使得抗体以正确折叠的形式分泌到周质中。
[0247]
本公开还提供产生本公开的抗体的细胞，其中合适的细胞包括真核细胞，例如哺乳动物细胞。细胞可以是能够在体外复制抗体(例如单克隆抗体，例如igg)的杂交细胞或“杂交瘤”。例如，本公开提供了一种重组宿主细胞(在本文中也称为“遗传修饰的宿主细胞”)，其用一种或多种核酸进行遗传修饰，所述核酸包含编码本公开的抗体的重链和/或轻链的核苷酸序列。
[0248]
本文还考虑了用于产生绕过杂交瘤产生的抗体分子的抗原结合区的重组dna形式的技术。dna被克隆到例如细菌(例如，噬菌体)、酵母(例如，酵母属或毕赤酵母属)、昆虫或哺乳动物表达体系中。合适技术的一个示例使用具有前导序列的噬菌体λ载体系统，该前导序列导致表达的抗体(例如fab或scfv)迁移至周质空间(在细菌细胞膜与细胞壁之间)或被分泌。对于结合感兴趣的抗原的那些，可以快速产生大量的功能片段(例如，fab或scfv)。
[0249]
可以使用本领域已知的多种技术(包括使用杂交瘤、重组、噬菌体展示技术、选择淋巴细胞抗体法(slam)(1)或它们的组合)制备特异性结合vv a56和vv b5的抗体。例如，可以使用噬菌体展示的方法来制备和分离抗体。噬菌体展示用于蛋白质相互作用的高通量筛
选。噬菌体可以用于展示从库或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用vv a56或vv b5(例如，使用结合或捕获到固体表面或珠粒上的标记的vv a56或vv b5)选择或鉴定表达结合vv a56或vv b5的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包含从噬菌体中用fab、fv(来自轻链或重链的单个fv区)表达的fd和m13结合结构域，或与噬菌体基因iii或基因viii蛋白重组融合的二硫键稳定的fv抗体结构域。通过链改组产生高亲和力人抗体是已知的，组合感染和体内重组作为构建大型噬菌体文库的策略也是已知的。在另一个实施方案中，核糖体展示可以用于替代噬菌体作为展示平台。细胞表面文库可以用于筛选抗体。此类程序提供了传统杂交瘤技术的替代性方法，用于分离和随后的克隆单克隆抗体。
[0250]
选择噬菌体之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并用于产生完整抗体(包含人抗体或任何期望的抗原结合片段)，并在任何期望的宿主(包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达所述抗体编码区。例如，可以使用本领域中已知的方法，采用重组产生fv、scfv、fab、f(ab')2和fab'片段的技术。
[0251]
核酸、表达载体和细胞
[0252]
鉴于以上关于产生本公开的抗体和融合蛋白的方法的小节，应理解本公开还提供核酸、表达载体和细胞。
[0253]
在某些实施方案中，提供了编码本公开的抗体或融合蛋白(包括本公开的任何抗vv a56和抗vv b5抗体，例如上文所述的此类抗体中的任何此类抗体)的可变重链(vh)多肽、可变轻链(v
l
)多肽或两者的核酸。根据一些实施方案，抗体是单链抗体(例如scfv)，并且核酸编码单链抗体。
[0254]
根据一些实施方案，提供了编码抗vv a56抗体a047/a057、a049/a059/a056、a050或a054的可变重链(vh)多肽、可变轻链(v
l
)多肽或两者的核酸。此类核苷酸序列的示例提供于下表12中。编码构架区和cdr的序列分别以大写和小写显示。
[0255]
表12
–
编码示例性抗vv a56抗体的核苷酸序列
[0256]
[0257]
[0258][0259]
根据一些实施方案，提供了编码抗vv b5抗体a048/a058/a073或a051的可变重链(vh)多肽、可变轻链(v
l
)多肽或两者的核酸。此类核苷酸序列的示例提供于下表13中。编码构架区和cdr的序列分别以大写和小写显示。
[0260]
表13
–
编码示例抗vv b5抗体的核苷酸序列
[0261][0262]
根据一些实施方案，提供了编码本公开的car的核酸，所述car是例如这样的car，其包含：单链抗体，所述单链抗体包含本公开的抗vv a56或抗vv b5抗体的vh多肽和v
l
多肽；跨膜结构域；和细胞内信号传导结构域。此类单链抗体、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的示例在上文详细描述。
[0263]
编码本文所述的a56-car-01的示例性核苷酸序列如seq id no:155所示。编码本文所述的a56-car-02的示例性核苷酸序列如seq id no:156所示。编码本文所述的a56-car-05的示例性核苷酸序列如seq id no:157所示。编码本文所述的a56-car-06的示例性核苷酸序列如seq id no:158所示。编码本文所述的a56-car-07的示例性核苷酸序列如seq id no:159所示。编码本文所述的a56-car-08的示例性核苷酸序列如seq id no:160所示。
编码本文所述的a56-car-010的示例性核苷酸序列如seq id no:161所示。编码本文所述的a56-car-020的示例性核苷酸序列如seq id no:162所示。编码本文所述的a56-car-021的示例性核苷酸序列如seq id no:163所示。编码本文所述的a56-car-027的示例性核苷酸序列如seq id no:164所示。编码本文所述的a56-car-028的示例性核苷酸序列如seq id no:165所示。编码本文所述的a56-car-029的示例性核苷酸序列如seq id no:166所示。编码本文所述的a56-car-030的示例性核苷酸序列如seq id no:167所示。编码本文所述的b5-car-03的示例性核苷酸序列如seq id no:168所示。编码本文所述的b5-car-04的示例性核苷酸序列如seq id no:169所示。。编码本文所述的b5-car-011的示例性核苷酸序列如seq id no:170所示。编码本文所述的b5-car-013的示例性核苷酸序列如seq id no:171所示。编码本文所述的b5-car-014的示例性核苷酸序列如seq id no:172所示。编码本文所述的b5-car-016的示例性核苷酸序列如seq id no:173所示。编码本文所述的b5-car-019的示例性核苷酸序列如seq id no:174所示。编码本文所述的b5-car-022的示例性核苷酸序列如seq id no:175所示。。编码表11中提供的鼠car的核苷酸序列的示例如seq id no:176-179所示。
[0264]
还提供了包含本公开的任何核酸的表达载体。编码本公开的抗体和融合蛋白的天然或合成核酸的表达可以通过将编码抗体或融合蛋白的核酸可操作地连接至启动子(其是组成型的或诱导型的)并将构建体掺入表达载体中以产生重组表达载体来实现。载体可适用于原核生物、真核生物或两者中的复制和整合。典型的克隆载体包含功能上适当定向的转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节编码抗体的核酸的表达的启动子。载体任选地包含含有至少一个独立终止子序列的通用表达盒、允许所述盒在真核生物和原核生物中复制的序列，例如在穿梭载体中发现的，以及用于原核和真核系统二者的选择标记。
[0265]
还提供了包含本公开的任何核酸和/或表达载体的细胞。根据一些实施方案，本公开的细胞包括编码抗体的vh多肽和抗体的v
l
多肽的核酸。在某些此类实施方案中，抗体是单链抗体(例如scfv)，并且核酸编码单链抗体。根据一些实施方案，提供了包含编码本公开的抗体的可变重链(vh)多肽的第一核酸和编码所述抗体的可变轻链(v
l
)多肽的第二核酸的细胞。在某些实施方案中，此类细胞包括包含第一核酸的第一表达载体和包含第二核酸的第二表达载体。
[0266]
还提供了制备本公开的抗体或融合蛋白的方法，所述方法包括在适合本公开的细胞表达所述抗体或融合蛋白的条件下培养所述细胞，其中产生所述抗体或融合蛋白。培养细胞以使抗体或融合蛋白表达的条件可以变化。此类条件可包括在合适的容器(例如，细胞培养板或其孔)中、在合适的培养基(例如细胞培养基，诸如dmem、rpmi、mem、imdm、dmem/f-12等)中、在合适的温度(例如，32℃-42℃，例如37℃)和ph(例如，ph 7.0-7.7，例如ph 7.4)下、在具有合适co2百分比(例如3％到10％，诸如5％)的环境中培养细胞。
[0267]
结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体
[0268]
除了上文融合蛋白部分中描述的本公开的嵌合抗原受体(car)之外，本公开的方面还包括抗溶瘤病毒抗原car。在某些实施方案中，此类car包含特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。这种car有多种用途。例如，受益于本公开，应当理解的是，此类car可用于包括向患有癌症的个体施用包含抗ov抗原car的药物组合物的方法，其中个体中的癌细胞被感染ov并在其表面表达ov抗原，从而将
luridus)昆虫痘病毒、禽痘病毒、大栗鳃角金龟(melolontha melolontha)昆虫痘病毒、接触传染性软疣病毒、长耳鹿(mule deerpox)痘病毒、粘液瘤病毒、尼罗河鳄鱼(nile crocodilepox)痘病毒、口疮病毒、绵羊痘病毒、猪痘病毒、痘苗病毒、亚巴猴肿瘤病毒、约卡痘病毒、巢斑螟(acrobasis zelleri)昆虫痘病毒、茶小卷蛾(adoxophyes honmai)昆虫痘病毒、埃及伊蚊(aedes aegypti)昆虫痘病毒、大绿丽金龟(anomala cuprea)昆虫痘病毒、马尼亚蜉金龟(aphodius tasmaniae)昆虫痘病毒、迁徒蚱蜢(arphia conspersa)昆虫痘病毒、牛丘疹性口炎病毒、骆驼痘病毒、伸展摇蚊(camptochironomus tentans)昆虫痘病毒、金丝雀痘病毒、弱摇蚊(chironomus attenuatus)昆虫痘病毒、羽摇蚊(chironomus plumosus)昆虫痘病毒、卷叶蛾(choristoneura biennis)昆虫痘病毒、柳色卷蛾(choristoneura conflicta)昆虫痘病毒、异色卷蛾(choristoneura diversuma)昆虫痘病毒、云杉色卷蛾(choristoneura fumiferana)昆虫痘病毒、蔷薇斜条卷叶蛾(choristoneura rosaceana)昆虫痘病毒、原切根虫(chorizagrotis auxiliaris)昆虫痘病毒、牛痘病毒、demodema bonariensis昆虫痘病毒、甘蔗甲虫(dermolepida albohirtum)昆虫痘病毒、茧蜂(diachasmimorpha)昆虫痘病毒、脱脚病病毒、苏柏莱维斯矮锹(figulus sublaevis)昆虫痘病毒、粪金龟(geotrupes sylvaticus)昆虫痘病毒、山羊痘病毒、绿盐摇蚊(goeldichironomus holoprasinus)昆虫痘病毒、野兔纤维瘤病毒、棉铃虫(heliothis armigera)昆虫痘病毒、雪鸡痘病毒、东亚飞蝗(locusta migratoria)昆虫痘病毒、牛结节疹病毒、迁飞黑蝗(melanoplus sanguinipes)昆虫痘病毒、猴痘病毒、孔雀痘病毒、粘虫(mythimna separata)昆虫痘病毒、塞内加尔小车蝗(oedaleus senegalensis)昆虫痘病毒、冬尺蠖蛾(operophtera brumata)昆虫痘病毒、新西兰红鹿副痘病毒、鸽痘病毒、伪牛痘病毒、鹦鹉痘病毒、pteropox病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、浣熊痘病毒、沙漠蝗(schistocerca gregaria)昆虫痘病毒、臭鼬痘病毒、麻雀痘病毒,松鼠纤维瘤病毒、松鼠痘病毒、欧椋鸟痘病毒、特纳河痘病毒、沙鼠痘病毒、火鸡痘病毒、天花病毒和田鼠痘病毒。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0275]
在某些实施方案中，ov抗原是由来自疱疹病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原，所述疱疹病毒科选自禽α疱疹病毒(gallid alphaherpes virus)1型、鹦鹉α疱疹病毒(psittacid alphaherpesvirus)1型、禽α疱疹病毒2型、鸭α疱疹病毒1型、鸽α疱疹病毒(columbid alphaherpesvirus)1型、禽α疱疹病毒3型、火鸡α疱疹病毒(meleagrid alphaherpesvirus)1型、海龟α疱疹病毒(chelonid alphaherpesvirus)5型、人α疱疹病毒(human alphaherpesvirus)1型、蛛猴α疱疹病毒(ateline alphaherpesvirus)1型、牛α疱疹病毒(bovine alphaherpesvirus)2型、弥猴α疱疹病毒(cercopithecine alphaherpesvirus)2型、人α疱疹病毒2型、兔α疱疹病毒(leporid alphaherpesvirus)4型、恒河猴α疱疹病毒(macacine alphaherpesvirus)1型、袋鼠α疱疹病毒(macropodid alphaherpesvirus)1型、袋鼠α疱疹病毒2型、黑猩猩α疱疹病毒(panine alphaherpesvirus)3型、狒狒α疱疹病毒(papiine alphaherpesvirus)2型、松鼠猴α疱疹病毒(saimiriine alphaherpesvirus)1型、人β疱疹病毒(human betaherpesvirus)5型、夜猴β疱疹病毒(aotine betaherpesvirus)1型、卷尾猴β疱疹病毒(cebine betaherpesvirus)1型、猕猴β疱疹病毒(cercopithecine betaherpesvirus)5型、恒河猴β疱疹病毒(macacine papiine alphaherpesvirus)3型、黑猩猩β疱疹病毒(panine betaherpesvirus)2型、狒狒β
疱疹病毒(papiine betaherpesvirus)3型、松鼠猴β疱疹病毒(saimiriine betaherpesvirus)4型、鼠β疱疹病毒(murid betaherpesvirus)1型、鼠β疱疹病毒2型、鼠β疱疹病毒8型、人β疱疹病毒6a型、人β疱疹病毒6b型、人β疱疹病毒7、象β疱疹病毒(elephantid betaherpesvirus)1型、人γ疱疹病毒(human gammaherpesvirus)4型、金丝猴γ疱疹病毒(callitrichine gammaherpesvirus)3型、猕猴γ疱疹病毒(cercopithecine gammaherpesvirus)14型、大猩猩γ疱疹病毒(gorilline gammaherpesvirus)1型、恒河猴γ疱疹病毒(macacine gammaherpesvirus)4型、黑猩猩γ疱疹病毒(panine gammaherpesvirus)1型、狒狒γ疱疹病毒(papiine gammaherpesvirus)1型、猿γ疱疹病毒(pongine gammaherpesvirus)2型、松鼠猴γ疱疹病毒(saimiriine gammaherpesvirus)2型、羚羊γ疱疹病毒(ateline gammaherpesvirus)2型、羚羊γ疱疹病毒3、牛γ疱疹病毒(bovine gammaherpesvirus)4型、仓鼠γ疱疹病毒(cricetid gammaherpesvirus)2型、人γ疱疹病毒8型、恒河猴γ疱疹病毒5型、鼠γ疱疹病毒(murid gammaherpesvirus)4型、鼠γ疱疹病毒7型、狷羚γ疱疹病毒(alcelaphine gammaherpesvirus)1型、狷羚γ疱疹病毒2型、牛γ疱疹病毒6型、山羊γ疱疹病毒(caprine gammaherpesvirus)2型、马羚γ疱疹病毒(hippotragine gammaherpesvirus)1型、绵羊γ疱疹病毒(ovine gammaherpesvirus)2型、猪γ疱疹病毒(suid gammaherpesvirus)3型、猪γ疱疹病毒4型、猪γ疱疹病毒5型、马γ疱疹病毒(equid gammaherpesvirus)2型、马γ疱疹病毒5型、和鼬γ疱疹病毒(mustelid gammaherpesvirus)1型。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0276]
根据一些实施方案，ov抗原是由来自腺病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原，所述腺病毒科选自家禽禽腺病毒(fowl aviadenovirus)a、蛙类唾液腺病毒(frog siadenovirus)a、人类哺乳动物腺病毒c、绵羊胸腺病毒(ovine atadenovirus)d、鲟鱼美洲白腺病毒(sturgeon ichtadenovirus)a、蝙蝠哺乳动物腺病毒a、蝙蝠哺乳动物腺病毒b、蝙蝠哺乳动物腺病毒c、蝙蝠哺乳动物腺病毒d、蝙蝠哺乳动物腺病毒e、蝙蝠哺乳动物腺病毒f、蝙蝠哺乳动物腺病毒g、牛胸腺病毒d、牛哺乳动物腺病毒a、牛哺乳动物腺病毒b、牛哺乳动物腺病毒c、犬哺乳动物腺病毒a、鹿胸腺病毒a、鹿哺乳动物腺病毒b、海豚哺乳动物腺病毒a、海豚哺乳动物腺病毒b、鸭胸腺病毒a、鸭禽腺病毒b、马哺乳动物腺病毒a、马哺乳动物腺病毒b、隼禽腺病毒a、家禽禽腺病毒b、家禽禽腺病毒c、家禽禽腺病毒d、家禽禽腺病毒e、鹅禽腺病毒a、大山雀唾液腺病毒a、人类哺乳动物腺病毒a、人类哺乳动物腺病毒b、人类哺乳动物腺病毒d、人类哺乳动物腺病毒e、人类哺乳动物腺病毒f、人类哺乳动物腺病毒g、蜥蜴胸腺病毒a、鼠哺乳动物腺病毒a、鼠哺乳动物腺病毒b、鼠哺乳动物腺病毒c、绵羊哺乳动物腺病毒a、绵羊哺乳动物腺病毒b、企鹅唾液腺病毒a、鸽禽腺病毒a、鸽禽腺病毒b、阔鼻猴哺乳动物腺病毒a、猪哺乳动物腺病毒a、猪哺乳动物腺病毒b、猪哺乳动物腺病毒c、负鼠胸腺病毒a、鹦鹉胸腺病毒a、鹦鹉禽腺病毒b、猛禽唾液腺病毒a、海狮哺乳动物腺病毒a、猿猴哺乳动物腺病毒a、猿猴哺乳动物腺病毒b、猿猴哺乳动物腺病毒c、猿猴哺乳动物腺病毒d、猿猴哺乳动物腺病毒e、猿猴哺乳动物腺病毒f、猿猴哺乳动物腺病毒g、猿猴哺乳动物腺病毒h、猿猴哺乳动物腺病毒i、贼鸥唾液腺病毒a、臭鼬哺乳动物腺病毒a、蛇胸腺病毒a、松鼠哺乳动物腺病毒a、树鼩哺乳动物腺病毒a、火鸡禽腺病毒b、火鸡禽腺病毒c、火鸡禽腺病毒d和火鸡唾液腺病毒a。这种ov抗原对于ov来说可以是天然的或异源的。
[0277]
在某些实施方案中，ov抗原是由来自副粘病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗
ananassae sigmavirus)、伊米果蝇西格玛病毒(drosophila immigrans sigmavirus)、暗果蝇西格玛病毒(drosophila obscura sigmavirus)、特立蒂斯果蝇西格玛病毒(drosophila tristis sigmavirus)、duvenhage狂犬病病毒、茄斑驳矮化核内水稻黄矮炮弹病毒(eggplant mottled dwarf nucleorhabdovirus)、ekpoma 1型蒂布鲁病毒、ekpoma 2型蒂布鲁病毒、欧洲蝙蝠1型狂犬病病毒、欧洲蝙蝠2型狂犬病病毒、羊茅叶条纹质型弹状病毒、菲基里尼莱达特病毒(fikirini ledantevirus)、福冈莱达特病毒(fukuoka ledantevirus)、甘诺鲁瓦蝙蝠狂犬病病毒、格雷洛奇哈帕病毒(gray lodge hapavirus)、哈特公园哈帕病毒(hart park hapavirus)、牙鲆粒外弹状病毒(hirame novirhabdovirus)、生驹狂犬病病毒、伊里里库里欧病毒(iriri curiovirus)、伊尔库特狂犬病病毒、伊斯法罕水疱病毒、伊塔纳斯库里欧病毒(itacaiunas curiovirus)、约英杰卡卡哈帕病毒(joinjakaka hapavirus)、朱罗纳水疱病毒、卡梅斯哈帕病毒(kamese hapavirus)、kanyawara莱达特病毒、克恩峡谷莱达特病毒(kern canyon ledantevirus)、keuraliba莱达特病毒、苦盏狂犬病病毒、金伯利暂时热病毒、克拉马斯图邦病毒(klamath tupavirus)、柯伦泰莱达特病毒(kolente ledantevirus)、库尔平耶暂时热病毒、科汤卡恩暂时热病毒、库马西莱达特病毒(kumasi ledantevirus)、拉霍亚哈帕病毒(la joya hapavirus)、兔头蝙蝠狂犬病病毒、兰德几亚哈帕病毒(landjia hapavirus)、生菜黄斑驳质型弹状病毒、莱里达蝙蝠狂犬病病毒、玉米伊朗花叶核内水稻黄矮炮弹病毒(maize iranian mosaic nucleorhabdovirus)、玉米细条纹核内水稻黄矮炮弹病毒(maize fine streak nucleorhabdovirus)、玉米花叶核内水稻黄矮炮弹病毒(maize mosaic nucleorhabdovirus)、马尔佩斯泉水疱病毒、曼尼托巴哈帕病毒(manitoba hapavirus)、马拉巴水疱病毒、马尔科哈帕病毒(marco hapavirus)、莫科拉狂犬病病毒、莫雷顿水疱病毒、莫斯凯鲁哈帕病毒(mosqueiro hapavirus)、莫苏里尔哈帕病毒(mossuril hapavirus)、芒特埃尔岗蝙蝠莱达特病毒(mount elgon bat ledantevirus)、穆萨病毒(moussa virus)、厩腐蝇西格玛病毒(muscina stabulans sigmavirus)、新泽西州水疱病毒、恩盖恩加哈帕病毒(ngaingan hapavirus)、西牟娄莱达特病毒(nishimuro ledantevirus)、恩科比逊莱达特病毒(nkolbisson ledantevirus)、北方禾谷花叶病质型弹状病毒、奥博第安暂时热病毒、大分莱达特病毒(oita ledantevirus)、奥德河哈帕病毒(ord river hapavirus)、帕里河哈帕病毒(parry creek hapavirus)、佩里内特水疱病毒、狗鱼幼鱼鲤春病毒、皮理水疱病毒、piscine粒外弹状病毒(piscine novirhabdovirus)、拉迪水疱病毒、水稻黄矮病核内水稻黄矮炮弹病毒(rice yellow stunt nucleorhabdovirus)、里约奇科硬膜炎病毒、rochambeau库里欧病毒、海鳟鲈鱼弹状病毒(sea trout perhabdovirus)、塞纳马杜雷拉思瑞普病毒(sena madureira sripuvirus)、希莫尼蝙蝠狂犬病病毒、黑鱼粒外弹状病毒(snakehead novirhabdovirus)、苣荬菜质型弹状病毒(sonchus cytorhabdovirus)1型、苦苣菜黄网病核内水稻黄矮炮弹病毒(sonchus yellow net nucleorhabdovirus)、苦苣菜黄脉病核内水稻黄矮炮弹病毒(sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus)、斯里布尔思瑞普病毒(sripur sripuvirus)、草莓皱缩质型弹状病毒、斯威特沃特科蒂布鲁病毒(sweetwater branch tibrovirus)、芋头脉萎黄病核内水稻黄矮炮弹病毒(taro vein chlorosis nucleorhabdovirus)、树鼩图邦病毒(tupaia tupavirus)、西高加索蝙蝠狂犬病病毒、美国小麦条点花叶质型弹状病毒、沃格贝尔哈帕病毒(wongabel hapavirus)、武汉
莱达特病毒(wuhan ledantevirus)、雅塔暂时热病毒、永嘉莱达特病毒(yongjia ledantevirus)、和尤格波格丹诺夫奇水疱病毒(yug bogdanovac vesiculovirus)。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0279]
在某些实施方案中，ov抗原是由来自呼肠孤病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原，所述呼肠孤病毒科选自伪盾伊蚊呼肠孤病毒(aedes pseudoscutellaris reovirus)、水生呼肠孤病毒a、版纳病毒、蓝舌病病毒、科罗拉多壁虱热病毒、质型多角体病毒1型、中华绒螯蟹呼肠孤病毒(eriocheir sinensis reovirus)、斐济病病毒、虫源呼肠孤病毒1型、哺乳动物正呼肠孤病毒、细小微胞藻呼肠孤病毒、真菌呼肠孤病毒1型、水稻齿叶矮缩病毒、轮状病毒a、伤瘤病毒、非洲马瘟病毒、水生呼肠孤病毒b、水生呼肠孤病毒c、水生呼肠孤病毒d、水生呼肠孤病毒e、水生呼肠孤病毒f、水生呼肠孤病毒g、鸟类正呼肠孤病毒、狒狒正呼肠孤病毒、昌吉诺拉病毒(changuinola virus)、秦纽达病毒(chenuda virus)、乔巴峡病毒(chobar gorge virus)、科里帕塔病毒(corriparta virus)、质型多角体病毒10、质型多角体病毒11、质型多角体病毒12、质型多角体病毒13、质型多角体病毒14、质型多角体病毒15、质型多角体病毒16、质型多角体病毒2、质型多角体病毒3、质型多角体病毒4、质型多角体病毒5、质型多角体病毒6、质型多角体病毒7、质型多角体病毒8、质型多角体病毒9、稗草皱缩矮化病毒、流行性出血病病毒、马脑病病毒、北澳蚊病毒(eubenangee virus)、埃亚契病毒(eyach virus)、大蒜矮缩病毒(garlic dwarf virus)、大岛病毒、虫源呼肠孤病毒2型、虫源呼肠孤病毒3型、虫源呼肠孤病毒4型、虫源呼肠孤病毒5、伊理病毒(ieri virus)、卡迪罗病毒(kadipiro virus)、莱邦博病毒(lebombo virus)、辽宁病毒、mahlapitsi正呼肠孤病毒、玉米粗缩病毒、马德里约柯托病毒(mal de rio cuarto virus)、真菌呼肠孤病毒2型、真菌呼肠孤病毒3型、纳尔逊贝正呼肠孤病毒、褐飞虱呼肠孤病毒(nilaparvata lugens reovirus)、燕麦不孕矮缩病毒(oat sterile dwarf virus)、欧伦哥病毒(orungo virus)、巴尼亚姆病毒(palyam virus)、马唐矮化病毒(pangola stunt virus)、秘鲁马病病毒、鱼正呼肠孤病毒、爬虫正呼肠孤病毒、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus)、水稻矮缩病毒(rice dwarf virus)、水稻瘤矮病毒(rice gall dwarf virus)、轮状病毒b、轮状病毒c、轮状病毒d、轮状病毒e、轮状病毒f、轮状病毒g、轮状病毒h、轮状病毒i、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus)、圣克洛伊河病毒(st croix river virus)、乌玛蒂娜病毒(umatilla virus)、瓦德麦达尼病毒(wad medani virus)、沃勒尔病毒(wallal virus)、沃里戈病毒(warrego virus)、王戈尔病毒(wongorr virus)、和云南环状病毒(yunnan orbivirus)。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0280]
根据一些实施方案，ov抗原是由选自以下的小rna病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原：类鸭甲肝病毒(aalivirus)a、爱知病毒(aichivirus)a、ampivirus a、水生病毒(aquamavirus)a、禽肝炎病毒(avihepatovirus)a、avisivirus a、博卡病毒(bopivirus)a、cadicivirus a、心病毒(cardiovirus)a、柯萨病毒(cosavirus)a、crohivirus b、肠病毒c、马鼻病毒(erbovirus)a、口蹄疫病毒、gallivirus a、harkavirus a、肝病毒a、hunnivirus a、kunsagivirus a、limnipivirus a、梅格病毒(megrivirus)a、米奇病毒(mischivirus)a、花叶病毒(mosavirus)a、orivirus a、oscivirus a、副肠孤病毒(parechovirus)a、pasivirus a、passerivirus a、potamipivirus a、rabovirus a、玫瑰病
毒(rosavirus)a、sakobuvirus a、salivirus a、萨佩罗病毒(sapelovirus)a、塞内卡病毒(senecavirus)a、shanbavirus a、sicinivirus a、捷申病毒(teschovirus)a、torchivirus a、震颤病毒(tremovirus a)、爱知病毒b、爱知病毒c、爱知病毒d、爱知病毒e、爱知病毒f、禽类萨佩罗病毒(avian sapelovirus)、avisivirus b、avisivirus c、牛鼻炎a病毒、牛鼻炎b病毒、心病毒b、心病毒c、柯萨病毒b、柯萨病毒d、柯萨病毒e、柯萨病毒f、crohivirus a、肠病毒a、肠病毒b、肠病毒d、肠病毒e、肠病毒f、肠病毒g、肠病毒h、肠病毒i、肠病毒j、肠病毒k、肠病毒l、equine rhinitis a virus,肝病毒b、肝病毒c、肝病毒d、肝病毒e、肝病毒f、肝病毒g、肝病毒h、肝病毒i、kunsagivirus b、kunsagivirus c、limnipivirus b、limnipivirus c、梅格病毒b、梅格病毒c、梅格病毒d、梅格病毒e、米奇病毒b、米奇病毒c、副肠孤病毒b、副肠孤病毒c、副肠孤病毒d、鼻病毒a、鼻病毒b、鼻病毒c、和萨佩罗病毒b。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0281]
在某些实施方案中，ov抗原是由来自选自以下的细小病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原：腺相关依赖性细小病毒a、食肉动物阿留申细小病毒(carnivore amdoparvovirus)1型、十足类肝胰浓核病毒(decapod hepandensovirus)1型、十足类对虾浓核病毒(decapod penstyldensovirus)1型、双翅目短浓核病毒(dipteran brevidensovirus)1型、鸡形目埃文细小病毒(galliform aveparvovirus)1型、鳞翅目双义浓核病毒(lepidopteran ambidensovirus)1型、鳞翅目itera浓核病毒(lepidopteran iteradensovirus)1型、灵长类红细胞细小病毒(primate erythroparvovirus)1型、灵长类四细小病毒(primate tetraparvovirus)1型、啮齿动物原细小病毒(rodent protoparvovirus)1、有蹄类博卡细小病毒(ungulate bocaparvovirus)1型、有蹄类copiparvovirus 1型、腺相关依赖性细小病毒b、雁形目依赖性细小病毒1型、海星双义浓核病毒1型、禽类依赖性细小病毒1型、蜚蠊目双义浓核病毒1型、蜚蠊目双义浓核病毒2型、食肉动物阿留申细小病毒2型、食肉动物阿留申细小病毒3型、食肉动物阿留申细小病毒4型、食肉动物博卡细小病毒1型、食肉动物博卡细小病毒2型、食肉动物博卡细小病毒3型、食肉动物博卡细小病毒4型、食肉动物博卡细小病毒5型、食肉动物博卡细小病毒6型、食肉动物原细小病毒1型、翼手目博卡细小病毒1型、翼手目博卡细小病毒2型、翼手目博卡细小病毒3型、翼手目博卡细小病毒4型、翼手目依赖性细小病毒1型、翼手目原细小病毒1型、翼手目四细小病毒1型、十足类双义浓核病毒1型、双翅目双义浓核病毒1型、双翅目短浓核病毒2型、真盲缺目原细小病毒1型、半翅类双义浓核病毒1型、半翅类双义浓核病毒2型、半翅类双义浓核病毒3型、膜翅目双义浓核病毒1型、兔形目博卡细小病毒1型、鳞翅目itera浓核病毒2型、鳞翅目itera浓核病毒3型、鳞翅目itera浓核病毒4型、鳞翅目itera浓核病毒5型、直翅目双义浓核病毒1型、直翅目浓核病毒1型、鳍脚亚目博卡细小病毒1型、鳍脚亚目博卡细小病毒2型、鳍脚亚目依赖性细小病毒1型、灵长类博卡细小病毒1型、灵长类博卡细小病毒2型、灵长类红细胞细小病毒2型、灵长类红细胞细小病毒3型、灵长类红细胞细小病毒4型、灵长类原细小病毒1型、灵长类原细小病毒2型、灵长类原细小病毒3型、啮齿动物红细胞细小病毒1型、啮齿动物原细小病毒2型、啮齿动物原细小病毒3型、有鳞目依赖性细小病毒1型、有蹄类博卡细小病毒2型、有蹄类博卡细小病毒3型、有蹄类博卡细小病毒4型、有蹄类博卡细小病毒5型、有蹄类博卡细小病毒6型、有蹄类copiparvovirus 2型、有蹄类红细胞细小病毒1型、有蹄类原细小病毒1型、有蹄类原细小病毒2型、有蹄类四细小病毒1型、有蹄类四细
小病毒2型、有蹄类四细小病毒3型、和有蹄类四细小病毒4。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0282]
根据一些实施方案，ov抗原是由来自选自以下的冠状病毒科的病毒的野生型基因组编码的抗原：甲型冠狀病毒1型、禽类冠状病毒(avian coronavirus)、鹎冠状病毒hku11、马环曲病毒、鼠冠状病毒、白鳊鱼病毒、球蟒网巢病毒1型、蝙蝠冠状病毒cdphe15、蝙蝠冠状病毒hku10、白鲸冠状病毒sw1、β冠状病毒1型、牛网巢病毒1型、牛环曲病毒、奇努克鲑鱼网巢病毒1型、黑水鸡冠状病毒hku21、冠状病毒hku15、肥头鲤网巢病毒1型、刺猬冠状病毒1型、人冠状病毒229e、人冠状病毒hku1、人冠状病毒nl63、人环曲病毒、中东呼吸综合征相关冠状病毒、长翼蝠冠状病毒1型、长翼蝠冠状病毒hku8、貂冠状病毒1、文鸟冠状病毒hku13、夜鹭冠状病毒hku19、伏翼蝠冠状病毒hku5、猪流行性腹泻病毒、猪环曲病毒、菊头蝠冠状病毒hku2、果蝠冠状病毒hku9、sars冠状病毒2、高头蝠冠状病毒512、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、画眉鸟冠状病毒hku12、扁颅蝠冠状病毒hku4、绣眼鸟冠状病毒hku16、野鸭冠状病毒hku20、和sars-cov-2。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0283]
在某些实施方案中，ov抗原是由牛痘病毒(例如，抗原a33、a34、a36、a56、b5、f12、f13等，例如来自经修饰的vv毒株、jx-594、gl-onc1，或选自western reserve、wyeth、lister、copenhagen、天坛、patwadangar和ankara改良牛痘病毒等的vv毒株)、腺病毒、hsv、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒和马拉巴病毒的基因组编码的抗原。此类ov抗原对于ov可为天然的或异源的。
[0284]
在某些实施方案中，ov抗原是天然ov抗原的经修饰形式(或衍生物)。例如，根据一些实施方案，ov抗原包含天然抗原的相同或基本上相似的表位，但被修饰/工程化以赋予期望的特性，例如，改进的病毒感染性等。在某些实施方案中，ov抗原被修饰/工程化以具有相对于天然抗原不同的表位，例如使得现有抗体(例如，被批准用于治疗用途的抗体)与经修饰/工程化的ov抗原结合，而不与天然抗原结合。
[0285]
根据一些实施方案，ov的基因组可被修饰以编码和表达一种或多种不由ov的野生型基因组编码的蛋白质，其中此类蛋白质在本文中可称为对于ov是“异源的”或“非天然的”ov抗原。ov的基因组可以被修饰以编码和表达任何感兴趣的异源ov抗原。在某些实施方案中，异源ov抗原是与表达该抗原的ov异源的病毒抗原(例如，由本文别处描述的任何病毒的野生型基因组编码的抗原)。根据一些实施方案，异源ov抗原是肿瘤抗原，其非限制性示例包括5t4、axl受体酪氨酸激酶(axl)、b细胞成熟抗原(bcma)、c-met、c4.4a、碳酸酐酶6(ca6)、碳酸酐酶9(ca9)、钙粘着蛋白-6、cd19、cd20、cd22、cd25、cd27l、cd30、cd33、cd37、cd44v6、cd56、cd70、cd74、cd79b、cd123、cd138、癌胚抗原(cea)、ckit、cripto蛋白、cs1、δ样经典notch配体3(dll3)、b型内皮素受体(ednrb)、肝配蛋白a4(efna4)、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(enpp3)、eph受体a2(epha2)、成纤维细胞生长因子受体2(fgfr2)、成纤维细胞生长因子受体3(fgfr3)、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、叶酸受体1(folr1)、糖蛋白非转移性b(gpnmb)、鸟苷酸环化酶2c(gucy2c)、人表皮生长因子受体2(her2)、人表皮生长因子受体3(her3)、整合素α、溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)、lewis y、liv-1、富含15个亮氨酸的重复序列(lrrc15)、间皮素(msln)、粘蛋白1(muc1)、粘蛋白16(muc16)、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2b(napi2b)、连接素-4、nmb、notch3、p-钙粘蛋白(p-cad)、前列腺特异性膜抗原(psma)、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)、溶质载体家族44成员4
(slc44a4)、slit家族成员6(slitrk6)、steap家族成员1(steap1)、组织因子(tf)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白-1(tim-1)、和滋养层细胞表面抗原(trop-2)。
[0286]
特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域(ov基因组可经修饰以编码和表达其，并且其可以在本公开的抗ov car或抗ov缀合物中采用)的非限制性示例包括以下抗体的抗原结合结构域：阿德木单抗(adecatumumab)、阿斯万卡单抗(ascrinvacumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、卓齐妥单抗(drozitumab)、杜力戈图单抗(duligotumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、杜氏图单抗(dusigitumab)、埃弗图单抗(enfortumab)、艾诺提克单抗(enoticumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、盖尼塔单抗(ganitumab)、格莱木单抗(glembatumumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊雷单抗(iratumumab)、依库单抗(icrucumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、纳瑞特单抗(narnatumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、耐西维单抗(nesvacumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉图单抗(olaratumab)、帕利珠单抗(panitumumab)、帕图单抗(patritumab)、普立木单抗(pritumumab)、雷德图单抗(radretumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、司瑞斑图单抗(seribantumab)、他瑞妥单抗(tarextumab)、替普单抗(teprotumumab)、托维图单抗(tovetumab)、伐提克图单抗(vantictumab)、维西库单抗(vesencumab)、伏妥昔单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、麻安莫单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、地莫单抗(detumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫希土姆单抗(moxetumomab)、他那莫单抗(naptumomab)、巯诺莫单抗(nofetumomab)、帕尼单抗(pemtumomab)、平妥莫单抗(pintumomab)、雷库图单抗(racotumomab)、沙妥莫单抗(satumomab)、苏力图单抗(solitomab)、帕他莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、卡罗单抗(capromab)、依决洛单抗(edrecolomab)、他那可单抗(nacolomab)、阿姆土西单抗(amatuximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、布妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、德洛图昔单抗(derlotuximab)、地努图希单抗(dinutuximab)、埃斯托西单抗(ensituximab)、弗图希单抗(futuximab)、吉仁土希单抗(girentuximab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、依萨图希单抗(isatuximab)、马格图希单抗(margetuximab)、利妥昔单抗、司妥昔单抗(siltuximab)、乌波利妥昔单抗(ublituximab)、依美昔单抗(ecromeximab)、阿比珠单抗(abituzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比伐单抗(bivatuzumab)、布朗替珠单抗(brontictuzumab)、美坎珠单抗(cantuzumab)、美坎珠单抗(cantuzumab)、西他珠单抗(citatuzumab)、克莱维珠单抗(clivatuzumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、登西珠单抗(demcizumab)、达罗珠单抗(dalotuzumab)、德尼珠单抗(denintuzumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、埃玛珠单抗(emactuzumab)、埃米贝珠单抗(emibetuzumab)、埃诺利珠单抗(enoblituzumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法勒珠单抗(farletuzumab)、费希腊妥单抗(ficlatuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、英戈土珠单抗(imgatuzumab)、依托珠单抗
(inotuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、利伐珠单抗(lifastuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛妥珠单抗(lorvotuzumab)、鲁姆妥珠单抗(lumretuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、奥卡土珠单抗(ocaratuzumab)、奥特乐土珠单抗(otlertuzumab)、欧那土珠单抗(onartuzumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab)、帕萨土珠单抗(parsatuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、皮那土珠单抗(pinatuzumab)、普拉土珠单抗(polatuzumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西姆土珠单抗(simtuzumab)、他珠单抗(tacatuzumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、妥可妥珠单抗(tucotuzumab)、万多妥珠单抗(vandortuzumab)、万努珠单抗(vanucizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏妥土珠单抗(vorsetuzumab)、苏非妥珠单抗(sofituzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、达妥昔单抗(depatuxizumab)、欧土希珠单抗(ontuxizumab)、布伦土维单抗(blontuvetmab)、他姆土维(tamtuvetmab)；或其肿瘤抗原结合变体。如本文所用，“变体”是指抗原结合结构域特异性结合特定抗原(例如，对于曲妥珠单抗是her2)但具有比亲本抗体更少或更多的氨基酸(例如，是亲本抗体的片段(例如，scfv))，相对于亲本抗体具有一个或多个氨基酸取代，或它们的组合。
[0287]
在一些实施方案中，本公开的抗ov抗原car或抗ov抗原缀合物的抗原结合结构域来自美国食品和药物管理局和/或欧洲药品管理局(ema)批准用作治疗性抗体(例如，用于靶向患者中的某些疾病相关细胞，等等)或其片段(例如，此类抗体的单链形式，诸如所述抗体的scfv形式)的抗体，其保留了特异性结合靶抗原的能力。
[0288]
本公开的car的抗原结合结构域可以是任何合适的形式，例如scfv等。可以采用任何合适的跨膜和细胞内信号传导结构域，包括上文融合蛋白部分中描述的任何跨膜和细胞内信号传导结构域，以及共刺激结构域、接头序列/间隔区结构域等。
[0289]
本公开的car可以由单个肽提供，或者可以由两个或更多个多肽提供。当car由两个或更多个多肽提供时，car可以以任何可用的多多肽形式提供，所述多多肽形式包括上文在本公开的融合蛋白部分中描述的任何此类多肽形式。
[0290]
还提供了编码本公开的任何抗ov抗原car的核酸、包含此类核酸的表达载体、以及包含此类核酸和表达载体的细胞。
[0291]
根据一些实施方案，提供了在其表面上表达抗ov抗原car的细胞。感兴趣的细胞包括但不限于免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是免疫效应细胞。可以在其表面上表达本公开的抗ov抗原car的免疫效应细胞的非限制性示例包括t细胞(即，该细胞可以是car t细胞)、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞等。还提供了药物组合物，其包含在其表面上表达抗ov抗原car的本公开的任何细胞。此类组合物可包含细胞和药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体的示例在下文中详细描述。
[0292]
结合溶瘤病毒抗原的缀合物
[0293]
除了以上缀合物部分中描述的本公开的抗vv a56和抗vv b5抗体和融合蛋白缀合物之外，本公开的各方面还包括抗溶瘤病毒抗原抗体缀合物。在某些实施方案中，此类缀合物包含特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的抗体，以及缀合至该抗体的试剂。根据一些实施方案，与抗体缀合的试剂选自化疗剂、毒素、辐射增敏剂和放射性同位素(例如，治疗性放射性同位素)。该试剂可以是上述缀合物部分中描述的任何此类试剂。
[0294]
本公开的抗ov抗体缀合物具有多种用途。例如，受益于本公开，应当理解的是，此类缀合物可用于包括向患有癌症的个体施用包含抗ov抗原缀合物的药物组合物的方法，其中个体中的癌细胞被感染ov并在其表面表达ov抗原，从而将缀合物靶向癌细胞以治疗个体的癌症。
[0295]
抗体(或包含其的融合蛋白)可经选择，以使得缀合物特异性结合感兴趣的ov抗原。ov抗原可以是天然ov抗原。例如，缀合物的抗体部分可以特异性结合由选自牛痘病毒(例如，抗原a33、a34、a36、a56、b5、f12、f13等，例如来自经修饰的vv毒株、jx-594、gl-onc1，或选自western reserve、wyeth、lister、copenhagen、天坛、patwadangar和ankara改良牛痘病毒等的vv毒株)、腺病毒、hsv、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒和马拉巴病毒的ov编码的天然抗原。
[0296]
在某些实施方案中，ov抗原与ov异源。例如，抗体(或包含该抗体的融合蛋白)可经选择以使得缀合物的抗体部分特异性结合以上car部分中描述的任何异源ov抗原。
[0297]
本公开的抗ov抗体缀合物的抗体部分可以任何期望的形式提供，例如四聚体形式、单链(例如，scfv)形式等，如上文关于本公开的抗体以及抗vv a56和抗vv b5抗体和融合蛋白缀合物的部分中所述。
[0298]
本公开的抗ov抗体缀合物可包括通过接头(例如，上文关于本公开的抗vv a56和抗vv b5抗体和融合蛋白缀合物的部分中描述的任何不可切割或可切割的接头)缀合至抗体(或包含所述抗体的融合蛋白)的试剂。
[0299]
还提供了包含本公开的任何抗ov抗体缀合物的药物组合物。此类组合物可包含所述缀合物和药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体的示例在下文中详细描述。
[0300]
组合物
[0301]
如上文所概述的，本公开还提供了组合物。根据一些实施方案，本公开的组合物包括本公开的抗体、融合蛋白、或缀合物。例如，抗体、融合蛋白、或缀合物可以是上文抗体部分中描述的任何抗体、融合蛋白、或缀合物，出于简洁的目的，将其描述并入但本文不再重复。
[0302]
在某些方面中，本公开的组合物包含存在于液体介质中的抗体、融合蛋白、或缀合物。液体介质可以是水性液体介质，例如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂，如盐(例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4)、缓冲剂(tris缓冲剂、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉)丙磺酸(mops)、n-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等)、增溶剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂，如吐温(tween)-20等)、核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、甘油、螯合剂等可以存在于此类组合物中。
[0303]
本公开的方面还包括药物组合物。在一些实施方案中，本公开的药物组合物包含本公开的抗vv a56抗体或抗vv b5抗体(或包含其的缀合物或融合蛋白)和药学上可接受的载体。
[0304]
可以将抗体、融合蛋白或缀合物掺入用于治疗施用的多种制剂中。更特别地，抗体、融合蛋白或缀合物可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。
[0305]
用于向个体施用的抗体、融合蛋白或缀合物的制剂(例如，适合于人类施用的制
剂)通常是无菌的，并且可以进一步不含可检测的热原或根据选定的施用途径禁止向患者施用的其它污染物。
[0306]
在药物剂型中，抗体、融合蛋白或缀合物可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独使用或以适当的关联以及组合形式与其它药学活性化合物一起使用。以下方法和载剂/赋形剂仅仅是示例，而决不是限制性的。
[0307]
对于口服制备物，抗体、融合蛋白或缀合物可单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组合使用；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组合使用；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。
[0308]
抗体、融合蛋白或缀合物可以配制用于肠胃外(例如，静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、鞘内、皮下等)施用。在某些方面中，通过将抗体、融合蛋白或缀合物溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(如植物油或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中来配制用于注射的抗体、融合蛋白或缀合物；并且如果需要的话，使用诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂的常规添加剂。
[0309]
包含抗体、融合蛋白或缀合物的药物组合物可以通过将具有所需纯度的抗体、融合蛋白或缀合物与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂混合来制备。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其它碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如edta；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、n-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如tween、brij pluronics、triton-x或聚乙二醇(peg)。
[0310]
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中在施用之前用无菌溶液重构冻干制剂。重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间移除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可以用于产生用于肠胃外施用的药物组合物。
[0311]
抗体、融合蛋白或缀合物的水性制剂可以在ph缓冲溶液中制备，例如，ph范围为约4.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或者约5.5。适合于此范围内ph的缓冲液的示例包含磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mm到约100mm或约5mm到约50mm，这取决于例如缓冲液和制剂的所需张力。
[0312]
可以包含张力剂来调节制剂的张力。示例张力剂包含氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖以及其组合的组的任何组分。在一些实施方案中，水性制剂是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是合适的。术语“等渗”表示具有与其比较的一些其它溶液相同的张力的溶液，如生理盐溶液或血清。可以以约5mm到约350mm的量使用张力剂，例如以100mm到350mm的
量使用。
[0313]
还可以将表面活性剂添加到制剂中以减少聚集和/或使所述制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性表面活性剂包含聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(tween)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)和十二烷基硫酸钠(sds)。合适的聚氧乙烯山梨糖醇酐-脂肪酸酯的示例是聚山梨醇酯20(以商标tween 20
tm
销售)和聚山梨醇酯80(以商标tween 80
tm
销售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的示例是以名称f68或poloxamer 188
tm
销售的聚乙烯-聚丙烯共聚物。合适的聚氧乙烯烷基醚的示例是以商标brij
tm
销售的聚氧乙烯烷基醚。表面活性剂的示例浓度范围可以为约0.001％到约1％w/v。
[0314]
也可以添加冻干保护剂以保护抗体和/或t细胞激活剂在冻干过程中免受不稳定条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包含糖(包含葡萄糖和蔗糖)、多元醇(包含甘露醇、山梨醇和甘油)和氨基酸(包含丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包含例如约10mm至500nm的量的冻干保护剂。
[0315]
在一些实施方案中，药物组合物包含抗体、融合蛋白、或缀合物，以及上述组分(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)中的一种或多种，并且基本上不含一种或多种防腐剂，诸如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵以及它们的组合。在其它实施方案中，制剂中包含防腐剂，例如，以约0.001到约2％(w/v)的浓度范围。
[0316]
试剂盒
[0317]
本公开的方面还包括试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可用于实践本公开的方法，例如包括向个体施用本公开的药物组合物以将抗体、融合蛋白(例如，car)或缀合物靶向所述个体中被溶瘤病毒(例如，vv)感染的癌细胞的方法。
[0318]
因此，在某些实施方案中，本公开的试剂盒包含本公开的任何药物组合物，以及向有需要的个体施用所述药物组合物的使用说明。试剂盒中包含的药物组合物可包含本公开的任何抗体、融合蛋白和/或缀合物，例如上文描述的任何抗体、融合蛋白和/或缀合物。应当理解的是，本公开的试剂盒可包含上文在与主题抗体、融合蛋白、缀合物和组合物相关的部分中描述的任何试剂和特征，出于简洁的目的，其在本文中不再详细重复。
[0319]
本公开的试剂盒可包含以单位剂量(例如，安瓿)或多剂量形式存在的一定量的组合物。因此，在某些实施方案中，试剂盒可包含一个或多个(例如，两个或更多个)单位剂量(例如，安瓿)的组合物，所述组合物包含本公开的抗体、融合蛋白、和/或缀合物。如本文中所使用的，术语“单位剂量”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含按足以产生期望效果的量计算的预定量的组合物。单位剂量的量取决于各种因素，例如所用的特定抗体、融合蛋白、和/或缀合物、要实现的效果和个体中与抗体、融合蛋白、和/或缀合物相关的药效动力学。在又其它实施方案中，试剂盒可以包含单个多剂量的组合物。
[0320]
在某些实施方案中，本公开的试剂盒包含用于例如通过向患有癌症的个体施用药物组合物，将所述药物组合物中存在的抗体、融合蛋白或缀合物靶向所述个体中的被vv感染的癌细胞(例如，以治疗所述个体的癌症)的使用说明，其中所述个体包含感染了vv的癌细胞，并且其中所述抗体、融合蛋白或缀合物靶向至在被感染的癌细胞的表面上表达的vv
抗原感染的癌细胞。
[0321]
根据一些实施方案，本公开的试剂盒可进一步包含药物组合物，所述药物组合物包含vv(例如，jx-594、gl-onc1、选自western reserve、wyeth、lister、copenhagen、天坛、patwadangar和ankara改良牛痘病毒的vv毒株，等)。此类试剂盒可进一步包括用于例如在施用包含本公开的抗体、融合蛋白或缀合物的药物组合物之前，向患有癌症的个体施用有效量的包含vv的药物组合物以感染所述个体中的癌细胞的使用说明。
[0322]
试剂盒中包含的说明书(例如，使用说明书(ifu))可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或次包装有关联)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，便携式闪存驱动器、dvd、cd-rom、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在又其它实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源，例如通过因特网，获得说明书的手段。该实施方案的一个示例是包括网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
[0323]
方法
[0324]
本公开的各方面包括使用本公开的抗体、融合蛋白(例如，car)和缀合物的方法。所述方法可用于多种环境，包括体外和/或体内研究和/或临床应用中。
[0325]
在某些方面中，提供了方法，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的包含本公开的抗vv a56或抗vv b5抗体中的任一者(包括包含此类抗体的融合蛋白或缀合物中的任一者)的药物组合物，其中所述个体包含被ov感染的癌细胞，所述ov编码与抗体结合的vv a56或vv b5抗原(其中vv a56或vv b5抗原可以对ov是天然的或异源的)，并且其中所述抗体、融合蛋白或缀合物通过在受感染的癌细胞的表面上表达的vv抗原靶向受感染的癌细胞。根据一些实施方案，此类方法进一步包括，在向个体施用药物组合物之前，通过向所述个体施用有效量的ov来感染癌细胞。此类方法可用于例如治疗个体的癌症。
[0326]
在某些实施方案中，药物组合物包含本公开的抗vv a56或抗vv b5抗体缀合物中的任一者。例如，药物组合物可包含缀合物，其中抗vv a56或抗vv b5抗体缀合至作为体内显像剂的可检测标记或放射性同位素。此类方法还可包括使用体内显像剂对个体中的受感染的癌细胞进行成像。向个体施用包含可检测标记或放射性同位素的缀合物的方法可用于对个体中的癌细胞进行成像，例如用于诊断、预后和/或抗癌疗法监测目的。
[0327]
根据一些方面，提供了将特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的抗体靶向个体中的癌细胞的方法。此类方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合ov抗原的抗体(或包含所述抗体的融合蛋白或缀合物)，其中所述个体中的癌细胞被ov感染并在其表面上表达所述ov抗原。ov抗原可以是本文别处描述的任何ov抗原。在某些实施方案中，ov抗原是天然ov抗原。例如，ov可以是上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒，或它们的工程化变体(例如，具有下文所述的ov修饰中的一种或多种ov修饰—例如，人gm-csf的转基因、胸苷激酶基因的缺失等—的工程化变体)，并且ov抗原对于ov是天然的。根据一些实施方案，ov抗原对于ov是异源的，例如，与ov异源的病毒抗原(例如，上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒ov抗原)、肿瘤抗原、或本文别处描述的任何其他异源ov抗原。根据一些实施方案，此类方法
进一步包括，在向个体施用药物组合物之前，通过向所述个体施用有效量的ov来感染癌细胞。此类方法可用于例如治疗个体的癌症。
[0328]
当结合在癌细胞表面时，抗体(或融合蛋白)可以诱导细胞毒性，例如，经由抗体依赖性细胞毒性(adcc)；通过在补体依赖性细胞毒性(cdc)中募集补体；通过抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)；通过表位扩散；或通过某种其他机制。抗体可以在fc区中进行修饰以提供所需的或增强的效应子功能。这可以通过在抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。或者，在需要消除或减少效应子功能以最小化副作用或治疗并发症的情况下，可以使用某些其他fc区。
[0329]
在某些实施方案中，药物组合物可包含缀合物，其中抗vv a56或抗vv b5抗体与选自化疗剂、毒素、辐射增敏剂、治疗性放射性同位素和允许对抗体进行体内成像的放射性同位素缀合。该试剂可以是以上缀合物部分中描述的任何此类试剂。
[0330]
抗体(或包含其的融合蛋白)可经选择，以使得缀合物特异性结合感兴趣的ov抗原。感兴趣的ov抗原包括但不限于本文别处描述的任何天然或异源的ov抗原。在某些实施方案中，ov抗原是天然ov抗原。例如，ov可以是上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒，或它们的工程化变体(例如，具有下文所述的ov修饰中的一种或多种ov修饰—例如，人gm-csf的转基因、胸苷激酶基因的缺失等—的工程化变体)，并且ov抗原对于ov是天然的。根据一些实施方案，ov抗原对于ov是异源的，例如，与ov异源的病毒抗原(例如，上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒ov抗原)、肿瘤抗原、或本文别处描述的任何其他异源ov抗原。在一些实施方案中，抗原是天然或异源的ov抗原，其表达受针对抗原的ov的野生型转录调控元件的专有控制。也就是说，根据此类实施方案，针对抗原的ov的转录调控元件相对于野生型ov没有被修饰。在某些实施方案中，抗原是天然ov抗原，其表达水平相对于野生型ov的表达通过对所述ov的一种或多种野生型转录调控元件的修饰(例如，替换、复制等)而改变(例如，增加)。举例来说，抗原可以是天然ov抗原(例如，天然a56、天然b5、或任何其他感兴趣的天然ov抗原)，其表达相对于野生型ov的表达通过将天然ov抗原的编码区可操作地偶联至一种或多种异源调控元件(例如，启动子，诸如人启动子)而增加，与ov的野生型转录调控元件相比，所述一种或多种异源调控元件导致更高的表达水平。此类ov可以是经修饰的ov，例如，包含下文描述的ov修饰中的一种或多种ov修饰的ov。
[0331]
在某些实施方案中，ov抗原与ov异源。例如，抗体可经选择以使得缀合物的抗体部分特异性结合本文别处描述的任何异源ov抗原，例如与ov异源的病毒抗原、肿瘤抗原等。
[0332]
抗体可以以任何期望的形式提供，例如，四聚体形式、单链(例如，scfv)形式等，如本公开的前述部分中所述。根据一些实施方案，药物组合物包含与可检测标记或放射性同位素缀合的抗体。在某些实施方案中，可检测标记或放射性同位素是体内显像剂。其中将抗体与体内显像剂缀合的方法可以进一步包括检测体内显像剂以在体内对个体中的癌细胞进行成像，例如用于诊断、预后和/或抗癌疗法监测目的。
[0333]
根据一些方面，提供了将特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的car靶向个体中的癌细胞的方法。此类方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含car，所述car包含特异性结合ov抗原的抗原结合结构域，其中所述个体中的癌细胞被ov感染并在其表面上表达所述ov抗原。car可以在细胞(例如，免疫细胞，诸如免疫效应细胞，例如t细胞、
nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞等)的表面上表达。例如，car可能存在于t细胞的表面上，其中所述方法是将car t细胞靶向到个体中的受感染的癌细胞的方法。根据一些实施方案，此类方法进一步包括，在向个体施用药物组合物之前，通过向所述个体施用有效量的ov来感染癌细胞。此类方法可用于例如治疗个体的癌症。
[0334]
car的抗原结合结构域特异性结合感兴趣的ov抗原。感兴趣的ov抗原包括但不限于本文别处描述的任何天然或异源的ov抗原。在某些实施方案中，ov抗原是天然ov抗原。例如，ov可以是上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒，或它们的工程化变体(例如，具有下文所述的ov修饰中的一种或多种ov修饰—例如，人gm-csf的转基因、胸苷激酶基因的缺失等—的工程化变体)，并且ov抗原对于ov是天然的。根据一些实施方案，ov抗原对于ov是异源的，例如，与ov异源的病毒抗原(例如，上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒ov抗原)、肿瘤抗原、或本文别处描述的任何其他异源ov抗原。
[0335]
可以通过多种方法制备包含在细胞表面上表达car的细胞的药物组合物。在一些实施方案中，本公开的细胞是通过用编码car的病毒载体转染细胞产生的。在一些实施方案中，细胞是t细胞，从而提供了产生car t细胞的方法。在一些实施方案中，此类方法包括激活t细胞(例如，从将施用car t细胞疗法的个体获得的t细胞)群，刺激t细胞群增殖，以及用编码car的病毒载体转导t细胞。在一些实施方案中，用编码car的逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒载体)转导t细胞。在一些实施方案中，用编码car的慢病毒载体转导t细胞。
[0336]
本公开的细胞可以是自体的/自身的(“自己的”)或非自体的(“非自己的”，例如同种异体的、同基因的或异种异体的)。如本文所用，“自体”是指来自同一个体的细胞。如本文所用，“同种异体”是指相同物种的细胞在遗传上与该细胞相比不同。如本文所用，“同基因的”是指不同个体的细胞，它们在基因上与相比之下的细胞相同。在一些实施方案中，细胞是从哺乳动物获得的t细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，所述灵长类动物是人。
[0337]
t细胞可获自多种来源，包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液，脾组织，以及肿瘤。在某些实施方案中，t细胞可以从使用任何数量的已知技术(诸如沉降，例如ficoll
tm
分离)从个体采集的单位血液获得。
[0338]
在一些实施方案中，使用分离或纯化的t细胞群。在一些实施方案中，t
ctl
和th淋巴细胞是从pbmc中纯化的。在一些实施方案中，在激活、扩增和/或遗传修饰之前或之后，将t
ctl
和th淋巴细胞分选成幼稚(tn)、记忆(t
mem
)和效应(t
eff
)t细胞亚群。用于此类分选的合适方法是已知的，并且包括例如磁激活细胞分选(macs)，其中tn是cd45ra

cd62l

cd95
–
；tscm是cd45ra

cd62l

cd95

；tcm是cd45ro

cd62l

cd95

；并且tem是cd45ro

cd62l
–
cd95

。用于此类分选的示例性方法描述于wang等人，(2016)blood 127(24):2980-90中。
[0339]
在一些实施方案中，表达以下标志物中的一种或多种标志物的特定t细胞亚群可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离：cd3、cd4、cd8、cd28、cd45ra、cd45ro、cd62、cd127和hla-dr。在一些实施方案中，表达选自由以下组成的组的标志物中的一种或多种标志物的特定t细胞亚群是通过阳性或阴性选择技术进一步分离的：cd62l、ccr7、cd28、cd27、cd122、cd127、cd197；或cd38或cd62l、cd127、cd197和cd38。在一些实施方案中，所制造的t细胞组合物不表达以下标志物中的一种或多种标志物：cd57、cd244、cd 160、pd-1、ctla4、
tim3和lag3。在一些实施方案中，所制造的t细胞组合物基本上不表达以下标志物中的一种或多种标志物：cd57、cd244、cd 160、pd-1、ctla4、tim3和lag3。
[0340]
为了获得治疗有效剂量的t细胞组合物，可以使t细胞经受一轮或多轮刺激、激活和/或扩增。t细胞通常可以使用如例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041中描述的方法来激活和扩增，所述美国专利中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，将t细胞激活并扩增约1天至21天，例如约5天至21天。在一些实施方案中，在将编码car的核酸(例如，表达载体)引入t细胞之前，将所述t细胞激活并扩增约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约3天、约2天至约4天、约3天至约4天、或约1天、约2天、约3天、或约4天。
[0341]
在一些实施方案中，在将编码car的核酸(例如，表达载体)引入t细胞之前，将所述t细胞激活和扩增约6小时、约12小时、约18小时或约24小时。在一些实施方案中，在将编码car的核酸(例如，表达载体)引入t细胞的同时激活所述t细胞。
[0342]
在一些实施方案中，适合于t细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo 15,(lonza))，以及增殖和活力所必需的一种或多种因子，包括但不限于血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、il-21、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α，或本领域技术人员已知的适用于细胞生长的任何其他添加剂。细胞培养基的其他说明性示例包括但不限于rpmi 1640、clicks、aevi-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 15和x-vivo 20、optimizer，并添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使t细胞生长和扩增的量的细胞因子。
[0343]
在一些实施方案中，通过显微注射、转染、脂转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、deae-葡聚糖介导的转移等将编码car的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。在一些实施方案中，通过aav转导将编码car的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。aav载体可包含来自aav2的itr，以及来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10中的任一者的血清型。在一些实施方案中，aav载体包含来自aav2的itr和来自aav6的血清型。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导将编码car的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。慢病毒载体骨架可以来源于hiv-1、hiv-2、visna-maedi病毒(vmv)、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)、或猴免疫缺陷病毒(siv)。慢病毒载体可以是有整合能力的或整合酶缺陷型慢病毒载体(tdlv)。在一个实施方案中，使用了包含基于hiv的载体骨架(即，hiv顺式作用序列元件)的idlv载体。
[0344]
在某些方面中，提供了将包含特异性结合溶瘤病毒(ov)抗原的抗体的缀合物靶向个体中的癌细胞的方法。此类方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合ov抗原的抗体，其中个体中的癌细胞被ov感染并在其表面上表达ov抗原。根据一些实施方案，此类方法进一步包括，在向个体施用药物组合物之前，通过向所述个体施用有效量的ov来感染癌细胞。此类方法可用于例如治疗个体的癌症。
[0345]
缀合物的抗体特异性结合感兴趣的ov抗原，包括但不限于本文别处描述的任何ov
抗原。在某些实施方案中，ov抗原是天然ov抗原。例如，ov可以是上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒，或它们的工程化变体(例如，具有下文所述的ov修饰中的一种或多种ov修饰—例如，人gm-csf的转基因、胸苷激酶基因的缺失等—的工程化变体)，并且ov抗原对于ov是天然的。根据一些实施方案，ov抗原对于ov是异源的，例如，与ov异源的病毒抗原(例如，上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒ov抗原)、肿瘤抗原、或本文别处描述的任何其他异源ov抗原。
[0346]
根据本公开施用于个体的ov可以是野生型ov或经修饰的ov。根据一些实施方案，ov是经修饰的ov，其中所述经修饰的ov是包含来自不同病毒的两个或更多个结构域的嵌合ov。在一些实施方案中，ov是经修饰的ov(例如，非嵌合或嵌合ov)，其包含以下功能类别中的一种或多种功能类别中的一种或多种修饰：感染、复制、嗜性、提高的安全性、用于成像的报告基因、阻碍宿主抗病毒免疫应答、增强宿主抗肿瘤免疫应答等。根据一些实施方案，ov经修饰以：编码和表达人gm-csf；具有胸苷激酶基因缺失(限制或基本上限制病毒复制到具有高水平胸苷激酶的细胞，所述具有高水平胸苷激酶的细胞通常见于具有突变ras或p53基因的癌细胞中)；编码和表达报告基因(例如，lac z、萤光素酶等)；改变一个或多个编码核糖核苷酸还原酶(rr)的基因；破坏f2l基因(其编码病毒dutp酶，该酶参与维持dna复制的保真度并为胸苷酸合酶产生tmp提供前体)；表达治疗性蛋白质(例如，自杀基因—即编码能够将药物前体转化为细胞毒性化合物的蛋白质的基因，包括但不限于tk、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶、胸苷酸激酶等)；表达免疫刺激蛋白，其中“免疫刺激蛋白”是指具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力的蛋白质，包括细胞因子、趋化因子、生长因子等；以及它们的任何组合。上述任何经修饰的ov可编码本文别处描述的任何ov抗原。例如，经修饰的ov可以从上面题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”部分中描述的任何病毒进行修饰，并且ov抗原对于ov是天然的。根据一些实施方案，ov抗原对于经修饰的ov是异源的，例如，与经修饰的ov异源的病毒抗原(例如，上文题为“结合溶瘤病毒抗原的嵌合抗原受体”的部分中描述的任何病毒ov抗原)、肿瘤抗原、或本文别处描述的任何其他异源ov抗原。
[0347]
在某些方面中，提供了方法，所述方法包括施用包含被ov感染的细胞(例如，癌细胞)的药物组合物。所述药物组合物可进一步包含特异性结合受感染的细胞(例如，癌细胞)表达的ov抗原的抗体、缀合物或融合蛋白。细胞(例如，癌细胞)可能已在手术期间从个体身上去除。所述细胞(例如，癌细胞)可能已经在实验室中被改变(并被杀死)，以使它们在回输到患者体内时更容易由免疫系统进行攻击。然后，患者的免疫系统会攻击所述细胞和仍在体内的任何类似细胞。本公开的抗体、缀合物或融合蛋白可以根据这种方法用来促进专业apc上的fc受体对肿瘤粒子/抗原的摄取，从而导致针对肿瘤的免疫应答增强。
[0348]
药物组合物可以施用于多种个体中的任何一种个体。在某些方面，个体是“哺乳动物”或“哺乳动物类”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类内的生物体，包含食肉动物(例如狗和猫)、啮齿目动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类动物(例如人类、黑猩猩和猴子)。在一些实施方案中，个体是人。在某些方面，个体是细胞增殖性疾病(例如，癌症)的动物模型(例如，小鼠模型、灵长类动物模型等)。
[0349]
有需要的个体可能患有细胞增殖性病症。“细胞增殖性疾病”意指其中多细胞生物中的一个或多个细胞亚群发生不希望的细胞增殖，从而导致伤害(例如，疼痛或生物体预期
寿命缩短)的疾病。细胞增殖性疾病包含但不限于癌症、癌症前期、良性肿瘤、血管增殖性疾病(例如，关节炎、再狭窄等)、纤维化疾病(例如，肝硬化、动脉粥样硬化等)、银屑病、表皮囊肿和皮样囊肿、脂肪瘤、腺瘤、毛细血管瘤和皮肤血管瘤、淋巴管瘤、痣病变、畸胎瘤、肾瘤、肌纤维瘤病、成骨肿瘤、发育不良性肿块、系膜细胞增殖性疾病等。
[0350]
在一些实施方案中，个体患有癌症。本主题的方法可以用于治疗多种癌症。如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞的生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。可以使用本主题方法治疗的癌症的示例包含但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体的示例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、各种类型的头颈癌等。在某些实施方案中，个体患有选自以下的癌症：实体瘤、复发性多形性成胶质细胞瘤(gbm)、非小细胞肺癌、转移性黑素瘤、黑素瘤、腹膜癌、上皮性卵巢癌、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、转移性结直肠癌、结直肠癌、胰腺导管腺癌、鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、神经母细胞瘤、输卵管癌、膀胱癌、转移性乳腺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、复发性头颈癌、鳞状细胞癌、头颈癌、间变性星形细胞瘤、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌、鳞状非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤、转移性肾细胞癌、基底细胞癌(基底细胞上皮瘤)和胶质肉瘤。在某些方面，个体患有选自以下的癌症：黑素瘤、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌(rcc)、膀胱癌、非小细胞肺癌(nsclc)和头颈鳞状细胞癌(hnscc)。
[0351]
本公开的抗体、融合蛋白和缀合物可以通过选自以下的施用途径来施用：口服(例如，以片剂形式、胶囊形式、液体形式等)、肠胃外(例如，通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或硬膜外注射)、局部、鼻内或肿瘤内施用。
[0352]
本公开的抗体、融合蛋白和缀合物可以治疗有效量在药物组合物中施用。“治疗有效量”意指足以产生期望结果的剂量，例如，与对照相比，足以实现有益或期望的治疗(包含预防)结果(诸如使癌症的症状减轻)的量。关于癌症，在一些实施方案中，治疗有效量足以减慢肿瘤的生长、减小肿瘤的大小等。可以以一次或多次施用的方式来施用有效量。
[0353]
如上所述，本公开的方面包括用于治疗个体的癌症的方法。治疗意指至少改善一种或多种与个体的癌症相关联的症状，其中改善以广义使用以指至少降低与所治疗的癌症相关联的参数(例如，症状)的幅度。因此，治疗还包括完全抑制癌症或与其相关联的至少一种或多种症状的情况，例如，防止癌症或与其相关联的至少一种或多种症状发生或停止(例如，终止)所述癌症或与其相关联的至少一种或多种症状，使得个体不再患有癌症，或者至少不再患有表征所述癌症的症状。
[0354]
本公开的抗体、融合蛋白或缀合物可单独或与第二试剂组合施用于个体。感兴趣的第二试剂包括但不限于经美国食品和药物管理局和/或欧洲药品管理局(ema)批准用于治疗癌症的试剂。在一些实施方案中，第二试剂是免疫检查点抑制剂。感兴趣的免疫检查点抑制剂包括但不限于细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(pd-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(pd-l1)抑制剂、淋巴细胞激活基因-3(lag-3)抑制剂、t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(tim-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(ido)抑制剂、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)抑制剂、t细胞激活的v结构域
ig抑制物(vista)抑制剂、b7-h3抑制剂，以及它们的任何组合。
[0355]
当本公开的抗体、融合蛋白或缀合物与第二试剂一起施用时，所述抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂可以根据任何合适的施用方案施用于个体。根据某些实施方案，根据批准用于个体使用的投配方案施用缀合物和第二试剂。在一些实施方案中，与在不施用抗体、融合蛋白或缀合物的情况下施用第二试剂时所利用的投配方案相比，施用抗体、融合蛋白或缀合物允许根据涉及一种或多种较低和/或较少频率的剂量和/或减少的周期数的投配方案来施用第二试剂。在某些方面中，与在不施用第二试剂的情况下施用抗体、融合蛋白或缀合物时所利用的投配方案相比，施用第二试剂允许根据涉及一种或多种较低和/或较少频率的剂量和/或减少的周期数的投配方案来施用抗体、融合蛋白或缀合物。
[0356]
在一些实施方案中，将一个或多个剂量的抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂同时施用于个体。“同时”是指抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂存在于同一药物组合物中，或抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂在1小时或更短、30分钟或更短、或15分钟或更短内作为单独的药物组合物施用。
[0357]
在一些实施方案中，将一个或多个剂量的抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂连续施用于个体。
[0358]
然而，在一些实施方案中，抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂以不同组合物和/或在不同时间施用于个体。例如，可以在施用第二试剂之前(例如，在特定周期中)施用抗体、融合蛋白或缀合物。或者，可以在施用抗体、融合蛋白或缀合物之前(例如，在特定周期中)施用第二试剂。待施用的第二药剂可以施用一段时间，该时间在待施用的第一药剂施用至少1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时或高达5天或更久之后开始。
[0359]
在一个示例中，在施用抗体、融合蛋白或缀合物之前将第二试剂施用于个体达期望的时间段。在某些方面中，此类方案“引发”癌细胞以增强抗体、融合蛋白或缀合物的抗癌效应。将施用第二试剂的步骤与施用抗体、融合蛋白或缀合物的步骤分开的这种时间段具有足够的时长以允许引发癌细胞，理想地使得抗体、融合蛋白或缀合物的抗癌效应增加。
[0360]
在一些实施方案中，相对于其他试剂的施用，对一种试剂的施用进行具体地定时。例如，在一些实施方案中，施用抗体、融合蛋白或缀合物，以便观察特定效应(或预期观察到特定效应，例如基于示出给定投配方案与感兴趣的特定效应之间的相关性的群体研究)。
[0361]
在某些方面，可以评估或以经验确定组合施用的药剂的所需相对给药方案，例如使用离体、体内和/或体外模型评估或经验确定；在一些实施方案中，这种评估或经验确定在体内，在患者群体中(例如，以便建立相关性)，或者在特定的感兴趣个体中进行。
[0362]
在一些实施方案中，根据包含至少两个周期的间歇性投配方案施用抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂。当两种或超过两种试剂组合施用且每种试剂通过这种间歇的周期性方案施用时，不同试剂的单独剂量可以彼此相互交叉。在某些方面中，在第一试剂的剂量之后某一时间段施用一个或多个剂量的第二试剂。在一些实施方案中，在第一试剂的一个剂量之后的一段时间施用第二试剂的每个剂量。在某些方面，在施用第二试剂的一个剂量一段时间之后，接着施用第一试剂的每个剂量。在一些实施方案中，在第二试剂的至少一对剂量之间施用两个或更多个剂量的第一试剂；在某些方面中，在第一试剂的至少一对剂量之间施用两个或更多个剂量的第二试剂。在一些实施方案中，相同试剂的不同剂量以共同的时间间隔分开；在一些实施方案中，相同试剂的不同剂量之间的时间间隔变化。在某些方
面中，抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂的不同剂量以共同的时间间隔彼此分开；在一些实施方案中，不同试剂的不同剂量通过不同的时间间隔彼此分开。
[0363]
用于使两种间歇的周期性投配方案相互交叉的一个示例性方案可包括：(a)第一投配期，在此期间向个体施用治疗有效量的抗体、融合蛋白或缀合物；(b)第一休息期；(c)第二投配期，在此期间向个体施用治疗有效量的第二试剂；以及(d)第二休息期。用于使两种间歇的周期性投配方案相互交叉的第二示例性方案可包括：(a)第一投配期，在此期间向个体施用治疗有效量的第二试剂；(b)第一休息期；(c)第二投配期，在此期间向个体施用治疗有效量的抗体、融合蛋白或缀合物；以及(d)第二休息期。
[0364]
在一些实施方案中，第一休息期和第二休息期可以对应于相同的小时数或天数。可替代地，在一些实施方案中，第一休息期和第二休息期是不同的，第一休息期比第二休息期长，或者反之亦然。在一些实施方案中，休息期中的每一个对应于120小时、96小时、72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、30小时、1小时或更短时间。在一些实施方案中，如果第二休息期长于第一休息期，则可以将其定义为数天或数周而不是数小时(例如1天、3天、5天、1周、2周、4周或更长时间)。
[0365]
如果第一休息期的时长是由特定的生物学事件或治疗事件的存在或发展确定的，则第二休息期的时长可以单独或组合地根据不同因素来确定。示例性的此类因素可包括施用疗法所针对的癌症的类型和/或阶段；抗体、融合蛋白或缀合物的性质(例如，药代动力学性质)；和/或患者对用抗体、融合蛋白或缀合物的疗法的响应的一个或多个特征。在一些实施方案中，可以根据所施用的试剂中的一种或另一种试剂的药代动力学特性(例如，如经由血浆浓度水平评定的)来调节一个或两个休息期的时长。例如，当相关试剂的血浆浓度低于预定水平时，任选地在对个体响应的一个或多个特征进行评估或其它考虑时，可以认为相关的休息期完成了。
[0366]
在某些方面中，可以凭经验确定施用特定试剂的周期数。而且，在一些实施方案中，与一个或多个其它周期相比，一个或多个周期所遵循的精确方案(例如，剂量的数量、剂量的间隔(例如，相对于彼此或相对于另一个事件，如施用另一种疗法)、剂量的量等)可以是不同的。
[0367]
抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂可以通过任何合适的施用途径一起或独立地施用。可以通过独立地选自口服、肠胃外(例如，通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或硬膜外注射)、局部或鼻腔施用的施用途径施用抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂。根据某些实施方案，抗体、融合蛋白或缀合物和第二试剂均同时(在相同的药物组合物或单独的药物组合物中)或连续地口服施用(例如，以片剂形式、胶囊形式、液体形式等)。
[0368]
当所述方法进一步包括在向个体施用药物组合物之前通过向个体施用ov来感染癌细胞时，可以采用任何合适的施用方案来感染癌细胞。痘病毒复制发生在细胞质中，因为病毒复杂到足以获得基因组复制所需的所有功能。一旦进入细胞质，就由与芯相关的病毒酶进行基因表达。表达分为2个阶段：早期基因：其占基因组的约50％，并且在基因组复制之前表达；和晚期基因，其在基因组复制之后表达。表达的时间控制由晚期启动子提供，所述晚期启动子的活性依赖于dna复制。基因组复制被认为涉及自引发，从而导致形成高分子量多联体，所述高分子量多联体随后被切割和修复以制造病毒基因组。病毒装配发生在细胞骨架中，并且可能涉及与细胞骨架蛋白(例如，肌动蛋白结合蛋白)的相互作用。在细胞质中
形成了包涵体，所述包涵体成熟为病毒粒子。牛痘病毒在dna病毒中是独一无二的，因为它只在宿主细胞的细胞质中复制。因此，需要大基因组来编码病毒dna复制所需的各种酶和蛋白质。在复制期间，牛痘会产生以下几种外膜不同的感染形式：细胞内成熟病毒体(imv)、细胞内包膜病毒体(iev)、细胞相关包膜病毒体(cev)和细胞外包膜病毒体(eev)。
[0369]
为了用ov感染癌细胞，使用合适的施用途径施用ov。施用途径可以随癌症的位置和性质而变化，并且可包括例如皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、区域(例如，在肿瘤附近，特别是使用脉管系统或肿瘤的邻近脉管系统)、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗和口服施用和制剂。瘤内注射或直接注射到肿瘤脉管系统中被特别考虑用于离散的、实体的、可接近的肿瘤。局部、区域或全身施用也可能是合适的。可以有利地通过向肿瘤施用多次注射(例如以约1cm的间隔间隔开的多次注射)来接触病毒粒子。在适当的情况下也可以应用连续施用，例如通过将导管植入肿瘤中或肿瘤脉管系统中。此类连续灌注可以在施用开始后进行例如约1-2小时、至约2-6小时、至约6-12小时、或约12-24小时的时段。施用方案可能会有所不同，并且通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展以及患者的健康和年龄。某些类型的肿瘤将需要更积极的治疗，而与此同时，某些患者无法忍受更多繁重的方案。临床医生将最适合做出此类决定。
[0370]
核酸构建体的注射可以通过注射器或任何其他用于注射溶液的方法递送，只要表达构建体可以穿过注射所需的特定规格的针头即可。可用于施用ov的示例性无针注射系统在美国专利号5,846,233中例示。该系统的特征为喷嘴，所述喷嘴限定了用于保持溶液的安瓿室和用于将溶液从喷嘴推出到递送部位的能量装置。另一种示例性注射器系统是允许在任何深度处精确地多次注射预定量的溶液的注射器系统(美国专利号5,846,225)。ov粒子或编码其的核酸的混合物可以在与一种或多种赋形剂、载体或稀释剂适当混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物和油中制备。
[0371]
医生可能会开始以低于所需水平的水平的ov载体剂量开处方以达到所需的治疗效应，并逐渐增加剂量直至达到所需的效应。或者，医生可通过施用某一剂量的ov载体开始治疗方案，随后逐渐施用更低剂量直至达到治疗效应，例如一个或多个肿瘤的体积减小。
[0372]
以下实施例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
[0373]
实验
[0374]
实施例1-抗体生成
[0375]
使用来自wyeth vv毒株的a56或b5序列(分别为seq id no:180和seq id no:181)生成表达牛痘病毒a56(cho-a56)或b5衣壳蛋白(cho-b5)的稳定cho细胞系。通过连续半月皮下免疫接种cho-a56和cho-b5细胞(第一次注射每种细胞类型3000万，后续注射每种细胞类型4500万)与氢氧化铝(5mg/注射)和cpg(目录号odn1826，20μg/注射)混合的混合物。在第10次注射后一周，对兔子实施安乐死并收获脾脏(cedarlane)。按照babcook等人(1)的方法培养和分离b细胞。通过以下方式来鉴定抗体：通过流式细胞术筛选b细胞上清液与被vv western reserve毒株vvdd(egfp)(来自dr.john bell,ottawa hospital research institute(ohri)的礼物，seq id no:182和seq id no:183)感染的ovcar3细胞(atcc，目录号htb-161)结合(数据未显示)。为了从培养的b细胞中克隆抗体，将冷冻细胞解冻并通过a56.hfc或b5.hfc溶血空斑测定进行分析。人fc融合蛋白是使用如表2和表4中所列的来自wyeth vv毒株的a56或b5序列自制产生的。将分离的单个b细胞裂解并通过rt-pcr扩增抗体
v基因。然后将对应于匹配的抗体重链和轻链的pcr产物克隆到人igg1恒定区和igκ恒定区构建体(ptt5/igg1、ptt5/igk)中。为了产生重组抗体，使用293fectin(thermo，目录号12347019)将vh和vl链质粒转染到hek293-6e细胞中。在分泌96小时后，通过离心和无菌过滤(0.22μm)清除含有抗体的上清液中的细胞。在akta express系统上使用hitrap mab select sure柱(ge，目录号：11003495)和hiprep 26/10脱盐柱(ge，目录号17508701)纯化抗体。通过sds-page、uplc-sec和lc-ms测试抗体的纯度。产生的抗体的序列显示在表1和表3中。抗体id和形式在下表15中列出。
[0376]
表15
–
抗体id和格式
[0377][0378]
实施例2
–
抗体与a56和b5抗原结合
[0379]
使用lenti-x293t(clontech，目录号632181)细胞产生稳定的细胞系，从而产生在细胞表面上表达抗原a56(wyeth vv序列)或b5(wyeth vv序列)的hek-a56(gfp)和hek-b5(gfp)细胞。将a549(atcc，目录号ccl-185)和caov3(atcc，目录号htb-75)肿瘤细胞在适当的培养基(a549-f-12k营养混合物(gibco，目录号21127-022)；补充有10％fbs(corning，目录号35-015-cv)的caov3-dmem(gibco，目录号11995-040))中生长至80-90％汇合。在无血清rpmi(gibco，目录号a10491-01)中以为0.5的感染复数用vvdd(egfp)感染细胞，并在37℃在5％co2中孵育6.5小时。将孔以1:2补充生长培养基，并进一步孵育过夜。将a549细胞进行胰蛋白酶消化，并与caov3细胞一起以约1
×
105个细胞/孔接种在96孔v形底平板(sarstedt，目录号82.1583.001)中。对应的未感染的a549和caov3细胞，以及hek-a56(gfp)和hek-b5(gfp)和hek-wt细胞系也以4
×
104个细胞/孔接种。使用抗牛痘病毒兔多克隆抗体(cedarlane，目录号ls-c103289)作为阳性对照。
[0380]
将抗a56抗体(a047、a049、a050或a054)、抗b5抗体(a048或a051)和人igg同种型对照(sigma，目录号i5154)添加到细胞中并在冰上孵育25分钟。将细胞用pbs洗涤两次，在
450g下离心4分钟，并与1:100alexafluor 647缀合的抗兔igg(jackson，目录号115-605-046)或alexafluor 647缀合的抗人igg(jackson，目录号109-605-098)一起，使用1:1000的可固定活性染料efluor 780(ebioscience，目录号65-0865-14)在室温(rt)下孵育15分钟。用pbs洗涤两次后，将细胞在ic固定缓冲液(ebioscience，目录号00-8222-49)中固定10分钟，用pbs洗涤两次，重悬于pbs中的1％fbs中，并在bd lsrfortessa x-20hts系统上通过流式细胞术进行分析，并将数据用flowjo v 10.5.3软件处理。数据显示了抗体与被vv vvdd(egfp)感染的细胞的结合(图1)。具体地，抗a56抗体结合hek-a56(gfp)细胞，并且抗b5抗体结合hek-b5(gfp)细胞(图2)。没有观察到与阴性对照(hek亲本细胞、未感染的a549或caov3细胞)，以及同样在hek细胞中表达的不相关的vv抗原a33的结合(数据未显示)。同种型对照higg显示为不与细胞结合。
[0381]
测试了市售的抗b5抗体(immunetech，目录号it-012-009m1，使用vv western reserve免疫原培养的)与b5抗原的结合。使用与上述相似的测定条件，通过流式细胞术，将稀释系列的抗牛痘兔多克隆抗体与immunetech抗b5抗体(“it抗b5 igg”)以及同种型对照进行比较。对于it抗b5 igg和小鼠同种型对照的小鼠抗体检测，使用山羊抗小鼠a647(jackson,目录号115-005-146)。it抗b5 igg不与hek-b5细胞结合(图3，顶部小图)。用于评定与b5.hfc可溶性抗原结合的elisa证实了该抗体不结合基于vv wyeth b5序列制备的b5试剂。在该测定中，将b5.hfc以2μg/ml包被在maxisorp平板上，并在4℃孵育过夜。按照标准elisa工序，洗涤平板，在5％脱脂乳粉中封闭，将一抗在室温下在封闭中孵育1小时，并洗涤。使用山羊抗migg fc hrp(jackson，目录号115-035-071)或抗rb igg fc hrp(jackson immunoresearch，目录号111-035-046)在室温下进行二次检测1小时，然后洗涤，并加入50ul/孔的tmb k-blue(neogen，编号308175)，然后加入50μl/孔的1n hcl。通过标准elisa，it抗b5 igg与b5.hfc可溶性抗原的结合呈阴性(图3，底部小图)。
[0382]
还测试了it抗b5 igg与western reserve vvddegfp感染的a549和ht29细胞的结合。将a549和ht29细胞(atcc目录号htb-38，在mccoy 5a培养基(gibco编号16600-082) 10％fbs)培养至80-90％汇合。在无血清rpmi中以为1的感染复数用vvdd(egfp)感染细胞。将细胞在5％co2中在37℃孵育6.5小时，以1:2补充生长培养基，并进一步孵育过夜。将细胞进行胰蛋白酶消化，并以约1
×
105个细胞/孔接种在96孔v形底平板中。将抗b5抗体a048 higg1和it抗b5 igg和人类同种型对照加入到细胞中并在冰上孵育25分钟。将细胞进行洗涤，并使用alexafluor 647缀合的抗人igg和抗鼠igg(jackson，编号115-605-164)，然后是1:1000的可固定活性染料efluor 780来如上检测抗体。在pbs中的1％fbs中进行两次洗涤、固定和再悬浮后，在bd lsrfortessa x-20hts系统上通过流式细胞术分析样品。数据显示a048抗体比与it抗b5 igg更强地与western reserve vvddegfp感染的a549和ht29细胞结合(图4)。a048抗体与被感染的a549细胞和ht29细胞结合的ec50分别是6nm和1.1nm。it抗b5 igg与被感染的a549和ht29细胞结合的ec50分别是78nm和15.8nm。
[0383]
实施例3—革新为小鼠和兔抗体
[0384]
将抗体革新为全兔igg或嵌合兔/小鼠igg2a fc抗体，在hek293细胞中表达，并如前所述进行纯化。测试为兔igg或小鼠或人嵌合体的抗体与如上所述用vvdd(egfp)感染的a549细胞的结合。将抗a56抗体(a056、a049、a059)和抗b5抗体(a073、a048、a058)，以及兔igg同种型(jackson，目录号011-000-003)、人igg同种型(sigma aldrich，目录号i5154)和
biotech，目录号0100-01)，并使用leica sp5 x激光扫描共聚焦显微镜成像。数据证实a049与vv vvdd(egfp)感染的肿瘤组织结合，未观察到与未感染的肿瘤组织结合(图6)。多克隆兔抗牛痘病毒抗体显示出与未感染的肿瘤组织的非特异性结合。
[0389]
实施例5
–
对b5和a56蛋白的抗体亲和力
[0390]
使用biacore t200评定抗体亲和力。在series s cm5芯片上，将a048固定在fc2上，将a051固定在fc3上，并且fc1空白固定。通过注入edc和nhs激活传感器表面。将配体如下固定：将抗b5 a048 higg1(12μg/ml)在200μl ph 4.5的乙酸钠中制备，并将a051(12μg/ml)在200μl ph 5.0的乙酸钠中制备。通过注入乙醇胺来封闭剩余被激活的基团。最后，用50mm naoh洗涤芯片。将约1000ru的每种抗体胺偶联，然后用缓冲液进行芯片均衡。所有结合研究均在新制备和过滤的运行缓冲液hbs-ep (ge，目录号br100188)中执行。将b5.hfc(mw 150kda)作为分析物以30μl/min缔合的速度流过浓度不断增加的抗原(1.5nm、4.6nm、13.8nm、41.4nm和124nm)200秒，然后进行单次30分钟解离。在每个循环结束时，通过以30μl/min注入ph 1.5、10mm甘氨酸60秒来再生igg捕获表面。注入不含分析物的运行缓冲液以用于双重参考减算。使用1:1langmuir结合进行曲线拟合。
[0391]
为a56抗体设置类似的实验条件，不同之处为使不同浓度的a56.hfc流过传感器(0.6nm、1.9nm、5.6nm、16.7nm和50nm)。表观kd被列出，由于使用二价抗原b5.hfc和a56.hfc，与抗体的相互作用可能不是简单的1:1结合(表17)。在这些条件下无法确定a051的亲和力，因为它已达到biacore t200的检测限。
[0392]
表17
–
抗体对a56或b5蛋白的亲和力
[0393] ka(1/ms)kd(1/s)表观kd(nm)a047(a56)1.92
×
1044.50
×
10-5
2.34nma049(a56)3.95
×
1052.27
×
10-5
≤0.1nm*a050(a56)9.98
×
1045.07
×
10-5
0.507nma054(a56)9.25
×
1051.41
×
10-2
15.32nma048(b5)2.967
×
1042.209
×
10-5
0.745nm
[0394]
*接近检测限
[0395]
评定抗体对a56.hfc或b5.hfc的亲和力。
[0396]
实施例6—表位分箱
[0397]
根据制造商的方案，使用ez-link sulfo-nhs-lc-biotin(thermo，目录号21343)以20:1的比率对抗体进行生物素化。使用vvdd(egfp)以0.5的moi感染a549细胞，并在测定前一天固定。在测定当天，将病毒感染的a549细胞与25μg/ml的非生物素化的抗体一起预孵育并孵育1小时。然后将生物素化的抗体(10μg/ml)加入96孔v型底平板的孔中至5μg/ml的最终浓度，并孵育1小时。最后，使用链霉亲和素-alexa647(jackson，目录号016-600-084)执行检测以检测所结合的生物素化的抗体。在intellicyt htfc高通量流式细胞仪上采集样品。使用抗卵白蛋白抗体(内部药物研究与开发中心(in-house centre for drug research and development,cdrd))作为不相关的对照igg。数据表明抗a56抗体似乎与a56上的不同表位结合，因为当将第二抗体加入到vavc包被的平板时，观察到了与所测试的第一抗体相似的结合。同样，数据表明抗b5抗体似乎结合b5上的不同表位(图7)。
[0398]
实施例7
–
抗体与病毒粒子的结合
[0399]
将96孔板(corning，目录号3368)用9
×
106pfu/ml的vvdd(egfp)在碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)中的溶液以50μl/孔包被。在4℃孵育过夜后，将经包被的孔用pbs洗涤三次，加入固定缓冲液并孵育10分钟。然后将经包被的孔用蒸馏水洗涤四次。将孔在室温下用5％脱脂乳粉的pbs溶液封闭1小时。将抗体(a049、a047、a050、a054、a048、a051)在封闭缓冲液中从20μg/ml的起始浓度开始以1:4的比例稀释和滴定。nkp30是一种nk细胞细胞毒性受体，已显示为结合vva56(2)。将nkp30-his(in-house)可溶性蛋白以20μg/ml或1μg/ml作为阳性对照进行测试，并将higg1作为阴性对照进行测试。将孔用水洗涤四次，并加入50μl/孔的抗体并在室温下孵育1小时。随后，将孔用水洗涤，加入0.2μg/ml的hrp缀合的山羊抗higg fc(jackson，目录号109-035-098)在封闭缓冲液中的溶液，并在室温下孵育1小时。在洗涤后，加入50μl/孔的tmb(neogen，目录号308177)并将平板在室温下孵育30分钟。用50μl的1mhcl停止显色。使用spectromax酶标仪测量450nm处的吸光度，并使用softmaxpro处理数据。数据显示除a054外的所有测试抗体都与vvdd(egfp)的病毒粒子结合(图8)。
[0400]
实施例8
–
抗体对病毒感染的影响
[0401]
将a549细胞以5
×
104个细胞/孔接种在96孔平底平板(flacon，目录号353075)中，并在37℃、5％co2下粘附过夜。将不同moi(1.5
×
106pfu/ml(moi 1)、1.5
×
105pfu/ml(moi 0.1)和1.5
×
104pfu/ml(moi 0.01))的vvdd(egfp)与等体积的20μg/ml的a047、a048、a049、a050、a051、a054、higg(sigma，目录号i5154)或1:100牛痘病毒多克隆抗体(cedarlane，目录号ls-c103289)一起在无血清f-12k营养混合物(gibco，目录号21127-022)中在室温下孵育15分钟。在37℃、5％co2下用vvdd(egfp)/抗体混合物感染细胞6.5小时，然后以1:2稀释度加入补充有10％fbs(corning 35-015-cv批次35015124)的f-12k营养混合物(gibco，目录号21127-022)，并培养过夜。在孵育后，将贴壁细胞进行胰蛋白酶消化并与非贴壁细胞一起铺板，转移至96孔v型底平板(sarstedt，目录号82.1583.001)。将细胞以450g离心4分钟，重悬于1:1000可固定活力染料efluor 780(ebioscience，目录号65-0865-14)中并在室温下孵育15分钟。然后将细胞用pbs洗涤，用ic固定缓冲液(ebioscience，目录号00-8222-49)在室温下固定10分钟，用pbs洗涤，最后重悬于1x pbs中，其中每孔6000个countbright绝对计数珠粒(invitrogen，目录号c36950)。在bd lsrfortessa x-20hts系统上通过流式细胞术分析样品，并用flowjo v 10.5.3软件处理数据。数据表明，加入这些抗体不会抑制或减少vvdd(egfp)对肿瘤细胞的感染(图9)。
[0402]
实施例9
–
抗体热稳定性
[0403]
使用protein thermo shift dye kit
tm
(thermofisher，目录号4461146)以差示扫描荧光法(dsf)测定抗体的变性温度(tm)。简而言之，在每个反应中使用31μg/ml的抗体。使用具有试剂盒手册中所述的推荐设置的applied biosystems quantstudio 7flex实时pcr系统生成抗体的解链曲线。然后通过使用thermofisher protein thermal shift软件(v.1.3)确定抗体的tm(表18)。通过dsf确定抗体的tm1。
[0404]
表18
–
抗体热稳定性
[0405]
[0406][0407]
实施例10
–
抗体与被哥本哈根牛痘感染的鼠细胞系的结合
[0408]
b16f10(atcc，目录号crl-6475)、ct26lacz(atcc，目录号crl-2639)和mc38(来自dr.john bell,ohri的礼物)肿瘤细胞在10cm组织培养板(thermo scientific，目录号12-556-002)中的补充有10％fbs(gibco，目录号12483020)的适当培养基(b16f10-dmem(gibco，目录号11995-040)；mc38-dmem(gibco，目录号11995-040)；ct26lacz-rpmi1640(gibco，目录号11875-093))中生长至80-90％汇合。在无血清dmem(gibco，目录号11995-040)中以0.5的感染复数用vvcopenhagen(yfp)(来自dr.john bell,ohri的礼物)感染细胞，并在5％co2中在37℃孵育6.5小时。将平板以1:2的比率补充生长培养基，并进一步孵育过夜(约16小时)。b16f10细胞进行胰蛋白酶(tryple，目录号12604021)消化，并以约1
×
105个细胞/孔与ct26lacz和mc38细胞一起在96孔u形底平板(sarstedt，目录号83.3925)中接种。对应的未感染的b16f10、ct26lacz和mc38细胞也以1
×
105个细胞/孔接种。将细胞用pbs 3％fbs(facs缓冲液)洗涤两次，并以1800rpm离心3分钟。将细胞重悬于pbs中，并与1:3000可固定活力染料zombie nir(biolegend，目录号423106)一起在室温下孵育15分钟。用facs缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于含有小鼠fc封闭剂(bd，目录号553141)的facs缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。无需进一步洗涤，就将细胞直接用1:100的抗a56-pe(a056，rb igg)、1:100的抗b5-pe(a073，rb igg)或1:100的抗牛痘病毒兔多克隆抗体(cedarlane，目录号ls-c103289)(其作为阳性对照)染色，并在4℃孵育30分钟。将细胞用facs缓冲液洗涤两次并重悬。然后用1:100的抗兔igg-pe(biolegend，目录号406421)对接受了抗牛痘病毒一抗的孔进行染色，并在4℃再孵育20分钟。用facs缓冲液再次洗涤后，将细胞在ic固定缓冲液(ebioscience，目录号00-8222-49)中固定10分钟，用pbs洗涤两次，重悬于facs缓冲液中，并在cytek aurora流式细胞仪上通过流式细胞术进行分析。使用flowjo v 10.5.3软件处理数据。数据显示了每个感染细胞系中yfp表达百分比，表明了感染vvcopenhagen(yfp)的细胞的比例(图10a)。发现抗a56-pe和抗b5-pe抗体结合b16f10、ct26lacz、以及根据其yfp阳性被vvcopenhagen(yfp)感染的mc38细胞(图10b)。正如预期的那样，抗牛痘病毒兔多克隆抗体也与受感染的(yfp阳性)细胞结合。未观察到与未感染的阴性对照细胞的结合。
[0409]
实施例11
–
牛痘a56和b5的免疫组织化学检测
[0410]
将hek-b5(gfp)细胞系在10个15cm组织培养板(corning，目录号353025)中补充有10％fbs(gibco，目录号12483020)的合适培养基(hek-dmem(gibco，目录号11995-040))中生长至90％汇合。此外，使u2os细胞(来自dr.john bell,ohri的礼物)生长至90％汇合，并用vvcopenhagen(yfp)以0.025的感染复数感染，并在5％co2中37℃孵育72小时。将hek-a56、hek-b5、hek-wt和u2os细胞进行胰蛋白酶(tryple，目录号12604021)消化，计数，并在15ml聚丙烯管(froggabio，目录号tb15-500)中重悬至2
×
108个细胞/ml的浓度。将细胞以
1500rpm离心5分钟，重悬于1ml熔融组织凝胶(thermo scientific，目录号hg-4000-012)中，并在冰上放置10分钟以使组织凝胶凝固。将组织凝胶丸粒转移到10ml 10％中性缓冲福尔马林(sigma，目录号ht501128)中，并在室温下放置24小时。为了进行免疫组织化学(ihc)，将组织凝胶切片(4μm)在37℃下孵育过夜，脱蜡，使用二甲苯和乙醇梯度再水化，并在biocare decloaking腔室中使用diva decloaker试剂(biocare,目录号dv2004)进行抗原修复(在110℃进行15分钟)，然后装入intellipath flx自动染色器中。在室温下使用biocare试剂执行brightfield ihc。将载玻片用peroxidased-1(biocare，目录号px968)处理5分钟，然后用background sniper(biocare，目录号bs966)处理10分钟。施加在davinci green(biocare，目录号pd900)中稀释的一抗30分钟，然后施加mach2 hrp聚合物(小鼠或兔的，基于一抗的物种)(biocare，目录号rhrp520和mhrp520)30分钟。将dab辣根过氧化物酶(biocare，目录号ipk5010g80)色原底物加入到载玻片中。在室温下加入用dh2o以1:5稀释的cat苏木精(biocare，目录号cathe)5分钟。将染色的载玻片用水洗涤，风干并使用ecomount(biocare，目录号em897l)加盖玻片。抗体稀释度如下：a058抗b5，rb/mu igg2a，1/280(10μg/ml)；a059抗a56，rb/mu igg2a，1/540(10μg/ml)；a056抗a56，rb igg，1/840(10μg/ml)；a073抗b5，rb igg，1/550(10μg/ml)。a56或b5特异性抗体能够分别在稳定转染的hek-a56和hek-b5细胞上特异性检测靶抗原(图11)。未观察到针对替代抗原或hek-wt细胞的交叉反应性。抗a56和抗b5抗体都能够检测到受感染的u2os细胞上的蛋白质表达，并且在未感染的u2os细胞上未检测到背景染色(图11)。
[0411]
实施例12
–
来自经vv处理的肿瘤的a56和b5的免疫组织化学检测
[0412]
将c57bl/6野生型小鼠(jackson laboratory，目录号000664)在右后侧皮下植入1
×
106个b16f10(atcc，目录号crl-6475)肿瘤细胞。小鼠分组如下：1剂vvcopenhagen(yfp)、2剂vvcopenhagen(yfp)、pbs、和水疱性口炎病毒(vsv)(来自dr.john bell,ohri的礼物)。所有注射的剂量均为在100μl体积中1
×
107pfu，并在肿瘤达到35-40mm2大小时进行瘤内递送。动物在第一次注射后1天、2天、3天或7天实施安乐死。收集肿瘤并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。固定后，将肿瘤包埋在石蜡中，并从每个切除的肿瘤中取出1-5个2mm的肿瘤穿孔(tumor punch)。将肿瘤穿孔排列以创建肿瘤组织微阵列(tma)并切片到载玻片上。为了进行ihc，将tma切片(4μm)在37℃下孵育过夜，脱蜡，使用二甲苯和乙醇梯度再水化，并在biocare decloaking腔室中使用diva decloaker试剂(biocare,目录号dv2004)进行抗原修复(在110℃进行15分钟)，然后装入intellipath flx自动染色器中。在室温下用biocare试剂执行明场ihc。将载玻片用peroxidazed-1(biocare，目录号px968)处理5分钟，然后用background sniper(biocare，目录号bs966)处理10分钟。施加在davinci green(biocare，目录号pd900)中稀释的一抗30分钟，然后施加mach2 hrp聚合物(鼠类或兔的，基于一抗的物种)(biocare，目录号rhrp520和mhrp520)30分钟。将dab辣根过氧化物酶(biocare，目录号ipk5010g80)色原底物加入到载玻片中。在室温下加入用dh2o以1/5稀释的cat苏木精(biocare，目录号cathe)5分钟。将染色的载玻片用水洗涤，风干并使用ecomount(biocare，目录号em897l)加盖玻片。将载玻片用抗a56(a056)或抗b5(a073)rb igg染色，并用抗兔二抗检测。抗体稀释度如下：a056抗a56，rb igg，1/840(10μg/ml)；a073抗b5，rb igg，1/550(10μg/ml)。dab染色(深灰色)指示阳性蛋白检测(图12)。针对a56或b5的抗体能够特异性地检测取自经处理的肿瘤的大多数核心上的靶抗原。在接受多次
vvcopenhagen(yfp)剂量的肿瘤上，蛋白质检测明显增加。对经pbs或vsv处理的肿瘤没有明显的交叉反应性。这些发现证明了在瘤内递送牛痘病毒后病毒来源的a56和b5蛋白表达的特异性检测和程度。
[0413]
实施例13
–
vv嵌合抗原受体(car)的设计和慢病毒转导后的检测
[0414]
人类vv-car构建体均含有gm-csfrα前导序列之后是a56或b5 scfv(源自a56：a049，b5：a048)、人类cd8α铰链和跨膜结构域、人类4-1bb细胞内信号传导结构域、和人类cd3ζ细胞内信号传导结构域(图13a)(3)。一些car构建体包括由t2a核糖体跳跃序列分隔的报告蛋白(例如egfp)。car的氨基酸序列在表7中提供。
[0415]
编码a56-car-01、a56-car-02、b5-car-03、b5-car-04或a56-car-06的基因片段由twist biosciences合成。将基因片段克隆到第2代转移质粒(来自dr.robert holt,bc cancer的礼物)中。使用标准磷酸钙转染方案(4)和第二代包装载体(来自dr.rob holt bc cancer的礼物)生成编码vv-car构建体的慢病毒。将jurkat t细胞(atcc，目录号tib-152)用来自每次慢病毒转染的500μl上清液进行转导。然后将jurkat细胞扩增1周，并根据山羊抗rb igg f(ab')2-alexa fluor 647检测(jackson laboratories，目录号111-605-047)分选出1
×
106个car阳性细胞。将富集的jurkat car阳性群体再扩增一周，并与hek-a56、hek-b5或hek-wt细胞一起接种在共培养测定中。将细胞以1:1的效应物:靶标(e:t)比率(1
×
105个总细胞)培养过夜(16小时)。第二天，将细胞用pbs洗涤，用正常山羊血清(jackson laboratories，目录号005-000-001)封闭，并用抗rb igg alexa fluor 647针对cd45 v450(bd，目录号560367)、cd69 pe-cy7(biolegend，目录号310912)进行染色。a56-car-01、a56-car-02和a56-car-06在与靶hek-a56系一起培养时表现出细胞表面car分子的下调；细胞表面car分子的这种下调表明了car激活(图14)。类似地，b5特异性car、b5-car-03和b5-car-04在与靶hek-b5系一起培养时表现出表面car的下调。当car-t细胞与hek wt系或不相关的靶抗原一起培养时，不存在car下调。这些数据表明，被转导以表达a56或b5特异性car的效应t细胞在遇到带有适当抗原(分别为a56或b5)的靶细胞时经历激活(如通过细胞表面car表达的下调所证明的)。
[0416]
实施例14
–
活化的a56-car-06阳性jurkat细胞上的car和egfp表达
[0417]
将共表达egfp的jurkat a56-car-06系与hek-a56系一起培养过夜(16小时)，如从实施例13的结果所预期的，观察到了car表达降低(图15)。然而，在car“阴性”群体内，观察到了egfp阳性群体。此外，egfp阳性群体表现出cd69(一种t细胞活化标志物)的表达增加，而egfp阴性群体表现出最小的cd69表达。cd69上调表明car-t细胞识别带有适当抗原(在这种情况下为a56)的靶细胞。这些结果表明，在遇到带有适当抗原(在这种情况下为a56)的靶细胞后，car-t细胞表现出细胞表面car表达的下调，但仍然可以通过egfp和cd69表达来鉴定，后者提供了通过car进行靶细胞识别的独立证据。
[0418]
实施例15
–
表达vv-cars的jurkat t细胞在与带有适当靶抗原的hek细胞系共培养时显示出特异性活化
[0419]
将表达a56-car-01、a56-car-02、b5-car-03、b5-car-04或a56-car-06的jurkat t细胞与hek-wt、hek-a56或hek-b5稳定细胞系一起以1:1的e:t比率一式三份地进行共培养，每种条件下1
×
105个总细胞。将细胞在5％co2中于37℃培养过夜(16小时)。第二天，将细胞用pbs洗涤，在正常山羊血清中封闭，并针对cd45、cd69、抗rb igg进行染色。然后评定cd45
jurkat群体的cd69表达。所有测试的car当与表达适当靶抗原的细胞共培养时均显示出cd69表达增加，但与表达不相关靶抗原的hek wt细胞或hek细胞共培养时cd69表达最低(图16)。这些发现表明，针对a56和b5的car-t细胞表现出对表达适当抗原(分别为a56和b5)的靶细胞的特异性识别，并显示出最小的交叉反应性和/或组成性活性(滋养信号传导)。
[0420]
实施例16
–
转导并富集a56-car-06表达的原代健康供体t细胞
[0421]
从健康供体pbmc样本中分离出cd4 和cd8 t细胞群。将5
×
105个健康供体t细胞用miltenyi transact
tm
(miltenyi biotec，目录号130-111-160)激活，并在补充有3％人血清(sigma，目录号h4522)、硫酸庆大霉素(sandoz,din:02268531)和人类白介素7(miltenyi biotec，目录号130-095-367)和白介素15(miltenyi biotec，目录号130-095-764)(10μg/ml)的miltenyi texmacs gmp(miltenyi biotec，目录号170-076-309)培养基中生长。激活后24小时，用a56-car-06慢病毒以0.25的moi转导t细胞。在接下来的12天中，将细胞以低于1
×
106个细胞/ml的密度扩增。在扩增后，使用流式细胞仪对一部分a56-car-06转导的t细胞进行egfp阳性分选。将2
×
105个细胞分选为高纯度，并接种在96孔圆底平板的单孔中。将分选的群体如上所述激活并再扩增12天，保持细胞密度低于1
×
106个细胞/ml。通过流式细胞术，最终扩增的富集群体》95％car阳性(图17)。这些发现表明，原代pbmc来源的人类t细胞可以很容易地转导以表达vv-car构建体，并且可以在转导后进行富集和扩增。
[0422]
实施例17
–
表达a56-car-06的人类t细胞当与表达a56的hek293t细胞系共培养时显示出特异性活化
[0423]
将表达a56-car-06的人类t细胞与hek-wt、hek-a56或hek-b5系一起以1:1的e:t比率一式三份共培养过夜(16小时)，每种条件下总共1
×
105个细胞。第二天，将细胞用pbs洗涤，用正常山羊血清封闭，并染色以检测cd3 bv510(biolegend，目录号317332)、cd45、cd69、cd137 bv650(biolegend，目录号564092)、抗rb igg的表达。通过流式细胞术评定cd3 egfp t细胞群的cd69和cd137表达。a56-car-06转导的t细胞当与表达a56靶抗原的细胞共培养时显示出cd69和cd137表达增加，但当与hek-wt细胞或表达无关抗原的hek细胞共培养时cd69和cd137的表达最小(图)。这些发现表明，当与在其表面上表达a56抗原的靶细胞一起培养时，经转导以表达a56-car-06的原代t细胞表现出特异性活化。
[0424]
实施例18-表达a56-car-06的人类t细胞在表达a56的靶细胞中诱导细胞死亡的形态学迹象
[0425]
将hek-wt、hek-a56或hek-b5细胞(各2
×
105个)接种在24孔组织培养板中并放置过夜以贴壁。第二天，每孔加入1
×
105个a56-car-06t细胞，并将细胞再培养48小时。图像描绘了当与a56-car-06阳性t细胞共培养时hek-a56靶细胞系的明显形态变化，表明肿瘤细胞被直接杀死。相比之下，hek-wt和hek-b5系保持完全汇合，没有形态变化(图19)。这些发现显示与a56-car-06t细胞一起共培养后破坏了hek-a56细胞单层，提供了直接致细胞病变效应的证据。
[0426]
实施例19-表达b5-car-011的人类t细胞表现出对表达b5的靶细胞的细胞毒性
[0427]
如先前在实施例13中所述，使用编码萤火虫荧光素酶的哺乳动物表达转移质粒pccl luc puromycin(来自dr.jonathan bramson,mcmaster university的礼物)产生慢病毒。将hek-wt、a56和b5系用这种编码荧光素酶的慢病毒转导，并在2周内选择对嘌呤霉素(1.5μg/ml，sigma，目录号p8833)的抗性。将嘌呤霉素抗性细胞培养物扩增并用作vv-car杀
healthcare,london,united kingdom)将
89
zr标记的抗体与游离的
89
zr分离，并使用50kda截留分子量的过滤器(millipore corp.)浓缩。在配备有1200型四元泵、1200型紫外吸收检测器和bioscan(washington dc,usa)nai闪烁检测器的agilent hplc系统(santa clara,ca,usa)上，使用尺寸排阻hplc柱(biosep-sec-s3000,phenomenex,torrance,california,usa)测定
89
zr-dfo-a049的比活性。hplc缓冲液是等度梯度的0.1m二水合磷酸二氢钠、0.1m十二水合磷酸氢二钠、0.1m叠氮化钠和0.15m氯化钠(ph 6.2-7.0)。获得了0.1mbq/μg的比活性，这足以用于放射免疫缀合物的体内表征。如前所述使用itlc-sg测定最终放射化学纯度，所述最终放射化学纯度》99.9％。
[0433]
抗体免疫反应性
[0434]
89
zr-dfo-a049的免疫反应性分数是根据lindmo细胞结合法，使用经稳定修饰以表达a56抗原(wyeth vv序列)的hek-293细胞(hek-a56)估计的。简而言之，将hek-a56细胞以1.0至24.6
×
106个细胞/ml的不同浓度悬浮在pbs ph 7.4中。其余工序如前所述(9)执行。结果表明，52％的
89
zr-dfo-a049仍然有效地与a56蛋白结合。
[0435]
动物肿瘤模型和抗体注射
[0436]
所有动物实验均在bc癌症研究中心的动物资源中心(animal resource centre of the bc cancer research centre)根据niversity of british columbia animal care committee(vancouver,british columbia,canada)的机构指南并在授权调查员的监督下执行。12周龄雌性免疫缺陷型nod.cg-rag1tm1mom il2rgtm1wjl/szj(nrg)小鼠(从内部繁殖集落获得)在左肩皮下注射hek-a56细胞或在右肩皮下注射不表达a56的亲本hek-293细胞(n＝8只小鼠)。对于两种细胞系，将5
×
106个细胞注入基质胶(1:1比率，bioscience,mississauga,ontario,canada)。
[0437]
正电子放射断层造影术(pet)
[0438]
当肿瘤达到成像尺寸(约100mm3)时，用氧气中2％的异氟醚麻醉小鼠，并静脉内注射
89
zr-dfo-a049(40.9
±
1.5μg，4.1
±
0.2mbq)。使用siemens(knoxville,tn,usa)inveon微型pet/ct扫描仪在注射后1天、3天和5天采集一只小鼠的pet图像。小鼠接受ct扫描以进行衰减校正，之后在第1天和第3天进行20分钟静态pet采集，并在第5天进行30分钟扫描。使用3维有序子集期望最大化(osem3d，2次迭代)之后是快速最大先验算法(fastmap：18次迭代)来重建图像。最大强度投影图像显示了由于抗体加工和新陈代谢在正常器官(例如肝和脾)中的预期积累，以及由于已知的
89
zr-dfo缀合物在小鼠(特别是在高骨重塑区域，例如长骨骨骺中)中的去金属化导致的骨摄取(10)。更重要的是，pet图像显示与阴性对照(hek-293)相比，hek-a56肿瘤的肿瘤摄取和肿瘤与背景比率更高，表明了
89
zr-dfo-a049抗体的特异性和有效肿瘤摄取(图21)。
[0439]
89
zr-dfo-a049生物分布的评定
[0440]
在第5天，对所有小鼠实施安乐死，并收集感兴趣的器官用于如前所述进行生物分布研究(9)。
89
zr-dfo-a049的结果如表19所示。
[0441]
表19
–
在第5天在表达a56的hek(hek-a56)和不表达的hek-293荷瘤小鼠中
89
zr-dfo-a049的生物分布。这些值表示为注射剂量的平均值
±
标准偏差百分比/克组织(％id/g)；每个时间点n＝8。显示了hek-a56与hek之间的统计差异(**，p《0.05，t检验)。
[0442][0443][0444]
生物分布结果证实了pet图像观察结果与预期的放射免疫缀合物在正常器官中的生物分布。关于肿瘤，相较于在不表达的hek肿瘤中的1.44
±
0.25％id/g(n＝8，p《0.05)，在表达a56的hek肿瘤中获得了7.71
±
4.52％id/g的更高摄取。因此，这些体内结果(pet成像和生物分布研究)确立
89
zr-dfo-a049可以有效且选择性地递送至表达a56的肿瘤。
[0445]
靶向在被ov感染的肿瘤细胞的表面上表达的溶瘤病毒编码蛋白的抗体在用放射性核素标记时可允许进行诊断、治疗和治疗诊断应用，例如，通过pet成像对ov感染进行体内成像，和通过放射免疫疗法局部递送治疗放射性同位素以杀死被ov感染的细胞以及未感染的邻近肿瘤细胞(11,12)。
[0446]
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[0459]
因此，以上仅说明本公开的原理。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种布置，尽管未在本文明确描述或示出，但所述各种布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有示例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开
发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不旨在限于本文示出和描述的示例性实施方案。