一种鱼露鲜味肽及其制备方法、鲜味强度评价方法和应用

1.本发明涉及呈味物质技术领域，具体地，涉及一种鱼露鲜味肽及其制备方法、鲜味强度评价方法和应用。


背景技术：

2.鱼露是一种以海洋低值鱼为主要原料，进行盐渍后，在自然条件下，通过耐盐性、嗜盐性微生物和鱼体自身的蛋白酶等对鱼体中的蛋白质、脂肪等成分进行长期发酵分解，形成的风味独特，味道鲜美的液体调味品。鲜味作为五大基本味觉之一，是人们日常饮食中努力追求的美味，其对食品滋味具有重要贡献，能使人产生舒服愉快的感觉。鲜味肽是一种分子量约为150～3000da，具有增鲜、增香及增强食品整体味感作用的具有鲜味的小分子多肽，并且有良好的加工特性、热稳定性以及营养价值。鲜味肽不仅本身具有鲜味，而且可以掩盖和减弱苦味以改善食品的风味，与其他物质协同增鲜还可以减少食盐和msg的摄入。
3.目前，鲜味肽的呈味评价方法主要包括感官评价法、电子舌分析法和味觉生物传感器检测法。
4.感官评价法是许多味觉评价的常用方法，是利用人的味觉器官来分析呈味物质的特性，由味蕾感觉不同化学物质的刺激信号，通过与标准品进行对比，得出不同物质的味觉强度。采用滋味稀释法和定量描述分析法对鲜味肽进行阈值分析和滋味轮廓描述。尽管感官评价小组成员经过了良好的培训和校准，但仍可能存在主观影响，如心理或生理因素对专家组成员的主观性是一个重要影响因素。且感官评价只适于定性检测，不能准确地对鲜味强度进行定量分析。
5.电子舌是一种基于电化学传感器技术模拟人体味觉感受建立的定性定量分析仪器。电子舌分析与感官评价法相比排除了主观影响，使得到的数据更准确，且具有更高的灵敏性。当溶液具有不良风味或有毒物质时，电子舌也可以客观地进行检测。由于其可靠性和可重复性，它已被广泛用于各种食品中鲜味强度的评估，在鲜味肽的评价中也占据主要地位。但其终究是无法在生理水平上检测鲜味，无法真正反应人类的感官结果，且难以做到鲜味强度的准确定量。
6.基于电化学物质的味觉生物传感技术由生物传感元件(识别元件)、物理化学传感器(如氧电极、场效应管、光敏管、压电晶体等)和信号放大器件组成。其中，能够产生敏感和选择性分析信号的生物材料被用作生物识别元件，包括微生物、酶、抗体、抗原、细胞、组织、蛋白质、神经和其他生物活性物质。这些功能性生物识别元件不仅能对味觉刺激做出反应，而且还可以传递化学信号。味觉细胞可以作为生物传感器的功能性生物元件，但大多数突触前味觉细胞可以对多种味觉作出反应。鲜味受体蛋白也可以作为生物传感器的功能性生物元件，zoll er制造了以人源t1r1/t1r3蛋白作为检测元件的鲜味生物传感器，但其检测效率太低，且只能用于鉴定筛选鲜味肽，且不能定量鲜味肽的鲜味强度。


技术实现要素：

7.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种鱼露鲜味肽及其鲜味强度评价方法。
8.本发明的第一个目的是提供一种鱼露鲜味肽。
9.本发明的第二个目的是提供一种鱼露鲜味肽的制备方法。
10.本发明的第三个目的是提供所述的鱼露鲜味肽在制备食品、食品添加剂和/或保健产品中的应用。
11.本发明的第四个目的是提供一种含有所述鱼露鲜味肽的食品、食品添加剂和/或保健产品。
12.本发明的第五个目的是提供含有所述鱼露鲜味肽的待测物的鲜味强度评价方法。
13.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
14.因此，本发明从鱼露中分离鉴定出氨基酸序列如seq id no:1～5所示的鲜味肽，并建立了一种在生理水平上相对定量鲜味强度的方法。
15.一种鱼露鲜味肽，所述鱼露鲜味肽包含氨基酸序列如seq id no:1～5中的一条或几条所示的鲜味肽。
16.优选地，所述鲜味肽的鲜味阈值为0.55～0.80mmol/ml。
17.一种鱼露鲜味肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
18.s11.将鱼露发酵原液用截留分子质量为3000da的超滤膜分离，收集透过液，即得到膜超滤法分离产物。
19.s12.用sephadex g-15凝胶层析色谱分离纯化步骤s11的膜超滤法分离产物，得到凝胶层析色谱分离产物，所述凝胶层析色谱分离产物含有所述鱼露鲜味肽的组分；
20.分离条件为：层析柱的规格为1.6cm
×
70cm，上样量2ml，洗脱液为超纯水，流速1ml/min，检测波长220nm。
21.优选地，用反相高效液相色谱分离步骤s12的凝胶层析色谱分离产物；
22.分离条件：色谱柱为spursil 5μm c18，250
×
4.6mm；进样体积为20μl；流动相a为超纯水，流动相b为乙腈，检测波长220nm，等度洗脱：体积浓度7％b，93％a，流速1ml/min，洗脱时间20min；
23.得到反相高效液相色谱分离产物。
24.优选地，所述反相高效液相色谱分离产物根据出峰时间从早到晚，依次含有氨基酸序列如seq id no:1～5所示的鲜味肽。
25.所述的鱼露鲜味肽在制备食品、食品添加剂和/或保健产品中的应用。
26.一种含有所述鱼露鲜味肽的食品、食品添加剂和/或保健产品。
27.含有所述鱼露鲜味肽的待测物的鲜味强度评价方法，所述方法包括以下步骤：
28.混合过表达t1r1、t1r3和g16gust44蛋白的单克隆化稳转细胞和钙离子荧光探针，用荧光倒置显微镜采集细胞内钙离子荧光信号，
29.每5s自动进行一次图像采集，在第20s时加入含有所述鲜味肽的待测物和鲜度标准物谷氨酸钠，继续检测，整个检测过程持续240s，得到所述鲜味肽和鲜度标准物谷氨酸钠对应的钙离子相对荧光变化峰值；
30.将谷氨酸钠鲜度值定义为1。相对鲜度值u计算公式为：
31.u＝f
sample
/f
msg
，
32.其中，f
sample
表示所述鲜味肽的钙离子相对荧光变化峰值的最大值，f
msg
表示谷氨酸钠的钙离子相对荧光变化峰值的最大值，计算所述鲜味肽的相对鲜度值。
33.优选地，所述过表达t1r1、t1r3和g16gust44蛋白的单克隆化稳转细胞连接有t1r1、t1r3和g16gust44基因的重组表达载体；
34.所述t1r1基因的ncbi登录号为nm_138697，所述t1r3基因的ncbi登录号为nm_152228，所述g16gust44基因为gna15的c末端的44个氨基酸由gnat3的c末端的44个氨基酸替换得到，所述gna15基因的ncbi登录号为nm_002068，所述gnat3基因的ncbi登录号为nm_001102386。
35.优选地，采集细胞内钙离子荧光信号的激发波长为490nm，发射波长为514nm。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明公开了一种鱼露鲜味肽及其制备方法、鲜味强度评价方法和应用。本发明用膜超滤法、凝胶色谱法和反相高效液相色谱分离鱼露中鲜味肽，用nano lc-q-orbitrap-ms/ms鉴定肽的分子量和序列，通过peaks studio 8.5软件并结合手动从头测序解析主要峰的离子碎片，得到多肽的氨基酸序列。biopep database生物活性肽数据库在线分析小分子肽的生物活性，基于此数据库预测鲜味肽的呈味强度，并结合肽段相对强度和肽段打分，从5个组分中分别筛选出一种鲜味肽，得到氨基酸序列如seq id no:1～5所示的鲜味肽，所述鲜味肽具有较好的鲜味及增鲜特性。本发明构建了稳定表达鲜味受体t1r1/t1r3的细胞——单克隆化的人源t1r1/t1r3/g16gust44稳转细胞系，通过钙离子荧光成像技术检测不同浓度鲜味肽引起的胞内钙离子荧光响应，以谷氨酸钠为标准品，排除浓度的影响，以谷氨酸钠和鲜味肽引起最强钙离子荧光变化时的浓度计算相对鲜度值，能在生理水平上相对定量检测鲜味肽的鲜味强度，具有良好的重现性、稳定性和可靠性。
附图说明
38.图1为凝胶层析分离图。
39.图2为凝胶层析分离组分感官雷达图。
40.图3为凝胶层析分离组分电子舌雷达图。
41.图4为反相高效液相分离色谱图。
42.图5为合成肽tltdvek的二级质谱图。
43.图6为合成肽lpvde的二级质谱图。
44.图7为合成肽aeeveeerlk的二级质谱图。
45.图8为合成肽vlthgedkege的二级质谱图。
46.图9为合成肽ltlf的二级质谱图。
47.图10为合成肽的感官评价雷达图。
48.图11为合成肽的电子舌评价雷达图。
49.图12为合成肽的协同增鲜作用。
50.图13为全基因扩增结果，其中a为t1r1，b为t1r2，c为g16gust44。
51.图14为载体酶切结果，m条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp和250bp；1、3和5表示：pcdna3.1、pcdna3.1-flag
和pcdna3.1-ha载体酶切产物；2、4和6表示：未酶切载体。
52.图15为菌落pcr鉴定结果，其中a为重组质粒pcdna3.1-his-t1r1菌落pcr鉴定结果；b为重组质粒pcdna3.1-flag-t1r3菌落pcr鉴定结果；c为重组质粒pcdna3.1-ha-g16gust44菌落pcr鉴定结果；1为阴性对照(ddh2o)，2为阴性对照(空载自连对照组)，3为阳性对照(gapdh)，m为marker自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp和100bp；4～9依次表示1～6号菌落。
53.图16为蛋白表达鉴定结果，其中m为marker；1为hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞；2为hek293细胞。
54.图17为不同浓度msg引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
55.图18为不同浓度msg引起的细胞钙离子相对荧光变化峰值图。
56.图19为不同浓度tltdvek引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
57.图20为不同浓度lpvde引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
58.图21为不同浓度ltlf引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
59.图22为不同浓度aeeveeerlk引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
60.图23为不同浓度vlthgedkege引起的细胞钙离子相对荧光变化图。
61.图24为不同浓度合成肽引起的细胞钙离子相对荧光变化峰值图。
具体实施方式
62.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
63.实施例1膜超滤法和凝胶色谱法分离鱼露中的鲜味肽
64.一、实验方法
65.1.膜超滤法分离鲜味肽
66.将鱼露发酵原液用双层纱布和中速滤纸过滤后，通过旋转蒸发仪浓缩脱盐，并储存于4℃下备用。将浓缩后的鱼露用超纯水稀释至固形物体积浓度1％，用0.45μm滤膜过滤，随后用截留分子质量为3000da的赛多利斯超滤膜进行分离，收集透过液真空冷冻干燥，得到膜超滤法分离产物。
67.2.凝胶色谱法分离鲜味肽
68.将步骤1膜超滤法分离产物过0.45μm微孔滤膜，用sephadex g-15凝胶层析色谱分离纯化。分离条件为：层析柱(1.6cm
×
70cm)，上样量2ml，洗脱液为超纯水，流速1ml/min，检测波长220nm。每3min收集一管，根据各个不同组分峰收集，浓缩冻干后进行感官评价和电子舌评价，选择鲜味最强的组分继续分离纯化。
69.二、实验结果
70.鲜味肽一般为分子量小于3kda的多肽，因此选择截留分子质量为3000da的超滤膜进行分离，并收集透过液进行下一步凝胶层析分离。分离结果如图1所示，一共分离得到4个组分峰(f1～f4)。各组分感官评价结果如图2所示，各组分滋味轮廓以鲜味为主，其次是酸味、咸味和甜味，苦味较弱。各组分的鲜味特征存在显著性差异，其中f2组分鲜味评分最高
为4.6，其次为f1组分，评分为3，而f3和f4组分鲜味评分相同为1.8。分析发现，在滋味轮廓中酸味和鲜味的变化趋势与一致，这可能是因为多肽的r基或c端残基中羧基的存在，其解离出的氢离子是引起酸味的重要物质。目前已报道的鲜味肽中，有很多肽不仅具有鲜味，同时还可能呈现一定的酸味。各组分电子舌分析结果如图3所示，电子舌分析结果与感官评价结果并不完全相同，但总体趋势是相同的，f2组分的鲜味仍为最突出的，其次是f1组分、f4组分和f3组分。因此，结合感官评价及电子舌分析结果，f2组分的鲜味最强且含量最高易收集，选择f2组分继续进行反相高效液相分离。
71.实施例2反相高效液相色谱分离纯化鱼露中的鲜味肽
72.一、实验方法
73.经实施例1凝胶色谱分离后得到4个组分(f1～f4)，将鲜味最强的组分f2用一级水配成浓度为5mg/ml的溶液，过0.45μm微孔滤膜，再用反相高效液相色谱(rp-hplc)进一步分离。rp-hplc的分离条件：色谱柱为spursil 5μm c18，250
×
4.6mm；进样体积为20μl；流动相a为超纯水，流动相b为乙腈，检测波长220nm，等度洗脱：体积浓度7％b，93％a，流速1ml/min，洗脱时间20min。分别将每个分离峰对应组分收集，浓缩、冷冻干燥。
74.二、实验结果
75.经过实施例1凝胶层析分离得到的组分仍为混合物，成分较为复杂，无法直接进行结构鉴定，因此需采用反相高效液相色谱进行进一步的分离。反相高效液相色谱法是依据分子疏水性对各物质进行分离的色谱法，具有操作简便、高效快速、灵敏度高和重复性好的优点，通常作为蛋白质、多肽分离纯化的最后一步。将f2组分复溶于超纯水进行反相高效液相分离后结果如图4所示，由图可知，采用反相高效液相进行纯化具有较好的分离效果，共分离得到5个组分，分别为f2-1、f2-2、f2-3、f2-4和f2-5，分离得到的组分均在前10min被洗脱出来，说明各组分有较强的极性。
76.实施例3鉴定鱼露鲜味肽的结构
77.一、实验方法
78.对实施例2反相高效液相纯化出的5个组分进行还原烷基化，然后对组分脱盐，之后将处理好的样本通过液质联用(lc-ms/ms)分析，得到质谱原始结果的raw文件，经过de novo分析，得到肽段序列分析结果。具体步骤如下：
79.1.制备样品
80.分别在5个组分样品中加入二硫苏糖醇溶液使其终浓度为10mmol/l，于56℃水浴中还原1h。加入碘乙酰胺溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min。使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。
81.2.毛细管液相色谱条件
82.预柱：300μm i.d.
×
5mm,packed with acclaim pepmap rplc c18,5μm,
83.分析柱：150μm i.d.
×
150mm,packed with acclaim pepmap rplc c18,1.9μm,
84.流动相a：0.1％甲酸；流动相b：0.1％甲酸，80％乙腈；梯度洗脱程序：0～2min 4％～8％b，2～45min 8％～28％b，45～55min 28％～40％b，55～56min 40％～95％b，保持流动相95％b洗脱10min；流速：600nl/min。上述百分含量均为体积浓度。
85.3.质谱条件
86.一级质谱参数：resolution：70000，agc target：3e6，maximum it：100ms，scan range：300to 1800m/z。
87.二级质谱参数：resolution：17500，agc target：1e5，maximum it：50ms，top n：20，nce/stepped nce：28。
88.经过de novo分析，得到组分f2-1、f2-2、f2-3、f2-4和f2-5肽段的序列分析结果，据此采用固相合成法合成所述肽段，并进行脱盐等处理得到纯度大于98％的多肽。
89.二、实验结果
90.将实施例2反相高效液相分离纯化得到的5个组分(f2-1、f2-2、f2-3、f2-4、f2-5)用nano lc-q-orbitrap-ms/ms鉴定肽的分子量和序列。经nano lc-ms/ms分离鉴定后，自动对质谱数据库进行检索，通过peaks studio 8.5软件并结合手动从头测序解析主要峰的离子碎片，得到多肽的氨基酸序列。尽管经过了一系列的分离纯化，去除了许多杂质，但每个样品组分依然是多肽混合物，不可能只含有一种多肽。质谱仪q exactive具有超高的分辨率和灵敏度，可以识别组分中含量极低的物质，因此每个组分能检测出许多种多肽。biopep database生物活性肽数据库能在线分析小分子肽的生物活性，基于此数据库预测鲜味肽的呈味强度，并结合肽段相对强度和肽段打分，从5个组分中分别筛选出一种鲜味肽，其主要信息如表1所示，每种鲜味肽的二级质谱图如图5～9所示。
91.表1鲜味肽的氨基酸序列鉴定
[0092][0093]
实施例4分析鲜味肽的呈味特性
[0094]
一、实验方法
[0095]
1.感官评价
[0096]
感官评价小组由12名味觉正常的学生组成(6女6男，年龄在20至25岁)，且小组成员均依据gb/t 16291.1-2012接受了感官培训以辨别5种基本味觉(酸、甜、苦、咸、鲜)。5种基本味觉酸、甜、苦、咸、鲜对应的标准品分别为0.8mg/ml柠檬酸溶液、10mg/ml蔗糖溶液、0.8mg/ml奎宁溶液、3.5mg/ml氯化钠溶液和3.5mg/ml谷氨酸钠(msg)溶液。标准溶液的感官评分为5分，试验采取10分制，0分代表没有味道，10分表示具有强烈味道。将实施例1凝胶色谱分离的组分f1～f4分别配制成浓度0.2mg/ml的溶液，将实施例3合成的氨基酸序列如seq id no:1～5所示的合成肽分别配制成1mmol/l的溶液，供小组成员进行感官评价。
[0097]
采用三角试验法测定每种合成肽的味觉阈值，将氨基酸序列如seq id no:1～5所示的合成肽溶于超纯水中至浓度为5mmol/l，感官小组对其滋味特性进行描述。随后根据三角实验准备1个样品实验组和2个空白对照组，按照1:1逐步稀释，由小组成员从低浓度到高浓度依次进行品尝。当恰好可以区分样品溶液与两个空白溶液时，该浓度即为肽的味觉阈
值。所有感官小组的品评结果平均值记为最终结果。
[0098]
合成肽的增鲜效果：以1mg/ml的msg溶液作为鲜味的感官标准品，评分为5分，向标准msg溶液中加入氨基酸序列如seq id no:1～5所示的合成肽，使复合溶液中合成肽最终的浓度为1mmol/l，对合成肽溶液进行感官评价来分析合成肽的协同增鲜效果，鲜味强于标准溶液则评为5～10分，弱于标准溶液则评0～5分。
[0099]
2.电子舌评价
[0100]
电子舌系统由5个味觉传感器组成：ca0(酸)、gl1(甜)、c00(苦)、aae(鲜)、ct0(咸)及ae1(涩)。首次检测，需先将所有传感器放在基准溶液(30mmol/l氯化钾和0.3mmol/l酒石酸混合溶液)中活化24h，待传感器完成自检，信号稳定后，才能开始样品的检测。将实施例1凝胶色谱分离的组分f1～f4用超纯水配置成多肽浓度为0.2mg/ml的溶液，实施例3合成的氨基酸序列如seq id no:1～5所示的肽分别配制成1mg/ml的溶液，置于电子舌样品盘中进行数据采集，每个样品每次数据采集时间为120s，共采集4次。所有数据均是以基准液为标准的绝对输出值，电子舌测试基准液的状态模拟人口腔中只有唾液时的状态。基准液由氯化钾和酒石酸组成味觉值，其接近无味，故酸味的无味点为-13，咸味的无味点为-6，以此为基准，当样品的味觉值低于基准液的无味点时说明样品无该味道，反之则有。
[0101]
二、实验方法
[0102]
结果如图10所示。合成的5条多肽除ltlf具有较显著的苦味外，其余滋味轮廓基本一致，整体具有较强的鲜味，酸味次之，具有一定的甜味和鲜味，基本不具有苦味。aeeveeerlk具有最强的鲜味，其次是vlthgedkege、tltdvek、lpvde和ltlf，但tltdvek和lpvde的鲜味无显著区别。且ltlf具有较强的苦味，这可能是因为当疏水性氨基酸(如苯丙氨酸、脯氨酸和亮氨酸等)处于肽链c-末端位置时会增加苦味的强度。5条合成肽的电子舌分析结果如图11所示，5条合成肽的滋味轮廓与感官评价的结果相似，且鲜味最强的依然是aeeveeerlk，其次vlthgedkege和tltdvek的鲜味无显著区别，然后是lpvde，ltlf的鲜味依旧最弱。可以发现，与实施例1凝胶色谱分离的组分f1～f3相比，合成肽的酸味明显增加，这可能是因为谷氨酸和天冬氨酸本就是酸性氨基酸或者是肽合成过程中残余的乙酸钠和氨基酸所致。合成肽的呈味特性及阈值如表2所示。
[0103]
表2合成肽的呈味特性及阈值
[0104][0105]
为了更全面的了解合成肽的呈味特性，采用滋味稀释法对合成肽的识别阈值进行测定，并要求感官评定人员对其的滋味进行语言描述，合成肽的呈味特性及阈值如表2所示。msg的阈值为1.77mmol/l，这5条合成肽的阈值均比msg的阈值低，说明合成肽具有较强的鲜味。合成肽的感官描述与滋味轮廓分析和电子舌分析基本保持一致。当5个合成肽的浓
度一致时，aeeveeerlk的鲜味最强，而阈值最低的合成肽却是vlthgedkege，说明呈鲜强度与呈鲜阈值并没有必然的相关性，且感官描述中vlthgedkege的鲜味也不比aeeveeerlk的鲜味突出。
[0106]
为了研究合成肽的增鲜作用，将合成肽添加到msg溶液中进行感官评价，结果如图12所示。合成肽aeeveeerlk、vlthgedkege、tltdvek和lpvde均能增强msg溶液的鲜味，其中aeeveeerlk的增鲜效果最强，而ltlf混合msg溶液的鲜味评分却微低于msg溶液，这可能是因为ltlf具有较突出的不愉悦的苦味，掩盖了鲜味，使感官评价人员不能清晰的分辨出鲜味的变化。
[0107]
实施例5构建重组表达载体
[0108]
通过ncbi网站查询人源t1r1(nm_138697)、t1r3(nm_152228)、gna15(nm_002068)、gnat3(nm_001102386)基因序列，gna15的c末端的44个氨基酸由gnat3的c末端的44个氨基酸替换得到g16gust44，合成基因t1r1-6his、t1r3和g16gust44。
[0109]
用prime primer软件设计引物，并在t1r1-6his正反引物的5
′
端分别加入xhoi、kpni酶切位点，在t1r3正反引物的5
′
端分别加入xhoi、kpni酶切位点，在g16gust44正反引物的5
′
端分别加入xhoi、bamhi酶切位点，设计所得引物如表3所示：
[0110]
表3 pcr引物序列
[0111][0112]
以已合成的目的基因作为扩增模板，进行pcr扩增。配制如表4反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于pcr仪中进行反应。pcr扩增反应条件为98℃，5min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，90s，30个循环；72℃，8min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，凝胶成像系统观察结果，回收目的条带。
[0113]
表4 pcr扩增体系
[0114][0115][0116]
质粒pcdna3.1、pcdna3.1-flag、pcdna3.1-ha的限制性内切酶分别为xhoi/kpni、xhoi/kpni、xhoi/bamhi。按表5配制酶切体系，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，回收目的条带。
[0117]
将pcr扩增出的t1r1-6his、t1r3和g16gust44基因序列分别连接到pcdna3.1、pcdna3.1-flag、pcdna3.1-ha载体上，于冰水浴中配制表6反应体系，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡，于37℃反应30min，构建得到重组质粒pcdna3.1-his-t1r1、pcdna3.1-flag-t1r3和pcdna3.1-ha-g16gust44。随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。分别将10μl连接反应产物加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μl lb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的lb平板上，在恒温培养箱中倒置培养12～16h。
[0118]
表5载体酶切反应体系
[0119][0120]
表6连接反应体系
[0121]
[0122]
二、实验结果
[0123]
经pcr扩增后，预计分别获得长度为2606bp、2605bp及1169bp的目的片段，经琼脂糖凝胶电泳后成像如图13所示，扩增出的条带与预计大小基本一致。
[0124]
对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图14所示，pcdna3.1大概5.4kb，pcdna3.1-flag大概5.5kb，pcdna3.1-ha大概5.4kb，图中扩增出的条带与预计大小基本一致。
[0125]
实施例6鉴定重组表达载体
[0126]
一、实验方法
[0127]
按表7配制pcr反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取实施例6培养的单个菌落至20μlpcr体系中，吹打混匀，置于pcr仪中进行反应，用琼脂糖凝胶电泳进行检测。各反应体系引物如表8所示。pcr扩增反应条件为94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，22个循环；72℃，5min。
[0128]
表7菌落pcr反应体系
[0129][0130]
表8菌落pcr引物序列
[0131][0132]
将鉴定出的阳性克隆转化子，按照体积浓度0.5％～1％的接种比例，取适量菌液，加至含有0.1mg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm，震荡培养12～16h，取适量菌液进行测序。通过snapgene软件将目的基因序列与测序结果序列进行比较。
[0133]
二、实验结果
[0134]
经琼脂糖凝胶电泳后成像如图15所示，以pcdna3.1-his-t1r1、pcdna3.1-flag-t1r3和pcdna3.1-ha-g16gust44为模板扩增出的条带大小应分别为923bp、1003bp和698bp，与图中条带大小一致，表明目的基因成功插入表达载体中。
[0135]
snapgene软件测序结果表明，重组表达质粒上的基因序列与目的基因序列100％
一致，证明t1r1-6his、t1r3和g16gust44基因已成功克隆到pcdna3.1、pcdna3.1-flag和pcdna3.1-ha载体上。
[0136]
实施例7确定g418杀伤浓度
[0137]
一、实验方法
[0138]
将外源dna克隆到具有某种抗性或选择基因的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中，用载体中所含的选择标志进行筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。g418(geneticin，遗传霉素)是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80s核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞。是稳定转染最常用的选择试剂。当neomycin基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neomycin基因编码的序列转录为mrna，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有g418的选择性培养基中生长。由于实施例5的3个质粒pcdna3.1、pcdna3.1-flag、pcdna3.1-ha的抗性基因都是neomycin，因此用g418筛选稳定高表达细胞株。
[0139]
各真核细胞系对g418敏感度不同，所以在筛选之前要确定g418的最佳筛选浓度。
[0140]
1.选取g418筛选浓度范围为100μg/ml～1mg/ml。用无双抗完全培养基将40mg/ml g418稀释至0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000和1100μg/ml12个级别。
[0141]
2.用完全培养基将hek293细胞接种于96孔板上，37℃，体积浓度5％co2培养24h贴壁。
[0142]
3.弃去步骤2的培养基，每孔加入200μl步骤1配制好的各个浓度的g418筛选培养基，每个浓度3个孔，继续37℃，体积浓度5％co2培养。
[0143]
4.每隔24h便更换一次培养基。选择出在10～14天内使细胞全部死亡的最低g418浓度作为筛选浓度。
[0144]
二、实验结果
[0145]
经筛选实验发现，使hek293细胞在10～14天内全部死亡的最低g418浓度为500μg/ml，以此浓度来筛选稳定表达株。
[0146]
实施例8 pcdna3.1-ha-g16gust44质粒转染、pcdna3.1-his-t1r1、pcdna3.1-flag-t1r3质粒共转染
[0147]
一、pcdna3.1-ha-g16gust44质粒转染
[0148]
使用omega公司endo-free plasmid mini kit i试剂盒提取质粒，按照invitrogen公司lipofectamine
tm
3000转染试剂进行转染。
[0149]
1.按照体积浓度0.5％～1％的接种比例，取1ml实施例5制备的带重组质粒pcdna3.1-ha-g16gust44的甘油菌接种于100ml lb液体培养基中，37℃，220rpm，振荡培养过夜。取5ml菌液使用omega公司endo-free plasmid mini kit i试剂盒提取pcdna3.1-ha-g16gust44重组质粒，-20℃保存。
[0150]
2.将hek293细胞接种于6孔板中，加入dmem完全培养基2.5ml，置于co2恒温培养箱中培养。
[0151]
3.观察步骤2细胞生长状态，当汇合度达到80％时进行转染。转染步骤参考lipofectamine
tm
3000转染试剂说明书，向750μl无血清opti-mem培养基中加入45μl lipofectamine
tm
3000试剂。
[0152]
4.再向750μl无血清opti-mem培养基加入15μg步骤1提取的重组质粒(0.5～5μg/μl)pcdna3.1-ha-g16gust44，然后添加30μl p3000
tm
试剂，充分混匀。
[0153]
5.取750μl稀释的lipofectamine
tm
3000试剂和750μl步骤4稀释的重组质粒pcdna3.1-ha-g16gust44混合均匀(1:1比例)。室温孵育10～15min。
[0154]
6.步骤5每孔加入250μl dna-脂质体复合物，37℃孵育细胞2天。然后进行转染细胞的qrt-pcr分析和稳定株筛选。
[0155]
二、pcdna3.1-his-t1r1、pcdna3.1-flag-t1r3质粒共转染
[0156]
将pcdna3.1-ha-g16gust44质粒转染中转染后的细胞接种于6孔板，培养过夜细胞贴壁后，吸去完全培养基，用500μg/ml g418培养基筛选14天，然后转染pcdna3.1-his-t1r1、pcdna3.1-flag-t1r3质粒，步骤如pcdna3.1-ha-g16gust44质粒转染所示，其中4步骤中15μg重组质粒变为15μg质粒pcdna3.1-his-t1r1和15μg质粒pcdna3.1-flag-t1r3。
[0157]
实施例9建立单克隆稳定株
[0158]
实施例8中转染pcdna3.1-ha-g16gust44、pcdna3.1-his-t1r1和pcdna3.1-flag-t1r3质粒的细胞接种于6孔板，培养过夜细胞贴壁后，吸去完全培养基，用500μg/ml g418培养基筛选，约14天后可见有抗性克隆出现，接着进一步用有限稀释法筛选单克隆。
[0159]
将抗性克隆消化下来，稀释成1
×
104细胞/ml的细胞悬液，向96孔板中a1孔加入200μl细胞悬液，其余每孔中添加100μl完全培养基。然后从a1孔中转移100μl至b1孔中，吹打混匀，重复此稀释步骤至此列最后一孔h1，吸走h1孔中100μl培养基，使第一列孔培养基体积相同。用排枪添加100μl培养基到第一列各孔，混合吹匀，然后从第一列取100μl培养基至第二列孔中，重复此稀释步骤至此列最后一列，吸走最后一列中100μl培养基，再向所有孔中加入100μl培养基，使所有孔中最终体积为200μl。将96孔板37℃，5％co2培养48h。然后每孔换500μg/ml g418培养基筛选，通过显微镜观察单个细胞的生长，通常2至3周的时间便可以观察到单克隆的形成。用qrt-pcr和western blot筛选出表达丰度较高的单克隆进行后续的扩大培养，即可得到单克隆化的人源t1r1/t1r3/g16gust44稳转hek293细胞系(hek293-t1r1/t1r3/g16gust44)。
[0160]
实施例10qrt-pcr检测目标基因表达水平变化
[0161]
一、实验方法
[0162]
1.取出实施例9培养好的单克隆化的人源t1r1/t1r3/g16gust44稳转hek293细胞系(hek293-t1r1/t1r3/g16gust44)，用pbs将细胞漂洗2次，6孔板中每孔加入350μl裂解液，然后按照艾科瑞公司steadypure universal rna extraction kit试剂盒提取rna。利用微量分光光度计对rna进行浓度与纯度的测定，od260 nm/280nm在1.8～2.0之间表示rna纯度达到要求。
[0163]
2.利用艾科瑞公司evo m-mlv rt premix for qpcr反转录试剂盒将符合纯度要求的rna反转录成cdna，反转录反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。反转录体系如表9所示。
[0164]
表9反转录反应体系
[0165][0166]
3.以gapdh为内参基因，根据人源gapdh、t1r1、t1r3、g16gust44基因序列设计引物，如表10所示。根据艾科瑞公司sybr green premix pro taq hs qpcr kit试剂盒配置qpcr反应体系，qpcr反应程序为：第一步：95℃，30s；第二步：95℃，5s，60℃，30s，40个循环。qpcr反应体系如表11所示。按以下公式进行数据处理：
[0167]
δδct＝(ct
目的基因-ct
内参基因
)
hek293-t1r1、t1r3、g16gust44-(ct
目的基因-ct
内参基因
)
hek293
............(1)
[0168]
差异倍数fold change＝2-δδct
表示实验组目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数。
[0169]
表10 qpcr引物序列
[0170][0171][0172]
表11 qpcr反应体系
[0173][0174]
二、实验结果
[0175]
提取单克隆筛选得到的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞mrna进行qrt-pcr分析，结果如表12所示，根据式(1)计算得t1r1、t1r3和g16gust44基因的2-δδct
分别为4871.00、313.00和3236.01，从基因表达水平说明了筛选出的单克隆细胞稳定表达了这3个基因。
[0176]
表12单克隆稳定株qpcr ct值
[0177][0178]
实施例11 western blot检测蛋白表达
[0179]
一、实验方法
[0180]
取实施例9培养好的单克隆化的人源t1r1/t1r3/g16gust44稳转hek293细胞系(hek293-t1r1/t1r3/g16gust44)，去除培养液，用pbs洗一遍。6孔板每孔加入250μl裂解液，裂解液在使用前数分钟内加入pmsf(苯甲基磺酰氟，phenylmethanesulfonyl fluoride)，使pmsf的最终浓度为1mmol/l。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。充分裂解后14000g离心5min，取上清，即可进行后续的电泳和转膜操作。
[0181]
二、实验结果
[0182]
结果如图16所示，g16gust44、t1r1、t1r3和gapdh蛋白的理论大小分别为43kda、93kda、93kda和36kda，条带与预期大小相符，从蛋白表达水平说明了g16gust44、t1r1、t1r3成功在hek293细胞中过表达。
[0183]
实施例12构建基于hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞系的鲜味评价方法
[0184]
一、实验方法
[0185]
将谷氨酸钠(msg)与实施例3合成的氨基酸序列如seq id no:1～5所示的合成肽溶解于hbss缓冲液中。使msg的浓度分别为2.5、5、10、20和40mmol/l，每种样品合成肽的浓度分别为1.25、2.5、5、10和20mmol/l。将钙离子荧光探针用无酚红dmem基础培养液稀释成5μmol/l的浓度。将实施例9培养的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞接种于24孔板，待细胞占据孔板的70％左右时进行实验。弃去培养液，用hbss漂洗细胞2次，每孔加入5μmol/l钙离子荧光探针200μl，37℃孵育30min后，再次用hbss漂洗细胞2次，加入200μl无酚红dmem基础培养液脱酯化20min。将处理好的细胞置于荧光倒置显微镜下，在490nm(激发波长)和514nm(发射波长)波长处采集细胞内钙离子荧光信号，每5s自动进行一次图像采集，在第20s时加入50μl不同浓度的样品合成肽溶液，整个检测过程持续240s。msg的反应终浓度为0.5、1、2、4和8mmol/l，合成肽的反应终浓度为0.25、0.5、1、2和4mmol/l，空白组加入50μl hbss，空白组与实验组每个浓度均设置4个平行。选取拍摄好的荧光照片，每张照片最少选择30个细胞区域检测荧光值。钙离子相对荧光变化的计算公式为：
[0186]
[0187]
δf表示相对荧光变化值，“f”表示细胞区域实时荧光值减去背景实时荧光值；“f0”表示0秒时的“f”。
[0188]
以msg作为鲜度标准物，将其鲜度值定义为1。相对鲜度值u计算公式为：
[0189]
u＝f
sample
/f
msg
...................(3)
[0190]
其中，f
sample
表示鲜味肽钙离子相对荧光变化峰值的最大值，f
msg
表示msg钙离子相对荧光变化峰值的最大值。
[0191]
二、实验结果
[0192]
由鲜味的呈味机制可知，当鲜味肽与受体t1r1/t1r3结合后，会引起胞内钙离子浓度的升高。msg通常作为鲜味的标准品，且能与受体t1r1/t1r3结合。因此，为验证实施例9构建的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞中过表达的t1r1/t1r3受体是否有相应的生理活性，分别用0.5、1、2、4和8mmol/l的msg溶液刺激细胞，通过观察细胞的荧光变化来判断实施例9构建的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞是否能用于鲜味检测。
[0193]
不同浓度msg引起的细胞钙离子荧光变化结果如图17所示，con代表hbss空白组，若相对荧光变化值大于0，则说明msg可以引起细胞的响应，相对荧光变化值越大，说明引起的钙离子荧光响应越强。由图17可知，msg刺激细胞可以引起胞内钙离子浓度的增加，说明实施例9构建的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞中过表达的t1r1/t1r3受体有正常活性，可以将此细胞作为检测鲜味的工具。
[0194]
当以最低浓度0.5mmol/l的msg刺激细胞时，仍然能引起较强的钙离子荧光变化，说明细胞能感应msg的阈值在0～0.5mmol/l之间，人对msg的感官阈值大约为1.77mmol/l，说明实施例9构建的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞能更灵敏的识别msg。
[0195]
比较不同浓度msg引起的钙离子相对荧光变化的强度，不同浓度msg引起的相对荧光变化峰值如图18所示，可以看出，当msg的浓度在0.5～1mmol/l时，其引起的钙离子响应随着浓度增大而增大，在1mmol/l时达到最强，浓度在1～8mmol/l时，其引起的钙离子响应随着浓度增大而减小，甚至在8mmol/l时不能引起钙离子的响应，说明钙离子响应强度随着鲜味物质的浓度增大而变强，但达到最大浓度后，钙离子响应强度随着鲜味物质的浓度增大而变弱，当味觉受体达到饱和时，呈味强度也会在达到最大值后保持不变，甚至产生抑制效果。
[0196]
不同浓度鲜味肽引起的细胞内钙离子响应变化结果如图19～23所示。tltdvek、lpvde、ltlf、aeeveeerlk和vlthgedkege这5个肽都可以引起细胞钙离子响应，且随着浓度的变化钙离子荧光响应强度也随之变化，说明其都具有鲜味。通过比较不同浓度鲜味肽引起的钙离子相对荧光变化的强度，不同浓度鲜味肽引起的相对荧光变化峰值如图24所示，可以看出，tltdvek的相对荧光变化峰值在浓度0.5mmol/l时最大，lpvde的相对荧光变化峰值在浓度1mmol/l时最大，ltlf的相对荧光变化峰值在浓度1mmol/l时最大，aeeveeerlk的相对荧光变化峰值在浓度2mmol/l时最大，vlthgedkege的相对荧光变化峰值在浓度2mmol/l时最大，且与msg的趋势相同，当鲜味肽小于最高荧光响应强度的浓度时，钙离子响应强度随浓度的增加而增强，当鲜味肽高于最高荧光响应强度的浓度时，钙离子响应强度随浓度的增加而减弱。由图24可以看出，最大的钙离子相对荧光变化峰值与其对应的浓度并没有必然的相关性，不同浓度下，每个肽的相对荧光变化峰值的排列大小不一样，比如浓度为1mmol/l时，钙离子相对荧光变化峰值由大到小为lpvde、aeeveeerlk、ltlf、vlthgedkege、
tltdvek，而浓度为2mmol/l时，钙离子相对荧光变化峰值由大到小为aeeveeerlk、vlthgedkege、ltlf、tltdvek。因此，选用每个肽最大的钙离子相对荧光变化峰值用于比较5个肽的鲜味，鲜味由大到小为lpvde、aeeveeerlk、vlthgedkege、ltlf和tltdvek。
[0197]
为了更直观的得到肽的鲜味大小，基于实施例9构建的hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞对肽的鲜味进行量化，按公式(3)进行计算，结果如表13所示，相对鲜度值由大到小排序依次为lpvde、aeeveeerlk、vlthgedkege、ltlf和tltdvek。
[0198]
表13合成肽的相对鲜度值
[0199][0200]
余弦相似度，又称为余弦相似性，是通过计算两个向量的夹角余弦值来评估他们的相似度。将向量根据坐标值，绘制到向量空间中，求得他们的夹角，并得出夹角对应的余弦值，此余弦值就可以用来表征这两个向量的相似性。夹角越小，余弦值越接近于1，它们的方向越吻合，则越相似。将5个肽的感官评价、电子舌分析和相对鲜度值法获得的鲜味强度分别作为3个矩阵，将其两两进行余弦相似性分析，结果如表14所示。由表14可知，感官评价、电子舌分析和相对鲜度值法的余弦值均大于0.9，表明建立的相对鲜度值法与另两种方法测定的鲜度值有较高相似性，说明相对鲜度值法具有可靠性。
[0201]
感官评价法具有一定的主观性，且会被其他味道影响，而且也难以感觉到鲜味的细微变化。实施例4的感官评价和电子舌是在相同的多肽浓度下检测鲜味，但不同浓度呈味物质的鲜味是不一致的，无法统一评价。本发明建立的基于hek293-t1r1/t1r3/g16gust44细胞的钙离子相对荧光变化鲜味评价方法，能排除主观因素和浓度干扰，检测的鲜味强度更准确。
[0202]
表14三种鲜味评价方法的余弦值
[0203][0204]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护
范围之内。