多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用。


背景技术：

2.现有的伤口愈合药物主要分为两类：小分子化合物(如去铁胺)和蛋白类生长因子(如表皮生长因子)。然而，这些药物在临床应用上都有各自的局限性。例如，小分子化合物的生物活性相对较低和不稳定，而蛋白类生长因子价格昂贵，需要严格的保存条件，容易引起增生性疤痕。
3.相比之下，肽是促进组织再生的一类独特的生物活性剂。在人体中，超过7000种天然存在的肽已被鉴定为激素、神经递质、生长因子、离子通道配体或抗感染药物，以调节各种生理活动。与蛋白类生长因子相比，多肽的化学合成(如固相多肽合成)具有更高的效率、数量和纯度。这些特性赋予肽非常有前景的药物应用潜力。在过去二十年中，全世界批准了近60多种肽类药物。2016年全球多肽治疗行业分析估计，2019年多肽药物的销售额将超过700亿美元，到2024年的复合年增长率(cagr)为9.1％。但是，其中用于治疗皮肤伤口愈合的肽制剂并不多。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用，以缓解现有技术中小分子化合物的生物活性相对较低且不稳定；蛋白质生长因子价格昂贵、保存条件严格，容易引起增生性疤痕的技术问题。
6.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明的第一方面提供了多肽在调控巨噬细胞体外转型或制备调控巨噬细胞体外转型产品中的应用，所述多肽来源于hst1，所述多肽的氨基酸序列由连续的至少13个氨基酸残基组成，所述多肽的氨基酸序列位于hst1氨基酸序列的第16～32位之间；
8.所述巨噬细胞体外转型为m1型巨噬细胞向m2型巨噬细胞转变。
9.在可选的实施方案中，所述多肽的氨基酸序列为(xn)shrefpfygdygs，x为任意氨基酸，n＝0～4。
10.第二方面，本发明提供了前述任一实施方式所述的多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用。
11.在可选的实施方式中，所述皮肤创面包括急性皮肤创面。
12.在可选的实施方式中，所述产品包括药品、护肤品或化妆品。
13.在可选的实施方式中，所述药品为外用制剂。
14.在可选的实施方式中，所述产品剂型包括喷剂、水剂、粉末剂、片剂、胶囊剂或凝胶剂。
15.第三方面，本发明提供了一种调控巨噬细胞体外转型制剂或促进皮肤创面愈合产品，所述制剂或产品含有前述任一实施方式所述的多肽；
16.优选地，所述制剂或产品中多肽的浓度为0.01μm～10μm，进一步优选为1μm。
17.在可选的实施方式中，所述制剂还含有m1型巨噬细胞分子标志物检测试剂和m2型巨噬细胞分子标志物检测试剂。
18.第四方面，本发明提供了前述任一实施方式所述的制剂在前述实施方式所述产品促进皮肤创面愈合效果评价中的应用。
19.本发明提供的多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用，该多肽(命名为hst 1-mad)促进伤口闭合、再上皮化、胶原沉积、血管生成以及紧密连接蛋白的表达，显著促进皮肤创面愈合。同时hst1-mad主动调节m1向m2巨噬细胞的转换，上调nrf2/nqo1轴，为创面愈合创造良好的环境。该多肽为制备促进皮肤创面愈合产品提供了一个新的有效物质。
20.本发明提供的促进皮肤创面愈合产品，生物活性更高，产率更高，且具有更高的纯度和更低的成本。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明实施例1～4和对比例1提供的大鼠急性皮肤创伤3天愈合照片(a)和伤口愈合数据(b)；
23.图2为本发明对比例1和实施例3～4提供的大鼠急性皮肤创伤5天愈合照片(a)和伤口愈合数据(b)；
24.图3为本发明对比例1和实施例3～4提供的h&e染色图片(a)和表皮层厚度数据(b)；
25.图4为本发明对比例1和实施例3～4提供的masson染色图片(a)和真皮胶原蛋白数据(b)；
26.图5为本发明对比例1和实施例3～4提供的免疫组化染色图片(a)和cd31阳性血管表面积数据(b)；
27.图6为本发明对比例1和实施例3～4提供的血管生成生长因子-vegf免疫组化染色图片(a)和vegf表达数据(b)；
28.图7为本发明对比例1和实施例3～4提供的免疫荧光染色中claudin1(a)和claudin2(b)的表达；
29.图8为本发明实施例5和对比例3～4提供的表皮层中紧密连接蛋白claudin1和claudin2的免疫荧光染色照片；
30.图9为本发明对比例1和实施例3提供的同一时间点的炎症因子(a)、hst1-mad对nrf2(b)和nqo1(c)表达水平的影响、1μm hst1-mad组的促炎因子il-6(d)、tnf-α(e)和mip-1β(f)的表达水平。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
32.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
34.在某次具体的实施方式中，第一方面，本发明提供了多肽在调控巨噬细胞体外转型或制备调控巨噬细胞体外转型产品中的应用，所述多肽来源于hst1，所述多肽的氨基酸序列由连续的至少13个氨基酸残基组成，所述多肽的氨基酸序列位于hst1氨基酸序列的第16～32位之间(命名为hst 1-mad)；所述巨噬细胞体外转型为m1型巨噬细胞向m2型巨噬细胞转变。
35.所述hst 1-mad主动调节m1巨噬细胞向m2巨噬细胞的转换，上调nrf2/nqo1轴，为创面愈合创造良好的环境。该多肽为制备促进皮肤创面愈合产品提供了一个新的有效物质。
36.可选地，所述多肽的氨基酸序列为(xn)shrefpfygdygs，x为任意氨基酸，n＝0～4。
37.第二方面，本发明提供了前述任一实施方式所述的多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用。
38.在可选的实施方式中，所述皮肤创面包括急性皮肤创面。
39.所述hst 1-mad能够促进伤口闭合、再上皮化、胶原沉积、血管生成以及紧密连接蛋白的表达，显著促进皮肤创面愈合。
40.在可选的实施方式中，所述产品包括药品、护肤品或化妆品。
41.在可选的实施方式中，所述药品为外用制剂。
42.在可选的实施方式中，所述产品剂型包括喷剂、水剂、粉末剂、片剂、胶囊剂或凝胶剂。
43.第三方面，本发明提供了一种调控巨噬细胞体外转型制剂或促进皮肤创面愈合产品，所述制剂或产品含有前述任一实施方式所述的多肽。
44.优选地，所述制剂或产品中多肽的浓度为0.01μm～10μm，进一步优选为1μm。
45.在可选的实施方式中，所述制剂还含有m1型巨噬细胞分子标志物检测试剂和m2型巨噬细胞分子标志物检测试剂。
46.第四方面，本发明提供了前述任一实施方式所述的制剂在前述实施方式所述产品促进皮肤创面愈合效果评价中的应用。
47.本发明提供的促进皮肤创面愈合产品，生物活性更高，产率更高，且具有更高的纯度和更低的成本。
48.下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的
实施例及实施例中的特征可以相互组合。
49.实施过程使用的c57雄性小鼠(6至8周龄；平均体重22～28g)购自广东省动物研究中心(广州，中国)。所有动物工作均由南部战区总医院动物伦理委员会批准。动物伦理批准文号为2020102003。在实验开始前，让小鼠适应生活环境1周。
50.hst1和hst1-mad(≥95％纯度)由制造商(synpeptideco.，ltd.，nanjing，china)合成和提供。将hst1和hst1-mad分别溶解在1ml 0.9％nacl中，调制hst1制剂的终浓度为10μm，hst1-mad制剂的终浓度为0.01μm、0.1μm、1μm和10μm。
51.实施例1
52.本实施例提供一种多肽对急性皮肤创面治愈效果的研究，多肽hst1-mad的氨基酸序列为shrefpfygdygs(seq id no.1)，考察0.01μm hst1-mad对急性皮肤创面治愈效果。具体方法如下：
53.取3只c57小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(5ml/kg)进行麻醉。在麻醉状态下，仔细刮去每只小鼠的背毛，并用碘伏消毒。通过打孔活检器械在每只小鼠的背部区域制作1cm的圆形全层伤口。将0.01μm hst1-mad应用于创面，每个创面每天使用0.5ml剂量，直至完全愈合。
54.实施例2
55.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例1不同的是，hst1-mad的浓度为0.1μm，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
56.实施例3
57.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例1不同的是，hst1-mad的浓度为1μm，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
58.实施例4
59.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例1不同的是，治疗方法为10μm hst1-mad，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
60.实施例5
61.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例3不同的是，hst1-mad的氨基酸序列为hshrefpfygdygs(seq id no.2)，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
62.实施例6
63.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例3不同的是，hst1-mad的氨基酸序列为hhshrefpfygdygs(seq id no.3)，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
64.实施例7
65.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例3不同的是，hst1-mad的氨基酸序列为khhshrefpfygdygs(seq id no.4)，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
66.实施例8
67.本实施例提供一种多肽对急性创面治愈效果的研究，与实施例3不同的是，hst1-mad的氨基酸序列为ekhhshrefpfygdygs(seq id no.5)，其余步骤均与实施例1相同，在此
不再赘述。
68.对比例1
69.本对比例提供一种实施例1～8的空白对照组，与实施例1不同的是，将0.01μm的hst1-mad替换为生理盐水(浓度为0.9％的nacl)，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。
70.实验例
71.对伤口闭合效果进行研究，动物实验步骤如实施例3、对比例1和对比例2述进行。在术后第3、5和10天，每组在每个时间点随机处死3只小鼠。整个创面被解剖并分成两部分。一部分标本固定在4％多聚甲醛溶液中进行组织学染色。另一部分标本用于蛋白免疫印迹分析。
72.在手术后第0天、第3天、第5天和第10天，用尼康数码相机(日本东京)拍摄伤口，并用软件imagej测量伤口面积。使用公式计算伤口愈合百分比(％)：
73.伤口愈合百分比(％)＝[(a
0-a
x
)/a0]
×
100％。
[0074]
其中，a0表示第0天的初始伤口面积；a
x
表示每个时间点的伤口面积。
[0075]
组织学染色过程如下：
[0076]
苏木精和伊红(h&e)染色
[0077]
固定组织用分度酒精、二甲苯脱水，用包埋机(jb-p5；武汉俊杰电子有限公司)浸润和石蜡包埋。将石蜡块切成4μm厚，在65℃烘箱(上海慧泰仪器制造有限公司,中国上海)中烘干2小时。将切片脱蜡至水并用苏木精和伊红染色。通过电子显微镜(olympus bx51,hamburg,germany)拍摄每个切片。每组选取5张组织切片。使用软件imagej测量再生上皮的面积和长度。
[0078]
上皮厚度＝上皮面积/上皮长度。
[0079]
马松三色染色
[0080]
为了半定量胶原的生成，组织切片用masson三色染色法染色。将所有切片脱水并依次用苏木精(g1004；servicebioinc.，boston，ma)，丽春红酸品红溶液(g2011；servicebioinc.，boston，ma)、1％磷钼酸和苯胺蓝(g1071；servicebioinc.，马萨诸塞州波士顿)。切片脱水后用中性胶密封。每组选取5个组织切片，所有染色切片均在显微镜下拍照。使用image-pro plus软件分析图像。使用公式：
[0081]
平均光密度(mod)＝积分光密度(iod)总和/面积总和
[0082]
免疫组织化学
[0083]
为检测创面血管生成情况，按照上述方法制作组织切片进行组织学分析，然后用兔抗血小板内皮细胞粘附分子-1(cd31)(gb13063；1:300；servicebio inc.,boston,ma)和小鼠抗vegf(ma5-13182；1:100thermo fisher scientific co.,ltd,california,us)4℃过夜孵育，然后二抗用山羊抗小鼠抗体(g1214；1:200；servicebio inc.,boston,ma)或山羊抗兔抗体(g1213；1:200；servicebio inc.,boston,ma)在室温下孵育1h，观察与一抗结合。
[0084]
切片用3，3
′‑
二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)溶液(g1211；servicebioinc.，4boston，ma)，并用苏木精复染。每张切片选取5个显微视野，每组选取切片5张，均用显微镜拍照。用image-pro plus软件分析vegf的阳性表达。用imagej软件自动计算cd31阳性血管
的表面积。通过将治疗组中cd31阳性血管的表面积标准化至对照组来进行定量分析。
[0085]
免疫荧光染色
[0086]
为了评估伤口中巨噬细胞(m1和m2)和紧密连接分子(claudin1和claudin2)的表达，进行了免疫荧光染色。将组织切片与抗cd68抗体(gb11067；1:300；servicebioinc.，boston，ma)，cd80(gb11034；1:300；servicebioinc.，boston，ma)，cd206(gb11062；1:500；servicebio inc.,boston,ma)，claudin1(37-4900；1:100；赛默飞世尔科技公司，中国上海)，claudin2(32-5600；1:200；赛默飞世尔科技公司，中国上海)在4℃下孵育过夜。
[0087]
使用二级hrp-驴抗兔igg抗体(ab150075；1:1000；艾博抗(上海)贸易有限公司)和hrp-山羊抗小鼠igg抗体(ab150113；1:1000；艾博抗(上海)贸易有限公司)在室温下孵育1小时，然后用4
′
，6-二脒基-2
′‑
苯基吲哚(dapi)(g1012；谷歌生物科技有限公司,中国武汉)染色切片用荧光显微镜((nikon eclipse ti-sr,tokyo,japan))拍摄。
[0088]
为了区分m1和m2巨噬细胞，使用cd68阳性和cd80阳性来表征m1型巨噬细胞。对于m2巨噬细胞，用cd68阳性和cd206阳性来表征m2型巨噬细胞。对阳性细胞使用image-pro plus软件进行自动计数和分析。使用mod值定量claudin1和claudin2的表达水平。
[0089]
蛋白质免疫印迹
[0090]
为了检测炎症因子的表达和氧化应激的调节，收集创面组织进行蛋白质免疫印迹试验。用pbs清洗伤口组织，加入裂解缓冲液，匀浆12000g离心10min。收集上清液。通过二辛可宁酸(bca)试剂盒测定蛋白质浓度(p0010；碧云天生物技术，中国上海)，并与还原十二烷基硫酸钠(sds)样品缓冲液混合，然后煮沸5分钟。将样品加载到sds-page凝胶上，并在80伏下电泳30分钟，然后在120伏下电泳1小时。在转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜后，用5％脱脂乳封闭膜1小时，并与一抗体核因子(红细胞衍生2)样2蛋白(nrf2)(ab137550；1:1000；艾博抗贸易有限公司，中国上海)，nad(p)h醌氧化还原酶1(nqo1)(ab28947；1:1000；艾博抗贸易有限公司，中国上海)，tnf-α(ab6671；1:1000；艾博抗贸易有限公司，中国上海)，il-6(ab9324；1:1000；艾博抗贸易有限公司，中国上海)，巨噬细胞炎症蛋白1β(mip-1β)(c04131；1:1000；上海萨博生物技术有限公司，中国南京)在4℃孵育过夜。随后，用hrp标记的山羊抗兔二抗(sa00001-2；1:3000；武汉三鹰生物技术有限公司)和hrp标记的山羊抗鼠二抗(gb23301；1:3000；武汉三鹰生物技术有限公司)在室温下孵育1小时，然后用化学发光法观察。为了检测上述蛋白的表达，用image j软件分析蛋白质免疫印迹条带。
[0091]
巨噬细胞体外转型实验
[0092]
采用实施例3提供的1μm的hst1-mad调控巨噬细胞体外转型，包括以下步骤：
[0093]
(1)取对数生长期细胞，用体积百分比为10％fbs的dmem高糖培养基将对数生长期raw264.7细胞配制为5
×
105个/ml密度的细胞悬液，接种在六孔板内，在5％co2，37℃环境下培养。
[0094]
(2)实验共分为三组，还包括空白组和lps模型组，每组取3个生物学重复。待步骤(1)中raw264.7细胞培养24h后，lps模型组、低剂量组和实验组分别加入lps使其终浓度为1.0μg/ml，处理1h后，各剂量组加入he-d，使其终浓度分别为200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml，继续培养24h。
[0095]
(3)吸弃每孔中的培养液，用pbs缓慢清洗三遍，每孔加入1ml trizol将细胞吹打均匀，使其充分裂解，立即放入液氮速冻20min，随后转移至-80℃低温保存以待送样。
[0096]
结果例
[0097]
为了筛选hst1-mad的最佳浓度，即具有最大功效的最低浓度，进行剂量依赖性研究，以评估0.01、0.1、1和10μm的hst1-mad对大鼠急性皮肤创伤愈合过程的影响。在术后第3天，与对照组(无hst1-mad)相比，1和10μm的hst1-mad显著促进伤口愈合(p《0.05)，如图1所示。因此，选取最佳浓度为1μm的hst1-mad进行进一步研究，以10μm hst1作为阳性对照。
[0098]
术后3天和5天，1μm hst1-mad组的创面愈合百分比显著高于对照组(p＜0.05),如图2中的a所示。在所有时间点，1μm hst1-mad与10μm hst1的愈合效果相当，如图2中的b所示。
[0099]
hst1-mad对再上皮化和胶原蛋白表达的影响
[0100]
h&e和masson染色以评估1μm hst1-mad对再上皮化和胶原再生的影响，如图3中的a和图4中的a所示，在创伤后10天，三组均有连续的新形成的表皮层。根据图3中的a和图3中的b定量分析显示，10μm hst1和1μm hst1-mad组新形成的表皮层厚度分别是对照组的1.54和1.47倍(p》0.05)。术后第5天和第10天，1μm hst1-mad组的胶原表达水平显著高于对照组(p《0.05)。1μm hst1-mad组与10μm hst1组对表皮层厚度及真皮胶原蛋白表达效果相当，如图4中的b所示。
[0101]
hst1-mad对血管生成的影响
[0102]
采用免疫组化染色法检测新生血管(以cd31作为标记物)(图5中的a)和血管生成生长因子-vegf的表达(图第6a)。术后第10天，1μm hst1-mad组的cd31阳性血管表面积和每个显微镜视野的vegf表达水平显著高于对照组(p《0.05)。相反，10μm hst1未能显著提高这两个参数，如图5中的b和图6中的b所示。
[0103]
hst1-mad对炎症细胞的调节作用
[0104]
为了评价hst1-mad对创面炎症细胞的调节作用，采用免疫荧光染色法对m1(cd68 和cd80 )和m2(cd68 和cd206 )巨噬细胞(如图7中的a和7中的b所示)进行双重染色。术后第5天，1μm hst1-mad组(9.83
±
2.48)和10μm hst1组(8.67
±
4.88)每个显微镜视野的m1巨噬细胞数量低于对照组(14.33
±
7.89)，如图7中的c所示。另一方面，1μm hst1-mad组(13.40
±
5.86)和10μm hst1组(10.67
±
7.34)中的m2巨噬细胞数量高于对照组(9.17
±
4.44)如图7所示。结果，与对照组相比，1μm hst1-mad和10μm hst1组中的m2与m1巨噬细胞的比率显著增高(分别为对照组2.61和2.17倍)(p《0.05)，如图7中的e所示。
[0105]
hst1-mad对紧密连接蛋白表达的影响
[0106]
进行免疫荧光染色以评价hst1-mad对新形成的表皮层中紧密连接蛋白(claudin1和claudin2)表达的影响，如图8中的claudin1和claudin2所示。术后第10天，1μm hst1-mad组和10μm hst1组创面新形成的表皮层中claudin1的表达强度显著高于对照组(p《0.05)，如图8所示。与对照组和10μm hst1阳性对照组相比，1μm hst1-mad处理也导致显著高的claudin 2表达强度(p《0.05)。
[0107]
hst1-mad对抗氧化剂和炎症因子表达水平的影响
[0108]
nrf2及其下游抗氧化蛋白nqo1是减轻ros诱导的皮肤创伤组织损伤的主要机制之一。采用western blot分析来评估hst1-mad对nrf2和nqo1表达水平的影响(图9中的a)。术后第5天，1μm hst1-mad组的nrf2表达水平高于对照组，但两组间差异无统计学意义(p》0.05图9中的b)。相反，nqo1在1μm hst1-mad组中的表达水平显著高于对照组(3.13倍)(p《
0.05，图9中的c)。此后，进一步分析了同一时间点的炎症因子(图9a)。
[0109]
术后第5天，1μm hst1-mad组的促炎因子il-6、tnf-α和mip-1β的表达水平显著低于对照组(p《0.05，图9中的d-f)。
[0110]
通过上述的分析可以看出，加速急性皮肤创面愈合的理想药物应不仅能显著促进再上皮化、胶原表达、血管生成，还能抑制过度炎症和氧化损伤。在这项研究中，hst1-mad人类唾液来源hst1的最小活性结构域-的使用与显著增高的新生表皮厚度、胶原沉积、血管生成、紧密连接蛋白(claudin 1和2)和内源性抗氧化酶nqo1表达相关。
[0111]
此外，它还能显著促进巨噬细胞由m1向m2的极化转变，减少炎性细胞因子如il-6、tnf-α和mip-1β的产生。并且hst1-mad的最佳浓度为hst1的十分之一。这些结果表明hst1-mad在促进急性皮肤伤口愈合产品中应用具有很好的疗效。
[0112]
在实施例1～4和对比例1浓度筛选试验中，1μm hst1-mad在促进皮肤伤口愈合方面最有效。在同一模型中，1μm hst1-mad甚至略优于10μm hst1。相反，在研究中发现1μm hst1的疗效显著低于10μm hst1。这些发现表明1μm hst1-mad已经非常有效，也进一步肯定了hst1-mad在成本效益方面相对于hst1的优势。
[0113]
hst1-mad对伤口提取液来源的酶降解的抗性明显高于hst1。在对hst1-mad和hst1的降解实验中，暴露8小时和24小时后，hst1已显著降解46％和92％，而在8小时和24小时后，hst1-mad分别有80％和42％。这是因为hst1比小片段的hst1-mad具有更多的裂解位点，降解主要发生在hst1的侧翼区域，限制了半衰期，降低了生物可利用的浓度。
[0114]
再上皮化、胶原沉积和血管生成是伤口愈合的主要参数。再上皮化在损伤后大约16-24小时开始，并经历伤口愈合过程的整个阶段。位于皮肤边缘的上皮细胞和角质形成细胞开始增殖并向伤口中心迁移，以在炎症细胞因子(如巨噬细胞和成纤维细胞产生的il-1、tnf-α和角质形成细胞生长因子(kgf))的刺激下重建表皮保护屏障。在巨噬细胞分泌的tgf-β1和pdgf的诱导下，成纤维细胞从周围组织迁移到伤口部位，从而促进胶原合成并转化为肌成纤维细胞，促进伤口收缩。tnf-α促进内皮细胞迁移和新血管形成，为伤口细胞增殖、迁移和代谢活动提供营养、氧气。在之前的研究中，在术后第7天hst1显著促进新生表皮增厚。结果显示术后第10天，10μm hst1和1μm hst1-mad组新生表皮厚度分别为对照组的1.54和1.47倍，但各组间差异无统计学意义。一种可能的解释是表皮的厚度持续增厚，直到皮肤损伤后第7天达到高峰，之后逐渐变薄，接近正常的皮肤表皮厚度。
[0115]
hst1还显示出促进成纤维细胞的迁移和成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，以增强伤口收缩功能和胶原沉积。结果表明，1μm hst1-mad和10μm hst1的胶原蛋白表达均明显高于对照组。这些结果表明，1μm hst1-mad对这些参数的效果与10μm hst1相当。此外，1μm hst1-mad组中cd31阳性血管的表面积和vegf表达水平显著高于对照组。除上述参数外，细胞间连接也是参与皮肤屏障形成的重要因素。主要包括粘附连接，紧密连接和桥粒。紧密连接由多种跨膜蛋白(如claudin、occludin)组成，是一种功能性的细胞间结构，维持皮肤屏障功能，对有效愈合伤口至关重要。claudin1是主要的跨膜蛋白，有助于形成新生表皮细胞间屏障。有研究表明，敲除claudin1基因不仅能显著降低皮肤角质形成细胞的增殖和迁移，还能降低角质层的水屏障功能，导致严重失水。hst1已被证明能增加人上皮细胞的上皮间质阻力(ter，一种紧密连接完整性的功能性测量方法)，从而产生上皮屏障。此外，hst1也能增加同一细胞系中连接蛋白zo-1的mrna水平。本研究发现，1μm hst1-mad和10μm hst1处理
后创面新形成表皮层中claudin1的表达强度明显高于对照组。另一种跨膜蛋白，claudin2，位于表皮，在人角质形成细胞中表达，主要参与形成阳离子选择性和水渗透性通道。结果显示，用1μm hst1-mad处理的claudin2的表达强度显著高于10μm hst1和对照组。相反，10μm hst1在该参数中没有显示出有益的效果。结果表明，1μm hst1-mad可促进claudin2在新生表皮层中的表达，从而维持离子梯度和屏障功能。
[0116]
m1/m2巨噬细胞极化对伤口愈合至关重要。伤后单核细胞在脂多糖(lps)和炎症细胞因子(il-4、il-10)等细菌产物刺激下分化为促炎m1巨噬细胞(经典活化巨噬细胞)。m1巨噬细胞参与吞噬微生物和分泌促炎介质，如tnf-α、il-6、inos和mip-1β。在后期炎症阶段，m1巨噬细胞转化为m2巨噬细胞(交替活化的巨噬细胞)，其表达高水平的tgf-β1、vegf-α和pdgf，以促进血管生成、胶原合成和上皮再生。从m1到m2巨噬细胞的快速转换可促进炎症消退和伤口愈合，而m1到m2的延迟转换可增加伤口愈合延迟和过度瘢痕形成的风险。在本研究中，1μm hst1-mad组炎性因子il-6、tnf-α和mip-1β的表达水平明显低于对照组。
[0117]
此外，与对照组相比，1μm hst1-mad组和10μm hst1组的m2/m1巨噬细胞比值显著升高。上述结果表明，1μm hst1-mad还可以调节巨噬细胞的极化，从而减轻炎症，促进急性创面的愈合。
[0118]
在伤口愈合过程中，先天免疫细胞产生并分泌大量的ros来阻止细菌的入侵。ros是自由基种类的统称，包括超氧化物、羟基自由基、过氧化氢和单线态氧。然而，由促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡引起的氧化应激可导致ros的过量产生，从而导致细胞损伤、瘢痕形成，甚至经久不愈的创面。抗氧化系统通过清除ros衍生物发挥保护作用。nrf2是一个关键的转录因子，与抗氧化反应元件结合，上调下游抗氧化蛋白如nqo1的表达。nqo1是一种在上皮和血管内皮组织中表达的胞质黄素酶，其具有超氧化物清除活性，从而保护细胞免受氧化应激。研究显示，术后第5天，1μm hst1-mad组的nrf2表达水平高于对照组。此外，与对照组相比，nqo1的表达水平显著升高。结果表明，nrf2-nqo1抗氧化轴参与了hst1-mad的促愈合作用。
[0119]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。