防治球虫的植生素配方的制作方法

1.本发明主要涉及用于治疗球虫病的植生素配方，更具体地涉及包含印度艾(artemisia indica)和三叶鬼针草(bidens pilosa)的组合的防治球虫的植生素配方。


背景技术：

2.球虫病是一种主要的家禽类寄生虫病，造成家禽业的巨大经济损失。在球虫亚纲下的艾美球虫(eimeria)属，其具孢子型态，为单细胞的寄生性原生动物。它们是肠寄生虫，会感染鱼类、爬行动物、鸟类和哺乳动物。鸡容易被至少11种的艾美球虫感染，在鸡中，柔嫩艾美球虫(e.tenella)、毒害艾美球虫(e.necatrix)、布氏艾美球虫(e.brunetti)和巨型艾美球虫(e.maxima)的毒性较高，而堆形艾美球虫(e.acervulina)、早熟艾美球虫(e.praecox)和和缓艾美球虫(e.mitis)的毒性较低。艾美球虫的感染通常是无症状的，但在小鸡或免疫受损的鸡只会表现出严重的临床症状，包括腹泻、血便、脱水、下垂、精神萎靡、食欲不振、苍白、羽毛松动和蜷缩。
3.艾美球虫的生命周期具有细胞内、细胞外、无性和有性阶段。当鸡只一被艾美球虫感染，寄生虫就会在鸡只中生长，并产生一个微小的卵(称为卵囊)，该卵囊会在鸡只的粪便中被传播出去。在适当的温度和湿度条件下，卵囊会在一到两天内发育形成芽孢化的卵囊，其能够感染其他鸡只。在此阶段，卵囊包含八个子体(称为孢子体)，当卵囊被鸡只吃下去后每个孢子体都能进入鸡只的肠细胞。进入细胞后，孢子体会多次分裂产生后代(裂殖子)。每个裂殖子又可以进入到另外的肠细胞。此周期可能重复数次，并导致大量的肠细胞被破坏。最后，周期停止并产生性细胞(雄性和雌性)。雄性使雌性受精产生卵囊，卵囊从肠细胞破裂并随着粪便被排出体外。成千上万个卵囊可能会在被感染鸡只的粪便中被传播。因此，在拥挤或不卫生条件下饲养的家禽有高度风险被感染。
4.植物被认为是动物以及人类药物的绝佳来源，其中菊科植物
–
三叶鬼针草被宣称为用于治疗球虫病的防治球虫药草。在美国专利号9,072,312揭露了用于预防和治疗球虫病的三叶鬼针草和聚乙炔类化合物。虽然三叶鬼针草及其活性化合物可以预防和治疗球虫病，但其预防和治疗有时在肮脏的鸡舍中是无效的。


技术实现要素：

5.一方面，本发明涉及一种防治球虫组合物，其包含：(a)有效量的印度艾萃取物；(b)有效量的三叶鬼针草萃取物；以及(c)医药上可接受的载剂、赋形剂或载体。
6.另一方面，本发明涉及一种防治球虫组合物，其包含：(a)有效量的印度艾萃取物或粉末；以及(b)有效量的三叶鬼针草萃取物或粉末。
7.在本发明的一个实施方式中，所述防治球虫组合物包含：(a)有效量的印度艾萃取物；以及(b)有效量的三叶鬼针草萃取物；或(a)有效量的印度艾萃取物；以及(b)有效量的三叶鬼针草粉末；或(a)有效量的印度艾粉末；以及(b)有效量的三叶鬼针草萃取物；或(a)有效量的印度艾粉末；以及(b)有效量的三叶鬼针草粉末。所述防治球虫组合物可进一步包
含医药上可接受的载剂、赋形剂或载体。
8.在一个实施方式中，所述防治球虫组合物为口服剂型。所述口服剂型可以选自锭剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、颗粒剂、粉剂、浓缩物、液体、模制球(molded balls)及其任何组合。
9.在另一个实施方式中，所述防治球虫组合物进一步包含动物饲料、非人类动物饲料或食物。
10.在另一个实施方式中，所述动物饲料选自由家禽饲料、鱼类食物、两栖类饲料、爬虫类食物、鸟类饲料及非人类的哺乳类食物组成的群组。
11.在另一个实施方式中，所述印度艾萃取物与所述三叶鬼针草萃取物约以0.0001:1.0至1.0:1.0的比例存在。
12.在另一个实施方式中，所述印度艾萃取物的量为所述组合物重量的0.0001％至0.01％。所述印度艾的量约在0.00005％至0.005％(w/w)或约在0.001％至0.01％(w/w)的范围内。
13.在另一个实施方式中，所述三叶鬼针草萃取物的量为所述组合物重量的0.01％至0.1％。所述三叶鬼针草的量在约0.005％至约0.05％的范围内。
14.在另一个实施方式中，所述印度艾包含绿原酸(chlorogenic acid)。
15.本发明还涉及一种防治球虫组合物，主要由或由(a)有效量的印度艾萃取物或粉末；(b)有效量的三叶鬼针草萃取物或粉末；以及(c)非人类动物饲料或食物组成。
16.本发明进一步涉及一种防治球虫组合物，主要由或由(a)有效量的印度艾萃取物或粉末；以及(b)有效量的三叶鬼针草萃取物或粉末组成。
17.在本发明的一个实施方式中，所述防治球虫组合物为非水性液体(non-aqueous liquid)、水性液体(aqueous liquid)、悬浮液或粉末形式。
18.还一方面，本发明涉及一种防治球虫组合物在制备用于杀死球虫卵囊和抑制球虫卵囊芽孢化的药物中的用途。
19.又一方面，本发明涉及本发明的防治球虫组合物在制备在个体有需要时用以杀死球虫卵囊、抑制卵囊芽孢化、减少孢子体入侵和减少血便，或用于减轻或治疗球虫病的药物中的用途。
20.再一方面，本发明涉及一种包含有效量的印度艾萃取物和医药上可接受的载剂的防治球虫配方在制备用于杀死球虫卵囊、抑制球虫卵囊芽孢化和减少孢子体入侵的药物中的用途。
21.这些和其他方面将从以下结合以下附图对优选实施方式的描述中变得显而易见，但是在不背离本公开的新颖概念的精神和范围的情况下可以进行变化和修改。
22.附图说明了本发明的一个或多个实施方式，并且与书面描述一起用于解释本发明的原理。在可能的情况下，在整个附图中使用相同的附图标记来指代实施方式的相同或相似的元件。
附图说明
23.图1a-c为描述在体外试验(in vitro)中含有印度艾(a.indica,ai)、三叶鬼针草(b.pilosa,bp)、或印度艾(ai)和三叶鬼针草(bp)的混合物的配方对柔嫩艾美球虫
(eimeria tenella,et)卵囊活性的影响的显微照片(上图)和直方图(下图)。所述卵囊用磷酸盐缓冲溶液(pbs)(阴性对照组,nc)、沸腾(阳性对照组,pc)或是含ai的植物萃取物(1a)、含bp的植物萃取物(1b)、或同时含有ai和bp的植物萃取物(1c)以指定剂量预处理30分钟。在以碘化丙啶(propidium iodide,pi)染色后，用荧光显微镜(左下图)或光学显微镜(左上图)检查卵囊活性。明视野处显示卵囊的数量。pi阳性卵囊的百分比以平均值
±
标准误差(mean
±
se)表示，绘制成直方图(右图)；比例尺为100μm。
24.图2a-c为描述在体外试验(in vitro)中含有印度艾(ai)、三叶鬼针草(bp)、或印度艾(ai)和三叶鬼针草(bp)的混合物的配方对柔嫩艾美球虫(et)卵囊的活性和芽孢化的影响的显微照片(上图)和直方图(下图)。所述卵囊用磷酸盐缓冲溶液(pbs)、卵囊芽孢化抑制剂
–
连二亚硫酸钠(sodium dithionite,sd)或是含ai的植物萃取物(2a)、含bp的植物萃取物(2b)、或同时含有ai和bp的植物萃取物(2c)以指定剂量预处理48小时。所述卵囊以重铬酸钾诱导卵囊芽孢化2天。用显微镜(左图)计数卵囊芽孢化的百分比，并绘制成直方图(右图)；比例尺为200μm。图中箭号表示该卵囊已芽孢化，而箭头表示该卵囊未芽孢化。
25.图3a-c为描述在体外试验(in vitro)中含有印度艾(ai)、三叶鬼针草(bp)、或含有印度艾(ai)和三叶鬼针草(bp)的混合物的配方对柔嫩艾美球虫(et)孢子体入侵的影响的显微照片(左图)和直方图(右图)。将牛肾上皮(madin
–
darby bovine kidney,mdbk)细胞与沙利霉素(salinomycin,sal)、或是含印度艾(ai)的植物萃取物(3a)、含三叶鬼针草(bp)的植物萃取物(3b)、或同时含有印度艾(ai)和三叶鬼针草(bp)的植物萃取物(3c)以指定剂量共同孵育0.5小时。将孢子体加到mdbk细胞中2小时。洗净后，将mdbk细胞用苏木精和伊红(h&e)染色并计算数量。被孢子体入侵的百分比(％)绘制成直方图。插图代表被放大的区域。100x和40x(插图)显微镜的比例尺分别为10μm和50μm(插图)。箭头指被孢子体感染的mdbk细胞。
26.图4a为显示在体内(in vivo)研究中使用的的实验步骤的示意图。未被治疗的鸡只族群每天使用标准饮食，被治疗的鸡只族群被喂食含有沙利霉素(salinomycin)、印度艾(ai)、三叶鬼针草(bp)或ai加bp的混合物的饮食。第7天以管喂方式给予鸡只磷酸盐缓冲溶液(pbs)或是柔嫩艾美球虫(et)已芽孢化的卵囊(1x104)。从感染后的第1天到第7天监测每组鸡只的存活率。
27.图4b为显示图4a的每组鸡只的存活率的图。鸡只被分为8组：第1组(g1)：未感染并以标准饮食喂养；第2组(g2)：被et染感并以标准饮食喂养；第3组(g3)至第8组(g8)：被et染感并如指示分别以含有沙利霉素(salinomycin)、bp单独、bp和不同剂量的ai的组合或不含bp单独ai的饮食喂养。每组有15只小鸡并标示出p值。
28.图5为显示图4a-b中被柔嫩艾美球虫(et)感后第7天的每个鸡只组别中的血便百分比直方图。鸡只粪便在感染后的第1天到第7天即被分类。
具体实施方式
29.本说明书所使用的术语在本发明的前后文以及每个术语被特定使用的前后文，在所属技术领域中具有其特定含义。这些用于描述发明内容的术语将在下面或说明书的其他地方讨论，以提供实施者有关本发明描述的进一步引导。为了方便阅读，这些术语可能会被特定标示，例如使用斜体和/或引号。这些特定标示并不影响术语所代表的范畴及含义；无
nmr进行性质分析。所得的纯化合物可进一步衍生以提供数种其他聚乙炔化合物(美国专利号7,763,285及kusano等人(jp 2004083463)，所有这些文献内容通过引用整并至本文中)。
41.印度艾萃取物和三叶鬼针草萃取物为以粉末形式使用。计算植物萃取物粉末的百分比方法为：植物粉末重量/植物粉末重量
±
基本的鸡只饲料＝植物粉末的百分比(％)。
42.本发明涉及印度艾以及含有印度艾和三叶鬼针草的配方的防治球虫特性的发现。
43.实施例
44.材料与方法
45.化学品：沙利霉素(salinomycin)、磷酸盐缓冲溶液(pbs)、h&e染色购买自sigma-aldrich
tm
，印度艾和三叶鬼针草经沸水处理萃取后以不同比例混和供后续使用。
46.入侵测定：将牛肾上皮(mdbk,ccl-22)细胞用含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)和其余营养物的dmem培养液培养，并以每孔2
×
105细胞数/孔盘种入24孔盘的玻璃盖玻片上。一天后，将细胞在含有沙利霉素(salinomycin)或含有特定剂量的植物萃取物和植物化学物质的dmem培养液中预孵育0.5小时。把新鲜的孢子体(2
×
105)加入所述细胞中再培养4小时。以大量磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗后，将细胞固定并用h&e染色。用显微镜拍摄照片。藉由100％
×
(被孢子体入侵的细胞数/总细胞数)的公式求出入侵率(％)。
47.活性测试(viability test)：将柔嫩艾美球虫孢子体与植物萃取物或沙利霉素(salinomycin)一起孵育4.5小时。使用显微镜区分在孢子体下的活细胞和死细胞(图3)。通过死细胞数除以总细胞数乘以100％计算存活率(％)。
48.芽孢化测定(sporulation assay)：将柔嫩艾美球虫卵囊分别用磷酸盐缓冲溶液(pbs)、沸腾(100℃30分钟)或与指定剂量的植物萃取物预处理48小时。在芽孢化前，将卵囊与2％的重铬酸钾(potassium dichromate)孵育2天。计算芽孢化的卵囊的百分比(％)。
49.碘化丙啶(pi)染色柔嫩艾美球虫的孢子体：et卵囊分别经磷酸盐缓冲溶液(pbs)(1小时)、沸腾处理(100℃30分钟)或与指定剂量的植物萃取物孵育1小时。将卵囊以pi染色，再用磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗后，使用显微镜检查卵囊。
50.鸡只、饮食和实验设计：鸡龄1日的罗曼肉雏鸡(lohmann broiler chicks)购自台中(中国台湾)孵化鸡场。抵达时进行鸡翅绑扎，以及称重并随机放在petersime雏鸡育雏单元(petersime starter brooder units)中。孵化后1至2天，让鸡只自由饮水和饮食。通过混合基础饮食与单独载体(对照组)或与含有印度艾(ai)、三叶鬼针草(bp)或同时含有ai和bp的特定剂量的植生素配方来配制饮食。分组后，将鸡只用管喂方式给予艾美球虫卵囊使鸡只感染。测量和检查鸡只的成长表现(体重和饲料转换率)、病理学(血便和肠道型态检定)和存活率(图4a)。所有鸡只都被饲养在机构的动物设施中，并根据机构的指引进行管理。
51.免疫组织化学染色法：分别从对照饮食以及含有印度艾(ai)、三叶鬼针草(bp)或同时含有ai和bp的饮食喂食14天的鸡只取出盲肠快速冷冻进行多个平行切片。将切片用h&e染色或用抗胰岛素抗体染色，搭配二氨基联苯胺四盐酸盐(diaminobenzidine tetrahydrochloride)显影，然后进行影像分析(yang等人research in veterinary science(2015)98:74-81)。
52.统计分析：来自三个或更多个独立实验结果以平均值
±
标准误差(mean
±
se)呈
现。数据以anova分析是否有显著差异，p值小于0.05的差异被认为具有统计学意义。
53.结果
54.植物萃取物对柔嫩艾美球虫卵囊的存活、卵囊芽孢化和孢子体入侵的影响
55.为了研究印度艾(ai)萃取物、三叶鬼针草(bp)萃取物以及ai与bp的组合萃取物的效果，分别检查ai、bp以及ai与bp的组合对柔嫩艾美球虫(et)卵囊的直接杀伤性。以沸腾处理作为阳性对照组，其藉由碘化丙啶(pi)染色显示可有效杀死30％的et卵囊(沸腾，图1a)。ai直接杀死艾美球虫卵囊的效果具有剂量依赖性(dose-dependent manner)(图1a，右图)。bp未能杀死卵囊(图1b)。ai与bp的组合杀死et卵囊(图1c)。
56.测试植物萃取物对柔嫩艾美球虫(et)卵囊芽孢化的影响。70％的et卵囊能够在体外培养中形成孢子(pbs，图2a)。以连二亚硫酸钠(sd)作为阳性对照组处理使柔嫩艾美球虫(et)卵囊的芽孢化现象较以磷酸盐缓冲溶液(pbs)处理的组别减少40％(sd，图2a，右图)。印度艾(ai)对减少柔嫩艾美球虫(et)卵囊的芽孢化具有剂量依赖性(图2a)。三叶鬼针草(bp)抑制对et卵囊的芽孢化也具有剂量依赖性(图2b)。ai与bp的组合抑制et卵囊的芽孢化具有协同效果(图2c)。
57.检查三叶鬼针草对et孢子体入侵mdbk细胞的影响。根据yang等人的报告(scientific reports(2019)9：2896，)，et孢子体可入侵20％的细胞(图3a，右图)。50μg/ml的抗球虫药
–
沙利霉素(salinomycin)可将et孢子体的入侵率降低至10％。印度艾(ai)减少et孢子体的入侵效果具有剂量依赖性(图3a，右图)。三叶鬼针草(bp)减少et孢子体入侵mdbk细胞的效果亦具有剂量依赖性(图3b，右图)。ai与bp的组合减少艾美球虫孢子体入侵细胞具有协同效果(图3c，右图)。数据显示，用ai与bp的组合处理可以干扰et在生命周期中的卵囊、卵囊芽孢化和孢子体入侵细胞的阶段。与单独使用ai或bp相比，ai与bp的组合在抑制et卵囊芽孢化和et孢子体入侵方面更为有效。数据显示ai和bp具有不同的抗球虫作用机制。
58.植物萃取物对被柔嫩艾美球虫感染鸡只的存活率、体重增加和饲料转化率的影响
59.在体内试验(in vivo)检查印度艾(ai)萃取物、三叶鬼针草萃取物(bp)ai与bp的组合萃取物的防治球虫效果。将鸡只随机分为8组，每天(第1天至第14天)以鸡标准饮食喂食(第1组和第2组)，以含有沙利霉素(salinomycin)的饲料喂食(第3组)，分别以含特定剂量的植物萃取物的饲料喂食(第4组至第8组)(图4a)。
60.图4b显示以标准饮食喂养的鸡只在被et感染后的存活率从100％(ctr，第1组)下降到60％(et，第2组)。以含有沙利霉素(salinomycin)的饲料喂养的被感染鸡只的存活率为100％(第3组)。同样地，以含有印ai、bp或ai与bp的组合喂养的被感染鸡只的存活率均为100％(第4组至第8组)。
61.表1显示植物萃取物对被et感染鸡只在体重增加效果上的影响。根据图4b，于第1天、第7天和第14天监测鸡只的体重(bw)，并在第7天和第14天计算体重(bw)增加量。在第7天(et感染前)，不同组别的鸡只体重的增加量相似(第7天的bw减去第1天的bw)。在第7天，以管喂方式给予第2组到第8组的鸡只et卵囊(1
×
104)使之感染，而对照组(第1组)的鸡只则给予pbs。在第14天(et感染后)，未感染且未用药鸡只(第1组)、被感染且未用药鸡只(第2组)、被感染且以沙利霉素(salinomycin)治疗的鸡只(第3组)、被感染且以0.01％bp治疗的鸡只(第4组)、被感染且以0.0001％ai加0.01％bp治疗的鸡只(第5组)、被感染且以0.001％
ai加0.01％bp治疗的鸡只(第6组)、被感染且以0.01％ai加0.01％bp治疗的鸡只(第7组)、被感染且以0.01％ai治疗的鸡只(第8组)的平均体重增加量(第14天的bw减去第1天的bw)，分别为88.84g、50.80g、56.33g、61.98g、62.91g、64.65g、67.66g和59.78g。数据显示，使用ai与bp的组合比仅单独使用其中一种的萃取物具有更好的体重增加效果。
62.表1
63.[0064][0065]
表2显示植物萃取物对被et感染鸡只的饲料转化率(fcr)的影响。在第14天(et感染后)，对照组鸡只(第1组)、被感染且未用药鸡只(第2组)、被感染且以沙利霉素(salinomycin)喂食的鸡只(第3组)、被感染且以0.01％bp喂食的鸡只(第4组)、被感染且以0.0001％ai加0.01％bp喂食的鸡只(第5组)、被感染且以0.001％ai加0.01％bp喂食的鸡只(第6组)、被感染且以0.01％ai加0.01％bp喂食的鸡只(第7组)、被感染且以0.01％ai喂食的鸡只(第8组)的平均饲料转换率分别为2.24、3.38、3.05、2.60、3.01、3.04、2.88和2.96。结果显示，与单独喂食沙利霉素(salinomycin)或以对照组饮食喂养的组别相比，ai、三叶bp或ai与bp的组合均可显著改善et感染引起的体重减轻，并还可大幅度地改善由et感染引起的饲料转化率的增加。造成改善的部分原因可以归因于植物萃取物的增重效果。
[0066]
表2
[0067]
[0068][0069]
植物萃取物对被柔嫩艾美球虫感染鸡只粪便中卵囊排放量(on fecal oocyst excretion)的影响
[0070]
表3显示每组的粪便中卵囊排放量的情形。被et感染鸡只粪便中的艾美球虫卵囊排放量是艾美球虫繁殖的指标。图4b中鸡只的每克粪便卵囊数(opg)于鸡只被et感染后的第3天至第7天计算。在未感染且未用药的对照组鸡只中未检测到粪便中有卵囊(第1组，表3)。感染后的第4天，所有被et感染的组别中都首次检测到粪便中有卵囊，其中，第2组在感染后第7天达到高峰值。喂食沙利霉素(salinomycin)的被感染鸡只(第3组)每克粪便中的卵囊数比被感染且未用药鸡只(第2组)略少；分别以0.01％bp、0.0001％ai加0.01％bp、0.001％ai加0.01％bp、0.01％ai加0.01％bp、以及0.01％ai喂养的受感染鸡只(第4组到第8组)的每克粪便卵囊数明显少于被感染且未用药的鸡只(第2组)。数据显示，与单独使用ai或bp相比，使用ai与bp的组合可以降低更多的每克粪便中的卵囊数。
[0071]
表3
[0072][0073]
植物萃取物对被柔嫩艾美球虫感染鸡只的肠道损伤的影响
[0074]
表4显示被et感染后第7天的鸡只的盲肠肉眼病变分数。观察并评分图4b中鸡只的盲肠肉眼病变。未被感染且未用药的对照组鸡只(第1组，表4)盲肠没有病变(分数＝0)。被et感染且未用药的鸡只(第2组)在感染后第7天的平均盲肠肉眼病变分数为4分，显示其肠道出现更多盲肠肉眼病变。喂食沙利霉素(salinomycin)的被感染鸡只的平均盲肠肉眼病变分数为3.86分(第3组)。分别以0.01％bp、0.0001％ai加0.01％bp、0.001％ai加0.01％bp、0.01％ai加0.01％bp、以及0.01％ai喂食的受感染鸡只(第4组到第8组)，其盲肠肉眼病变分数显著地低于被感染且未用药的鸡只(第2组)。数据显示，使用混和印度艾与三叶鬼针草的萃取物降低肠道损伤的程度较其他任何单独萃取物的效果还要大。
[0075]
表4
[0076][0077]
表5显示图4b中被et感染后第7天的鸡只的盲肠显微镜检病变分数。在显微镜下检查球虫引起的黏膜损伤，并根据鸡只的盲肠黏膜损伤的分布和严重程度计算盲肠显微镜检病变分数。
[0078]
在未感染且未用药的对照组鸡只(第1组)中未观察到盲肠显微镜检病变(分数＝0)。被感染且未用药的鸡只(第2组)在被et感染后的第7天盲肠有严重的显微镜检病变(分数＝7.2)。盲肠中还有严重溃疡、出血和绒毛减少的现象(数据未公开)。盲肠上皮内部出现卵囊、配子体和裂殖子(数据未公开)。与被感染且未用药的鸡只(第2组)相比，喂食沙利霉素(salinomycin)的被感染鸡只(第3组)在盲肠的显微镜检病变(分数＝6.29)上有轻微改善。然而，喂食三叶鬼针草萃取物、混和印度艾与三叶鬼针草的萃取物或单独印度艾萃取物的被感染鸡只(第4组到第8组，表5)的盲肠的显微镜检病变显著减少(分数为4.78至5.80)。结果一致地，喂食三叶鬼针草萃取物相较于对照组的饮食，可使得鸡只的溃疡和出血状况减少，且在鸡只盲肠中保留了更多的黏膜和绒毛(数据未公开)。喂食三叶鬼针草萃取物的被感染鸡只也比喂食沙利霉素(salinomycin)的被感染鸡只和对照组饮食的鸡只的盲肠上皮内卵囊、配子和裂殖子的数量较少(数据未公开)。总体来说，三叶鬼针草萃取物、混和印度艾与三叶鬼针草的萃取物或单独印度艾萃取物可明显地减轻被艾美球虫感染后鸡只的肠道病理现象。数据显示，混和印度艾与三叶鬼针草的萃取物降低肠道显微损伤的程度较
其他任何单独萃取物的效果还要大。
[0079]
表5
[0080][0081][0082]
植物萃取物对被柔嫩艾美球虫感染鸡只的血便的影响
[0083]
图5显示被柔嫩艾美球虫(et)感染后第7天每个鸡只组别中血便的百分比。在未感染的对照组鸡只(ctr，第1组)中没有血便。et感染引起100％的血便(第2组)。喂食沙利霉素(salinomycin)的被感染鸡只的血便百分比明显降低(第3组)。分别以0.01％bp、0.0001％ai加0.01％bp、0.001％ai加0.01％bp、0.01％ai加0.01％bp、以及0.01％ai(第4组至第8组)喂食的被感染鸡只和被感染且未用药的鸡只(第2组)相比，血便百分比显著降低。数据显示，混和印度艾与三叶鬼针草的萃取物降低血便现象的程度较其他任何单独萃取物的效果还要大。
[0084]
本说明书中引用和讨论的所有参考文献均以引用方式全文并入本文，其程度如同每个参考文献单独以引用方式并入一样。