一种低色温无荧光粉LED在预防年龄相关性黄斑变性中的应用

一种低色温无荧光粉led在预防年龄相关性黄斑变性中的应用
技术领域
1.本发明涉及光医疗和光健康领域，具体涉及一种低色温无荧光粉led在预防年龄相关性黄斑变性中的应用。


背景技术：

2.年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,amd)是眼科中常见的一种疾病，会导致视觉障碍和严重视力丧失，现已是全球范围内严重不可逆性视力丧失的第三个主要原因。到2040年，全球患有amd的人数预计将达到3亿，从而构成一个重大的公共卫生问题，对社会经济产生很大影响。在临床上，amd被分为早期和晚期。早期amd主要表现为bruch膜和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,rpe)之间中等大小的病理性沉积物和视网膜色素改变(色素沉着过度或色素沉着不足)。晚期amd具有非血管性(称为“干性”)和新生血管性(称为“湿性”)两种形式。amd是一种多因素疾病，年龄是最强的危险因素，遗传因素，吸烟和饮食中抗氧化剂(锌和类胡萝卜素)摄入量低也是amd发病的重要因素，其病理机制涉及补体，脂质，血管生成，炎症和细胞外基质途径的失调。已经确定了50多个遗传易感基因座，其中最重要的是cfh和arms2基因。大剂量锌和抗氧化剂维生素补充剂可以减缓amd的疾病进展。新生血管性amd占晚期amd的10％。脉络膜新生血管会导致患者急性视力丧失，但玻璃体内注射抗血管内皮生长因子疗法(例如兰尼单抗，阿柏西普或贝伐单抗)在治疗新生血管性amd方面非常有效。晚期非血管性amd，也称为地图状萎缩(geographic atrophy,ga)，主要特点是rpe、光感受器和脉络膜毛细血管层不可逆性的丢失。它占晚期amd病例的90％。补体抑制作用被认为是治疗萎缩性amd重要的干预措施。在2期和3期临床试验中已测试了靶向补体途径的药物，例如依库丽单抗和兰帕珠单抗。在mahalo ii期试验中，lampalizumab治疗可减少20％的地理萎缩区域进展，在cfi风险等位基因携带者中则可减少44％(大约为试验样本的一半)。但是，chroma和spectri iii期试验的结果表明兰帕单抗在48周的治疗中并未减少地理萎缩的扩大。此外，在complete研究中，依库丽单抗对地理萎缩的生长没有影响。所以，对于晚期非血管性amd来说，目前没有确切统一的治疗手段。
3.氧化应激已被认为是引发rpe变性的关键因素。氧化应激最终涉及过量的ros，这些ros主要在线粒体中产生。ros氧化许多生物大分子，包括蛋白质，脂质和核酸，并可能引起这些分子的结构和功能变化。在amd病理学中，过量的ros和氧化的脂蛋白导致蛋白错误折叠，聚集以及先天免疫反应的慢性激活。许多报告指出rpe线粒体dna(mtdna)损伤是amd病理学的重要因素，造成mtdna损伤累积的潜在机制包括nfe2l2和pgc-1α调节的抗氧化酶活性降低，mtdna修复蛋白降低或线粒体清除障碍。ros水平升高进一步促进了mtdna的损伤。rpe mtdna损伤的程度与amd严重程度相关。但需要注意的是，在光感受器中未观察到amd相关的mtdna损伤增加。这可能与能量产生途径的细胞特异性差异有关：与依赖于产生ros的线粒体的rpe相反，光感受器利用有氧糖酵解产生能量(一种不产生过量ros的途径)。
1)在r28细胞中表达上调；rmc-1细胞中胶质纤维酸性蛋白(gfap)和波形蛋白的表达上调。因此，我们得出的结论是，1900k低色温无荧光粉led几乎不会对视网膜细胞造成损害，并为人类减少了长期暴露于荧光白光led的潜在健康风险。除此之外，利用此灯的另一实验也初步证明该1900k低色温led不仅在伤口愈合和毛发生长上具有益处，还能够调节褪黑素的分泌，治疗失眠，维护正常生物节律。我们还发现该灯能够保护眼表，减少因含蓝光led所带来的眼表健康问题。结合目前以上研究结果，我们相信该低色温led在临床眼病预防治疗上具备很大潜力。


技术实现要素：

6.发明人首次发现低色温无荧光粉led对arpe-19细胞的保护作用。低色温无荧光粉led能够增加细胞活力、减少过氧化氢带来的细胞死亡、ros生成和线粒体功能损伤。这为低色温无荧光粉led未来相关的光治疗提供了基础实验支持和信心，也为包括amd在内的眼病防治提供了新思路。
7.本发明的目的在于提供一种低色温无荧光粉led在预防年龄相关性黄斑变性中的应用，开辟了低色温无荧光粉led除了照明之外作为医疗器械的新用途，也为防治年龄相关性黄斑变性提供了新的途径。
8.本发明是通过如下技术方案实现的：
9.一种低色温无荧光粉led在预防年龄相关性黄斑变性中的应用；
10.其中，所述低色温无荧光粉led其色温为1600-2200k。
11.进一步地，所述低色温无荧光粉led其色温为1900k。
12.进一步地，所述低色温无荧光粉led的辐照度为5-15w/m2。
13.进一步地，所述低色温无荧光粉led的辐照度为10w/m2。
14.进一步地，所述低色温无荧光粉led能够增加视网膜色素上皮细胞的细胞活力。
15.进一步地，所述低色温无荧光粉led能够抵抗过氧化氢对细胞的损伤。
16.进一步地，所述低色温无荧光粉led能够减少细胞内ros的生成从而抵御氧化应激给细胞带来的损伤。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明首次发现了低色温无荧光粉led在保护arpe-19细胞中的作用，即通过减少细胞内ros和氧化应激给线粒体带来的损伤来保护arpe-19。低色温无荧光粉led安全性好，已大量投入市场，为年龄相关性黄斑变性的预防提供了新的潜在方案，也为低色温无荧光粉led的健康照明应用提供了依据和机遇。
附图说明
19.图1为先光照48小时后400μm h2o2损伤6小时的造模图。
20.图2为不同色温led(1900k、4000k、6600k、blue)照射arpe-19细胞48小时之后细胞活力的结果。
21.图3为不同辐照度(5w/m2、10w/m2、15w/m2)低色温双基色led照射arpe-19细胞48小时之后细胞活力的结果。
22.图4为10w/m
2 1900k led照射不同时间(1d、2d、3d)后arpe-19细胞活力的结果。
23.图5为h2o2损伤造模最佳浓度的选择。
24.图6为先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6h，之后去除h2o2，处理结束后0h、3h、9h、24h细胞活力的结果。
25.图7为1900k、4000k、blue led光照48h后和先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6h模式下细胞内ros的水平。
26.图8为先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤3h模式下arpe-19细胞内线粒体的形态。
27.图9为先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6h模式下arpe-19细胞线粒体dna损伤的情况。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非用于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
30.实验材料和实验材料来源如下：细胞系为人视网膜色素上皮细胞系(arpe-19)，由上海市第十人民医院的于靖博士赠予。
31.低色温无荧光粉led采用多基色led原理通过模拟计算，匹配红(波长为630nm)、黄光(波长为560nm)两种颜色led的功率比例从而实现完全无蓝光成分的低色温高显指照明，显色指数可超过80，色温1600-2200k，满足照明需求。
32.实验所用pcr引物，如表1所示。
33.表1 pcr引物
[0034][0035]
线粒体荧光蛋白报告载体pdsred2-mito购买于武汉淼灵生物科技有限公司。该载体带有dsred红色荧光，cmv启动子，kan抗性g418筛选标记。
[0036]
实验中涉及的主要试剂、耗材和试剂盒，如表2所示。
[0037]
表2主要试剂、耗材和试剂盒
[0038]
试剂、耗材和试剂盒名称购买公司胎牛血清(fbs)bi
dmem/f-12培养基bitrypsin-edtabi二甲基亚矾(dmso)solarbiopbsorigene培养皿和移液管等细胞培养耗材biofil过氧化氢(h2o2)sigma-aldrichtris-basesolarbio无水乙醇西陇科学氯化钠(nacl)西陇科学氯化钾(kcl)天津市大茂化学试剂厂ezup柱动物基因组dna提取试剂盒上海生工生物科技有限公司pcr试剂盒takara依地酸二钠solarbio醋酸西陇科学dna markernovoproteinrnase-free water上海碧云天生物技术有限公司转染试剂lipofiter 3汉恒生物科技有限公司cck8 kit上海翌圣生物科技股份有限公司二氢乙锭(dhe)sigma-aldrich
[0039]
实验中用到的仪器设备，如表3所示。
[0040]
表3仪器设备
[0041]
仪器设备名称生产公司台式高速低温离心机thermo scientific湿度co2细胞培养箱thermo scientific forma3111涡旋振荡仪kylin-bell lab instruments移液枪eppendorf酶标仪thermo scientific相差显微镜荧光显微镜蔡司lsm800超净工作台zhchene智城荧光显微镜olympus lx71,tokyo,japan摇床kylin-bell lab instruments磁力搅拌器金坛市中大仪器厂pcr扩增仪美国bio-rad公司凝胶成像系统美国bio-rad公司核酸电泳仪tanon
[0042]
实验试剂配制，如表4、表5所示。
[0043]
表4 50*tae配制
[0044]
242gtris37.2g依地酸二钠
补足0.8lh2o57.1ml冰醋酸补足1lh2o
[0045]
表5 2400μm h2o2配制
[0046]
13.6μl3wt％h2o2补足5ml完全培养基
[0047]
实施例1：不同色温led(1900k、4000k、6600k、blue)照射arpe-19细胞系48h后细胞活力的检测。
[0048]
人视网膜色素上皮细胞系arpe-19在含有10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dulbecco改良的eagle培养基中(dmem/f12)培养。置于37℃，5％co2的培养箱中。每4至5天进行细胞传代。
[0049]
采用cck8试剂盒来检测arpe-19在接受不同色温led光照48小时后的细胞活性。在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，接种细胞数大约3
×
103个，将培养板放在37℃，5％co2的培养箱中培养24小时，待细胞贴壁后接受黑暗、1900k、4000k、6600k、blue led五种处理48小时，1900k、4000k、6600k、blue四种led的辐照度统一设为10w/m2，每组设置3-5个复孔。向每个对照与处理组中都加入100μl含10％cck8的培养基，之后将培养板放于培养箱中孵育2-3h。用酶标仪测定在波长450nm处的吸光度。
[0050]
活力计算公式：细胞活力*(％)＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]x100
[0051]
a(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
[0052]
a(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
[0053]
a(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
[0054]
结果显示，1900k led可明显增强细胞活力至170％左右，而4000k、6600k、blue三种led均降低细胞活力，并且随着光源色温的升高细胞活力呈递减趋势。直至6600k、blue led照时，细胞活力仅为对照组的10％。由此可证明，色温为1900k的低色温无荧光粉led可增强细胞活力、促进细胞增殖，不对细胞造成损伤。随色温的升高，光源的蓝光成分逐渐增加，并显现出逐渐增强的细胞毒性及抑制细胞增殖的作用，如图2。
[0055]
实施例2：不同辐照度(5w/m2、10w/m2、15w/m2)1900k led照射arpe-19细胞系48h后细胞活力的检测。
[0056]
我们设置了如下3个辐照度梯度(5w/m2、10w/m2、15w/m2)对arpe-19进行光照，48小时后进行cck8检测。结果显示，1900k led的辐照度为5w/m2、10w/m2和15w/m2时均能增强细胞活力，且该效果在辐照度为10w/m2时最佳，细胞活力达到对照组的170％，如图3。
[0057]
实施例3：10w/m
2 1900k led照射不同时间(1d、2d、3d)后arpe-19细胞活力的检测。
[0058]
为了确定对细胞起保护作用的最佳光照时间。我们设置了如下3个时间点：1d、2d、3d。分别在光照以上几个时间点后对arpe-19进行cck8检测。结果显示，随着光照时间的延长，细胞活力也随之逐渐升高，但第三天细胞活力升高并不明显，并不排除96孔板空间限制的原因，如图4。
[0059]
实施例4：不同浓度的h2o2作用于arpe-19细胞6h，进行细胞活力的检测，以探究h2o2损伤造模的最佳浓度。
[0060]
h2o2是常用的氧化剂，是探究rpe氧化应激常用的造模方法之一，h2o2可造成细胞线粒体呼吸链崩溃并进一步导致细胞死亡，我们设置了0、200、400、600、800、1000μm h2o2的浓度梯度处理arpe-19细胞6小时，探究h2o2的半数致死浓度。结果显示，随着h2o2的浓度的增加，arpe-19细胞活力逐渐降低，且在h2o2浓度为400μm时，细胞死亡50％左右，如图5。
[0061]
实施例5：探究1900k led预处理情况下对损伤情况下arpe-19细胞活力的改善。
[0062]
我们采用1900k led预先光照48小时后400μm h2o2损伤6小时的模式。处理结束后去除h2o2用新培养基继续孵育，选取处理结束后0h、3h、9h、24h四个时间点利用cck8检测试剂盒对细胞活力进行检测，以探究1900k led预处理情况下对细胞的保护作用。
[0063]
结果表明1900k led预处理情况下对细胞有保护作用，相比单独h2o2损伤组，1900k led预处理后损伤组的细胞活力要更高，且四个时间点均有统计学意义，虽然1900k led预光照后细胞活力并未达到对照组的细胞活力，但相比单独损伤组，有明显的改善，并且该保护效应不是一时的，在造模结束后24小时内，均能显示出改善作用，如图6。
[0064]
实施例6：1900k、4000k、blue led光照48h后和先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6h模式下进行细胞内ros水平的检测。
[0065]
年龄相关性黄斑变性的一重要发病因素为长期的氧化应激刺激，我们采用细胞h2o2造模也是为了模拟这一发病因素，氧化应激会导致细胞内ros水平升高，我们继续采用上述1900k、4000k、blue led光照48h后和先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6h两种模式检测细胞内ros水平。检测ros水平的染料为二氢乙锭(dhe)，dhe被氧化以后会产生氧化乙啶进入细胞核掺入染色体dna中，在535nm波长的激发光下产生红色荧光，胞浆中未被氧化的dhe在370nm波长的激发光下可发出蓝色荧光。具体步骤为：细胞处理结束后，用pbs和培养基各清洗细胞一次，加入含100μm ros的空白培养基(不含血清和双抗)2ml孵育20分钟，每隔3-4分钟晃动混匀一次，使其充分反应。孵育结束后，弃去培养基，pbs清洗一次，随后胰酶消化并收集细胞，pbs清洗重悬细胞2次，最后加入400μl pbs重悬细胞置于冰上避光保存待上机检测。
[0066]
结果表明1900kled能够减少细胞内ros的产生，大概是dark组的70-80％。4000k和blue led照射之后细胞内的ros水平皆上升。4000k组ros水平低于blue组，blue组的ros水平比dark组多出35％。此外，1900k led预处理能减少h2o2带来的氧化应激，h2o2单独处理组的ros水平比dark组多30％，1900k组的ros水平和之前差不多，但是1900k h2o2组的细胞内ros水平相比h2o2单独处理组明显要低，如图7。
[0067]
实施例7：观察先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤3h模式下arpe-19细胞内线粒体的形态。
[0068]
将arpe-19细胞接种于35mm共聚焦小皿上，培养24小时待细胞汇合度达到50％-70％时，进行质粒转染。在转染之前，给共聚焦小皿更换新鲜培养基。培养基的体积约为2ml。随后配制lipofiter 3脂质体转染试剂-培养基混合液和质粒-培养基混合液。质粒-培养基混合液：4μg质粒dna加到250ul dmem/f-12培养基中，用枪轻轻吹打混匀。lipofiter 3脂质体转染试剂-培养基混合液：250ul dmem/f-12培养基中加入10ul lipofiter 3，用枪轻轻吹打混匀，室温放置5分钟。随后将配制好的lipofiter 3脂质体转染试剂-培养基混合液和质粒-培养基混合液轻轻混合。之后置于室温孵育20分钟。孵育结束后，将500ul lipofiter 3-dna混合物加入共聚焦小皿中轻轻混匀。之后培养6-12小时，视情况去除含有
lipofiter 3-dna的无血清培养液并加入新鲜含血清的细胞培养液继续培养。之后再培养24-40小时即可在荧光显微镜下观察转染效果。观察到质粒转染效率较好，则可更换正常培养基置于1900k led下光照48h，并用400μm h2o2损伤3小时，造模结束后在蔡司共聚焦显微镜下观察线粒体的形态。
[0069]
实验结果显示400μm h2o2损伤3h后即可观察到线粒体分裂为短棒状或圆点状。dark组和1900k led组的线粒体为线状、网状，1900k h2o2组线粒体仍大部分为线状，如图8。结果表明1900k led光照预处理能够减少h2o2带来的线粒体碎片化。
[0070]
实施例8：先1900k led光照48h后400μm h2o2损伤6小时模式下检测arpe-19细胞线粒体dna损伤的情况。
[0071]
维持线粒体基因组完整性是正常线粒体功能的先决条件。由于氧化磷酸化途径产生的高浓度活性氧(ros)，线粒体基因组高度暴露于氧化应激，导致线粒体dna损伤。因此，线粒体dna损伤被证明与衰老以及包括神经退行性疾病和癌症在内的许多人类疾病有关。rpe常常需要吞噬感光细胞脱落的膜盘，加上其特殊的解剖位置，丰富血流带来的氧气和忙碌的细胞内活动使得rpe经常收到氧化自由基的攻击。先前的体外研究表明，过氧化氢(h2o2)引起的氧化应激通过对其线粒体dna造成优先损伤而导致rpe细胞死亡。而且在氧化应激后，线粒体dna损伤比人类细胞中的核dna损伤更广泛，持续时间更长。因此细胞线粒体dna损伤情况的检测很有必要。线粒体dna损伤情况检测的具体步骤如下：细胞处理结束后，吸弃培养基，预冷pbs冲洗一次，吸去pbs，每10cm2细胞加入200μl buffer pbs和20μl proteinase k，晃动培养瓶收集细胞转移至新的离心管中，再加入200μl buffer cl，震荡混匀，56℃水浴10min之后加入相同份的无水乙醇，充分颠倒混匀。用移液器将溶液加入吸附柱中，静置2分钟，再10000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中废液。向吸附柱中加入500μl cw1 solution，10000rpm离心30秒，倒掉收集管废液。再向吸附柱中加入500μl cw2 solution，10000rpm离心30秒，倒掉收集管废液。再于12000rpm室温离心2分钟，离去残留的cw2 solution。随后将吸附柱打开盖子室温放置数分钟彻底晾干吸附材料中残留的cw2solution。将吸附柱放入一个新的1.5ml ep管中，加入50-200μl ce buffer静置3分钟，12000rpm室温离心2分钟，收集dna溶液。使用long amplification taq聚合酶试剂盒(takara)从15ng总dna中扩增出长和短的线粒体片段。长线粒体片段(16568bp)引物为f：atgatgtctgtgtggaaagtggctgtgc，r：gggagaagccccggcaggtttgaagc。短线粒体片段(158bp)引物为f：gatttgggtaccacccaagtattg，r：aatattcatggtggctggcagta。长线粒体片段pcr扩增条件如下：95℃持续5分钟，17个循环(95℃持续30秒；65℃持续15分钟)，最终延伸步骤为72℃持续10分钟。短线粒体片段pcr扩增段条件如下：95℃持续5分钟，17个循环(95℃持续30秒；60℃持续30秒；72℃持续30秒)，最终延伸步骤为72℃持续10分钟。所有长链和短链pcr反应均在线性上升阶段停止。之后pcr产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分开(选用高分子量dna ladder250-10000bp)。最后在image lab 5.2.1的紫外线照射下进行凝胶可视化并拍摄图片，然后通过imagej量化条带。
[0072]
结果显示dark组和1900k组的线粒体长链和线粒体短链之比基本没有差异，h2o2组线粒体长链和线粒体短链之比要比dark组低，而1900k h2o2组线粒体长链和线粒体短链之比要比h2o2组高，如图9。表明1900k h2o2组dna损伤的情况较h2o2组轻。再次印证1900k led光照预处理能够减少h2o2带来的线粒体损伤。
[0073]
以上所描述的实施例仅表达了本发明的几种优选实施例，其描述较为具体和详细，但并不用于限制本发明。应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种变化和更改，凡在本发明的构思和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。