多孔生物打印墨水及其制备方法和体表组织及其制备方法

1.本发明涉及三维生物打印及组织器官修复重建技术领域，具体涉及一种多孔生物打印墨水及其制备方法和体表组织及其制备方法。


背景技术：

2.因先天性小耳畸形、外伤等原因造成的耳廓缺损或缺失临床常见。耳廓是人体面部的主要特征之一，其缺损或缺失会严重影响患者的美观和心理健康。目前，最有效的治疗方法是基于自体肋软骨雕刻和人工假体的耳廓重建术，但是前者会对供区造成严重的手术创伤且耳廓形态难以精确控制，而后者易引发异物排斥反应且无生物学功能。因此，目前迫切需要一种形态良好且具有正常生物学功能的耳廓替代物。
3.组织工程与再生医学技术的迅速发展为耳廓再造带来了新的策略。目前基于软骨组织工程技术已经利用聚羟基乙酸/聚乳酸(pga/pla)和软骨细胞成功实现了组织工程耳廓的首个国际临床突破。但是，耳廓重建术后患者出现不同程度的炎症和变形，严重阻碍了其临床应用。这主要是由于(1) 残留的pga/pla聚合物支架易引发无菌性炎症反应，影响了细胞外基质 (ecm)的分泌；(2)常规的细胞接种技术难以实现软骨细胞的均匀分布，影响了ecm的均匀性；(3)不均质的ecm影响了整体的生物稳定性，进而导致变形。
4.近年来，天然水凝胶类支架，如明胶、胶原、海藻酸钠、透明质酸等材料，结合三维生物打印技术可以实现细胞和材料的定向空间分布，在组织和器官的仿生构建中发挥了显著的应用优势。因此，水凝胶与生物打印技术的结合可能是解决上述问题的关键突破口。然而，目前用于构建耳廓等效物的常用水凝胶存在以下缺陷：(1)传统水凝胶的单一成分难以精确模拟软骨特有的微环境；(2)固化水凝胶的致密质地阻碍营养物质的交换并影响内部软骨组织的形成；(3)水凝胶的机械稳定性不足以维持精确的三维形态。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种多孔生物打印墨水及其制备方法和体表组织及其制备方法，旨在解决现有技术中的问题。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
7.一种仿生多孔生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
8.s1：对软骨组织进行预处理，获得软骨组织的质量百分数为5-10％的组织溶液；
9.s2：在上述组织溶液中加入适量的辅助剂并混匀，获得辅助剂质量百分数为5-10％的水凝胶溶液；
10.s3：在上述水凝胶溶液中加入适量的造孔剂并混匀，获得造孔剂质量百分数为0.1-5％的生物墨水。
11.本发明的有益效果是：本发明制备工艺简单，其所提供的生物墨水具有以下优势：生物相容性好、免疫原性低、体内炎症反应轻；能仿生模拟软骨特异性的微环境；具备快速的光固化性能和流变性能，利于生物打印成型；具备互通的微孔结构利于细胞行为；生物力
学强度好，利于三维形态的维持；降解速率适中，与软骨再生速率相匹配。
12.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
13.进一步，所述s1包括以下具体步骤：
14.s11：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
15.s12：称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数比为0.1～10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1～1 ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为 0.1～1％的混合溶液；
16.加入浓度为1～10mol/l的氢氧化钠使得上述混合溶液维持ph值在8～10 之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
17.反应结束后，用浓度为1～10mol/l的盐酸中和至ph为7，然后将中和后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得粉末；
18.将上述粉末与完全培养基混合获得质量百分数为5-10％的组织溶液，有利于保持细胞的活性。
19.采用上述进一步方案的有益效果是软骨组织致密，将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞和酶消化处理，可以彻底脱干净细胞，去除免疫原性；经甲基丙烯酸酐修饰后的软骨脱细胞基质具有快速的光固化性能，具备可打印性；软骨脱细胞基质作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，更重要的是，其含有的软骨基质成分可以提供软骨再生微环境，促进软骨细胞基质分泌和软骨形成。
20.进一步，所述s1中的软骨组织为耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨及半月板中的一种或多种。
21.采用上述进一步方案的有益效果是获取方便，有利于仿生再造体表组织的制备。
22.进一步，所述s2中的辅助剂为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种。
23.采用上述进一步方案的有益效果是单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
24.进一步，所述s2中的造孔剂为聚环氧乙烷、明胶、胶原、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、甲壳素、丝素蛋白及普郎尼克中的一种或多种。
25.采用上述进一步方案的有益效果是固化后的水凝胶致密质地，添加聚环氧乙烷等形成微孔结构可以实现无阻碍的营养物质交换，进而促进细胞的行为活动。
26.本发明还提供一种采用如上所述的制备方法制备的仿生多孔生物墨水。
27.采用上述进一步方案的有益效果是本发明所制备的生物墨水具有以下优势：生物相容性好、免疫原性低、体内炎症反应轻；能仿生模拟软骨特异性的微环境；具备快速的光固化性能和流变性能，利于生物打印成型；具备互通的微孔结构利于细胞行为；生物力学强度好，利于三维形态的维持；降解速率适中，与软骨再生速率相匹配。
28.本发明还提供一种体表组织的制备方法，包括以下具体步骤：
29.步骤一：将适量的种子细胞与如上所述的仿生多孔生物墨水混匀，获得所述种子
细胞浓度为(1～60)
×
106个/ml的生物墨水混合溶液；
30.步骤二：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
31.步骤三：3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水混合溶液和强度增强剂，以构建人体体表组织。
32.采用上述进一步方案的有益效果是水凝胶的力学性能较差，交替排列生物墨水混合溶液和强度增强剂可以提供更强的生物力学支撑，进而保证复杂精细三维结构的形态保真度；整合3d生物打印技术，可实现细胞和材料的精准空间分布，既解决了形态控制的问题，又保证了细胞和材料的定向分布，同时还可以添加各类生物活性因子，为进一步的梯度构造或定向差异排列的调控功能提供了可能。
33.进一步，所述步骤一中的种子细胞为耳廓软骨细胞、关节软骨细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞中一种或多种。
34.采用上述进一步方案的有益效果是获取方便，其可在生物墨水中生长，增殖和分泌细胞外基质，有利于后续再造体表组织的制备。
35.进一步，所述步骤三中的强度增强剂为聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸及聚羟基乙酸中的一种或多种。
36.采用上述进一步方案的有益效果是可以提供更强的生物力学支撑，进而保证复杂精细三维结构的形态保真度。
37.本发明还提供一种采用如上所述的制备方法制备的体表组织。
38.采用上述进一步方案的有益效果是复合软骨细胞并结合三维生物打印技术制备出精确形态和适宜生物性能的体表组织替代物，并应用该替代物在体内/体外构建出精确形态、优异力学、软骨特异ecm沉积的成熟体表组织，最终实现临床转化突破，满足耳再造的临床应用需求。
附图说明
39.图1为本发明中生物墨水制备的流程图；
40.图2为本发明中体表组织制备的流程图；
41.图3为本发明的操作流程图；
42.图4为本发明未添加造孔剂所制备的生物墨水在荧光显微镜下的图像；
43.图5为本发明添加造孔剂所制备的生物墨水在荧光显微镜下的图像；
44.图6为本发明未添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像；
45.图7为本发明添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像；
46.图8为传统技术未添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像；
47.图9为传统技术添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像。
48.图10为软骨脱细胞基质光敏水凝胶的光固化交联反应式；
49.图11为本发明3d生物打印构建体表组织的过程图；
50.图12为未加造孔剂和加入造孔剂时水凝胶中细胞迁移实验的荧光共聚焦结果的比照图；
51.图13为未加造孔剂和加入造孔剂时流式细胞周期检测结果的比照图；
52.图14为未加造孔剂和加入造孔剂时体内细胞外基质分泌和组织再生结果的比照图。
具体实施方式
53.以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
54.实施例1
55.如图1至图14所示，本实施例提供一种仿生多孔生物墨水的制备方法，包括以下具体步骤：
56.s1：对软骨组织进行预处理，获得软骨组织的质量百分数为5-10％的组织溶液；
57.s2：在上述组织溶液中加入适量的辅助剂并混匀，获得稳定剂质量百分数为5-10％的水凝胶溶液；
58.s3：在上述水凝胶溶液中加入适量的造孔剂并混匀，获得造孔剂质量百分数为0.1-5％的生物墨水。
59.本实施例制备工艺简单，其所提供的生物墨水具有以下优势：生物相容性好、免疫原性低、体内炎症反应轻；能仿生模拟软骨特异性的微环境；具备快速的光固化性能和流变性能，利于生物打印成型；具备互通的微孔结构利于细胞行为；生物力学强度好，利于三维形态的维持；降解速率适中，与软骨再生速率相匹配。
60.需要说明的是，上述软骨组织优先采用猪的软骨组织。
61.实施例2
62.在实施例1的基础上，本实施例中，所述s1包括以下具体步骤：
63.s11：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
64.s12：称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为0.1～10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1～1 ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为 0.1～1％的混合溶液；
65.加入浓度为1～10mol/l的氢氧化钠使得上述混合溶液维持ph值在8～10 之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
66.反应结束后，用浓度为1～10mol/l的盐酸中和至ph为7，然后将中和后的溶液装在透析袋(透析分子量为3500d)内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥(真空冷冻干燥，-40
°
抽真空)，获得粉末(海绵状或粉末状)；
67.将上述粉末与完全培养基混合获得质量百分数为5-10％的组织溶液，有利于保持细胞的活性。
68.软骨组织致密，将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞和酶消化处理，可以彻底脱干净细胞，去除免疫原性；经甲基丙烯酸酐修饰后的软骨脱细胞基质具有快速的光固化性能，具备可打印性；软骨脱细胞基质作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，更重要的是，其含有的软骨基质成分可以提供软骨再生微环境，促进软骨细胞基质分泌和软骨形成。
69.优选地，本实施例中，所述s11中的粉碎机包括低温冷冻研磨仪，采用低温冷冻研
磨仪粉碎制成软骨粉末。
70.另外，所述s11中的粉碎机还包括组织破碎机，通过组织破碎机将上述软骨粉末进一步粉碎形成粒径在100-500um的软骨粉末。
71.优选地，本实施例中，所述s11中的脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理中的一种或多种组合处理方法。以胰蛋白酶处理为例，0.5％胰蛋白酶/pbs溶液(w/v)37℃恒温震荡24h，
72.优选地，本实施例中，所述s11中的酶消化处理为胶原酶处理、胃蛋白酶处理和透明质酸酶处理中的一种或多种组合消化方法。
73.上述脱细胞处理的具体步骤为：软骨粉末依次经0.5％胰蛋白酶溶液 37℃处理24小时、核酸酶溶液37℃处理4小时、10mm tris-hcl于37℃处理24小时、1％triton x-100于37℃处理24小时、去离子水充分洗涤3 天。
74.上述酶消化处理制备水溶性的软骨脱细胞基质的具体步骤为：软骨脱细胞基质粉末经0.15％胶原酶或胃蛋白酶溶液于37℃处理24小时，3500d透析膜于去离子水中充分透析3天，真空冷冻干燥处理。
75.实施例3
76.在实施例1至实施例2任一项的基础上，本实施例中，所述s1中的软骨组织为耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨及半月板中的一种或多种。获取方便，有利于仿生再造体表组织的制备。
77.实施例4
78.在实施例1至实施例3任一项的基础上，本实施例中，所述s2中的辅助剂为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种。
79.单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
80.实施例5
81.在实施例1至实施例4任一项的基础上，本实施例中，所述s2中的造孔剂为聚环氧乙烷、明胶、胶原、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、甲壳素、丝素蛋白及普郎尼克中的一种或多种。
82.固化后的水凝胶致密质地，添加聚环氧乙烷等形成微孔结构可以实现无阻碍的营养物质交换，进而促进细胞的行为活动。
83.实施例6
84.本实施例提供一种仿生多孔生物墨水的制备方法，包括以下具体步骤：
85.s1：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
86.称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为0.1％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以 0.1ml/min的速度加入适量的甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.1％的混合溶液；
87.用浓度为1mol/l的氢氧化钠使得上述混合溶液维持ph值在8之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8小时；
88.反应结束后，用浓度为1mol/l的盐酸中和，然后将中和后的溶液装在透析袋(透析分子量为3500d)内在蒸馏水中充分透析后7天以上例如8天后冷冻干燥(真空冷冻干燥，-40
°
抽真空)，获得粉末(海绵状或粉末状)；
89.将上述粉末与完全培养基混合获得质量百分数为5％的组织溶液；
90.s2：在上述组织溶液中加入适量的辅助剂并混匀，获得辅助剂质量体积比为3％的水凝胶溶液；
91.s3：在上述水凝胶溶液中加入适量的造孔剂并混匀，获得造孔剂质量体积比为0.1％的生物墨水。
92.实施例7
93.本实施例提供一种仿生多孔生物墨水的制备方法，包括以下具体步骤：
94.s1：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
95.称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为6％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.6ml/min的速度加入适量的甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.6％的混合溶液；
96.用浓度为5mol/l的氢氧化钠使得上述混合溶液维持ph值在9之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应10小时；
97.反应结束后，用浓度为5mol/l的盐酸中和，然后将中和后的溶液装在透析袋(透析分子量为3500d)内在蒸馏水中充分透析后7天以上例如9天后冷冻干燥(真空冷冻干燥，-40
°
抽真空)，获得粉末(海绵状或粉末状)；
98.将上述粉末与完全培养基混合获得质量百分数为7％的组织溶液；
99.s2：在上述组织溶液中加入适量的辅助剂并混匀，获得辅助剂质量体积比为5％的水凝胶溶液；
100.s3：在上述水凝胶溶液中加入适量的造孔剂并混匀，获得造孔剂质量体积比为3％的生物墨水。
101.实施例8
102.本实施例提供一种仿生多孔生物墨水的制备方法，包括以下具体步骤：
103.s1：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
104.称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以1ml/min的速度加入适量的甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为1％的混合溶液；
105.用浓度为10mol/l的氢氧化钠使得上述混合溶液维持ph值在10之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应12小时；
106.反应结束后，用浓度为10mol/l的盐酸中和，然后将中和后的溶液装在透析袋(透析分子量为3500d)内在蒸馏水中充分透析后7天以上例如10 天后冷冻干燥(真空冷冻干燥，-40
°
抽真空)，获得粉末(海绵状或粉末状)；
107.将上述粉末与完全培养基混合获得质量百分数为10％的组织溶液；
108.s2：在上述组织溶液中加入适量的辅助剂并混匀，获得辅助剂质量体积比为8％的
水凝胶溶液；
109.s3：在上述水凝胶溶液中加入适量的造孔剂并混匀，获得造孔剂质量体积比为5％的生物墨水。
110.实施例9
111.在实施例1至实施例8任一项的基础上，本实施例还提供一种采用如上所述的制备方法制备的仿生多孔生物墨水。
112.本实施例所制备的生物墨水具有以下优势：生物相容性好、免疫原性低、体内炎症反应轻；能仿生模拟软骨特异性的微环境；具备快速的光固化性能和流变性能，利于生物打印成型；具备互通的微孔结构利于细胞行为；生物力学强度好，利于三维形态的维持；降解速率适中，与软骨再生速率相匹配。
113.实施例10
114.在实施例9的基础上，本实施例还提供一种体表组织的制备方法，包括以下具体步骤：
115.步骤一：将适量的种子细胞与如上所述的仿生多孔生物墨水混匀，获得所述种子细胞浓度为(1～60)
×
106个/ml的生物墨水混合溶液；
116.步骤二：应用ct(电子计算机断层扫描)、mri(磁共振成像)或激光扫描、经计算机辅助设计构建人体体表组织形态的三维数字模型；
117.步骤三：3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水混合溶液和强度增强剂，以构建人体体表组织。
118.上述3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水混合溶液和强度增强剂其中的“交替排列”指的是3d生物打印机先排列一行生物墨水混合溶液并间隔排列一行强度增强剂，然后再排列一行生物墨水混合溶液并间隔排列一行强度增强剂，如此循环，以打印出体表组织。
119.水凝胶的力学性能较差，交替排列生物墨水混合溶液和强度增强剂可以提供更强的生物力学支撑，进而保证复杂精细三维结构的形态保真度；整合 3d生物打印技术，可实现细胞和材料的精准空间分布，既解决了形态控制的问题，又保证了细胞和材料的定向分布，同时还可以添加各类生物活性因子，为进一步的梯度构造或定向差异排列的调控功能提供了可能。
120.上述体表组织可以为耳廓组织，也可以为其他组织，例如鼻组织、气管组织和关节组织。
121.实施例11
122.在实施例10的基础上，本实施例中，所述步骤一中的种子细胞为耳廓软骨细胞、关节软骨细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞中一种或多种。
123.获取方便，其可在生物墨水中生长，增殖和分泌细胞外基质，有利于后续再造组织的制备。
124.实施例12
125.在实施例10至实施例11任一项的基础上，本实施例中，所述步骤三中的强度增强剂为聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸及聚羟基乙酸中的一种或多种。上述强度增强剂可以提供更
强的生物力学支撑，进而保证复杂精细三维结构的形态保真度。
126.实施例13
127.本实施例还提供一种体表组织的制备方法，包括以下具体步骤：
128.步骤一：将适量的种子细胞与如上所述的仿生多孔生物墨水混匀，获得所述种子细胞浓度为1
×
106个/ml的生物墨水混合溶液；
129.步骤二：利用激光扫描并经计算机辅助设计构建人体耳廓体表组织形态的三维数字模型；
130.步骤三：3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水和聚己内酯，以构建人体耳廓组织。
131.实施例14
132.本实施例还提供一种体表组织的制备方法，包括以下具体步骤：
133.步骤一：将适量的种子细胞与如上所述的仿生多孔生物墨水混匀，获得所述种子细胞浓度为30
×
106个/ml的生物墨水混合溶液；
134.步骤二：利用激光扫描并经计算机辅助设计构建人体耳廓组织形态的三维数字模型；
135.步骤三：3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水和聚己内酯，以构建人体耳廓组织。
136.实施例15
137.本实施例还提供一种体表组织的制备方法，包括以下具体步骤：
138.步骤一：将适量的种子细胞与如上所述的仿生多孔生物墨水混匀，获得所述种子细胞浓度为60
×
106个/ml的生物墨水混合溶液；步骤二：利用激光扫描并经计算机辅助设计构建人体耳廓组织形态的三维数字模型；
139.步骤三：3d生物打印机基于上述三维数字模型交替排列上述生物墨水和聚己内酯，以构建人体耳廓组织。
140.实施例16
141.在实施例10至实施例15任一项的基础上，本实施例还提供一种采用如上所述的制备方法制备的体表组织。
142.复合软骨细胞并结合三维生物打印技术制备出精确形态和适宜生物性能的体表组织替代物，并应用该替代物在体内/体外构建出精确形态、优异力学、软骨特异ecm沉积的成熟组织，最终实现临床转化突破，满足耳再造的临床应用需求。
143.图3为本发明的操作流程图，其中a代表多孔水凝胶的示意图；b代表非多孔水凝胶的示意图；c代表3d生物打印和光固化交联的的示意图：打印完成后生物墨水还是水溶性的，而光交联固化后不再水溶，可保持稳定形态；d代表多孔水凝胶固化后，其中的制孔剂水溶后形成了多孔结构，有利于细胞的增殖和迁移；e代表非多孔水凝胶固化后，致密的凝胶会阻碍细胞的增殖和迁移。
144.传统技术是采用阴阳模具压制形成组织。
145.图4所示为本发明未添加造孔剂所制备的生物墨水在荧光显微镜下的图像，即将所制备的生物墨水标记罗丹明(荧光染料)在荧光显微镜下获得图 4所示的图像；
146.图5为本发明添加造孔剂所制备的生物墨水在荧光显微镜下的图像，即将所制备
的生物墨水标记罗丹明(荧光染料)在荧光显微镜下获得图5所示的图像。
147.相比较而言，图5中添加了造孔剂的生物墨水中孔的数量明显多于图4 中未添加造孔剂的生物墨水中孔的数量。
148.图6为本发明未添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像，即将所制备的生物墨水组织块切片染色在光镜下获得如图6所示的图像；
149.图7为本发明添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像，即将所制备的生物墨水组织块切片染色在光镜下获得如图7所示的图像。
150.相比较而言，图7中添加了造孔剂的生物墨水中孔的数量明显多于图6 中未添加造孔剂的生物墨水中孔的数量。
151.图8为传统技术未添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像，图9 为传统技术添加造孔剂所制备的生物墨水在光镜下的图像。相比较而言，图 9中添加了造孔剂的生物墨水中孔的数量明显多于图8中未添加造孔剂的生物墨水中孔的数量。
152.图10为本发明软骨脱细胞基质光敏水凝胶的光固化交联反应式，图11 为本发明3d生物打印构建体表组织的过程图；本发明成功制备了基于软骨脱细胞基质的光敏水凝胶，证实光敏水凝胶具有快速的光固化特性和可打印性能，添加辅助剂后可经3d生物打印设备构建精确的三维结构，并可保持稳定。
153.图12为未加造孔剂和加入造孔剂时水凝胶中细胞迁移实验的荧光共聚焦结果的比照图，左上图为常规的没有加入造孔剂水凝胶的试验示意图，左下图为本发明中加入造孔剂水凝胶的试验示意图，其中，该两个图中的
①
表示培养基，
②
表示加入了种子细胞的水凝胶，
③
表示没有加入种子细胞的水凝胶。
154.另外，图12中的右上图表示常规没有加入造孔剂的水凝胶1至7天荧光共聚焦的结果，右下图表示的是本发明中加入造孔剂的水凝胶荧1至7天光共聚焦的结果。由上述结果可知，造孔剂的加入制备的多孔水凝胶有利于细胞的迁移。
155.图13为未加造孔剂和加入造孔剂时流式细胞周期检测结果的比照图，上图为没有加入造孔剂的种子细胞和水凝胶混合物细胞周期的分布图及其对应的饼图，下图为本发明加入造孔剂的种子细胞和水凝胶混合物细胞周期的分布图及其对应的饼图。由上述内容可知，加入造孔剂细胞和水凝胶混合物处于增殖期的细胞的比例比较高，表明造孔剂的加入制备的多孔水凝胶有利于细胞的增殖。
156.图14为未加造孔剂和加入造孔剂时体内细胞培养结果的比照图，第一行从左至右的第一张图为没有加入造孔剂水凝胶与种子细胞混合后生物打印的小方格，第一行从左至右第二张至第五张图分别为加入造孔剂水凝胶与种子细胞混合物组织学染色后于显微镜下检测的结果，依次为苏木素-伊红染色、番红o染色、阿尔新蓝染色和二型胶原免疫组化染色。
157.另外，第二行从左至右的第一张图为本发明加入造孔剂水凝胶与种子细胞混合后生物打印的小方格，第二行从左至右第二张至第五张图分别为加入造孔剂水凝胶与种子细胞混合物组织学染色后于显微镜下检测的结果，依次为苏木素-伊红染色、番红o染色、阿尔新蓝染色和二型胶原免疫组化染色。
158.由上述内容可知，造孔剂的加入制备的多孔水凝胶有利于细胞外基质的分泌和软骨组织的形成。
159.综上所述，本发明采用的工艺所制备的生物墨水的孔隙结构明显优于传统技术所制备的生物墨水。
160.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。