抗血凝素抗体及其使用方法与流程

抗血凝素抗体及其使用方法
1.政府许可权
2.本发明是根据美国卫生与公众服务部颁发的hhso100201700020c批准在政府支持下完成的。政府享有本发明的一定权利。
3.序列表
4.序列表的正式副本以ascii格式的序列表与说明书同时通过efs-web以电子方式提交，文件名为“10625wo01_seq_list_st25.txt”，创建日期为2020年10月28日，大小为约36kb。这个ascii格式化文件中所含的序列表是说明书的一部分并且以全文引用的方式并入本文中。


背景技术：

5.流感是一种高度传染性疾病，其历史悠久，特征在于一波又一波的大流行、流行病、复发和爆发。尽管每年进行疫苗接种工作，但流感感染仍会导致大量发病和死亡。
6.流感病毒包括四种类型：甲型、乙型、丙型和丁型。乙型流感会导致大量季节性流感感染，并且可以与严重流感相关，需要住院治疗。
7.血凝素是一种三聚体糖蛋白，包含两个结构域、一个由受体结合位点(通常发生抗原漂移)和茎区(在各种流感病毒株中更为保守)组成的球状头部结构域。ha蛋白以前体(ha0)形式合成，所述前体经过蛋白水解加工以产生两个亚基(ha1和ha2)，其彼此缔合以形成茎/球状头部结构。ha1肽负责病毒吸附到细胞表面，并且(与神经氨酸酶一起)是病毒吸附和进入宿主细胞所必需的。ha2肽形成茎状结构，其介导病毒和细胞膜在内体中的融合，从而使核糖核蛋白复合物释放到细胞质中。
8.新型流感病毒株可以是由于称为抗原漂移的现象，或者血凝素或神经氨酸酶分子发生突变而产生新型和不同表位的结果。因此，每年都必须针对预测出现的病毒生产新的疫苗，这个过程不仅成本高，而且效率极低。虽然技术进步已经提高了产生用于疫苗组合物的改进的流感抗原的能力，但是仍然需要提供另外的针对流感的保护来源。


技术实现要素：

9.本公开提供了结合乙型流感ha的抗体及其抗原结合片段。所述抗体尤其可用于抑制或中和乙型流感ha的活性。
10.在第一方面，本公开提供了特异性结合乙型流感血凝素(ha)的分离的重组单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合至乙型流感ha的分离的重组抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下特征中的一者或多者：
12.(a)是完全人类单克隆抗体；
13.(b)以小于约10-10
m的ec
50
结合至乙型流感ha；
14.(c)展示出感染流感的动物的存活率增加；以及/或者
15.(d)包含(i)三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)，所述重链互补决
定区包含在包含seq id no:2所示氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内；以及(ii)三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，所述轻链cdr包含在包含seq id no:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内。
16.在某些实施方案中，在皮下或静脉内施用和/或在乙型流感病毒感染前或感染后施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段赋予动物(例如，哺乳动物)对乙型流感病毒的保护增加。
17.在某些实施方案中，在皮下或静脉内施用和/或在乙型流感病毒感染前或感染后施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段可以减轻感染乙型流感病毒的动物(例如，哺乳动物)的乙型流感感染的严重性。
18.在某些实施方案中，例如，与抗病毒剂(诸如巴洛沙韦马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)的口服施用相比，从感染前1天或2天或3天或4天或5天或6天或7天开始，当以单次静脉内剂量施用于暴露于乙型流感病毒的动物(例如，哺乳动物)时，本公开的抗体或其抗原结合片段提供了对乙型流感病毒的保护增加，所述单次静脉内剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg所述哺乳动物体重。
19.在一些实施方案中，当以单次皮下或静脉内剂量施用时，与已经施用于可比较的动物(例如，哺乳动物)的同种型(阴性)对照抗体相比，本文提供的抗体或其抗原结合片段为动物(例如，哺乳动物)提供了对乙型流感病毒的保护增加，所述单次皮下或静脉内剂量的范围为0.5mg/kg至约15mg/kg所述动物的体重，例如约1mg/kg、约5mg/kg、约7mg/kg、或约10mg/kg、或约12mg/kg所述动物的体重。
20.在一些实施方案中，与抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)的口服施用相比，当以单次静脉内剂量施用于动物(例如，哺乳动物)时，本文提供的抗体或其抗原结合片段提供了对乙型流感的保护增加，所述单次静脉内剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg所述动物的体重。例如，所述抗病毒剂可以是奥塞米韦，每天施用两次，持续5天，剂量为约2mg/kg。
21.在一些实施方案中，当在乙型流感暴露和感染前24小时作为单剂量施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段在暴露于和感染乙型流感病毒的动物(例如，哺乳动物)群体中赋予约100％的存活率，所述单剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg体重。
22.在一些实施方案中，当在乙型流感暴露和/或感染前1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天以单次静脉内剂量施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)中赋予100％的存活率，所述单次静脉内剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、或约10mg/kg或约15mg/kg。
23.在某些实施方案中，例如，与抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)的口服施用相比，从感染后第1天、第2天或第3天开始，当以单次静脉内剂量施用于感染流感病毒的哺乳动物时，抗体或其抗原结合片段展示出保护增加，所述单次静脉内剂量为约5mg/kg至约15mg/kg。例如，所述抗病毒剂可以是奥塞米韦，从感染后第1天或第2天或第3天开始，每天施用两次，持续5天，剂量为约2mg/kg。
24.在一个相关实施方案中，在皮下或静脉内施用和/或在乙型流感病毒感染前或感染后施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段赋予感染流感病毒的动物(例如，哺乳动
物)的保护增加。
25.在一些实施方案中，当以单次皮下或静脉内剂量施用于感染的哺乳动物时，与施用同种型(阴性)对照抗体的动物相比，本文提供的抗体或其抗原结合片段展示出保护增加，所述单次皮下或静脉内剂量的范围为0.5mg/kg至约15mg/kg，例如约1mg/kg、约5mg/kg、约7mg/kg、或约10mg/kg或约12mg/kg。
26.在一些实施方案中，与抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)的口服施用相比，当以单次静脉内剂量施用于感染流感病毒的哺乳动物时，本文提供的抗体或其抗原结合片段展示出保护增加，所述单次静脉内剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg。例如，所述抗病毒剂可以是奥塞米韦，每天施用两次，持续5天，剂量为约2mg/kg。
27.在一些实施方案中，当在感染后24小时或更长时间作为单剂量施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)群体中展示出约100％的存活率，所述单剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg所述动物的体重。
28.在一些实施方案中，当在感染后24、48、72或96小时以单次静脉内剂量施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)群体中展示出100％的存活率，所述单次静脉内剂量为约5mg/kg、或约10mg/kg或约15mg/kg所述动物的体重。
29.在一些实施方案中，与在施用抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)的可比较的动物群体中观察到的80％存活率相比，当以单次静脉内剂量施用时，本文提供的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)群体中展示出约100％的存活率，所述单次静脉内剂量为约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg所述动物的体重。例如，所述抗病毒剂可以是奥塞米韦，每天口服施用两次，持续5天，剂量为约2mg/kg。如本文所述，存活率可以在本公开的抗体或其抗原结合片段施用后的固定点测量(例如，施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更长)。
30.在一些实施方案中，在施用抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)时，本公开的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)中提供加合保护作用。例如，所述抗病毒剂可以是在感染后超过48小时施用的奥塞米韦。
31.在一些实施方案中，在施用抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)时，本公开的抗体或其抗原结合片段在感染流感病毒的动物(例如，哺乳动物)中提供加合保护作用。例如，所述抗病毒剂可以是在感染后72小时施用的奥塞米韦。
32.在一些实施方案中，当抗体以单次静脉内剂量施用于流感病毒感染的动物(例如，哺乳动物)时，本公开的抗体或其抗原结合片段在与抗病毒剂组合使用时提供加合保护作用，所述单次静脉内剂量的范围为约7mg/kg至约15mg/kg所述动物的体重，并且所述抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)以约2mg/kg所述动物的体重的剂量口服施用，每天两次，持续5天。
33.在一些实施方案中，当在流感病毒感染后96小时与抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)组合使用时，本公开的抗体或其抗原结合片段提供加合保护作用，其中所述抗体以单次静脉内剂量施用于动物，所述单次静脉内剂量的范围为约7mg/kg至约15mg/kg所述动物的体重，并且所述抗病毒剂(例如奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)以约2mg/kg所述动物的体重的剂量口服施用，每天两次，持续5天。
34.在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可以静脉内、鼻内、皮下、皮内或肌内施用，并且所述抗病毒剂可以口服或静脉内施用。
35.在一些实施方案中，所述抗病毒剂在本文提供的抗体施用之前、同时或之后施用。
36.在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段和/或所述抗病毒剂(诸如巴洛沙韦、马波西尔、奥塞米韦、扎那米韦或吡莫地韦)可以以单剂量或以多剂量施用。
37.本文表1和2中提供了示例性抗乙型流感ha抗体。表1列出了示例性抗乙型流感ha抗体的重链可变区(hcvr)、轻链可变区(lcvr)、重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)、轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)、重链(hc)和轻链(lc)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗乙型流感ha抗体的hcvr、lcvr、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3、hc和lc的核酸序列标识符。
38.本文提供了包含hcvr的抗体或其抗原结合片段，所述hcvr包含根据表1的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
39.在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合乙型流感ha，包含seq id no:2的hcvr氨基酸序列。
40.本文提供了包含lcvr的抗体或其抗原结合片段，所述lcvr包含根据表1的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
41.在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合乙型流感ha，包含seq id no:10的lcvr氨基酸序列。
42.在一些实施方案中，所述特异性结合乙型流感ha的分离的抗体或抗原结合片段包含seq id no:2/10的hcvr/lcvr氨基酸序列对。
43.在一些实施方案中，所述分离的抗体或抗原结合片段包含：
44.(a)hcdr1结构域，其具有seq id no:4的氨基酸序列；
45.(b)hcdr2结构域，其具有seq id no:6的氨基酸序列；
46.(c)hcdr3结构域，其具有seq id no:8的氨基酸序列；
47.(d)lcdr1结构域，其具有seq id no:12的氨基酸序列；
48.(e)lcdr2结构域，其具有seq id no:14的氨基酸序列；以及
49.(f)lcdr3结构域，其具有seq id no:16的氨基酸序列。
50.在一些实施方案中，所述特异性结合乙型流感ha的分离的抗体或抗原结合片段包含(a)seq id no:4的hcdr1，(b)seq id no:6的hcdr2；(c)seq id no:8的hcdr3；(d)seq id no:12的lcdr1；(e)seq id no:14的lcdr2和(f)seq id no:16的lcdr3。
51.在一些实施方案中，所述特异性结合乙型流感ha的分离的抗体或抗原结合片段包含(a)seq id no:8的hcdr3和(b)seq id no:16的lcdr3。
52.本公开还提供了包含重链cdr1(hcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr1(hcdr1)包含seq id no:4的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
53.本公开还提供了包含重链cdr2(hcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr2(hcdr2)包含seq id no:6的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
54.本公开还提供了包含重链cdr3(hcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr3(hcdr3)包含seq id no:8的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
55.本公开还提供了包含轻链cdr1(lcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr1(lcdr1)包含seq id no:12的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
56.本公开还提供了包含轻链cdr2(lcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr2(lcdr2)包含seq id no:14的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
57.本公开还提供了包含轻链cdr3(lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr3(lcdr3)包含seq id no:16的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
58.本公开还提供了包含hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述hcdr3和lcdr3氨基酸序列对包含seq id no:8/16，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
59.本公开还提供了包含一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述cdr被包含在表1所示的示例性抗乙型流感ha抗体的hcvr/
lcvr氨基酸序列内。在某些实施方案中，所述hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组包含seq id no:4-6-8-12-14-16。
60.用于鉴别在hcvr和lcvr氨基酸序列内的cdr的方法和技术是本领域众所周知的，且可以用于鉴别在本文公开的指定hcvr和/或lcvr氨基酸序列内的cdr。可以用于鉴别cdr的边界的示例性惯例包括，例如，kabat定义、chothia定义和abm定义。一般来说，kabat定义基于序列差异，chothia定义基于结构环区域的位置，并且abm定义是kabat和chothia方法之间的折衷方案。参见例如，kabat,"sequences of proteins of immunological interest,"national institutes of health,bethesda,md.(1991)；al-lazikani等人,j.mol.biol.273:927-948(1997)；和martin等人,proc.natl.acad.sci.usa86:9268-9272(1989)。公共数据库也可以用于鉴别抗体内的cdr序列。
61.本文还提供了与包含hcvr的所述cdr和lcvr的所述cdr的抗体或其抗原结合片段竞争乙型流感ha的特异性结合的抗体及其抗原结合片段，其中所述hcvr和lcvr各自具有根据表1中列出的所述hcvr和lcvr序列的氨基酸序列。
62.本公开还提供了与包含hcvr的所述cdr和lcvr的所述cdr的参考抗体或其抗原结合片段交叉竞争乙型流感ha的结合，或者结合乙型流感ha上的相同的表位的抗体及其抗原结合片段，其中所述hcvr和lcvr各自具有根据表1中列出的所述hcvr和lcvr序列的氨基酸序列。
63.本公开还提供了阻断乙型流感ha吸附和/或进入宿主细胞的分离的抗体及其抗原结合片段。
64.在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是双特异性的，所述双特异性包括对所述乙型流感ha中的第一表位的第一结合特异性和对另一个抗原的第二结合特异性。
65.在第二方面，本文提供了编码抗乙型流感ha抗体或其部分的核酸分子(例如，dna或rna分子)。例如，编码所述hcvr氨基酸序列的所述核酸分子列于表2中；在某些实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:1的hcvr多核苷酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。编码所述lcvr氨基酸序列的所述核酸分子也列于表2中；在某些实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:9的lcvr多核苷酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
66.本文还提供了编码表1中列出的所述hcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述hcdr1核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
67.本文还提供了编码表1中列出的所述hcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述hcdr2核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、
至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
68.本文还提供了编码表1中列出的所述hcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述hcdr3核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
69.本文还提供了编码表1中列出的所述lcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述lcdr1核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
70.本文还提供了编码表1中列出的所述lcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述lcdr2核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
71.本文还提供了编码表1中列出的所述lcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的所述lcdr3核酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
72.本文还提供了编码hcvr的核酸分子，其中所述hcvr包含一组三个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3)，其中所述hcdr1-hcdr2-hcdr3氨基酸序列组如表1中列出的所述示例性抗流感ha抗体所定义。
73.本文还提供了编码lcvr的核酸分子，其中所述lcvr包含一组三个cdr(即，lcdr1-lcdr2-lcdr3)，其中所述lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组如表1中列出的所述示例性抗流感ha抗体所定义。
74.本文还提供了编码hcvr和lcvr二者的核酸分子，其中所述hcvr包含seq id no:2的氨基酸序列，并且其中所述lcvr包含seq id no:10的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含表2中列出的hcvr或lcvr多核苷酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。在某些实施方案中，所述核酸分子编码hcvr和lcvr，其中所述hcvr和lcvr二者均衍生自表1中列出的相同的抗乙型流感ha抗体。
75.还提供了编码表1中列出的所述重链氨基酸序列中的任一者和/或所述轻链氨基酸序列中的任一者的核酸分子。
76.在一个相关方面，本文提供了能够表达包含抗流感ha抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，所述载体可以包括重组表达载体，所述重组表达载体包含上述
核酸分子中的任一个，即编码表1中所示的hcvr、lcvr和/或cdr序列中的任一个的核酸分子。在本公开的范围内还包括的是引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许抗体或抗体片段产生的条件下培养宿主细胞，并且回收如此产生的抗体和抗体片段，来产生抗体或其部分的方法。
77.在第三方面，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种特异性结合乙型流感ha的重组单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。在一个相关方面，所述组合物可以是抗乙型流感ha抗体和第二治疗剂的组合。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与抗乙型流感ha抗体组合的任何药剂。可以有利地与抗乙型流感ha抗体组合的示例性药剂包括但不限于结合和/或抑制流感ha活性的其他药剂(包括其他抗体或其抗原结合片段，诸如结合和/或抑制甲型流感ha的抗体等)和/或不直接结合流感ha但仍然抑制病毒活性(包括对宿主细胞的感染性)的药剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)第一抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段；(b)第二抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体结合至乙型流感ha上的第一表位并且所述第二抗体结合至乙型流感ha上的第二表位，其中所述第一和第二表位是不同的且非重叠的；以及(c)药学上可接受的载剂或稀释剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)第一抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段；(b)第二抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体不与所述第二抗体交叉竞争乙型流感ha的结合；以及(c)药学上可接受的载剂或稀释剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)第一抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段；(b)第二抗流感抗体或其抗原结合片段，其与不同的流感抗原相互作用，其中所述第一抗体结合至乙型流感ha上的表位，并且所述第二抗体结合至不同的流感抗原上的表位；以及(c)药学上可接受的载剂或稀释剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)第一抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其与不同的病毒(非流感)抗原相互作用，其中所述第一抗体结合至乙型流感ha上的表位，并且所述第二抗体结合至不同的病毒(非流感)抗原上的表位；以及(c)药学上可接受的载剂或稀释剂。涉及本文提供的抗乙型流感ha抗体的另外的组合疗法和共制剂在本文别处有所公开。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段，以及(b)抗甲型流感ha抗体或其抗原结合片段。
78.在第四方面，本文提供了使用抗乙型流感ha抗体或本文提供的抗体的抗原结合部分来治疗与乙型流感ha相关的疾病或障碍(诸如受试者的病毒感染)或与所述病毒感染相关的至少一种症状的治疗方法，其中所述治疗方法包括将治疗有效量的包含抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物施用于有需要的受试者。所治疗的病症是通过抑制流感ha活性而得到改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况。在某些实施方案中，本公开提供了预防、治疗或改善乙型流感感染的至少一种症状的方法，所述方法包括将治疗有效量的抗流感ha抗体或其抗原结合片段施用于有需要的受试者。
79.在一些实施方案中，本公开提供了通过施用本文提供的抗乙型流感ha抗体来改善、减轻或降低受试者的流感感染的至少一种症状的严重性、持续时间或发生频率的方法，其中所述至少一种症状选自由以下各项组成的组：头痛、发热、疼痛、流涕(鼻塞)、寒战、疲劳、虚弱、喉咙痛、咳嗽、气短、呕吐、腹泻、肺炎、支气管炎和死亡。
80.在某些实施方案中，本文提供了降低受试者的病毒载量的方法，所述方法包括将
有效量的抗体或其片段施用于所述受试者，所述抗体或其片段结合乙型流感ha并且阻断流感病毒结合和/或进入所述宿主细胞。
81.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以预防性或治疗性地施用于具有流感感染、或处于具有流感感染的风险下、或倾向于出现流感感染的受试者。有风险的受试者包括但不限于免疫功能不全的人，例如因自身免疫性疾病而免疫功能不全的人，或那些接受免疫抑制疗法的人(例如器官移植后)，或那些患有人类免疫缺陷综合征(hiv)或获得性免疫缺陷综合征(aids)的人，某些形式的消耗或破坏白血球的贫血，那些接受放射或化疗的人或那些患有发炎性病症的人。有获得流感感染风险的其他受试者包括老年人(65岁或以上)、2岁以下的儿童、医护人员以及患有潜在医学病症(诸如肺部感染、心脏病或糖尿病)的人。此外，任何与感染个体有身体接触或身体紧密接近的人都会增加感染流感病毒的风险。此外，受试者因接近疾病爆发，例如受试者居住在人口稠密的城市，或非常接近于已确诊或怀疑感染流感病毒的受试者，或职业选择，例如医院员工、药物研究人员、前往感染区域旅行或频繁搭乘飞机，均有感染流感的风险。
82.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合施用给有需要的个体。第二治疗剂可以选自由以下各项组成的组：抗炎药(诸如皮质类固醇和非甾体抗炎药)、抗感染药、不同的流感ha抗体(例如，甲型流感ha抗体)、针对不同流感抗原(例如，神经氨酸酶)的抗体、抗病毒药、减充血剂、抗组胺剂、流感疫苗、膳食补充剂(诸如抗氧化剂以及本领域已知的可用于改善流感感染的至少一种症状或用于降低患者的病毒载量的任何其他药物或疗法)。在某些实施方案中，如果可能发生与本文提供的抗体或其抗原结合片段相关的任何可能副作用，则所述第二治疗剂可以是有助于抵消或减轻此类副作用的药剂。抗体或其片段可以皮下、静脉内、皮内、腹膜内、经口、鼻内、肌肉内或颅内施用。在一些实施方案中，所述抗体可以以单次静脉内输注施用以使所述受试者的所述血清中的所述抗体浓度达到最大。抗体或其片段可以约0.01mg/kg受试者体重至约100mg/kg受试者体重的剂量施用。在某些实施方案中，本文公开的抗体可以以包含50mg至5000mg的一个或多个剂量施用。
83.在第五方面，本文提供了一种特异性结合至乙型流感血凝素(ha)的分离的重组抗体或其抗原结合片段。其中所述抗体具有以下特征中的一者或多者：(a)以小于约10-9
m的ec
50
结合至乙型流感ha；(b)展示出与未进行施用的可比较的感染乙型流感的动物相比，在施用于感染乙型流感的动物后，所述感染乙型流感的动物的存活率增加，以及/或者(c)包含(i)三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)，所述重链互补决定区被包含在重链可变区(hcvr)内，所述重链可变区包含与seq id no:2所示的所述hcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)三个轻链cdr(lcdr1、hcdr2和hcdr3)，所述轻链cdr被包含在轻链可变区(lcvr)内，所述轻链可变区包含与seq id no:10所示的所述lcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
84.在一些实施方案中，当以约5mg/kg所述哺乳动物的体重或约0.5mg/kg的单次静脉内剂量预防性施用于哺乳动物时，所述分离的抗体或其抗原结合片段保护所述哺乳动物免受随后暴露于乙型流感病毒引起的感染。在一些实施方案中，当在暴露于乙型流感病毒前预防性施用于哺乳动物时，所述分离的抗体或其抗原结合片段降低所述哺乳动物的流感感染的风险。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段施用于哺乳动物时，所述分离的抗体或其抗原结合片段改善、减轻或降低所述哺乳动物的流感感染的至少一种
症状的严重性、持续时间或发生频率。在一些实施方案中，所述至少一种症状选自由以下各项组成的组：头痛、发热、疼痛、流涕(鼻塞)、寒战、疲劳、虚弱、喉咙痛、咳嗽、气短、呕吐、腹泻、肺炎、支气管炎和死亡。
85.在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为至少约80％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为至少约90％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约100％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约80％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约90％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约100％。在一些实施方案中，所述存活率在施用后13天是明显的。
86.在一些实施方案中，本公开提供了一种如上文所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含具有seq id no:2的氨基酸序列的hcvr。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr。
87.在第六方面，本文提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr1结构域；(b)具有seq id no:6的氨基酸序列的hcdr2结构域；(c)具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr3结构域；(d)具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr1结构域；(e)具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr2结构域；以及(f)具有seq id no:16的氨基酸序列的lcdr3结构域。
88.在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至乙型流感血凝素(ha)。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5mg/kg所述哺乳动物的体重或约0.5mg/kg的单次静脉内剂量预防性施用于哺乳动物时，保护所述哺乳动物免受随后暴露于乙型流感病毒引起的感染。在一些实施方案中，当在暴露于乙型流感病毒前将所述分离的抗体或其抗原结合片段预防性施用于哺乳动物时，降低所述哺乳动物的流感感染的风险。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段施用于哺乳动物时，所述分离的抗体或其抗原结合片段改善、减轻或降低所述哺乳动物的流感感染的至少一种症状的严重性、持续时间或发生频率。在一些实施方案中，所述至少一种症状选自由以下各项组成的组：头痛、发热、疼痛、流涕(鼻塞)、寒战、疲劳、虚弱、喉咙痛、咳嗽、气短、呕吐、腹泻、肺炎、支气管炎和死亡。
89.在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为至少约80％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为至少约90％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约0.5mg/kg的
单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约100％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约80％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约90％。在一些实施方案中，当将所述分离的抗体或其抗原结合片段以约5.0mg/kg的单次预防剂量施用于多个哺乳动物中的每个时，所述多个哺乳动物在施用后19天的存活率为约100％。在一些实施方案中，所述存活率在施用后13天是明显的。
90.在一些实施方案中，上文所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:2的氨基酸序列的hcvr。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含seq id no:2/10的hcvr/lcvr氨基酸序列对。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是igg1抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是igg4抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
91.在第七方面，本文提供了一种药物组合物，其包含上文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
92.在一些实施方案中，所述药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂选自由以下各项组成的组：抗病毒药、抗炎药、特异性结合至流感ha的不同的抗体、流感疫苗、膳食补充剂和另一种治疗流感感染的姑息疗法。在一些实施方案中，所述抗炎药选自由以下各项组成的组：皮质类固醇和非甾体抗炎药。在一些实施方案中，所述膳食补充剂是抗氧化剂。在一些实施方案中，所述抗病毒药是奥塞米韦。在一些实施方案中，所述抗病毒药是抗甲型流感药。在一些实施方案中，所述抗甲型流感药是抗体。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至甲型流感ha。
93.在一些实施方案中，本公开提供了一种包含编码如上文所述的抗体的hcvr或lcvr的多核苷酸序列的多核苷酸分子。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含所述多核苷酸的载体。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含所述载体的细胞。
94.在第八方面，本文提供了预防、治疗或改善感染流感的受试者的流感感染的至少一种症状的方法，所述方法包括将如上文所述的抗体或抗原结合片段或者如上文所述的药物组合物施用于所述受试者。
95.在一些实施方案中，所述至少一种症状选自由以下各项组成的组：发热、咳嗽、身体疼痛、流涕、气短、肺炎和支气管炎。在一些实施方案中，将所述药物组合物预防性施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述受试者选自由以下各项组成的组：免疫功能低下的个体、65岁或以上的成年人、医护人员以及具有医学问题史或潜在医学病症的人。在一些实施方案中，所述潜在医学病症选自由以下各项组成的组：心脏病和糖尿病。在一些实施方案中，所述药物组合物与第二治疗剂组合施用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂选自由以下各项组成的组：抗病毒药、抗炎药、特异性结合至流感ha的不同的抗体、流感疫苗、膳食补充剂和另一种治疗流感感染的姑息疗法。在一些实施方案中，所述抗炎药选自由以下各项组成的组：皮质类固醇和非甾体抗炎药。在一些实施方案中，所述膳食补充剂是抗氧化剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂通过与所述抗体或其抗原结合片段不同的施用途径施
用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂口服施用。在一些实施方案中，所述抗病毒药是奥塞米韦。在一些实施方案中，所述奥塞米韦在所述抗体或其抗原结合片段的施用前施用。在一些实施方案中，所述奥塞米韦与所述抗体或其抗原结合片段同时施用。在一些实施方案中，所述奥塞米韦在所述抗体或其抗原结合片段的施用后施用。在一些实施方案中，所述抗病毒药是抗甲型流感药。在一些实施方案中，所述抗甲型流感药是抗体。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至甲型流感ha。在一些实施方案中，所述药物组合物皮下、静脉内、皮内、肌肉内、鼻内或口服施用。
96.本公开还包括抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段用于治疗将受益于阻断流感ha结合和/或活性的疾病或障碍的用途。本公开还包括抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗将受益于阻断流感ha结合和/或活性的疾病或障碍的药物中的用途。
97.通过阅读随后的详细描述，其他实施方案将变得显而易见。
具体实施方式
98.在描述本发明的方法前，应当理解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
99.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本公开的实践或检验，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用整体并入本文。
100.本公开提供了结合乙型流感ha的抗体及其抗原结合片段。所述抗体尤其可用于抑制或中和乙型流感ha的活性。
101.相对于未经修饰的抗体，本文提供的抗体可以是全长的(例如，igg1或igg4抗体)，或可以仅包含抗原结合部分(例如，fab、f(ab’)2或scfv片段)，并且可以被修饰以影响功能，例如增加在宿主中的持久性、或增加效应子功能、或消除残留的效应子功能(reddy等人,2000,j.immunol.164:1925-1933)。在某些实施方案中，所述抗体可以是双特异性的。
102.在一些实施方案中，所述抗体可用于阻断流感病毒与宿主细胞的附着和/或用于防止流感病毒进入宿主细胞。在一些实施方案中，所述抗体通过抑制病毒的细胞间传播而起作用。在某些实施方案中，所述抗体可用于预防、治疗或改善受试者中流感病毒感染的至少一种症状。在某些实施方案中，所述抗体可预防性或治疗性地施用于具有流感病毒感染或有感染流感病毒的风险的受试者。在某些实施方案中，可以将含有至少一种本文提供的抗体的组合物施用于疫苗禁忌或疫苗不太有效的受试者，例如老年患者、非常年轻的患者、可能对疫苗的任何一种或多种组分过敏的患者，或者可能对疫苗中的免疫原无反应的免疫功能低下的患者。在某些实施方案中，包含至少一种本文提供的抗体的组合物可以在流感爆发期间施用于医务人员、住院患者或疗养院居民或其他高风险患者。在某些实施方案中，包含至少一种本文提供的抗体的组合物可以在预测的年度疫苗无效的情况下或在已经经历主要抗原转变的毒株发生大流行的情况下作为一线治疗施用于患者。
103.定义
104.术语“流感血凝素”，也称为“流感ha”，是一种存在于流感病毒颗粒表面的三聚体
糖蛋白，可介导病毒吸附(通过ha1与α-2,3-唾液酸或α-2,6-唾液酸的结合)和进入(通过构象变化)宿主细胞。ha由两个结构域构成：含有受体结合位点的球状头部域(抗原突变频率高)和茎区(在流感病毒的各种病毒株中较为保守)。流感ha以前体(ha0)形式合成，该前体经过蛋白水解加工以产生两个亚基(ha1和ha2)，它们彼此缔合以形成茎/球状头部结构。病毒ha是病毒上变化最大的抗原(18个亚型可分为两组)，但茎(ha2)在各组内高度保守。全长乙型流感ha的氨基酸序列的示例是来自b/victoria/2/87的ha，seq id no:21(genbank登录号aaa43697.1)；来自b/nanchang/3451/93的ha，seq id no:22(部分序列；genbank登录号aad02807.1)；来自b/singapore/11/1994的ha，seq id no:23(genbank登录号abn50712.1)和来自b/florida/4/2006的ha，seq id no:24(genbank登录号aca33493.1)。术语“流感-ha”还包括从其他乙型流感分离株以及甲型流感分离株分离的流感ha蛋白变体。术语“流感ha”还包括重组流感ha或其片段。所述术语还涵盖与例如组氨酸标签、小鼠或人类fc或信号序列偶联的流感ha或其片段。
105.如本文所用，术语“流感感染”，也被表征为“流感”，指由流感病毒引起的严重的急性呼吸道疾病。所述术语包括呼吸道感染以及包括高烧、头痛、全身疼痛、疲劳和虚弱、在某些情况下极度疲惫、鼻塞、打喷嚏、喉咙痛、胸部不适、咳嗽、呼吸急促、支气管炎、肺炎和严重情况下死亡的症状。
106.术语“表面等离激元共振”是指一种光学现象，其允许通过例如使用biacore
tm
系统(pharmacia biosensor ab,uppsala,sweden和piscataway,n.j.)检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化分析实时生物分子相互作用。
107.生物层干涉量度法是一种用于测量生物分子相互作用的无标记技术。它是分析从两个表面反射的白光的干扰图案的光学分析技术：在生物传感器尖端上的固定蛋白层和内部参考层。与生物传感器尖端结合的分子数量的任何变化都会引起可实时测量的干扰图案的偏移(abdiche,y.n.等人,analytical biochemistry,(2008),377(2),209-217)。在某些实施方案中，“基于实时生物层干涉仪的生物传感器(octet htx测定)”用于评估某些抗流感ha抗体的结合特征。
108.术语“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定子，称为互补位。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。术语“表位”还指b细胞和/或t细胞起反应的抗原上的位点。其还指抗体所结合的抗原区域。表位可以定义为结构性或功能性的。功能性表位一般是结构性表位的子集并且具有直接促成相互作用的亲和力的那些残基。表位还可以是构形性的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施方案中，表位可以包括作为分子的化学活性表面基团的决定子，所述基团如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定三维结构特征和/或荷质比特征。
109.如本文所用，术语“交叉竞争”是指抗体或其抗原结合片段结合抗原，并抑制或阻断另一抗体或其抗原结合片段的结合。所述术语还包括两个抗体之间在两个方向上的竞争，即第一抗体结合并阻断第二抗体的结合，反之亦然。在某些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以结合同一表位。可替代地，第一抗体和第二抗体可以结合不同但重叠的表位，使得其中一个的结合抑制或阻断第二抗体的结合，例如，通过位阻。抗体之间的交叉竞争可以通过本领域已知的方法来测量，例如通过实时无标记生物层干涉量度分析法。为了确定测
试抗体是否与参考抗乙型流感抗体交叉竞争，使参考抗体在饱和条件下与流感病毒ha或肽结合。接着，评估测试抗体与流感病毒ha结合的能力。如果在与参考抗流感病毒ha抗体饱和结合后，测试抗体能够与流感病毒ha结合，则可以断定测试抗体与参考抗流感病毒ha抗体结合不同的表位。在另一个方面，如果测试抗体在与参考抗流感病毒ha抗体饱和结合后不能与流感病毒ha结合，则测试抗体可以结合至与参考抗流感病毒ha抗体结合的表位相同的表位。
110.短语“治疗有效量”意指产生施用其所希望达成的作用的量。确切量将取决于治疗目的，并且可由本领域的技术人员使用已知技术确定(参见例如lloyd(1999)the art,science and technology of pharmaceutical compounding)。
111.如本文所用，术语“受试者”是指需要改善、预防和/或治疗疾病或障碍诸如病毒感染的动物，例如哺乳动物，诸如人。受试者可能具有流感感染或倾向于出现流感病毒感染。“倾向于出现流感病毒感染”的受试者或“可能处于感染流感病毒的高风险”的受试者是那些由于自身免疫性疾病而免疫系统受损的受试者、那些接受免疫抑制疗法的人(例如，器官移植后)、那些患有人类免疫缺陷综合症(hiv)或获得性免疫缺陷综合症(aids)的人、某些形式的消耗或破坏白血球的贫血、那些接受放射或化疗的人或那些患有发炎性病症的人。此外，年幼或年老的受试者的风险也会增加。任何与感染个体有身体接触或身体紧密接近的人都会增加感染流感病毒的风险。此外，受试者因接近疾病爆发，例如受试者居住在人口稠密的城市，或非常接近于已确诊或怀疑感染流感病毒的受试者，或职业选择，例如医院员工、药物研究人员、前往感染区域旅行或频繁搭乘飞机，均有感染流感的风险。
112.如本文所用，术语“治疗(treat、treating或treatment)”是指由于治疗剂(诸如本文公开的抗体)向有需要的受试者的施用而产生的流感感染的至少一种症状或适应症的严重性的减少或改善。所述术语包括抑制疾病的进展或感染的恶化。还术语还包括疾病的积极预后，即在施用诸如本文公开的抗体的治疗剂后，受试者可以无感染或可以具有降低的病毒滴定度或病毒滴定度为零。治疗剂可以治疗剂量向个体施用。
113.术语“预防(prevent、preventing或prevention)”是指在施用本文公开的抗体后抑制流感感染的表现或流感感染的任何症状或适应症。所述术语包括预防暴露于病毒或有流感感染风险的受试者的感染扩散。
114.如本文所用，“保护作用”可以通过本领域已知的任何标准程序来展示，以确定本文公开的药剂(诸如抗病毒剂)或抗体(诸如抗流感ha抗体)是否可以提供以下中的一者或多者：例如，在暴露于感染因子之后，受试者群体的存活率增加(相对于未治疗且也暴露于感染因子的可比较的受试者群体)、病毒载量降低(相对于治疗前的受试者)、或至少一种与感染因子相关的症状改善(相对于治疗前的受试者)。
115.如本文所用，术语“抗病毒药物”是指用于治疗、预防或改善受试者的病毒感染的任何抗感染药物或疗法。术语“抗病毒药”包括但不限于(奥塞米韦)、(扎那米韦)、巴洛沙韦、马波西尔、利巴韦林或干扰素-α2b。“抗病毒药”还包括抗病毒抗体。例如，抗病毒药可以是用于治疗、预防或改善流感感染(例如甲型流感、乙型流感或它们二者)的抗体。这种抗体可以靶向来自甲型流感、乙型流感或它们二者的血凝素。在本公开中，待治疗的感染是由流感病毒引起的。
116.一般说明
id no:24)。
124.在某些实施方案中，抗体从用初级免疫原(诸如全长乙型流感ha)或用重组形式的乙型流感ha或其片段免疫，然后用次级免疫原或乙型流感ha的免疫原活性片段免疫的小鼠获得。在某些实施方案中，抗体是从用流感疫苗组合物免疫，随后用一种或多种重组生产的ha肽进行加强免疫的小鼠获得的。例如，抗体可以通过首先用b/victoria/2/87免疫小鼠，然后用b/yamagata/16/88再用b/victoria/2/87免疫小鼠来获得；或者首先用b/yamagata/16/88免疫小鼠，然后用b/victoria/2/87再用b/yamagata/16/88免疫小鼠来获得。在一些方面，b/yamagata毒株可以被b/maryland/03/2008或b/florida/4/2006或b/nanchang/3451/93或b/singapore/11/1994替换。小鼠可以用编码来自b/victoria/2/87、b/yamagata/16/88、b/maryland/03/2008、b/nanchang/3451/93、b/singapore/11/1994和/或b/florida/4/2006的ha的dna混合物，例如，编码来自b/victoria/2/87和b/yamagata/16/88的ha的dna的1:1混合物来加强免疫。
125.免疫原可以是乙型流感ha的生物活性和/或免疫原性片段或者编码它们的活性片段的dna。所述片段可以源自ha蛋白的茎区。
126.肽可以经过修饰以包括添加或取代某些残基，从而用于进行标记或达到与载体分子如klh缀合的目的。例如，可以在肽的n-末端或c-末端添加半胱氨酸，或可以添加接头序列，以制备与例如klh缀合的肽以进行免疫。
127.如通过体外或体内测定法所确定，本文公开的某些抗乙型流感ha抗体能够结合和中和乙型流感ha的活性。可以使用本领域的技术人员已知的任何标准方法(包括结合测定法或活性测定法)来测量抗体结合至和中和乙型流感ha的活性以及因此病毒吸附和/或进入宿主细胞并随后发生病毒感染的能力，如本文所述。
128.用于测量结合活性的非限制性示例性体外测定法是本领域的技术人员已知的。例如，抗乙型流感ha抗体对乙型流感ha的结合亲和力和解离常数可以使用biacore仪器通过表面等离子共振来确定。中和测定法可用于确定各种乙型流感病毒株的感染性。乙型流感病毒ha的抗体可介导补体依赖性细胞毒性(cdc)或可在体外介导病毒感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。示例性抗体能够在体内中和乙型流感病毒感染。
129.对乙型流感ha具有特异性的抗体可以不含另外的标记或部分，或者它们可以含有n-末端或c-末端标记或部分。在一些实施方案中，所述标记或部分是生物素。在结合分析中，标记(如果有的话)的位置可以确定肽相对于肽所结合的表面的取向。举例来说，如果表面涂覆有抗生物素蛋白，则含有n-末端生物素的肽将被定向，使得肽的c-末端部分将在表面远侧。在一些实施方案中，标记可以是放射性核素、荧光染料或mri可检测的标记。在某些实施方案中，此类标记的抗体可以用于包括成像分析在内的诊断分析中。
130.抗体和抗体的抗原结合片段
131.抗体
132.如本文所用，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其由四条多肽链，即两条重(h)链与两条轻(l)链通过二硫键互连(即，“完整抗体分子”)；以及其多聚体(例如igm)或其抗原结合片段构成。每条重链由重链可变区(“hcvr”或“v
h”)和重链恒定区(由域ch1、ch2和ch3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(“lcvr”或“v
l”)和轻链恒定区(c
l
)构成。vh和v
l
区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(fr)。
每个vh和v
l
由从氨基末端到羧基末端按照以下次序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。可以基于两个或更多个cdr的并排分析来定义氨基酸共有序列。
133.如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人单克隆抗体可以包括例如在cdr中以及特别是在cdr3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不意在包括已将源自另一哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的cdr序列移植到人fr序列上的单克隆抗体。所述术语包括在非人类哺乳动物中或在非人类哺乳动物的细胞中以重组方式产生的抗体。所述术语并不意图包括从人类个体中分离或在人类个体中产生的抗体。
134.如本文所用，术语“重组”是指通过本领域称为重组dna技术的技术或方法产生、表达、分离或获得的抗体或其抗原结合片段，所述技术或方法包括例如dna剪接和转基因表达。所述术语是指在非人类哺乳动物(包括转基因非人类哺乳动物，例如转基因小鼠)，或细胞(例如cho细胞)表达系统中表达的抗体，或从重组组合人抗体库中分离的抗体。
135.术语“特异性结合”或“特异性结合至”等意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对较稳定的复合物。特异性结合的特征可在于至少约1
×
10-8
m或更低的平衡解离常数(例如，更小的kd指示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子共振等。如本文所述，已经通过htx生物传感器上的实时无标记生物层干涉量度分析法鉴定了与流感ha特异性结合的抗体。此外，结合至流感-ha中的一个结构域和一个或多个附加抗原的多特异性抗体或结合至流感-ha的两个不同的区域的双特异性抗体仍然被认为是如本文所用的“特异性结合”的抗体。
136.术语“高亲和力”抗体是指对流感-ha具有至少10-8
m；至少约10-9
m；至少约10-10
m；或至少约10-11
m的结合亲和力(以kd表示)的单克隆抗体，如通过实时、无标记生物层干涉测定法(例如htx生物传感器)，或通过表面等离子共振(例如biacore
tm
)，或通过溶液亲和elisa所测量。
137.术语“慢解离速率”、“koff”或“kd”是指抗体以1
×
10-3
s-1
或更小、或者1
×
10-4
s-1
或更小的速率常数从流感-ha解离，如通过实时、无标记生物层干涉测定法(例如htx生物传感器)或通过表面等离子共振(例如biacore
tm
)所确定。
138.如本文所用，术语“k
d”意图指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
139.如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留结合流感ha的能力的抗体的一个或多个片段。
140.在具体实施方案中，本文提供的抗体或抗体片段可以缀合至部分诸如配体或治疗部分(“免疫缀合物”)诸如抗病毒药、第二抗流感抗体或任何其他用于治疗由流感病毒引起的感染的治疗部分。
141.如本文所用，“分离抗体”意图指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(ab)的抗体(例如，特异性结合流感-ha的分离抗体或其片段基本上不含特异性结合除流感-ha
以外的抗原的ab)。
142.如本文所用，“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和流感ha活性的抗体”或“拮抗剂抗体”)意图指与流感ha结合导致抑制流感ha的至少一种生物活性的抗体。例如，本文提供的抗体可以防止或阻断流感吸附或进入宿主细胞。另外，“中和抗体”是能够中和，即防止、抑制、降低、阻碍或干扰病原体在宿主中启动和/或持续感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和的抗体”在本文中可互换使用。这些抗体可以单独或组合使用，作为预防剂或治疗剂在适当的配制后与其他抗病毒剂一起使用，或与活性接种疫苗结合使用，或作为诊断工具使用。
143.抗原结合片段
144.除非另外具体指示，否则如本文所用，术语“抗体”应理解为涵盖包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即，“完整抗体分子”)以及其抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留特异性结合至乙型流感ha的能力的抗体的一个或多个片段。抗体片段可以包括fab片段、f(ab')2片段、fv片段、dab片段、含有cdr的片段或分离的cdr。在某些实施方案中，术语“抗原结合片段”是指多特异性抗原结合分子的多肽片段。可以使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变域和(任选地)恒定域的dna的重组基因工程技术，例如，从完整抗体分子衍生抗体的抗原结合片段。这样的dna是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、dna文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以被合成。可以对所述dna进行测序并且通过化学方式或通过使用分子生物学技术来操纵所述dna，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域布置成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
145.抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补性决定区(cdr)诸如cdr3肽)或受限制的fr3-cdr3-fr4肽。如本文所用，其他经工程化的分子(诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双体、三体、四体、微体、纳米体(例如，单价纳米体、二价纳米体等)、小模块免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar结构域)也被涵盖在表述“抗原结合片段”内。
146.抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且一般包含邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列同框的至少一个cdr。在具有vh结构域与v
l
结构域缔合的抗原结合片段中，vh和v
l
结构域可相对于彼此以任何合适的布置定位。举例来说，可变区可以是二聚体，并且含有v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体vh或v
l
结构域。
147.在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以存在于本文公开的抗体的抗原结合片段内的可变结构域和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)v
h-ch1；(ii)v
h-ch2；(iii)v
h-ch3；(iv)v
h-ch1-ch2；(v)v
h-ch1-ch2-ch3；(vi)v
h-ch2-ch3；(vii)v
h-c
l
；(viii)v
l-ch1；(ix)v
l-ch2；(x)v
l-ch3；
(xi)v
l-ch1-ch2；(xii)v
l-ch1-ch2-ch3；(xiii)v
l-ch2-ch3；和(xiv)v
l-c
l
。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或者可以通过全长或部分铰链或接头区相连。铰链区可以由在单一多肽分子中相邻可变结构域与/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联的至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成。此外，本文公开的抗体的抗原结合片段可以包含具有上文所列的可变结构域和恒定结构域构型中的任一个的彼此和/或与一个或多个单体vh或v
l
结构域(例如，通过二硫键)呈非共价缔合的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
148.如同完整抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变域，其中每个可变域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，可以使任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)适用于本文公开的抗体的抗原结合片段的语境中。
149.对抗体及其抗原结合片段的修饰
150.在某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的框架区可以与人类生殖系序列一致，例如与本文所提供的抗体的序列一致，或可以被天然或人工地修饰。给定框架区(或一个或多个框架区)中的一个或多个氨基酸可以被置换，并且置换可以是保守或非保守置换。取代一个或多个cdr残基或省略一个或多个cdr也是可能的。抗体已在科学文献中描述，其中一个或两个cdr可以被分配用于结合。padlan等人(1995faseb j.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区，并且得出结论，仅约五分之一到三分之一的cdr残基实际接触抗原。padlan还发现许多抗体，所述抗体中一个或两个cdr没有与抗原接触的氨基酸(另参见vajdos等人2002j mol biol 320:415-428)。因此，本文提供的抗体可以在cdr区和/或框架区进行有效修饰，只要修饰的抗体保持一种或多种所需特征即可，例如抗体或其抗原结合片段以小于约10-10
m的ec
50
结合至乙型流感ha；和/或展示出与未进行所述施用的可比较的流感感染动物相比，在向所述感染流感的动物施用后感染流感的动物的存活率增加。
151.可以相对于来自本文所提供的抗体的cdr序列进行对给定cdr的修饰，并且所述修饰可以包括保守或非保守取代。可以通过分子建模和/或凭经验确定合乎需要的取代。举例来说，一个或多个cdr残基可以被占据另一人类抗体序列中的对应位置的氨基酸或此类序列的共有序列取代。
152.此外，它们的抗原结合片段可以是本文公开的抗体，但经过修饰以省略一个或多个cdr和/或一个或多个框架区，只要修饰的抗体(又名抗原结合片段)保持与乙型流感病毒ha的结合即可。
153.基于先前的研究，通过分子建模和/或凭经验可以从位于chothia cdr外部的kabat cdr区域鉴别出不接触抗原的cdr残基(例如hcdr2中的残基h60-h65通常是不需要的)。可以修饰本文提供的抗体或其抗原结合片段以除去或替换给定的cdr，特别是不接触抗原的cdr。轻链cdr可以用例如通用轻链cdr替代。
154.本文提供的完全人抗流感ha单克隆抗体可以包含与对应种系序列相比或与本文提供的序列相比，重链和轻链可变结构域的框架和/或cdr区中的一个或多个氨基酸置换、
插入和/或缺失。此类修饰或突变可通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，或通过将氨基酸序列与本文提供的抗体(例如，表1中提供的抗体序列中的任一者)的那些序列比较来容易地确定。
155.本公开包括来源于本文公开的氨基酸序列中的任一者的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或cdr内的一个或多个氨基酸被修饰，只要修饰的抗体保持一种或多种所需特征即可，例如抗体或其抗原结合片段以小于约10-10
m的ec
50
结合至乙型流感ha；和/或展示出与未进行所述施用的可比较的流感感染动物相比，在向所述感染流感的动物施用后感染流感的动物的存活率增加。在获得含有一个或多个框架区和/或cdr的修饰的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)的改善或增强、免疫原性降低等。
156.本公开还包括来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变成得到所述抗体的种系序列的对应残基，或另一人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生多种抗体和抗原结合片段，其包含一个或多个个别修饰或种系突变或其组合。在某些实施方案中，vh和
/或vl
结构域内的所有框架和/或cdr残基突变回衍生出抗体的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如，仅存在于fr1的前8个氨基酸内或fr4的后8个氨基酸内的突变残基，或仅存在于cdr1、cdr2或cdr3内的突变残基。在其他实施方案中，框架和/或一个或多个cdr残基中的一个或多个突变为不同的种系序列(即，不同于最初衍生出抗体的种系序列的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，本文所公开的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基得以保持或突变为不同种系序列的对应残基。在得到含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)、降低的免疫原性等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。
157.本公开提供与本文提供的cdr或框架区中的序列具有“基本上同一性”或“基本上相似性”的抗体。序列的差异，例如表1或表2中提供的序列与基于其的修饰序列之间的差异，用“基本上同一性”或“基本上相似性”表示。
158.当提及核酸或其片段时，术语“基本上同一性”或“基本上相同的”表示当与另一个核酸(或另一个核酸的互补链)最佳比对时，存在核苷酸序列的百分比同一性，例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的核苷酸碱基，如通过任何熟知的序列同一性算法诸如fasta、blast或gap所测量，如下文所讨论。在某些情况下，与参考核酸分子具有大体一致性的核酸分子可以编码与参考核酸分子所编码的多肽具有相同或大体上类似的氨基酸序列的多肽。
159.如应用于多肽，术语“大体上类似性”或“大体上类似”意指当最佳地比对时，如通过使用默认间隙重量的程序gap或bestfit，共用至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列一致性的两个肽序列。在一些方面，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被含有具有类似的化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般而言，保守氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以上调相似性百分比或程度以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。参见例如，pearson(1994)methods mol.biol.24:307-331，其以引用的方式并入本文中。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下文献中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：gonnet等人(1992)science 256:1443 45，所述文献以引用的方式并入本文中。“适度保守”替换是在pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
160.多肽的序列同一性和/或相似性通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用关于指定到包括保守氨基酸置换的各种取代、缺失和其他修饰的相似性度量来匹配相似序列。例如，gcg软件含有程序诸如gap和bestfit，其可以与默认参数一起用来确定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gcg 6.1版。多肽序列也可以使用默认或推荐参数，使用fasta进行比较；所述fasta是gcg 6.1版中的程序。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(pearson(2000)同上)。序列也可以使用smith-waterman同源搜索算法进行比较，该算法使用仿射空位搜索，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为2，blosum矩阵为62。当将本文公开的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410和(1997)nucleic acids res.25:3389-3402，其各自以引用的方式并入本文中。
161.本文提供了完全人抗流感-ha单克隆抗体，其包含本文公开的具有一个或多个置换(例如，保守置换)的hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列中的任一者的变体。例如，本公开包括具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗乙型流感-ha抗体，其相对于本文公开的hcvr、lcvr和/或cdr(例如，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2或lcdr3)氨基酸序列中的任一者，具有例如20个或更少、19个或更少、18个或更少、17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸置换。例如，抗乙型流感-ha抗体相对于本文公开的hcvr、lcvr和/或cdr(例如，hcdr1、hcdr2、hcdr3、
lcdr1、lcdr2或lcdr3)氨基酸序列中的任一者，可以包含20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。
162.示例性地，本文提供了特异性结合乙型流感ha的抗体或其抗原结合片段，其包含与seq id no:2不同的hcvr氨基酸序列，所述不同之处为至少1至至多50个保守氨基酸置换，例如至少10至至多40个保守氨基酸置换，或至少20至至多50个保守氨基酸置换，或至少20至至多40个保守氨基酸置换。另外，本文提供了特异性结合乙型流感ha的抗体或其抗原结合片段，其包含与seq id no:10不同的lcvr氨基酸序列，所述不同之处为至少1至至多50个保守氨基酸置换，例如至少10至至多40个保守氨基酸置换，或至少20至至多50个保守氨基酸置换，或至少20至至多40个保守氨基酸置换。此类置换可以在框架区或cdr中并保持抗体或其抗原结合片段与乙型流感ha结合的特异性。
163.本文还提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:4不同的氨基酸序列的hcdr1，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:6不同的氨基酸序列的hcdr2，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:8不同的氨基酸序列的hcdr3，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:12不同的氨基酸序列的lcdr1，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:14不同的氨基酸序列的lcdr2，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seq id no:16不同的氨基酸序列的lcdr3，所述不同之处为1、或2、或3个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。
164.本公开还提供了抗体或其抗原结合片段，其包含与seq id no:8/16不同的hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)，所述不同之处为至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6个氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)。
165.本公开还提供了包含一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述cdr被包含在表1所示的示例性抗乙型流感ha抗体的hcvr/lcvr氨基酸序列内。在某些实施方案中，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组与seq id no:4-6-8-12-14-16的不同之处为至多20个保守氨基酸置换，例如，至多1、或至多2、或至多3、或至多3、或至多4、或至多5、或至多6、或至多7、或至多8、或至多9、或至多10、或至多11、或至多12、或至多13、或至多14、或至多15、或至多16、或至多17、或至多18、或至多19个氨基酸的保守氨基酸置换。
166.本文提供了包含hcvr的抗体或其抗原结合片段，所述hcvr包含根据表1的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
167.本文提供了包含lcvr的抗体或其抗原结合片段，所述lcvr包含根据表1的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、
至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
168.本文提供了包含seq id no:2/10的hcvr/lcvr氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
169.本公开还提供了包含重链cdr1(hcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr1(hcdr1)包含seq id no:4的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
170.本公开还提供了包含重链cdr2(hcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr2(hcdr2)包含seq id no:6的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
171.本公开还提供了包含重链cdr3(hcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr3(hcdr3)包含seq id no:8的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
172.本公开还提供了包含轻链cdr1(lcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr1(lcdr1)包含seq id no:12的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
173.本公开还提供了包含轻链cdr2(lcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr2(lcdr2)包含seq id no:14的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
174.本公开还提供了包含轻链cdr3(lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr3(lcdr3)包含seq id no:16的氨基酸序列，或者它们的具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
175.本公开还提供了包含hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述hcdr3和lcdr3氨基酸序列对包含seq id no:8/16，或者它们的具有至少
80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％序列同一性的基本上相似的序列。
176.人抗体的制备
177.用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法是本领域中已知的。任何此类已知方法均可用于本文公开的上下文中以制备特异性结合至乙型流感ha的人抗体。包含以下任一者的免疫原可用于产生针对乙型流感ha的抗体。在某些实施方案中，抗体从用全长天然乙型流感ha(参见例如，genbank登录号aaa43697.1或aca33493.1)，或用活减毒或灭活病毒，或用编码蛋白质或其片段的dna免疫的小鼠获得。或者，乙型流感ha蛋白或其片段可以使用标准生物化学技术来产生，并进行修饰以及用作免疫原。在一些实施方案中，免疫原可以是重组产生的乙型流感ha蛋白或其片段。在某些实施方案中，免疫原可以是流感病毒疫苗。在某些实施方案中，可以施用一次或多次加强注射。在某些实施方案中，加强注射可以包含一种或多种流感病毒毒株，或来源于这些毒株的血凝素，例如首先用b/victoria/2/87，然后用b/yamagata/16/88，然后又用b/victoria/2/87；或b/yamagata/16/88，然后用b/victoria/2/87，然后用b/yamagata/16/88加强注射。在一些方面，b/yamagata毒株被b/maryland/03/2008或b/nanchang/3451/93或b/florida/4/2006替换。所有小鼠都可以用编码来自b/victoria/2/87、b/yamagata/16/88、b/maryland/03/2008和/或b/florida/4/2006的ha的dna混合物加强免疫。在某些实施方案中，加强注射可以含有流感毒株的混合物，或来源于这些毒株的血凝素的混合物，或编码ha的dna。在某些实施方案中，免疫原可以是在大肠杆菌(e.coli)或任何其他真核或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞)中表达的重组流感ha肽，或者流感病毒本身。
178.使用技术(参见例如us 6,596,541，雷杰纳荣制药公司(regeneron pharmaceuticals)，)或用于产生单克隆抗体的任何其他已知方法，可以首先分离出具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力的乙型流感ha嵌合抗体。技术涉及生成转基因小鼠，所述转基因小鼠具有包含与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人类重链和轻链可变区的基因组，使得所述小鼠响应于抗原刺激产生包含人类可变区和小鼠恒定区的抗体。分离出编码抗体的重链和轻链可变区的dna并且将其与编码人类重链和轻链恒定区的dna可操作地连接。随后，在能够表达完全人类抗体的细胞中表达所述dna。
179.一般来说，用所关注的抗原攻击小鼠，并从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如b细胞)。淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以制备无限增殖杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴别出产生对所关注的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可以将编码重链和轻链可变区的dna分离并与所期望的重链和轻链的同种型恒定区连接。此类抗体蛋白可以在细胞(如cho细胞)中产生。可替代地，可以直接从抗原特异性淋巴细胞中分离出编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链可变域的dna。
180.首先，分离出具有人类可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下文实验章节中，针对期望的特征，包括亲和力、选择性、表位等，表征并且选择抗体。小鼠恒定区被所期望的人恒定区替换以产生完全人抗体，例如野生型或经修饰的igg1或igg4。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和目标特异性特征存在于可变
区中。
181.生物等效物
182.本文公开的抗乙型流感ha抗体和抗体片段涵盖氨基酸序列与所描述的抗体的氨基酸序列不同，但保留结合流感ha的能力的蛋白质。当与亲本序列对比时，这样的变体抗体和抗体片段包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或置换，但显示出与所述抗体的生物学活性基本上等效的生物学活性。同样，本文公开的编码抗体的dna序列涵盖这样的序列，所述序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或置换，但是编码与本文公开的抗体或抗体片段基本上生物等效的抗体或抗体片段。
183.如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是当在类似实验条件下以单次剂量或多次剂量施用相同摩尔剂量时，吸收速率和程度不展示显著差异的药物等效物或药物替代物，则将其视为生物等效的。如果某些抗体在吸收程度上是等效的，但是在吸收速率上不是等效的，则将其视为等效物或药物替代物，但因为吸收速率的此类差异是有意的并且反映在标记中，所以可以被视为生物等效的，这些抗体对于例如在长期使用中达到有效体内药物浓度不是必需的，并且被认为对于所研究的特定药品不具有临床意义。
184.在一些实施方案中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度或效力无临床上有意义的差异，则这两种抗原结合蛋白是生物等效的。
185.在一些实施方案中，如果与不进行参考产品和生物产品之间的切换的连续疗法相比，患者可以进行此类切换一次或多次，而没有预期的不良反应风险的增加，包括免疫原性的临床上显著的变化、或减少的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
186.在一些实施方案中，如果两种抗原结合蛋白都通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制来发挥作用，以达到此类机制是已知的程度，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
187.生物等效性可以由体内和/或体外方法证明。生物等效性度量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量了随时间推移的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人体内生物利用率数据相关联并且可以合理地预测人体内生物利用率数据的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量了随时间推移的抗体(或其靶标)的适当急性药理作用；以及(d)建立抗体的安全性、功效或生物利用率或生物等效性的良好对照的临床试验。
188.抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种置换或者使生物学活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建。举例来说，可以缺失不是生物活性必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸替换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥键。在其他情形下，生物等效抗体可以包括包含氨基酸变化的抗体变体，这些变化修饰抗体的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。
189.包含fc变体的抗流感-ha抗体
190.根据本文公开的某些实施方案，提供了抗乙型流感ha抗体，所述抗乙型流感ha抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如与中性ph相比在酸性ph下增强了或减少了抗体与fcrn受体的结合。例如，本公开包括抗流感-ha抗体，所述抗流感-ha抗体在fc结构域的ch2或ch3区中包含突变，其中相对于相同但未经修饰的抗体，一个或多个突变在酸性环境下(例如，在ph范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了fc结构域
与fcrn的亲和力。当施用于动物时，相对于相同但未经修饰的抗体，此类突变可导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包括例如位置250(例如，e或q)；250和428(例如，l或f)；252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)处的修饰；或位置428和/或433(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或434处的修饰(例如，a、w、h、f或y[n434a、n434w、n434h、n434f或n434y])；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308处的修饰(例如，308f、v308f)以及位置434处的修饰。在一些实施方案中，修饰包含428l(例如m428l)和434s(例如n434s)修饰；428l、259i(例如v259i)和308f(例如v308f)修饰；433k(例如h433k)和434(例如434y)修饰；252、254和256(例如252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如308f或308p)。在又一个实施方案中，修饰包含265a(例如d265a)和/或297a(例如n297a)修饰。
[0191]
例如，本公开包括抗乙型流感ha抗体，所述抗乙型流感ha抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含一对或多对或者一组或多组选自由以下组成的组的突变：250q和248l(例如t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如m428l和n434s)；257i和311i(例如p257i和q311i)；257i和434h(例如p257i和n434h)；376v和434h(例如d376v和n434h)；307a、380a和434a(例如t307a、e380a和n434a)；以及433k和434f(例如h433k和n434f)。前述fc结构域突变的所有可能组合和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变都涵盖在本文公开的范围内。
[0192]
本文提供了包含嵌合重链恒定(ch)区的抗乙型流感ha抗体，其中所述嵌合ch区包含来源于多于一种免疫球蛋白同种型的ch区的区段。举例来说，抗体可以包含嵌合ch区，所述区包含衍生自人类igg1、人类igg2或人类igg4分子的ch2结构域的部分或全部，其与衍生自人类igg1、人类igg2或人类igg4分子的ch3结构域的部分或全部组合。根据某些实施方案，抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合ch区。举例来说，嵌合铰链可以包含衍生自人类igg1、人类igg2或人类igg4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据eu编号，位置216到227的氨基酸残基)，其与衍生自人类igg1、人类igg2或人类igg4铰链区的“下铰链”序列(根据eu编号，位置228到236的氨基酸残基)组合。根据某些实施方案，嵌合铰链区包含衍生自人类igg1或人类igg4上铰链的氨基酸残基，和衍生自人类igg2下铰链的氨基酸残基。包含如本文所描述的嵌合ch区的抗体可以在某些实施方案中呈现修饰的fc效应功能，而不会不利地影响抗体的治疗或药代动力学特性。(参见例如2013年2月1日提交的美国临时申请第61/759,578号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
[0193]
抗体的生物特征
[0194]
一般而言，本文公开的抗体通过与乙型流感ha结合而发挥作用。例如，本公开包括抗体和抗体的抗原结合片段，其以小于10nm的kd结合乙型流感ha(
例如
，在25℃或在37℃下)，如在biacore仪器中通过表面等离子共振，或基于实时生物层干涉仪的生物传感器(octet htx测定法)所测量。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段以小于约5nm、小于约2nm、小于约1nm、小于约500pm、小于250pm或小于100pm的kd结合乙型流感ha，如例如使用如本文所述的测定法形式或基本上相似的测定法通过表面等离子共振所测量。
[0195]
本公开还包括结合乙型流感病毒ha的抗体及其抗原结合片段，其解离半衰期(t1/2)大于约75分钟，如在37℃下通过表面等离子共振，例如，使用如本文所定义测定形式，或基本上类似的测定法所测量。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段以大于
约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、或大于约1000分钟的t1/2结合流感ha，如例如使用如本文定义的测定法形式(例如，mab捕获或抗原捕获形式)或基本上相似的测定在25℃下通过表面等离子共振所测量。
[0196]
本公开还包括中和流感病毒对其宿主细胞的感染性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体展示出针对各种代表性流感病毒的中和效力，所述代表性流感病毒例如b/victoria/2/87、b/yamagata/16/88、b/maryland/03/2008、b/nanchang/3451/93和/或b/florida/4/2006，在微量中和测定法或基本上类似的测定法中，ic
50
范围为约1pm至约800nm，例如ic
50
范围为约1pm至约800pm，ic
50
范围为约1pm至约10pm，ic
50
范围为约10pm至约50pm，ic
50
范围为约1pm至约100pm，ic
50
范围为约10pm至约100pm，ic50范围为100pm至约800pm，或ic
50
范围为约500pm至约800pm，ic
50
范围为约1nm至约10nm，ic
50
范围为约10nm至约50nm，ic
50
范围为约1nm至约100nm，ic
50
范围为约10nm至约100nm，ic
50
范围为约100nm至约800nm，或ic
50
范围为约500nm至约800nm。
[0197]
本公开还包括以亚纳摩尔/升浓度与感染乙型流感的细胞结合并展示出与ha特异性结合的抗体或其抗原结合片段(参见实施例3)。
[0198]
本公开还包括抗乙型流感ha抗体，其展示出保护作用增加(相对于未治疗的受试者)，或体内乙型流感感染的有效中和。某些抗体在预防性施用时展示出保护作用(感染前；参见实施例4)。在一些实施方案中，相对于用人igg1同种型对照抗体治疗的小鼠，在感染前5天施用的一剂5mg/kg或0.5mg/kg抗ha抗体在预防性施用时导致小鼠100％存活。
[0199]
例如，用抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段进行预防性治疗可以保护哺乳动物免受随后暴露于流感病毒的感染，或降低随后暴露于流感病毒的感染概率或风险。所述保护选自由以下各项组成的组：流感感染的至少一种症状的改善、缓解或降低严重性、持续时间或发生频率。在一些方面，当在暴露于流感病之前(例如，在暴露于流感病毒前至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或2至5天)预防性施用于动物(例如，哺乳动物)时，降低流感感染的风险。至少一种症状可以选自由以下各项组成的组：头痛、发热、疼痛、流涕(鼻塞)、寒战、疲劳、虚弱、喉咙痛、咳嗽、气短、呕吐、腹泻、肺炎、支气管炎和死亡。
[0200]
在一个实施方案中，特异性结合至乙型流感ha的分离的重组抗体或其抗原结合片段具有以下特征中的一者或多者：(a)是完全人单克隆抗体；(b)以小于约10-9
、小于约10-10
m、小于约10-11
m、小于约10-12
m或小于约10-13
m的ec
50
结合至乙型流感ha；(c)展示出与未用特异性结合至乙型流感ha的分离的重组抗体或其抗原结合片段治疗的可比较的流感感染动物相比，流感感染的动物的存活率增加；以及/或者(d)包含(i)三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)，所述重链互补决定区被包含在重链可变区(hcvr)内，所述重链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列；以及(ii)三个轻链cdr(lcdr1、hcdr2和hcdr3)，所述轻链cdr被包含在轻链可变区(lcvr)内，所述轻链可变区包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
[0201]
本文公开的抗体可以具有一种或多种前述生物学特征，或它们的任何组合。通过对包括本文工作例在内的本公开的回顾，本文公开的抗体的其他生物特征将对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
[0202]
表位作图和相关技术
[0203]
本公开包括抗乙型流感ha抗体，其与在乙型流感ha分子的一个或多个结构域内存在的一个或多个氨基酸相互作用。抗体所结合的表位可以由定位于流感ha分子内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单个邻接序列(例如，结构域中的线性表位)组成。或者，表位可以由定位于乙型流感ha分子内的多个非邻接氨基酸(或氨基酸序列)(例如，构象表位)组成。
[0204]
本领域普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断分析，如antibodies,harlow和lane(cold spring harbor press,纽约州冷泉港(cold spring harbor,ny))中所描述的分析。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke(2004)methods mol.biol.248:443-63)、肽裂解分析结晶学研究和nmr分析。另外，可以采用如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(tomer(2000)prot.sci.9:487-496)。可以用于鉴别与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换法涉及所关注的蛋白质的氘标记，接着是抗体与氘标记的蛋白质的结合。接着，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比不属于界面的一部分的氨基酸内的可交换质子更慢的速度进行氘氢反交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可能保留氘，并且因此与不包括在界面中的氨基酸相比表现出相对较高的质量。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如，ehring(1999)analytical biochemistry 267:252-259；engen和smith(2001)anal.chem.73:256a-265a。
[0205]
术语“表位”是指b细胞和/或t细胞起反应的抗原上的位点。b细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个氨基酸，或至少4个氨基酸，例如，至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10氨基酸。
[0206]
修饰辅助概况分析(map)，也称为基于抗原结构的抗体概况分析(asap)，是一种根据每个抗体与化学或酶修饰的抗原表面的结合概况的相似性，对针对同一抗原的大量单克隆抗体(mab)进行分类的方法(参见us 2004/0101920，专门以全文引用的方式并入本文中)。每个类别可以反映与另一个类别所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。这一技术允许快速过滤基因相同的抗体，从而可以使表征集中在基因不同的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，map可以促进鉴别产生具有所需特征的单克隆抗体的稀有杂交瘤克隆。map可以用于将本文提供的抗体分类为结合不同表位的抗体组。
[0207]
在某些实施方案中，甲型流感病毒ha抗体或其抗原结合片段与流感ha中的示例区域中的任何一个或多个内的表位或其片段结合，所述表位是天然形成的，或以重组方式产生的。
[0208]
本公开包括结合至相同表位或表位的一部分的抗乙型流感ha抗体。同样，本公开还包括与本文所述的特定示例性抗体中的任一者竞争结合至乙型流感ha或其片段的抗乙型流感ha抗体。例如，本公开包括抗乙型流感ha抗体，所述抗乙型流感ha抗体与从表1中所述的那些抗体获得的一种或多种抗体交叉竞争与乙型流感ha的结合。
[0209]
可以通过使用已知方法确定抗体是否与参考抗乙型流感ha抗体结合相同的表位
或竞争结合参考抗乙型流感ha抗体。例如，为了确定测试抗体是否与参考抗乙型流感ha抗体结合相同的表位，使参考抗体在饱和条件下与乙型流感ha或肽结合。然后，评估测试抗体结合至乙型流感ha分子的能力。如果测试抗体在与参考抗乙型流感ha抗体饱和结合后能够结合至乙型流感ha，则可以得出以下结论：测试抗体结合至与参考抗乙型流感ha抗体不同的表位。在另一个方面，如果测试抗体在与参考抗乙型流感ha抗体饱和结合后不能与乙型流感ha结合，则测试抗体可以结合至与参考抗乙型流感ha抗体结合的表位相同的表位。
[0210]
为了确定抗体是否与参考抗乙型流感ha抗体竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，使参考抗体在饱和条件下结合至乙型流感ha，然后评估测试抗体与乙型流感ha分子的结合。在第二方向上，使测试抗体在饱和条件下结合至乙型流感ha分子，然后评估参考抗体与乙型流感ha分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗体能够结合至乙型流感ha分子，则可以得出以下结论：测试抗体和参考抗体竞争乙型流感ha的结合。如本领域的普通技术人员所理解，与参考抗体竞争结合的抗体不一定结合与参考抗体相同的表位，但可以通过结合重叠或相邻的表位来在空间上阻断参考抗体的结合。
[0211]
如果两种抗体各自竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体与相同或重叠的表位结合。即，如在竞争性结合分析中所测量，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，例如75％、90％或甚至99％(参见例如junghans等人,cancer res.199050:1495-1502)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
[0212]
然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体结合的缺乏事实上是否是由于结合至与参考抗体相同的表位，或空间阻断(或另一个现象)是否是造成所观察的结合缺乏的原因。可以使用elisa、ria、表面等离子共振、流式细胞术或者本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合分析来进行这类实验。
[0213]
免疫缀合物
[0214]
本文设想了与治疗部分缀合的人抗乙型流感ha单克隆抗体(“免疫缀合物”)，诸如类毒素或抗病毒药以治疗流感病毒感染。如本文所用，术语“免疫缀合物”是指与放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂化学或生物连接的抗体。抗体可以在沿分子的任何位置与放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、肽或治疗剂连接，只要它能够结合其靶标。免疫缀合物的实例包括抗体药物缀合物和抗体-毒素融合蛋白。在一个实施方案中，药剂可以是针对流感ha的第二种不同抗体。在某些实施方案中，抗体可以与特异性针对病毒感染的细胞的药剂缀合。可与抗流感ha抗体缀合的治疗部分的类型并将考虑待治疗的病况和要实现的所需治疗效果。用于形成免疫缀合物的合适药剂的实例是本领域已知的；参见例如wo 05/103081。
[0215]
多特异性抗体
[0216]
本文公开的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种目标多肽的不同表位具有特异性，或可以含有对超过一种目标多肽具有特异性的抗原结合域。参见例如，tutt等人.,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等人.,2004,trends biotechnol.22:238-244。
[0217]
本文提供的多特异特异性抗原结合分子中的任一者或其变体可以使用标准分子生物学技术(例如，重组dna和蛋白质表达技术)来构建，如本领域的普通技术人员所已知。
[0218]
在一些实施方案中，乙型流感ha特异性抗体以双特异性形式(“bi-specific”或“bispecific”)产生，其中与乙型流感ha的不同结构域结合的可变区连接在一起，以在单个结合分子内赋予双结构域特异性。适当设计的双特异性可以通过增加特异性和结合亲合力来增强整体乙型流感ha蛋白抑制功效。对个别域具有特异性的可变区(例如，n末端域的区段)，或可以与一个域内的不同区结合的可变区配对在一个结构骨架上，所述结构骨架允许每个区同时与单独的表位结合，或与一个域内的不同区结合。在双特异性的一个实例中，来自对一个域具有特异性的结合物的重链可变区(vh)与来自一系列对第二个域具有特异性的结合物的轻链可变区(v
l
)重新组合，以确定可以与原始vh配对而不破坏所述vh的原始特异性的非同源v
l
搭配物。以这种方式，单个v
l
区段(例如v
l
1)可以与两个不同的vh域(例如vh1和vh2)组合，以产生由两个结合“组”(vh1-v
l
1和vh2-v
l
1)构成的双特异性。使用单个v
l
区段降低了系统的复杂性，从而简化了用于产生双特异性的克隆、表达和纯化过程并提高了效率(参见例如ussn13/022759和us2010/0331527)。
[0219]
或者，可以使用本文所描述的技术或本领域技术人员已知的其他技术，以双特异性形式制备结合多于一个结构域和第二靶标的抗体，诸如但不限于例如第二不同抗乙型流感ha抗体。与不同区结合的抗体可变区可以与结合到例如流感病毒上的相关位点的可变区连接在一起，以在单个结合分子内赋予双抗原特异性。适当设计的这种性质的双特异性具有双重功能。对细胞外域具有特异性的可变区与对细胞外域之外具有特异性的可变区组合，并配对在一个结构骨架上，使每个可变区能够与单独的抗原结合。
[0220]
可以用于本文公开的背景的示例性双特异性抗体形式涉及第一免疫球蛋白(ig)ch3结构域和第二ig ch3结构域的使用，其中所述第一和第二ig ch3结构域的至少一个氨基酸彼此不同，并且其中至少一个氨基酸差异与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比减少了双特异性抗体与蛋白a的结合。在一个实施方案中，第一ig ch3结构域结合蛋白a并且第二ig ch3结构域含有降低或消除蛋白a结合的突变，例如h95r修饰(根据imgt外显子编号；根据eu编号的h435r)。第二ch3还可以包含y96f修饰(按照imgt；按照eu的y436f)。在第二ch3内可能发现的其他修饰包括：在igg1抗体的情况下，d16e、l18m、n44s、k52n、v57m和v82i(按照imgt；按照eu的d356e、l358m、n384s、k392n、v397m和v422i)；在igg2抗体的情况下，n44s、k52n和v82i(imgt；按照eu的n384s、k392n和v422i)；以及在igg4抗体的情况下，q15r、n44s、k52n、v57m、r69k、e79q和v82i(按照imgt；按照eu的q355r、n384s、k392n、v397m、r409k、e419q和v422i)。在本文公开的范围内设想了上文所述的双特异性抗体形式的变化。
[0221]
可以在本文公开的语境中使用的其他示例性双特异性形式包括但不限于例如基于scfv的或双体双特异性形式、igg-scfv融合体、双可变结构域(dvd)-ig、四源杂交瘤、钮入孔、共同轻链(例如，具有钮入孔的共同轻链等)、crossmab、crossfab、(seed)体、亮氨酸拉链、duobody、igg1/igg2、双重作用fab(daf)-igg和mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如，klein等人,2012,mabs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献)。还可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有确定组成、价数和几何形状的多聚体复合物。(参见例如，kazane等人,j.am.chem.soc.[epub:2012年12月4日])。
[0222]
治疗性施用和配制物
[0223]
本文提供了包含抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本公开的治疗组合物将与药学上可接受的载剂、赋形剂和其他药剂一起施用，所述其他药剂被掺入配制物中，以提供改进的转移、递送、耐受性等。众多的适当配制物可以见于所有医药化学家已知的处方集中：remington's pharmaceutical sciences,mack publishing company,宾夕法尼亚州伊斯顿(easton,pa)。这些配制物包括例如散剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子脂质)的囊泡(如lipofectin
tm
)、dna结合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液卡波蜡(carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。还参见powell等人“compendium of excipients for parenteral formulations”pda(1998)j pharm sci technol 52:238-311。
[0224]
抗体剂量可以视待施用的个体的年龄和体格、目标疾病、病状、施用途径等而变化。当本文公开的抗体用于治疗成年患者的疾病或障碍或用于预防此类疾病时，通常以约0.1至约60mg/kg体重、或约5至约60、约10至约50、或约20至约50mg/kg体重的单剂量施用本文公开的抗体是有利的。视病症的严重程度而定，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以以至少约0.1mg至约5000mg、约1至约2000mg、约5至约1000mg或约10至约500mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量施用。在某些实施方案中，初始剂量之后可以施用抗体或其抗原结合片段的第二或多个后续剂量，其量可以大致等于或小于初始剂量的量，其中后续剂量间隔至少1天到3天；至少一周，至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
[0225]
各种递送系统是已知的并且可以用于施用药物组合物，例如在脂质体、微粒、微胶囊内包封、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如wu等人,(1987)j.biol.chem.262:4429-4432)。引入方法包括(但不限于)：皮内、经皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外以及口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或团注、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。药物组合物也可以在囊泡，尤其脂质体中递送(参见例如langer(1990)science 249:1527-1533)。
[0226]
本文还考虑使用纳米颗粒来递送本文公开的抗体。抗体结合的纳米颗粒可以用于治疗和诊断应用。抗体结合的纳米颗粒以及制备和使用方法由arruebo,m.等人,2009(“antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”，j.nanomat.第2009卷,文章编号439389,24页,doi:10.1155/2009/439389)详细描述，其以引入的方式并入本文中。可以开发纳米颗粒并与药物组合物中所含的抗体缀合，以靶向病毒感染的细胞。用于药物递送的纳米颗粒也已在例如us 8257740或us 8246995中描述，每个专利都以全文引用的方式并入本文中。
[0227]
在某些情形下，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。在又一个实施方案中，可以将控制释放系统放入组合物的目标附近，由此仅需要一部分全身剂量。
[0228]
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内、颅内、腹膜内和肌肉内注射、滴液输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规地用于注射的无菌水性介质或油性
介质中来制备。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当安瓿中。
[0229]
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本文公开的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易于应用于递送本文公开的药物组合物。这种笔式递送装置可以重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可更换的筒。一旦筒内的所有药物组合物都已施用并且筒变空时，就可以容易地丢弃空筒并且更换为含有药物组合物的新筒。然后可以再使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦清空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。
[0230]
多种可重复使用的笔式递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本文公开的药物组合物。实例包括但不限于：autopen
tm
(英国伍德斯托克(woodstock,uk)的owen mumford公司)；disetronic
tm
笔(瑞士布格多夫(burghdorf,switzerland)的disetronic medical systems)；humalog mix 75/25
tm
笔；humalog
tm
笔；humalin 70/30
tm
笔(印第安纳州印第安纳波利斯(indianapolis,in)的eli lilly and co.)；novopen
tm
i、ii和iii(丹麦哥本哈根(copenhagen,denmark)的novo nordisk)；novopen junior
tm
(丹麦哥本哈根的novo nordisk)；bd
tm
笔(新泽西州富兰克林湖(franklin lakes,nj)的becton dickinson)；optipen
tm
；optipen pro
tm
；optipen starlet
tm
以及opticlik
tm
(德国法兰克福(frankfurt,germany)的sanofi-aventis)等。可用于皮下递送本文公开的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于solostar
tm
笔(sanofi-aventis)、flexpen
tm
(novo nordisk)和kwikpen
tm
(eli lilly)、sureclick
tm
自动注射器(加利福尼亚州千橡树市(thousand oaks,ca)的amgen)、penlet
tm
(德国斯图加特(stuttgart,germany)的haselmeier)、epipen(dey,l.p.)以及humira
tm
笔(伊利诺伊州阿博特帕克(abbott park il)的abbott labs)等。
[0231]
有利地，将用于上文所描述的口服或不经肠使用的药物组合物制备成适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。此类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。在单位剂量中，每个剂型所含的抗体量一般为约5至约5000mg；特别是在注射剂形式中，优选的是，抗体的含量为约5至约500mg，其他剂型为约10至约250mg。
[0232]
抗体的治疗用途
[0233]
本文公开的抗体可用于治疗和/或预防与乙型流感病毒感染相关的疾病或障碍或病症以及/或者用于改善与此类疾病、障碍或病症相关的至少一种症状。
[0234]
在某些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗患有由乙型流感病毒导致的严重和急性呼吸道感染的受试者。在一些实施方案中，抗体可用于降低病毒滴定度或降低宿主中的病毒载量。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以以治疗剂量施用于乙型流感病毒感染的患者。
[0235]
相对于未经处理但类似定位的受试者，本文公开的一种或多种抗体可以施用以缓解或预防或减轻疾病或障碍的一种或多种症状或病症的严重性。所述抗体可以用于改善或降低流感病毒感染的至少一种症状的严重性，所述症状包括但不限于发烧、咳嗽、咽喉痛、
头痛、身体疼痛、疲劳、极度疲惫、呼吸急促、支气管炎、肺炎和死亡。
[0236]
本文还设想将本文公开的一种或多种抗体预防性用于处于风险中的受试者以发展流感病毒感染，诸如免疫功能低下的个体、老年人(65岁或以上)、小于2岁的儿童、医护人员、与患有流感病毒感染的患者密切接触的家族成员和有病史(例如，肺部感染、心脏病或糖尿病的风险增加)的患者。
[0237]
在另一个实施方案中，本发明的抗体用于制备用于治疗患有流感病毒感染的患者的药物组合物。在另一个实施方案中，抗体作为辅助疗法与本领域的技术人员已知可用于治疗或改善流感病毒感染的任何其他药剂或任何其他疗法一起使用。
[0238]
组合疗法
[0239]
组合疗法可以包括抗乙型流感ha抗体和可以有利地与抗体或抗体的生物活性片段组合的任何其他治疗剂。本文公开的抗体可以与一种或多种用于治疗流感病毒的药物或药剂(例如抗病毒剂)协同组合。
[0240]
例如，示例性抗病毒剂包括例如疫苗、神经氨酸酶抑制剂或核苷类似物。可与本文提供的抗体组合使用的其他示例性抗病毒剂可以包括例如齐多夫定、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘尿苷、曲氟尿苷、膦甲酸、阿昔洛韦、利巴韦林、金刚烷胺、雷曼替丁、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、α-干扰素和其他干扰素、神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦奥塞米韦拉尼那韦、帕拉米韦)或金刚乙胺。
[0241]
其他示例性抗病毒药物包括但不限于ha抑制剂、唾液酸抑制剂和m2离子通道抑制剂。在一个实施方案中，m2离子通道抑制剂是金刚烷胺或金刚乙胺。
[0242]
在一些实施方案中，本文提供的抗体可以与第二治疗剂组合以减少患有流感病毒感染的患者的病毒载量，或改善感染的一种或多种症状。
[0243]
本文公开的抗体可与抗炎药(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药)、减充血剂、抗组胺药、抗感染药、不同的流感病毒抗体、抗病毒药、流感病毒疫苗(诸如或)、膳食补充剂(诸如抗氧化剂)或另一种治疗流感病毒感染的姑息疗法组合使用。姑息疗法包括治疗受试者以使受试者更舒适和/或减轻乙型流感感染症状的严重性。
[0244]
在某些实施方案中，第二治疗剂是另一种流感抗体。在某些实施方案中，第二治疗剂是针对流感血凝素(例如，甲型流感血凝素)的另一种抗体。在某些实施方案中，第二治疗剂是不同流感蛋白如神经氨酸酶或基质蛋白2(m2e蛋白)的四聚体胞外域的另一种抗体。在某些实施方案中，第二治疗剂是不同蛋白质如宿主跨膜蛋白酶丝胺酸2(tmprss2)的抗体。第二抗体可以特异性针对来自不同亚型或病毒株的一种或多种不同流感病毒蛋白。本文考虑使用对流感病毒具有广泛中和或抑制活性的抗体组合(“混合液”)。在一些实施方案中，可以将非竞争性抗体组合并施用于有需要的受试者，以降低流感病毒由于选择压力而快速变异逃避的能力。在一些实施方案中，包含所述组合的抗体与ha蛋白上不同的非重叠表位结合。包含所述组合的抗体可以阻止病毒附着宿主细胞和/或进入宿主细胞和/或与宿主细胞融合。抗体可与选自任何一种或多种乙型流感病毒毒株的血凝素相互作用，并且当单独使用或与上述任何一种或多种药剂组合使用时，可中和任何一种或多种乙型流感病毒株，包括b/victoria/2/87、b/yamagata/16/88、b/maryland/03/2008、b/nanchang/3451/93和/或b/florida/4/2006。
[0245]
除了本文公开的抗乙型流感ha抗体之外，本文还考虑使用抗流感ha抗体的组合，其中其中组合包含一种或多种不交叉竞争的抗体；在一些实施方案中，所述组合包含具有广泛中和活性的第一抗体以及具有针对窄谱分离物的活性并且不与第一抗体交叉竞争的第二抗体。
[0246]
如本文所用，术语“与
……
组合”是指可以在本文公开的抗乙型流感ha抗体的施用之前、同时或之后施用一种或多种另外的治疗活性组分。术语“与
……
组合”还包括连续或同时施用抗流感ha抗体和第二治疗剂。
[0247]
在施用本文公开的抗乙型流感ha抗体之前，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。举例来说，如果第一组分是在施用第二组分之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟或之前不到1分钟施用，则可以认为第一组分是在第二组分“之前”施用。在其他实施方案中，在施用本文公开的抗乙型流感ha抗体之后，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。举例来说，如果第一组分是在施用第二组分之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，则可以认为第一组分是在第二组分“之后”施用。在其他实施方案中，在施用本文公开的抗乙型流感ha抗体同时，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。出于本公开的目的，“同时”施用包括例如以单一剂型向受试者施用或以单独的剂型在彼此约30分钟或更短时间内向受试者施用抗乙型流感ha抗体和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，则每个剂型可以通过相同的途径施用(例如，抗乙型流感ha抗体和另外的治疗活性组分都可以静脉内施用等)；或者，每个剂型可以通过不同的途径施用(例如，抗乙型流感ha抗体可以静脉内施用，而另外的治疗活性组分可以口服施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、以相同途径的单独剂型或以不同途径的单独剂型施用所述组分都被认为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用抗乙型流感ha抗体“之前”、“同时”或“之后”(那些术语如上文所定义)施用另外的治疗活性组分被视为与另外的治疗活性组分的“组合”施用抗乙型流感ha抗体。
[0248]
本公开包括这样的药物组合物，其中本文公开的抗乙型流感ha抗体与如本文别处所述的一种或多种另外的治疗活性组分共配制。
[0249]
施用方案
[0250]
根据某些实施方案，本文提供的单剂量抗乙型流感ha抗体或其抗原结合片段(或者包含此类抗流感ha抗体或片段与本文提及的任何其他治疗活性剂的组合的药物组合物)可以施用于有需要的受试者。根据本文公开的某些实施方案，可以将多剂量的抗乙型流感ha抗体(或者包含抗乙型流感ha抗体与本文提及的其他治疗活性剂中的任一者的组合的药物组合物)在限定的时间范围内施用于受试者。根据本公开的该方面的方法包括向受试者按顺序施用多剂量的抗乙型流感ha抗体。如本文所用，“按顺序施用”意指每个剂量的抗乙型流感ha抗体在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、日、周或月)分开的不同日施用于受试者。本公开包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的抗乙型流感ha抗体，然后是一个或多个第二剂量的抗乙型流感ha抗体，以及任选地随后是一个或多个第
三剂量的抗乙型流感ha抗体按顺序施用于患者。
[0251]
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用抗乙型流感ha抗体的时间顺序。因此，"初始剂量"为在治疗方案的开始时施用的剂量(也称为"基础剂量")；"二级剂量"为在初始剂量之后施用的剂量；并且"三级剂量"为在二级剂量之后施用的剂量。初始剂量、二级剂量和三级剂量都可以含有相同量的抗流感ha抗体，但一般在施用频率方面可以彼此不同。然而，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中含有的抗乙型流感ha抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，接着以较低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
[0252]
在某些示例性实施方案中，每个第二和/或第三剂量在紧接前一剂量之后1至48小时(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2小时或更长)施用。如本文所用，短语“紧接前一剂量”是指在多次施用的顺序中，抗乙型流感ha抗体的剂量在顺序中紧接着的下一剂量施用之前施用于患者，而没有中间剂量。
[0253]
根据该方面的方法可以包括向患者施用任何数量的第二和/或第三剂量的抗乙型流感ha抗体。举例来说，在某些实施方案中，仅向患者施用单次二级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)二级剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单次三级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)第三剂量。
[0254]
在某些实施方案中，在治疗方案的过程中，向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以变化。在治疗过程中，医生也可以根据临床检查后个别患者的需要来调整施用频率。
[0255]
抗体的诊断用途
[0256]
抗乙型流感ha抗体可用于检测和/或测量样品中的乙型流感ha，例如用于诊断目的。一些实施方案考虑将一种或多种抗体用于检测疾病或障碍诸如病毒感染的测定法中。乙型流感ha的示例性诊断测定法可以包括，例如，将获自患者的样品与抗乙型流感ha抗体接触，其中所述抗乙型流感ha抗体用可检测标记或报告分子标记或用作捕获配体以从患者样品中选择性分离乙型流感病毒ha。或者，未标记的抗乙型流感ha抗体可以与本身被可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，诸如3h、
14
c、
32
p、
35
s或
125
i；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或者酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的乙型流感ha的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)和荧光活化细胞分选(facs)。
[0257]
可用于乙型流感ha诊断测定法的样品包括可从患者获得的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下含有可检测量的乙型流感ha或其片段。通常，将测量从健康患者(例如，未患流感相关疾病的患者)获得的特定样品中的乙型流感ha水平，以初步建立乙型流感ha的基线或标准水平。然后可以将该乙型流感ha的基线水平与在从怀疑患有乙型流感ha相关病症或与这种病症相关的症状的个体获得的样品中测量的乙型流感ha水平进行比较。
[0258]
对乙型流感ha具有特异性的抗体可以不含另外的标记或部分，或者它们可以含有
n-末端或c-末端标记或部分。在一个实施方案中，所述标记或部分是生物素。在结合分析中，标记(如果有的话)的位置可以确定肽相对于肽所结合的表面的取向。举例来说，如果表面涂覆有抗生物素蛋白，则含有n-末端生物素的肽将被定向，使得肽的c-末端部分将在表面远侧。
[0259]
实施例
[0260]
提供以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供完整公开内容和描述如何制备和使用本文公开的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其公开的范围。已努力确保有关所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计，室温为约25℃并且压力是大气压或接近大气压。
[0261]
实施例1：乙型流感血凝素(ha)的人抗体的产生
[0262]
在小鼠中产生针对流感血凝素的人抗体，其包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的dna。用表达甲型和乙型流感血凝素的载体组合免疫小鼠，然后用甲型和乙型流感病毒株感染和恢复，然后施用包含重组血凝素蛋白混合物的加强剂。通过流感ha特异性免疫测定来监测抗体免疫应答。如美国专利7582298中所述，抗乙型流感ha抗体直接从抗原阳性小鼠b细胞中分离，所述b细胞未与骨髓瘤细胞融合，该专利以引用的方式整体特别并入本文。使用该方法，获得了全人抗流感ha抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。
[0263]
本文所述的示例性抗体称为mab 35490。根据本实施例的方法产生的示例性抗体的生物特性详细地描述于以下阐述的实施例中。
[0264]
实施例2：重链和轻链可变区胺基酸和核苷酸序列
[0265]
表1列出了示例性抗乙型流感ha抗体的重链和轻链可变区和cdr以及重链和轻链序列的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表2中。
[0266]
表1：氨基酸序列标识符
[0267][0268]
表2：核酸序列标识符
[0269][0270]
本文公开的抗体具有全人可变区，但可具有小鼠恒定区(例如，小鼠igg1 fc或小鼠igg2 fc(a或b同种型))或人恒定区(例如，人igg1 fc或人igg4 fc)。如本领域的普通技术人员所理解，具有特定fc同种型的抗体可以转化为具有不同fc同种型的抗体(例如，具有小鼠igg1 fc的抗体可以转化为具有人igg4的抗体，等等)，但在任何情况下，可变域(包括cdr)——由表1和表2中所示的数字标识符表示的可变域将保持不变，并且无论fc域的性质如何，预计与抗原的结合特性是相同或基本上相似的。
[0271]
实施例3：与流感感染的细胞结合的抗血凝素抗体
[0272]
mdck london细胞以40,000个细胞/孔接种在96孔板中的50μl感染培养基(含有
1％丙酮酸钠、0.21％低igg bsa溶液和0.5％庆大霉素的dmem)中。将细胞在37℃和5％co2下温育四小时。然后用10e-2.5稀释度的50μl乙型流感/florida/4/2006病毒(b/yamagata谱系的疫苗株)感染平板，轻轻拍打并放回37℃ 5％co2放置20小时。然后将平板用pbs洗涤一次，并用50μl 4％pfa的pbs溶液固定，并在室温下温育15分钟。平板用pbs洗涤三次，并用300μl startingblock
tm
(pbs)封闭缓冲液(thermo fisher scientific)在室温下封闭一小时。将乙型流感抗ha抗体mab35490p(用人igg1 fc形式化)和人igg1同种型对照抗体在封闭缓冲液中稀释至100μg/ml的起始浓度，并以1:4滴定至6.1e-3μg/ml的最终浓度。在温育后，从平板中除去封闭缓冲液，并以75μl/孔将稀释的抗体添加到细胞上。将平板在室温下温育一小时。在温育后，用洗涤缓冲液(咪唑缓冲盐水和20，在milli-q水中稀释至1x)洗涤平板三次，并用75μl/孔的二抗(过氧化物酶affinipure驴抗人igg，jackson immunoresearch)(在封闭缓冲液中以1:2000稀释)覆盖。第二溶液在室温下在平板上温育一小时。随后，用洗涤缓冲液洗涤平板三次，并添加75μl/孔的显影底物elisa pico底物(1:1制备)。立即在molecular devices spectramax i3x读板器上读取平板的发光情况，ec
50
数据显示在表3中。
[0273]
表3：flub感染细胞的抗ha结合elisa
[0274]
抗体ec
50 log[m]人igg1同种型对照不结合mab354907.610e-10
[0275]
如表3所示，mab35490以亚纳摩尔/升浓度与乙型流感感染的细胞结合，这展示出与ha的特异性结合。
[0276]
实施例4：通过预防性抗体施用预防乙型流感引起的死亡
[0277]
在感染前五天，balb/c elite小鼠用5mg/kg或0.5mg/kg mab35490(用人igg1 fc形式化)或5mg/kg人igg1同种型对照抗体(在pbs中稀释)通过皮下注射到颈背来处理。在感染当天，将乙型流感/florida/4/2006病毒原液在冰上解冻，并且在pbs中从2.05e08pfu/ml的原液稀释到20μl pbs(2.0e05pfu/ml)中含有4000pfu病毒。使病毒一直保持在冰上。给每只小鼠注射2.4mg/kg开他敏和0.1mg/kg甲苯噻嗪的混合物，并让其休息大约10-15分钟，直到它们完全入睡。然后给每只小鼠鼻内给予20μl病毒(4000pfu)以完全吸入病毒。然后在感染后两周监测小鼠的体重减轻和发病率。与感染时的初始体重相比体重减轻25％或更多会导致安乐死。结果在表4中示出。
[0278]
表4：施用mab35490或同种型对照后的小鼠存活率
[0279][0280]
用人igg1同种型对照抗体治疗的所有动物都死于感染，需要在感染后八天实施安乐死。用5mg/kg和0.5mg/kg mab35490治疗的所有动物都在感染中存活，这展示了flub抗ha抗体mab35490的功效。