用于治疗神经毒性的方法和材料与流程

psychopharmacol.28(2):124-133；和papapetropoulos等,2018mov disord.33(s2):s14(abstract 29))。如本文所表明的，cx-8998和btz的共同治疗(例如，二者的施用)不干扰btz对人多发性骨髓瘤细胞系的体外活性或btz对多发性骨髓瘤细胞系rpmi-8226细胞的体内活性。如本文所表明的，cx-8998和btz的共同治疗逆转了btz诱导的神经毒性。例如，cx-8998(10和30mg/kg)和btz的共同治疗逆转btz诱导的神经传导速度(ncv)的降低，而不干扰btz诱导的蛋白酶体抑制。例如，cx-8998(30mg/kg)和btz的共同治疗降低btz诱导的β-微管蛋白聚合和神经纤维损失。具有降低或消除神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)的能力提供了使化疗的治疗益处(例如，抗癌效果)最大化、同时降低或消除化疗的任何神经毒性副作用的独特且未实现的机会。例如，降低或消除神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)的能力可使患者耐受化疗而不需要会导致不充分的癌症治疗和/或缩短的存活期的任何剂量减少或终止。
9.总体上，本文的一方面的特征在于用于治疗患有神经毒性的哺乳动物的方法。所述方法可包括以下或基本上由以下组成：将有效量的含有t型钙通道调节剂或其盐的组合物施用至哺乳动物以减轻哺乳动物中神经毒性的症状。所述方法还可包括鉴定所述哺乳动物患有神经毒性。所述哺乳动物可为人。神经毒性可为化疗诱导的神经毒性。所述化疗诱导的神经毒性可为硼替佐米诱导的神经毒性。可以对患有神经毒性的哺乳动物施用化疗以治疗哺乳动物中的癌症。癌症可为多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、白血病、消化道癌、肺癌、睾丸癌、卵巢癌、脑癌、子宫癌、前列腺癌、骨癌、乳腺癌、或膀胱癌。症状可为疼痛、肢体无力、肢体麻木、瘙痒、麻痹、瘫痪、嗅觉缺失、上睑下垂、慢性咳嗽、运动功能障碍、记忆丧失、视力丧失、头痛、认知损害、脑病、痴呆、心境障碍、便秘、性功能障碍、膀胱潴留、出血、或其任何组合。t型钙通道调节剂可为负向调节剂。负向调节剂可为负向别构调节剂。t型钙通道调节剂可降低t型钙通道活性。t型钙通道调节剂可包括cx-8998。cx-8998可为盐形式。t型钙通道调节剂可包括cx-8998的代谢物。cx-8998的代谢物可具有以下的结构或其任何组合：
[0010][0011]
cx-8998的代谢物可为盐形式。t型钙通道调节剂可包括cx-8998和cx-8998的一种以上的代谢物。组合物可包括约10nm至约1000nm的t型钙通道调节剂。组合物可包括给予哺乳动物约3mg/kg哺乳动物体重至约30mg/kg哺乳动物体重的t型钙通道调节剂。组合物可口服施用。
[0012]
除非另外指出，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文中所描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施本发明，下文中仍描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献以其整体通过引用结合在此。在冲突的情况下，以包括定
义的本说明书为准。此外，材料、方法、和实例仅为说明性的并且不旨在进行限制。
[0013]
在以下附图和说明书中描述了本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和附图、以及从权利要求书中显而易见。
附图说明
[0014]
图1a-1d.btz抗癌活性的cx-8998干扰。(图1a)在存在或不存在各种浓度的cx-8998的情况下，用ic
50
(分别为6
±
0.5nm、4
±
1.7nm和2.5
±
0.6nm)的btz体外处理72小时的多发性骨髓瘤细胞系(mcl)mm.1s、rpmi8336、和u266b1的存活百分比。(图1b)携带rpmi8226异种移植物的裸小鼠的相对体重。(图1c)携带rpmi8226异种移植物的裸小鼠中的肿瘤体积。(图1d)从大鼠分离的pbmc中的蛋白酶体抑制百分比。
[0015]
图2.尾神经传导速度。在btz诱导的cipn的大鼠模型中，在第1阶段(基线和4周)和第2阶段(5周和8周)期间通过肌电图从尾神经获得的传导速度。
[0016]
图3.坐骨神经传导速度。在btz诱导的cipn的大鼠模型中，在第1阶段(基线和4周)和第2阶段(5周和8周)期间通过肌电图从坐骨神经获得的传导速度。
[0017]
图4.机械阈值(mt)。在btz诱导的cipn的大鼠模型中，在第1阶段(基线和4周)和第2阶段(5周和8周)期间使用动态触觉测量仪试验(dynamic aesthesiometer test)测量的机械性痛觉超敏(mechanical allodynia)的评价。
[0018]
图5a-5c.β-微管蛋白聚合、坐骨神经纤维密度和组织病理学。(图5a)在存在或不存在cx-8998的情况下，来自用btz处理8周后收集的坐骨神经组织的蛋白提取物中的β-微管蛋白聚合的百分比。(图5b)在存在或不存在cx-8998的情况下，在来自用btz处理8周后收集的后爪的足底无毛皮肤部分中定量的每mm的神经纤维的数量。(图5c)图5b中定量的组织样品的代表图像。
具体实施方式
[0019]
本文提供用于治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，预定或期望对其施用与化疗诱导的神经毒性相关的化学治疗剂的哺乳动物)的方法和材料。例如，可将一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)施用至患有神经毒性的哺乳动物以治疗所述哺乳动物。在一些情况中，可对患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物施用一种以上的t型钙通道调节剂和/或其一种以上的代谢物以治疗所述哺乳动物。
[0020]
在一些情况中，可对患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)施用一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)以减轻或消除神经毒性的一种以上的症状。例如，可将一种以上的t型钙通道调节剂施用至如本文所述的哺乳动物以使神经毒性的一种以上的症状的严重程度减轻例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％以上。在一些情况中，神经毒性的症状可为延迟的症状(例如，可在已发展神经毒性后几小时、几天、或几周未被检测到)。可通过本文所述的方法来减轻或消除的神经毒性的症状的实例包括，但不限于，疼痛、无力(例如，肢体无力)、麻木(例如，肢体麻木)、瘙痒、麻痹、瘫痪、嗅觉缺失、上睑下垂、慢性咳嗽、运动功能障碍、记忆丧失、视力丧失、头痛、认知损害、
脑病、痴呆、心境障碍、便秘、性功能障碍、膀胱潴留、和/或出血。
[0021]
可通过施用一种以上的t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物如本文所述治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的任何合适的哺乳动物(例如，人)。在一些情况中，患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物可患有使哺乳动物更容易发展神经毒性的疾病或病症。可如本文所述治疗的患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物的实例包括但不限于，人、非人灵长类动物如猴、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、小鼠和大鼠。在一些情况中，可通过将一种以上的t型钙通道调节剂施用至人来治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的人。
[0022]
可通过施用一种以上的t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物如本文所述来治疗任何合适的神经毒性。神经毒性可影响(例如，可损伤)神经系统的任何合适的部分。在一些情况中，神经毒性可存在于中枢神经系统(cns)中。在一些情况中，神经毒性可存在于周围神经系统(pns)中。在一些情况中，神经毒性可存在于cns和pns二者中。神经毒性可对神经系统引起任何类型的损伤。在一些情况中，神经毒性可包括对神经组织(例如，对一种以上的神经元)的可逆性损伤。例如，神经毒性可改变神经系统的正常活性(例如，可破坏一种以上的神经元的功能)。在一些情况中，神经毒性可包括对神经组织(例如，对一种以上的神经元)的永久性损伤。例如，神经毒性可杀伤或损害一种以上的神经元的功能。在一些情况中，可通过暴露于特定物质来诱导神经毒性。神经毒性的原因包括但不限于，药物疗法(例如，化疗)、放射治疗、暴露于重金属(例如，铅和汞)、糖尿病、病毒感染、神经损伤、遗传性基因病况、暴露于杀虫剂、暴露于溶剂(例如，工业溶剂和清洁溶剂)、暴露于霉菌、食品、食品添加剂、和毒素(例如，天然存在的毒素和人造毒素)。在一些情况中，可通过化疗来诱导神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)。在化疗诱导的神经毒性中，可通过任何化学治疗剂来引起神经毒性。在施用至哺乳动物(例如，人)时可引起神经毒性的化学治疗剂的实例包括但不限于，蛋白酶体抑制剂(例如，btz如chemobort
tm
、和bortecad
tm
)、埃博霉素、长春花生物碱、紫杉烷类、免疫调节药物、蒽环类、环磷酰胺类、和铂系疗法。在化疗诱导的神经毒性中，可对患有任何类型的癌症的哺乳动物(例如，人)施用化疗。在一些情况中，癌症可包括一种以上的实体瘤。在一些情况中，癌症可为血液癌症。在一些情况中，癌症可为原发性癌症、转移性癌症、或复发性癌症。可由可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂治疗的癌症的实例包括但不限于，多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、白血病、消化道癌、肺癌、睾丸癌、卵巢癌、脑癌、子宫癌、前列腺癌、骨癌、乳腺癌、和膀胱癌。在一些情况中，可通过将一种以上的t型钙通道调节剂施用至哺乳动物来治疗患有多发性骨髓瘤(例如，复发性多发性骨髓瘤)和患有化疗诱导的(例如，btz诱导的)神经毒性、或处于发展化疗诱导的神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)。
[0023]
在一些情况中，用于治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)的方法还可包括鉴定所述哺乳动物患有神经毒性或处于发展神经毒性的风险。任何合适的方法可用于鉴定哺乳动物患有神经毒性或处于发展神经毒性的风险。例如，神经学检查(例如，对于肌肉强度、协调、感觉、认知功能如记忆和思考、以及视觉和言语的神经学检查)、神经学成像(例如，磁共振成像(mri))、神经或皮肤活组织检查、和/或肌电图(例如，神经传导速度)可用于鉴定哺乳动物患有神经毒性。例如，在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂(例如，btz)的当前施用、在施
用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂(例如，btz)的预定施用、年龄(例如，老年患者处于较高风险)、病毒感染(例如，疱疹)、吸烟史、副肿瘤抗体、具有降低的肌酸酐清除率的受损的肾功能、现存的神经性症状(例如，由于糖尿病、遗传性神经病变、和/或先前暴露于神经毒素引起)可用于鉴定哺乳动物处于发展神经毒性的风险(例如，容易发展化疗诱导的神经毒性)。
[0024]
一旦鉴定为患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险，可对哺乳动物(例如，人)施用、或指示自我施用一种以上的t型钙通道调节剂。
[0025]
t型钙通道调节剂可以是可抑制t型钙通道的任何分子(例如，小分子、核酸、多肽、或其组合)。t型钙通道也可以是指电压激活的钙3(cav3)通道。在一些情况中，t型钙通道调节剂可为t型钙通道拮抗剂。例如，t型钙通道调节剂可抑制(例如，降低或消除)t型钙通道的(例如，t型钙通道的亚基的)表达。在一些情况中，t型钙通道调节剂可抑制(例如，可降低或消除)t型钙通道的活性(例如，通过结合至t型钙通道、或以其它方式抑制或阻断通道的活性)。如本文所用，术语“cx-8998”也可指cx-8998的cx-8998结构类似物，条件是该结构类似物保持如本文所述的cx-8998的药物功能(例如，剂量依赖性震颤减少、癫痫发作的减少和/或消除、和/或疼痛的减少和/或消除)。类似地，cx-8998的代谢物也可指cx-8998的代谢物的结构类似物，条件是该结构类似物保持如本文所述的cx-8998的代谢物的药物功能。在一些情况中，当t型钙通道调节剂为cx-8998时，可将cx-8998代谢成(例如，将t型钙通道调节剂施用至哺乳动物后由哺乳动物代谢)cx-8998的代谢物中的一种以上的代谢物。cx-8998的化学名称包括但不限于，(r)-2-(4-异丙基苯基)-n-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)乙酰胺和2-(4-异丙基苯基)-n-{1r)-1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基}乙酰胺盐酸盐。本发明的示例性t型钙通道调节剂包括但不限于，cx-8998(也称为mk-8998)、cx-8998的代谢物、cx-5395和cx-6526。在一些情况中，可通过将cx-8998施用至哺乳动物来治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)。cx-8998的化学结构如下文中所示。
[0026][0027]
示例性cx-8998代谢物的化学结构如下文中所示。
[0028][0029][0030]
t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)可为任何合适的形式。在一些情况中，t型钙通道调节剂可为碱形式(例如，化合物的游离碱形式)。在一些情况中，t型钙通道
调节剂可为盐形式(例如，化合物的盐形式)。在t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物为盐的情况中，所述盐可以是任何合适的盐。例如，cx-8998盐可包括由任何合适的酸(例如，盐酸、柠檬酸、氢溴酸、马来酸、磷酸、硫酸、富马酸、和酒石酸)形成的盐。例如，cx-8998可为cx-8998盐酸盐(例如，cx-8998-hcl)。在一些情况中，cx-8998盐可为氘化的。
[0031]
在一些情况中，t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)可为如其它地方所描述的(参见，例如，2019年10月3日提交的标题为“使用(r)-2-(4-异丙基苯基)-n-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)乙酰胺治疗特发性震颤(treating essential tremor using(r)-2-(4-isopropylphenyl)-n-(1-(5-(2,2,2-trifluoroethoxy)pyridin-2-yl)ethyl)acetamide)”的国际专利申请)。
[0032]
在一些情况中，t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)可穿过血脑屏障。例如，cx-8998或其代谢物可穿过血脑屏障(例如，可存在于脑脊髓液(csf)和/或cns中)。在一些情况中，t型钙通道调节剂不可穿过血脑屏障。
[0033]
t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)可为选择性调节剂。本上下文中的“选择性”意味着与其它电压激活的钙通道相比，t型钙通道调节剂在调节t型钙通道方面更有效。例如，与其它类型的钙通道(例如，l型钙通道、p型钙通道、n型钙通道、和r型钙通道)相比，t型钙通道调节剂在调节t型钙通道方面更有效。例如，与其它类型的离子通道靶标(例如，氯化物通道、钾通道、和钠通道)相比，t型钙通道调节剂在调节t型钙通道方面更有效。可使用任何合适的方法确定选择性。例如，可通过将t型钙通道调节剂抑制第1类型的离子通道(例如，t型钙通道)的ic
50
与其抑制第2类型的离子通道(例如，钠通道)的ic
50
相比较来确定选择性。如果抑制第1类型的通道的ic
50
低于抑制第2类型的通道的ic
50
，则可认为t型钙通道调节剂是选择性的。ic
50
比为0.1(以下)表示10倍(以上)的选择性。ic
50
比为0.01(以下)表示100倍(以上)的选择性。ic
50
比为0.001(以下)表示1000倍(以上)的选择性。在一些情况中，与其它类型的离子通道相比，t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物对于t型钙通道可具有2倍以上、10倍以上、100倍以上、或1000倍以上的选择性。例如，与其它离子通道相比，t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物可具有大于100倍的选择性。在一些情况中，t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物可选择性拮抗任何cav3亚型(例如，cav3.1、cav3.2、和/或cav3.3)。在一些情况中，t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物可选择性拮抗所有三种cav3亚型(例如，cav3.1、cav3.2、和cav3.3)。
[0034]
在一些情况中，一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)可配制成组合物(例如，药学上可接受的组合物)，用于施用至患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)。例如，一种以上的t型钙通道调节剂可与一种以上的药学上可接受的载体(添加剂)、赋形剂、和/或稀释剂一起配制。在一些情况中，药学上可接受的载体、赋形剂、和/或稀释剂可以是非天然存在的药学上可接受的载体、赋形剂、和/或稀释剂。在一些情况中，药学上可接受的载体、赋形剂、和/或稀释剂可以是合成的药学上可接受的载体、赋形剂、和/或稀释剂。可用于本文所述的组合物的药学上可接受的载体、赋形剂、和稀释剂的实例包括但不限于，蔗糖、乳糖、淀粉(例如，羟基乙酸淀粉)、纤维素、纤维素衍生物(例如，改性纤维素如微晶纤维素，以及纤维素醚类如羟丙基纤维素(hpc)和纤维素醚羟丙基甲基纤维素(hpmc))、木糖醇、山梨醇、甘露醇、明胶、聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮
(pvp)、聚乙二醇(peg)、交联的聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、羧甲基纤维素、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、和交联的羧甲基纤维素钠(croscarmellose sodium))、钛氧化物、偶氮染料、硅胶、气相二氧化硅、滑石、碳酸镁、植物硬脂、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸、抗氧化剂(例如，维生素a、维生素e、维生素c、棕榈酸视黄酯、和硒)、柠檬酸、柠檬酸钠、对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、凡士林、二甲基亚砜、矿物油、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、水、盐类或电解质类(例如，盐水、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、和锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚丙烯酸酯、蜡、羊毛脂、卵磷脂、和玉米油。
[0035]
含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物可设计成用于对患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)施用的任何类型。例如，含有一种以上的t型钙通道调节剂的组合物可设计成用于对患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物的口服或肠胃外(包括但不限于，皮下、肌内、静脉内、皮内、脑内、鞘膜内、或腹膜内(i.p.)注射)施用。适用于口服施用的组合物包括但不限于，液体、片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、凝胶剂、和颗粒剂。在一些情况中，含有cx-8998或其代谢物的组合物可为立即释放口服剂型。在一些情况中，含有cx-8998或其代谢物的组合物可为受控(例如，延迟和/或持续)释放口服剂型。在一些情况中，含有cx-8998或其代谢物的组合物可以是至少具有设计成用于立即释放的第一组分和设计成用于受控释放的第二组分的口服剂型。适用于肠胃外施用的组合物包括但不限于，水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。
[0036]
可以以任何合适的量(例如，任何合适的剂量)将含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物施用至患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)。例如，本文所述的组合物可配制成将有效量的一种以上的t型钙通道调节剂递送至患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物。有效量可取决于施用途径、受试者的年龄和总体健康状况、赋形剂使用、与其它治疗性治疗共同使用如使用其它药剂的可能性、和治疗医生的判断而变化。含有一种以上的t型钙通道调节剂的组合物的有效量可以是可治疗如本文所述的患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物而不对哺乳动物产生显著毒性(例如，损伤除了神经组织以外的细胞(细胞毒性)、组织、和/或器官(例如，肝毒性))的任何量。例如，cx-8998的有效量可为约10nm至约1000nm(例如，约10nm至约900nm、约10nm至约800nm、约10nm至约700nm、约10nm至约600nm、约10nm至约500nm、约10nm至约400nm、约10nm至约300nm、约10nm至约200nm、约10nm至约100nm、约10nm至约50nm、约50nm至约1000nm、约10nm至约1000nm、约10nm至约1000nm、约100nm至约1000nm、约200nm至约1000nm、约300nm至约1000nm、约400nm至约1000nm、约500nm至约1000nm、约600nm至约1000nm、约700nm至约1000nm、约800nm至约1000nm、约900nm至约1000nm、约100nm至约900nm、约200nm至约800nm、约300nm至约700nm、约400nm至约600nm、约100nm至约300nm、约300nm至约500nm、约500nm至约700nm、或约700nm至约900nm)。在一些情况中，cx-8998的有效量可为约10nm、约30nm、约100nm、约300nm、或约1000nm。例如，cx-8998的有效量可为约10微克每kg要治疗的哺乳动物的体重(μg/kg)至约1000μg/kg每天(例如，
约10μg/kg至约900μg/kg、约10μg/kg至约800μg/kg、约10μg/kg至约700μg/kg、约10μg/kg至约600μg/kg、约10μg/kg至约500μg/kg、约10μg/kg至约400μg/kg、约10μg/kg至约300μg/kg、约10μg/kg至约200μg/kg、约10μg/kg至约100μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约1000μg/kg、约100μg/kg至约1000μg/kg、约200μg/kg至约1000μg/kg、约300μg/kg至约1000μg/kg、约400μg/kg至约1000μg/kg、约500μg/kg至约1000μg/kg、约600μg/kg至约1000μg/kg、约700μg/kg至约1000μg/kg、约800μg/kg至约1000μg/kg、约900μg/kg至约1000μg/kg、约50μg/kg至约900μg/kg、约75μg/kg至约800μg/kg、约100μg/kg至约600μg/kg、约200μg/kg至约700μg/kg、约300μg/kg至约600μg/kg、约400μg/kg至约500μg/kg、约100μg/kg至约200μg/kg、约200μg/kg至约300μg/kg、约300μg/kg至约400μg/kg、约400μg/kg至约500μg/kg、约500μg/kg至约600μg/kg、约600μg/kg至约700μg/kg、约700μg/kg至约800μg/kg、或约800μg/kg至约900μg/kg体重每天)。在一些情况中，cx-8998的有效量可为约100μg/kg、约300μg/kg、或约600μg/kg每天。根据哺乳动物对治疗的应答，有效量可保持恒定、或者可调整为按比例增减或可变剂量。各种因素可影响用于特定用途的实际有效量。例如，施用频率、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、施用途径、和/或要治疗的哺乳动物中神经毒性的严重程度可需要增加或减少施用的实际有效量。
[0037]
可以以任何合适的频率将含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物施用至患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)。施用频率可以是可治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物而不对哺乳动物产生显著毒性(例如，损伤除了神经组织以外的细胞(细胞毒性)、组织、和/或器官(例如，肝毒性))的任何频率。例如，施用频率可以是约每天几次(例如，bid)至约一天一次、约一天一次至约一周一次、约一周一次至约一月一次、或约一月两次至约一月一次。施用频率可保持恒定或可在治疗期间变化。与有效量同样的，各种因素可影响用于特定用途的实际施用频率。例如，有效量、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、和/或施用途径可需要增加或减少施用频率。
[0038]
可将含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物施用至患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)持续任何合适的持续时间。用于施用或使用含有一种以上的t型钙通道调节剂的组合物的有效持续时间可以是可治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物而不对哺乳动物产生显著毒性(例如，损伤除了神经组织以外的细胞(细胞毒性)、组织、和/或器官(例如，肝毒性))的任何持续时间。例如，有效持续时间可从几天至几周、几周至几个月、几个月至几年、或几年至一生而变化。在一些情况中，有效持续时间可在约10年至约一生的持续时间的范围内。多种因素可影响用于特定治疗的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可随着施用频率、有效量、多种治疗剂的使用、和/或施用途径而变化。
[0039]
在一些情况中，含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物可在组合物中包含有效治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)的一种以上的t型钙通道调节剂作为仅有的活性成分(一种以上)。
[0040]
在一些情况中，含有一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂(例如，cx-8998或其代谢物)的组合物可在组合物中包含有效治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)的一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)额外的活性剂(例如治疗剂)。
[0041]
在一些情况中，通过施用一种以上的t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物来如本文所述治疗的患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)也可用一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)额外的治疗剂来治疗。与本文所述的一种以上的t型钙通道调节剂组合使用的治疗剂可以是任何合适的治疗剂。在一些情况中，用于治疗神经毒性的治疗剂可以是可减轻或消除神经毒性的一种以上的症状的药剂。可与本文所述的一种以上的t型钙通道调节剂组合使用以治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物的治疗剂的实例包括但不限于，类固醇(例如，皮质类固醇)，止痛药(例如，扑热息痛，非甾体抗炎药(nsaid)如布洛芬和萘普生，以及阿片类药物如氢可酮、氢吗啡酮、美沙酮、吗啡、和羟考酮)，抗癫痫药，和抗抑郁药(例如，血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)、选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)、三环类、和单胺氧化酶抑制剂(maoi))。在一些情况中，一种以上的额外的治疗剂可与一种以上的t型钙通道调节剂一起施用(例如，在含有一种以上的t型钙通道调节剂和含有一种以上的额外的治疗剂的组合物中)。在一些情况中，一种以上的额外的治疗剂可独立于一种以上的t型钙通道调节剂而施用。当一种以上的额外的治疗剂独立于一种以上的t型钙通道调节剂而施用时，可首先施用一种以上的t型钙通道调节剂，然后施用一种以上的额外的治疗剂，或反之亦然。
[0042]
在一些情况中，如本文所述的用于治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)的方法(例如，通过施用一种以上的t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物)也可包括对哺乳动物进行有效治疗神经毒性的一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)额外治疗(例如，治疗性干预)以治疗哺乳动物。如本文所述可用于治疗患有神经毒性、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物的额外治疗的实例包括但不限于，氧疗法(例如，高压氧疗法)、职业疗法、物理疗法、手术、和冥想。在一些情况中，可以在施用一种以上的t型钙通道调节剂的同时进行有效治疗神经毒性的一种以上症状的一种以上的额外治疗。在一些情况中，可以在施用一种以上的t型钙通道调节剂之前和/或之后进行有效治疗神经毒性的一种以上症状的一种以上的额外治疗。
[0043]
在一些情况中，可对通过施用一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物来如本文所述治疗的患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)施用、或可安排施用一种以上的(例如，一种、两种、三种、四种、五种以上)在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂。可与本文所述的一种以上的t型钙通道调节剂组合使用的、在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂可以是在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的任何合适的化学治疗剂。在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的化学治疗剂的实例包括但不限于，蛋白酶体抑制剂
(例如，btz如chemobort
tm
、和bortecad
tm
)、埃博霉素、长春花生物碱、紫杉烷类、免疫调节剂药物、蒽环类、环磷酰胺类、和铂系疗法。例如，还可对患有癌症和要施用、或安排施用在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂的哺乳动物施用一种以上的t型钙通道调节剂(例如，可与一种以上的t型钙通道调节剂共同治疗)。如本文所用，共同治疗或共同施用可包括在治疗过程期间施用两种以上的治疗剂(例如，一种以上的t型钙通道调节剂和在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂)。在一些情况中，两种以上的治疗剂的共同施用可包括同时或基本上同时施用两种以上的治疗剂。例如，可以在施用当施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂几秒或几分钟(例如，间隔约0分钟至约5分钟)内施用一种以上的t型钙通道调节剂。在一些情况中，在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂可与一种以上的t型钙通道调节剂一起施用(例如，在含有一种以上的t型钙通道调节剂和含有在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂的组合物中)。在一些情况中，在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂可独立于一种以上的t型钙通道调节剂而施用。例如，可在施用当施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂几分钟、几小时、几天、或几周内施用一种以上的t型钙通道调节剂。当在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂独立于一种以上的t型钙通道调节剂而施用时，可首先施用一种以上的t型钙通道调节剂，然后施用在施用至哺乳动物时可引起化疗诱导的神经毒性的一种以上的化学治疗剂(例如，可以预防性地施用一种以上的t型钙通道调节剂)，或反之亦然。
[0044]
在一些情况中，如本文所述用于治疗患有神经毒性(例如，化疗诱导的神经毒性如btz诱导的神经毒性)、或处于发展神经毒性的风险的哺乳动物(例如，人)的方法(例如，通过施用一种以上的t型钙通道调节剂如cx-8998或其代谢物)还可包括监测要治疗的哺乳动物。任何合适的方法可用于监测哺乳动物中神经毒性的严重程度。例如，神经学检查(例如，对于肌肉强度、协调、感觉、认知功能如记忆和思考、以及视觉和言语的神经学检查)、神经学成像(例如，mri)、神经或皮肤活组织检查、和/或肌电图(例如，神经传导速度)可用于监测哺乳动物中神经毒性的严重程度。在一些情况中，本文所述的方法还可包括对如本文所述要治疗的哺乳动物监测其它类型的毒性(例如，损伤除了神经组织以外的细胞(细胞毒性)、组织、和/或器官(例如，肝毒性和肾毒性))。如果存在，可通过在施用已知量的特定组合物之前和之后评估哺乳动物的临床征象和症状来确定毒性水平。注意，施用至哺乳动物的特定组合物的有效量可根据期望的结果以及哺乳动物的应答和毒性水平来调节。
[0045]
将在以下实施例中进一步描述本发明，但以下实施例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
[0046]
实施例
[0047]
实施例1：通过cx-8998逆转硼替佐米诱导的神经毒性
[0048]
本实施例对于干扰硼替佐米(btz)细胞毒性和逆转化疗诱导的周围神经毒性(cipn)评价一种选择性t型钙通道调节剂cx-8998。
[0049]
方法
[0050]
体外研究
[0051]
化学品和药物
[0052]
rpmi(roswell park memorial institute)1640培养基、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、碳酸氢钠和丙酮酸钠购自euroclone spa(pero,italy)。胎牛血清(fbs)购自hyclone laboratories,inc(logan,ut,usa)。所有其它的化学品获得自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。btz获得自lc laboratories(woburn,ma,usa)和cx-8998由cavion,inc.(charlottesville,va,usa)提供。btz(2.6mm)和cx-8998(10mm)溶解于二甲基亚砜(dmso)并在培养基中稀释。
[0053]
人多发性骨髓瘤细胞系
[0054]
mm.1s和u266b1细胞获得自美国典型培养物保藏中心(san giovanni,italy)。所有细胞系用补充有10％fbs、青霉素和链霉素的含有2mm l-谷氨酰胺的rpmi培养基保持在漂浮培养物中。mm.1s细胞培养基补充有1.5g/l碳酸氢钠、10mm hepes和1mm丙酮酸钠。细胞在37℃下、在5％co2和95％空气中生长于用于漂浮细胞的75cm2培养瓶(corning inc.corning,ny,usa)中。
[0055]
体外btz细胞毒性研究
[0056]
磺酰罗丹明b检验(srb)测量btz的细胞生长抑制效果(细胞存活％)。细胞以10000个细胞/孔置于96孔板(eppendorf,milano,italy)中。24小时后，细胞暴露于btz(0.05-250nm)72小时。培养后，btz以用于试验的剂量范围稀释于培养基中。用三氯乙酸将细胞固定1小时。用srb在1％乙酸中的溶液将细胞染色15分钟。通过用1％乙酸洗涤5次来除去未结合的染料。用三(羟甲基)氨基甲烷碱溶液溶解结合的染料，并在540nm处测量内容物的吸光度。生长抑制表示为细胞的dmso对照吸光度的百分比，并在添加药物前校正吸光度。通过用graphpad prism软件(4.0版本,graphpad software,inc.,la jolla,ca,usa)拟合的非线性最小二乘法曲线来计算btz相对于对照的细胞存活％的50％抑制浓度(ic
50
)。
[0057]
体外组合(btz和cx-8998)干扰研究
[0058]
三种人mmc(rpmi 8226、mm.1s、u266b1)暴露于单独的ic
50
浓度的btz或与5种浓度(10、30、100、300、1000nm)的cx-8998的组合72小时。cx-8998的这些浓度(超过2个数量级)是基于先前的细胞培养实验。还进行了用单独的5种浓度的cx-8998和单独的dmso(对照)的培养。通过srb检验来测量3种细胞系各自的生长抑制，并对于各浓度的药物或药物组合相对于对照(对照值为100％)表示为平均值
±
sd％细胞存活。通过非线性最小二乘法来分析各药物或药物组合和对照之间的细胞存活百分比的差异，p《0.05为统计学显著。
[0059]
体内研究
[0060]
体内btz和组合(btz和cx-8998)抗肿瘤(干扰)研究
[0061]
小鼠的护理和饲养符合usda(美国农业部)animal welfare act和start iacuc(机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee))的规定。方案经由start iacuc评审并批准。小鼠单独地居住在plus通风笼(techniplast,west chester,pa,usa)中，并用teklad2919(envigo,somerset,nj,usa)、照射的、19％蛋白、9％脂肪和4％纤维小鼠饲料喂养。小鼠维持在受控环境条件下(22 /-2℃温度，55 /-10％相对湿度和12小时光/暗循环(7a.m.-7p.m.)。
[0062]
south texas accelerated research therapeutics(start)(san antonio,tx,usa)进行本研究。在人骨髓瘤的基于start细胞的异种移植物(start-cbx)无胸腺裸小鼠
(crl:nu(ncr)-foxn1
nu
肿瘤模型中，对btz和btz与cx-8998的组合测试抗肿瘤活性。将rpmi-8226细胞皮下注射(105个细胞)至32只6-12周龄的雌性无胸腺裸小鼠(charles river laboratories,houston,tx,usa)。在肿瘤体积(tv)达到125-250mm3时，开始研究。通过用数显游标卡尺测量可触及肿块来评估tv，并用式宽度2x长度x 0.52以mm3表示。通过平均tv将小鼠分为4组，每组8只动物：肿瘤溶媒对照(每天一次口服0.5％二氯甲烷和1％tween 80，持续18天)，非肿瘤对照(无处理，持续28天)，肿瘤btz(每周两次静脉内注射1mg/kg btz，持续28天)，肿瘤btz和cx-8998(每周两次静脉内注射1mg/kg btz，持续28天，和每天一次口服30mg/kg cx-8998，持续28天)。30mg/kg剂量在临床前安全性研究中为耐受的，并预期导致超过治疗范围的暴露，持续28天。对于溶媒对照小鼠，每周两次收集体重、tv和动物观察结果直至第18天(终止)，对于其它3组的每一组、每周两次收集体重、tv和动物观察结果直至第28天(终止)。在第18天用kruskal-wallis和dunn多重比较检验来分析平均值
±
sd体重和tv，并在第28天用mann whitney检验来分析平均值
±
sd体重和tv，p《0.05为统计学显著。
[0063]
体内btz和组合(btz和cx-8998)cipn-逆转研究
[0064]
对于wistar大鼠的护理和饲养符合米兰比可卡大学(university of milano-bicocca)指南并遵循国家(d.l.n.26/2014)和国际规章和政策(directive 2010/63/eu)。在与干扰研究中的裸小鼠类似的环境条件下，每笼饲养2-3只大鼠。方案(47123/14)由米兰比可卡大学伦理委员会(university of milano-bicocca ethics committee)批准。
[0065]
使用了10-11周龄的wistar雌性大鼠(n＝52)(envigo,correzzano,italy)。研究分为2个阶段，每个阶段4周。在第1阶段，大鼠随机分为2组：第1组通过尾静脉静脉内接受0.2mg/kg的btz(n＝44)、每周三次、持续4周，和第2组(n＝8)为未处理的(对照)。从基线(第1天)至第28天、在第1阶段期间定期测量体重。在第1阶段的基线和结束(第28天)，对尾神经和坐骨神经进行神经传导速度(ncv)、和测量后爪的机械阈值(mt)的动态触觉测量仪测试(dat)。然后，将btz大鼠重新随机分为4组用于下一阶段。在第2阶段，一组(n＝8)保持未处理的(对照)，第二组(n＝8)接受0.2mg/kg的btz、每周三次、持续4周，其余3组(每组n＝12)接受0.2mg/kg的btz(每周3次、持续4周)和每天经口管饲3、10、或30mg/kg的cx-8998(持续4周)的共同治疗。基于先前的临床前研究，cx-8998提供了在预期的治疗范围内和以上的良好耐受暴露范围。从基线(第28天)至第56天(终止)定期测量体重。在基线和第35天和第56天，在全部4组中测量ncv和mt。在第1天、第28天、第35天、和第56天，在施用btz 1小时后，收集血液样品用于蛋白酶体测量。终止时，获得坐骨神经用于β-微管蛋白聚合，并获得皮肤样品用于表皮内神经纤维(ienf)密度和组织病理学。通过mann whitney检验来分析平均值
±
sem体重、平均值
±
sem ncv、平均值
±
sem mt、平均值
±
sem ienf密度、平均值
±
semβ-微管蛋白聚合和平均值
±
sem蛋白酶体抑制之间的差异用于第4周处理周期结束时ctrl和btz组之间的比较，然后用kruskal-wallis和dunn多重比较检验对上述进行分析用于第5周和第8周时间点处所有组之间的比较，p《0.05为统计学显著。
[0066]
cipn-逆转研究的评价方法
[0067]
ncv
[0068]
用肌电图仪(myto 2,abn neuro,firenze,italy)从尾神经和坐骨神经获得ncv(米/秒)。通过将记录针状电极置于尾部远端并将刺激针状电极置于靠近记录点5cm和10cm来测量尾ncv。确定在神经刺激后在2个部位记录的电位的峰潜伏期并计算ncv。通过将针状
记录电极置于靠近踝骨并将刺激电极置于靠近大腿来测量坐骨ncv。与尾神经类似地记录峰潜伏期并计算ncv。在温度受控设施中(22
±
2℃)、在标准条件下进行ncv，大鼠处于异氟烷麻醉状态，同时监测生命体征。
[0069]
dat
[0070]
用dat设备(型号37450,ugo basile biological instruments,comerio,italy)来评估mt。在适应环境后，将伺服控制的尖端金属丝(0.5mm直径)置于后爪的足底表面上并在20秒内施加渐进点状压力直至50克。记录引发了自发性后爪退缩反应的压力并代表mt指数。在3次中每2分钟在每侧交替收集mt以产生平均值。平均mt值表示各大鼠耐受的最大压力(克)。各动物对于机械刺激的暴露限于30秒。
[0071]
蛋白酶体抑制检验
[0072]
用ficoll-hypaque密度分离来分离外周血单核细胞(pbmc)。将细胞添加至裂解液(水中50mm hepes、5mm edta、150mm nacl和1％triton-x100)并提取。在4℃下以13500rpm将裂解物离心15分钟。将蛋白提取物溶解于无蛋白酶和磷酸盐抑制剂的裂解缓冲液(10％甘油、25mm tris-hcl ph 7.5、1％triton x-100、5mm edta ph 8和1mm egta ph 8)中，并在4℃下以14000rpm离心10分钟。用蛋白检验试剂盒(pierce,thermo scientific,rockford,il,usa)通过bradford检验来评估蛋白浓度。荧光检验评价蛋白酶体活性，并用n-琥珀酰-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素底物(sigma aldrich,milano,italy)将蛋白提取物温育2小时。蛋白酶体活性检测为从试剂中裂解的底物产生的相对光单位。用荧光计(wallac 1420多标记计数器，perkin elmer italia spa,monza,italy)评估来自各反应的荧光(f)。蛋白酶体活性(pa)计算为％pa＝(f btz-f底物)/(f对照-f底物)和抑制表示为100x(1-pa)。
[0073]
组织样品收集
[0074]
在第56天，通过co2吸入来使动物安乐死，每组从4只大鼠获得组织样品。将右坐骨神经冷冻于液氮中用于β-微管蛋白聚合检验，并收集足底无毛皮肤样品用于ienf密度。
[0075]
β-微管蛋白聚合检验
[0076]
除了裂解缓冲液包含新鲜添加的蛋白酶和磷酸盐抑制剂(10mm原钒酸钠、4mm苯基甲基磺酰氟化物、1％抑肽酶和20mm焦磷酸钠)以外，与蛋白酶体检验类似地处理来自坐骨神经的蛋白提取物。将蛋白提取物离心(4℃下14000rpm 10分钟)以从聚合(p)部分分离可溶性(s)游离微管蛋白部分。收集上清液并通过超声处理20秒来将聚合的微管蛋白的丸粒重悬浮于补充有0.5％脱氧胆酸钠(相当于s部分)的一定体积的裂解缓冲液中。将蛋白等分试样(10μg)置于13％sds-page上，电泳后转移至硝酸纤维素滤膜。使用小鼠抗β-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。在用一抗温育后，洗涤膜并且用缀合至山羊抗兔igg的辣根过氧化物酶(perkin elmer italia spa,monza,italy)温育。ecl化学发光系统(amersham ge healthcare europe gmbh,milano,italy)用于检测。用gel logic 100图像系统(eastman kodak,rochester,ny,usa)将谱带强度定量。从一式三份的实验获得最终平均值，数据表示为与对照相比，处理的大鼠中p/p s的百分比。
[0077]
ienf密度
[0078]
在4℃下在2％plp(多聚甲醛-赖氨酸-高碘酸钠)中将来自后爪的足底无毛皮肤样品(5mm)固定24小时，并冷冻保存过夜。用低温恒温器连续切割样品以产生20μm切片。随机
选择来自各足垫的3个切片，使用自由漂浮方案、用组合有生物素化抗兔igg和vector sg底物试剂盒过氧化物酶(vector laboratories,burlingame,ca)的兔多克隆抗蛋白基因产物9.5(pgp 9.5；genetex,irvine,ca,usa)免疫染色。在具有显微镜摄像机的高放大倍率的光学显微镜下，不知情的观察者计数各切片中免疫阳性的ienf的总数。对穿过真皮-表皮界面的单个纤维进行计数。排除了表皮内的次级分支。测量表皮的长度以产生如其它地方所描述的ienf/毫米的线密度(canta等,2016neurobiol aging 45:136-148)。
[0079]
结果
[0080]
体外btz细胞毒性研究和体外组合(btz和cx-8998)细胞毒性干扰研究
[0081]
btz在3种mcl中导致浓度依赖性细胞生长抑制(细胞毒性)。对于mm.1s、rpmi 8226和u266b1细胞系，ic
50 btz值分别为6
±
0.5nm、4
±
1.7nm和2.5
±
0.6nm。
[0082]
与dmso对照相比，单独的btz(对于mm.1s、rpmi 8226和u266b1细胞系，ic
50
浓度分别为6、4和2.5nm)显著降低(p《0.001)3种mcl的细胞存活百分比(图1a)。与dmso对照相比，cx-8998(10-1000nm)和btz的组合显著降低(p《0.001)3种mcl的细胞存活百分比，并且与单独的btz相比显示类似的降低(图1a)。单独的cx-8998(所有浓度)在任何mcl中均没有降低细胞存活百分比，并且与dmso对照相比显示类似的细胞存活水平(图1a)。
[0083]
体内组合(btz和cx-8998)抗肿瘤干扰研究
[0084]
在携带rpmi-8229人mcl异种移植物的裸小鼠中评价cx-8998对btz体内抗肿瘤活性的影响。从基线(第0天)至第18天，体重增加百分比在溶媒对照组中是明显的(与肿瘤异种移植物生长一致)，并且在非肿瘤对照组中为较小程度的(正常动物生长)(图1b)。用单独的1mg/kg btz或与30mg/kg cx-8998的组合的治疗在前两周的治疗期间导致瞬时体重下降，并且在第18天和第28天无体重增加，与btz在该模型中的已知的抗肿瘤效果和耐受性特征一致(图1b)。
[0085]
在第18天，与溶媒对照小鼠相比，单独的btz和与cx-8998的组合二者使tv显著地降低(分别地，p《0.001和p《0.05)(图1c)。在用单独的btz治疗的小鼠中，从第18天至第28天，tv趋于增加，然而与cx-8998的组合趋于降低tv，并且两组之间的差异在终止时达到统计学显著(p《0.01)(图1c)。总体来说，体外细胞存活数据和体内tv和体重增加数据为收敛的，并且支持cx-8998对btz的抗肿瘤活性和耐受性没有干扰。
[0086]
体内组合(btz和cx-8998)cipn-逆转研究
[0087]
使用2阶段研究设计，在btz诱导的神经毒性的大鼠模型中，评价cx-8998对cipn的逆转的效果。在第1阶段结束时(第4周)，雌性wistar大鼠的btz和对照组之间的平均值
±
sem体重(克)中无统计学显著差异。在重新随机化和额外的治疗1或4周(分别为第5周和第8周)后，在btz、btz与3、10、和30mg/kg的cx-8998的组合和对照组中，体重变化无显著差异。用单独的btz和与cx-8998的组合的治疗为良好耐受的。在两只动物中观察到死亡，在btz与3mg/kg cx-8998和10mg/kg cx-8998的组合中各有一只。
[0088]
与基线相比，在第4周，btz治疗导致循环pbmc中平均值
±
sem％蛋白酶体活性的显著抑制(p《0.05)(图1d)。在第5周和第8周，btz和btz与cx-8998的所有组合类似地抑制蛋白酶体活性(图1d)。与体外和体内mcl研究一致，这些数据表明cx-8998的共同施用不干扰btz的抗蛋白酶体活性。
[0089]
cx-8998对生理和行为端点的影响
[0090]
降低的ncv和机械性痛觉超敏是大鼠中btz诱导的神经毒性的特征(cavaletti等,2007exp neurol 204:317-325；和meregalli等,2010ejp14:343-350)。在基线处(第1天)，对照组和单独的btz组之间，尾神经(图2)和坐骨神经(图3)的平均值
±
sem ncv(米/秒)为类似的。在所有治疗后时间点，与对照相比，对于尾神经在第4、5和8周(分别为p《0.01、p《0.05、p《0.001)(图2)和对于坐骨神经在第4和8周(分别为p《0.01、p《0.05)(图3)，btz治疗使尾和坐骨ncv显著降低。在第5周，坐骨神经的ncv数值上小于对照，但差异不为统计学显著的(表1)。坐骨神经ncv值的总体变异性越大，第5周时每组的动物数量越小和/或btz在第5周相对于第8周对降低ncv的绝对效果越低，会导致缺少统计学显著性。
[0091]
在第8周时，与单独的btz相比，10和30mg/kg cx-8998与btz的组合显著增加(分别为p《0.01、p《0.001)尾神经的ncv(图2)。在第8周时，与单独的btz相比，在与10mg/kg和30mg/kg cx-8998的组合组中，坐骨神经的ncv显著增加(p《0.05)(图3)。在第5周时，与单独的btz相比，组合组中尾神经或坐骨神经的ncv无显著性差异(图2、3，表1)。在第5周时，与单独的btz相比，在与btz的所有组合中，尾神经显示趋向于增加的ncv的数值趋势(表1)。相反地，与单独的btz相比，在坐骨神经中、在第5周时、在所有组合剂量组中观察到趋向于降低的ncv的数值趋势(表1)。除了上述因素以外，短的cx-8998治疗持续时间会导致在第5周时间点观察到的显著治疗效果的缺乏。
[0092]
在基线(第1天)时，后爪的平均值
±
sem mt(克)在对照组和单独的btz组之间是相当的(图4)。在第4周时，与对照大鼠相比，btz使mt显著降低(p《0.0001)，表明机械性痛觉超敏的发展(图4)。在第5周和第8周时，与单独的btz相比，用btz与3和30mg/kg cx-8998的组合治疗的大鼠显示增加mt的趋势(机械性痛觉超敏减少)，但差异不为统计学显著的(图4，表1)。
[0093]
cx-8998对组织评估的效果
[0094]
降低的ienf密度和升高的β-微管蛋白聚合是与btz诱导的神经毒性相关的组织异常(cavaletti等,2007exp neurol 204:317-325；和meregalli等,2010ejp 14:343-350)。
[0095]
与对照相比，单独的btz以及btz与3和10mg/kg cx-8998的组合使平均值
±
semβ-微管蛋白聚合(％)显著增加(p《0.05)(图5a)。在第8周时，与单独的btz相比，当btz与30mg/kg cx-8998组合时，该增加趋于逆转、但没有达到统计学显著(图5a，表1)。
[0096]
与对照相比，单独的btz使大鼠后爪组织样品中的平均值
±
sem ienf密度(每毫米的纤维数量)显著降低(p《0.001)(图5b)，这与受损的ncv一致。在第8周，与30mg/kg cx-8998的共同施用显著逆转btz诱导的ienf密度的降低(p《0.05)(图5b)。在第8周时，与btz相比，btz和3mg/kg cx-8998的组合显示趋于逆转的趋势、但没有达到统计学显著，并且与btz相比，在与10mg/kg cx-8998共同施用的情况下未观察到逆转(图5b，表1)。
[0097]
后爪的足底无毛皮肤中神经纤维的定性光学显微镜分析表明，与单独的btz、以及btz与3mg/kg剂量的cx-8998的组合相比，btz和30mg/kg cx-8998的组合有明显更多的神经纤维(箭头)(图5c)。这些定性神经纤维观察结果与ienf密度数据一致。
[0098]
表1.体内研究的终点的治疗组比较和统计学分析
[0099][0100][0101]
[0102][0103][0104][0105]
[0106][0107][0108]
[0109][0110][0111]
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[0115][0116]
综合这些结果表明，cx-8998可用于逆转cipn模型中的神经毒性而不影响btz细胞毒性。
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其它实施方案
[0118]
应理解，尽管已结合本发明的详细说明描述了本发明，但前述描述旨在进行说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求书的范围内。