HIF-2α的抑制剂的制作方法

hif-2
α
的抑制剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2019年12月4日提交的美国临时申请no.62/943,632的优先权权益，其在此通过引用整体并入以用于所有目的。
3.发明背景
4.缺氧可诱导因子(hif)转录因子在细胞对低氧可用性的响应中起着不可或缺的作用。[immunity.2014年10月16日；41(4):518
–
528.]hif是异二聚体转录因子，由称为芳基烃受体核转位子(arnt或hif-β)的共同组成亚基和三个hif-α亚基之一组成。[j.med.chem.2015,58,5930-5941.]在正常情况下，α-亚基在保守脯氨酸残基上被脯氨酰基-4-羟化酶(phd)羟基化，并且随后被希佩尔林道(von hippel-lindau，pvhl)泛素e3连接酶复合物进行靶向降解。[cancer res 2006；66(12):6264-70]然而，在缺氧条件下，hif-α积累并进入细胞核以激活调控代谢、血管生成、细胞增殖和存活、免疫逃避和炎性响应的基因的表达。[j.med.chem.2018,61,9691-9721.]
[0005]
在三种不同的α-亚基同种型中，hif-1α、hif-2α和特征较少的hif-3α、hif-1α和hif-2α过表达与患有各种癌症的患者的不良临床结果相关联。具体而言，已发现hif-2α是胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、头颈部鳞状癌和非小细胞肺癌中的不良预后的标志物。缺氧在许多急性和慢性炎性病症(诸如炎性肠病和类风湿性关节炎)中也很普遍。[j.clin invest.2016；126(10):3661-3671.]
[0006]
鉴于hif-2α在癌症、炎症和其他病症中的重要作用，本领域需要hif-2α抑制剂。本发明解决了这种需要并且还提供了相关的优点。
发明概要
[0007]
本发明涉及抑制低氧可诱导因子(hif)转录因子家族，特别是hif-2α的活性的化合物。该化合物由式(i)：
[0008][0009]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示，其中x1、x2、x3、y、y1、y2、y3、r4和虚线键具有下文定义的含义。
[0010]
在相关方面，本文提供了用于治疗受试者(如，人)中由hif-2α介导的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的hif-2α抑制剂。由hif-2α介导的疾病和病症包括癌症、炎症、自身免疫病症和代谢病症，如下文所述。可以通过调节hif-2α活性全部或部分治疗或预防的其他疾病、病症和疾患是本文提供的hif-2α抑制剂化合物的候选适应症。
[0011]
本文还提供了所描述的hif-2α抑制剂与一种或多种如下文所描述的额外的剂组合的用途。
[0012]
发明详述
[0013]
在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于本文阐述的特定实施方案，并且还应理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，并且不旨在进行限制。
[0014]
在提供数值范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间达下限十分之一单位(除非上下文另有明确规定)的每个中间值和在所陈述范围内的任何其他陈述值或中间值都涵盖在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且还涵盖在本发明内，受所陈述范围内的任何明确排除限值的限制。当所陈述范围包括限值中的一个或两个时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包含于本发明中。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0015]
如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。进一步应注意权利要求书可被起草成排除任何任选的的要素。因此，本声明旨在用作此类与权利要求要素的列举有关的排他性术语(诸如“唯一”、“仅”等)的使用，或“否定”限制的使用的先行基础。
[0016]
提供本文所讨论的出版物仅是因为它们在本技术的提交日期之前公开。此外，提供的公开日期可能与实际公开日期不同，这可能需要独立确认。
[0017]
定义
[0018]
除非另有说明，否则以下术语旨在具有下面阐述的含义。其他术语在整个说明书的其他地方被定义。
[0019]
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指直链或具支链烃基团，其具有指示的碳原子数(即，c
1-8
意指一至八个碳)。烷基可以包括任何数目的碳，诸如c
1-2
、c
1-3
、c
1-4
、c
1-5
、c
1-6
、c
1-7
、c
1-8
、c
1-9
、c
1-10
、c
2-3
、c
2-4
、c
2-5
、c
2-6
、c
3-4
、c
3-5
、c
3-6
、c
4-5
、c
4-6
和c
5-6
。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。
[0020]
术语“亚烷基”是指直链或具支链的饱和脂肪族基团，其具有指示的碳原子数并且连接至少两个其他基团，即，二价烃基团。连接至亚烷基的两个部分可以与该亚烷基基团的同一原子或不同原子连接。例如，直链亚烷基可以是-(ch2)
n-的二价基团，其中n为1、2、3、4、5或6。代表性亚烷基基团包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。在一些实施方案中，亚烷基基团可以是取代的或未取代的。当包含亚烷基的基团被任选取代时，应理解任选的取代可在该部分的亚烷基部分上。
[0021]
术语“环烷基”是指烃环，其具有指示数目的环原子(如，c
3-6
环烷基)并且是完全饱和的或在环顶点之间具有不超过一个双键。“环烷基”还意在指代双环和多环烃环，诸如例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷等。在一些实施方案中，本公开的环烷基化合物为单环c
3-6
环烷基部分。
[0022]
术语“杂环烷基”是指环烷基环，其具有指示数目的环顶点(或成员)并具有一至五个选自n、0和s的杂原子，该杂原子替代一至五个碳顶点并且其中氮和硫原子被任选地氧化并且(一个或多个)氮原子被任选地季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环的环体系，并且可以具有一个或两个连接环顶点的双键。杂环烷基基团的非限制性实例包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑啉酮、乙内酰脲、二噁茂烷、邻苯二甲酰亚胺、哌啶、
1,4-二噁烷、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-s-氧化物、硫代吗啉-s,s-氧化物、哌嗪、吡喃、吡啶酮、3-吡咯啉、噻喃、吡喃酮、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基基团可以通过环碳或杂原子附接至分子的其余部分。
[0023]
如本文所用，与本文描绘的任何化学结构中的单键、双键或三键相交的波浪线表示单键、双键或三键与分子的其余部分的点附接。此外，延伸到环(如苯基环)的中心的键意在指示在任何可用的环顶点处的附接。本领域技术人员将理解，被示出为附接到环的多个取代基将占据提供稳定化合物的环顶点并且在其他方面是空间上相容的。对于二价组分，表达示(representation)意味着包括任一取向(正向或反向)。例如，基团
“–
c(o)nh
‑“
意在包括任一取向的键联：-c(o)nh-或
–
nhc(o)-，并且类似地，
“‑
o-ch2ch2‑“
意在包括-o-ch2ch
2-和-ch2ch
2-o-两者。
[0024]
除非另有说明，否则术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语"c
1-4
卤代烷基”意在包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0025]
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和的、通常为芳族的烃基团，其可以是稠合在一起或共价连接的单环或多环(最多三个环)。芳基基团的非限制性实例包括苯基、萘基和联苯基。该术语还意在包括稠合环烷基苯基和杂环烷基苯基环体系，诸如例如茚满、四氢萘、色烷和异色烷环。作为取代基基团，对于稠环体系，与分子其余部分的附接点可以是通过芳族部分上的碳原子、环烷基部分上的碳原子或杂环烷基部分上的原子。
[0026]
术语“杂芳基”是指含有一至五个选自n、o和s的杂原子的芳基基团(或环)，其中氮和硫原子被任选地氧化，并且一个或多个氮原子被任选地季铵化。杂芳基基团可通过杂原子附接至分子的其余部分。杂芳基基团的非限制性实例包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基、苯并三嗪基、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、吲哚嗪基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基(benzothiaxolyl)、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等。杂芳基环的取代基可选自下面描述的可接受的取代基的组。
[0027]
上述术语(如，“烷基”、“芳基”和“杂芳基”)在一些实施方案中将任选地被取代。下面提供了每种类型基团的选定取代基。
[0028]
烷基基团(包括常常称为亚烷基、烯基和炔基的那些基团)的任选取代基可以是选自以下的多种基团：卤素、-or’、-nr’r”、-sr’、-sir’r”r
”’
、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr
’‑
c(o)nr”r
”’
、-nr”c(o)2r’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nr’s(o)2r”、-cn(氰基)、-no2、芳基、芳氧基、氧代基、环烷基和杂环烷基,数量范围为从零到(2m’ 1),其中m'是此类基团中的碳原子的总数目。r’、r”和r
”’
各自独立地是指氢、未取代的c
1-8
烷基、未取代的芳基、被1-3个卤素取代的芳基、c
1-8
烷氧基或c
1-8
硫代烷氧基基团，或未取代的芳基-c
1-4
烷基基团。当r'和r”附接到同一个氮原子时，它们可以与氮原子组合形成3-、4-、5-、6-或7-元环。例如，-nr'r”意在包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。
[0029]
环烷基和杂环烷基基团的任选取代基可以是选自以下的多种基团：任选地被c(o)
or'取代的烷基、卤素、-or’、-nr’r”、-sr’、-sir’r”r
”’
、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr
’‑
c(o)nr”r
”’
、-nr”c(o)2r’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nr’s(o)2r”、-cn(氰基)、-no2、芳基、芳氧基和氧代基。r'、r”和r”'各自独立地指代氢、未取代的c
1-8
烷基、未取代的芳基、被1-3个卤素取代的芳基、c
1-8
烷氧基或c
1-8
硫代烷氧基，或未取代的芳基-c
1-4
烷基基团。
[0030]
类似地，芳基和杂芳基基团的任选取代基是变化的并且通常选自：-卤素、-or'、-oc(o)r'、-nr'r"、-sr'、-r’、-cn、-no2、-co2r’、-conr’r”、-c(o)r’、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr”c(o)2r’、-nr
’‑
c(o)nr”r
”’
、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nr’s(o)2r”、-n3、全氟(c
1-4
)烷氧基和全氟(c
1-4
)烷基，数量范围为从零到芳环体系上的开放化学价的总数；其中r'、r”和r”'独立地选自氢、c
1-8
烷基、c
1-8
卤代烷基、c
3-6
环烷基、c
2-8
烯基和c
2-8
炔基。其他合适的取代基包括通过1-6个碳原子的亚烷基栓链附接至环原子的以上芳基取代基中的每一种。
[0031]
芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-t-c(o)-(ch2)
q-u-的取代基替代，其中t和u独立地为-nh-、-o-、-ch
2-或单键，并且q是0至2的整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被式-a-(crfrg)
r-b-的取代基替代，其中a和b独立地为-ch
2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)
2-、-s(o)2nr
’‑
或单键，r为1至3的整数，并且rf和rg各自独立地为h或卤素。如此形成的新环的单键中的一个可任选地被双键代替。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被式-(ch2)
s-x-(ch2)
t-的取代基替代，其中s和t独立地为0至3的整数，并且x为-o-、-nr
’‑
、-s-、-s(o)-、-s(o)
2-或-s(o)2nr
’‑
。-nr
’‑
和-s(o)2nr
’‑
中的取代基r'选自氢或未取代的c
1-6
烷基。
[0032]
如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(o)、氮(n)、硫(s)和硅(si)。
[0033]
术语“药学上可接受的盐”意在包括根据在本文描述的化合物上发现的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性官能团时，可通过使此类化合物的中性形式与足量的所需碱无溶剂地(neat)接触或在合适的惰性溶剂中接触来获得碱加成盐。源自药学上可接受的无机碱的盐的实例包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、三价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等。源自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺(包括取代的胺、环状胺、天然存在的胺等，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n
’‑
二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海巴胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等)的盐。当本发明的化合物含有相对碱性官能团时，可通过使所述化合物的中性形式与足量的期望酸无溶剂地接触或在合适的惰性溶剂中接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括源自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的那些，以及源自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸诸如精氨酸等的盐，以及有机酸诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见，例如，berge,s.m.,等人,“pharmaceutical salts”,journal of pharmaceutical science,1977,66,1-19)。本发明
的某些特定化合物同时含有碱性和酸性官能团，所述官能团允许所述化合物转化成碱加成盐或酸加成盐。
[0034]
化合物的中性形式可以通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。所述化合物的母体形式在某些物理特性(诸如在极性溶剂中的溶解度)上不同于各种盐形式，但是出于本发明目的在其他方面盐等同于所述化合物的母体形式。
[0035]
除了盐形式之外，本发明还提供了呈前药形式的化合物。本文所述化合物的前药为在生理条件下容易经历化学变化以提供本发明的化合物的那些化合物。另外，前药在离体环境中可通过化学或生物化学方法转化为本发明的化合物。例如，当放置在具有合适的酶或化学试剂的经皮贴剂贮库中时，前药可缓慢地转化为本发明的化合物。
[0036]
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及包括水合形式在内的溶剂化形式存在。一般来说，溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且旨在涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶型或无定形的形式存在。一般来说，所有物理形式对于本发明所涵盖的用途而言都是等同的并且旨在落入本发明的范围内。
[0037]
本发明的某些化合物可以在特定条件下作为多晶型物存在。多晶型是指固体材料以多于一种的晶体结构形式或相存在的能力，其中晶格中的分子具有不同的排列或构象。如果由于堆积而存在这种类型的差异，则将它称为“堆积多晶型”，而如果由于构象差异而存在，则将它称为“构象多晶型”。同一化合物的不同多晶型物往往表现出不同的物理性质，包括堆积性质、光谱性质、热力学性质、溶解度和熔点等；动力学特性，诸如溶解速率和稳定性；和机械性质，诸如硬度和抗拉强度。
[0038]
多晶型物可以根据它们在不同温度和压力范围内的稳定性被分类为两种类型中的一种。在单变性(monotropic)系统中，只有一种多晶型物(即单变型(monotrope))是稳定的，并且它在低于熔点的所有温度和压力下都表现出较低的自由能含量和溶解度。在互变性(enantiotropic)系统中，一种多晶型物在一定的温度和压力下是稳定的，而另一种或多种多晶型物在不同的温度和压力下是稳定的。
[0039]
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(如，单独的对映异构体)都意在包括在本发明的范围内。
[0040]
本发明的化合物还可以在构成此类化合物的原子中的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。同位素的非天然比例可以被定义为范围为从自然界中发现的量到由100％所讨论的原子组成的量。例如，所述化合物可以掺有放射性同位素，诸如例如氚(3h)、碘-125(
125
i)或碳-14(
14
c)，或非放射性同位素，诸如氘(2h))或碳-13(
13
c)。此类同位素变化可以为本技术中其他地方描述的效用提供额外的效用。例如，本发明的化合物的同位素变体可以具有额外的效用，包括但不限于作为诊断剂和/或成像剂，或作为细胞毒性/放射性毒性治疗剂。此外，本发明的化合物的同位素变体可具有改变的药代动力学和药效学特征，这可有助于提高治疗期间的安全性、耐受性或功效。本发明的化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，都旨在涵盖在本发明的范围内。
[0041]
术语“患者”或“受试者”可互换使用以指代人类或非人类动物(如，哺乳动物)。
[0042]
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等，当它们应用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指例如hif-2α抑制剂、包含hif-2α抑制剂的药物组合
物，或诊断剂与受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。在细胞的背景下，施用包括试剂与细胞的接触(如，体外或离体)，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与所述细胞接触。
[0043]
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指在疾病、病症或疾患或其症状已被诊断出、观察到等之后启动的一连串动作(诸如施用hif-2α的抑制剂或包含hif-2α的抑制剂的药物组合物)，以暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰受试者的疾病、病症或疾患的潜在原因中的至少一种，或者与困扰受试者的疾病、病症、疾患相关的症状中的至少一种。因此，治疗包括抑制(如，遏制疾病、病症或疾患或与其相关的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。
[0044]
如本文所用的术语“需要治疗”是指由医生或其他护理人员做出的受试者需要治疗或将从治疗中受益的判断。该判断是基于医生或护理人员的专业知识范围内的各种因素做出的。
[0045]
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等是指通常在受试者易患特定疾病、病症或疾患的背景下以某种方式(如，在疾病、病症、疾患或其症状发作之前)启动的一连串动作(诸如施用hif-2α抑制剂或包含hif-2α抑制剂的药物组合物)，以暂时或永久地预防、压制、抑制或降低受试者患上疾病、病症、疾患等的风险(如通过例如没有临床症状所确定的)或延迟其发作。在某些情况下，该术语还指代减缓疾病、病症或疾患的进展或抑制其进展至有害或在其他方面不期望的状态。
[0046]
如本文所用的术语“需要预防”是指由医生或其他护理人员做出的受试者需要或将受益于预防性护理的判断。该判断是根据医生或护理人员专业知识范围内的各种因素做出的。
[0047]
短语“治疗有效量”是指剂单独地或作为药物组合物的一部分并且以单剂量或作为一系列剂量的一部分以能够当施用给受试者时对疾病、病症或疾患的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量施用于受试者。治疗有效量可以通过测量相关生理效应来确定，并且它可以结合受试者疾患的给药方案和诊断分析等进行调整。例如，在施用后特定时间时测量hif-2α抑制剂(或如其代谢物)的血清水平可以指示是否已经使用了治疗有效量。
[0048]
短语“以足以实现改变的量”意指在施用特定疗法之前(如，基线水平)和之后测量的指标的水平之间存在可检测的差异。指示物包括任何客观参数(如，血清浓度)或主观参数(如，受试者的幸福感)。
[0049]
术语“小分子”是指具有小于约10kda、小于约2kda或小于约1kda的分子量的化学化合物。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。在治疗上，与大分子相比，小分子可能对细胞更具渗透性，更不易降解，并且不太可能引发免疫响应。
[0050]
术语“抑制剂”和“拮抗剂”或“激活剂”和“激动剂”分别是指例如用于激活例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的抑制性或激活分子。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟激活、灭活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。激活剂是增加、激活、促进、增强激活、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂也可以被定义为降低、阻断或灭活组成型活性的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促进
靶标激活增加的分子。“拮抗剂”是对抗激动剂的一种或多种作用的分子。拮抗剂阻止、降低、抑制或中和激动剂的活性，并且拮抗剂还可以阻止、抑制或降低靶标如靶受体的组成型活性，即使在没有鉴定的激动剂的情况下亦可如此。
[0051]
术语“调节(modulate)”、“调节(modulation)”等是指分子(如，激活剂或抑制剂)直接或间接增加或减少hif-2α的功能或活性的能力。调节剂可以单独起作用，或者它可以使用辅因子，如蛋白质、金属离子或小分子。调节剂的实例包括小分子化合物和其他生物有机分子。许多小分子化合物文库(如，组合文库)是可商购获得的并且可以用作为鉴定调节剂的起点。熟练技术人员能够开发这样的一种或多种测定法(如，生物化学测定法或细胞基测定法)，在所述测定中可以筛选此类化合物文库以鉴定一种或多种具有所需特性的化合物；此后，熟练的药物化学家能够通过例如合成和评价其类似物和衍生物来优化此类一种或多种化合物。合成和/或分子建模研究也可用于鉴定激活剂。
[0052]
分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性；对其他分子的活性的调节；等。术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成的活性，对于例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成是必需的活性，或者与例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成特异性相关的活性。
[0053]
如本文所用，“相当的”、“相当的活性”、“与
……
相当的活性”、“相当的效果”、“与
……
相当的效果”等是可以定量和/或定性地看待的相对术语。该术语的含义通常取决于使用它们的上下文。例如，从定性的角度来看，两种均激活受体的剂可以被视为具有相当的效果，但如果一种剂只能达到另一种剂的活性的20％(如在本领域公认的测定法(如，剂量响应测定法)或本领域公认的动物模型中测定的)，那么这两种剂可被视为缺乏相当的效果。当将一个结果与另一个结果(如，一个结果与参考标准)进行比较时，“相当”经常(但不总是)意味着一个结果偏离参考标准小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在特定实施方案中，如果一个结果偏离参考标准小于15％、小于10％或小于5％，则它与参考标准相当。例如但不限于，活性或效果可以是指功效、稳定性、溶解度或免疫原性。
[0054]“基本上纯的”指示组分占组合物总含量的大于约50％，并且通常占总多肽含量的大于约60％。更典型地，“基本上纯的”是指这样的组合物，在所述组合物中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多是感兴趣的组分。在一些情况下，多肽将占组合物的总含量的大于约90％或大于约95％。
[0055]
具有选择性的化合物在某些病症的治疗中可能特别有用，或者可以降低不期望的副作用的可能性。在一个实施方案中，本公开的化合物对其他hif同种型具有选择性。在又一个实施方案中，本公开的化合物对hif信号转导通路中的其他激酶和靶标具有选择性。特定实例包括hif-1α和细胞色素p450酶。可以例如通过比较如本文所述的化合物对hif-2α的抑制与如本文所述的化合物对另一种蛋白质或同种型的抑制来确定选择性。在一个实施方案中，对hif-2α的选择性抑制比对另一种蛋白质或同种型的抑制高至少1000倍、高500倍，或高100倍，或高20倍。
[0056]
例如，细胞、组织、器官或生物体的术语“响应”涵盖生物化学或生理行为，如生物
隔室内的浓度、密度、粘附或迁移，基因表达速率或分化状态的变化，其中该变化与激活、刺激或治疗相关，或与诸如遗传编程的内部机制相关。在某些背景下，术语“激活”、“刺激”等是指如受内部机制以及受外部或环境因素调控的细胞激活；而术语“抑制”、“下调”等是指相反的效果。
[0057]
本发明的化合物
[0058]
在一个特定方面，本文提供了具有式(i)的化合物：
[0059][0060]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中，
[0061]
虚线键是符合为y1、y2和y3提供的基团的单键或双键；
[0062]
x1是cr1或n；
[0063]
x2是cr2或n；
[0064]
x3是cr3或n；
[0065]
y选自由以下组成的组：-o-、-c(ra)(rb)-、-n(ra)-、-c(ra)(rb)-n(ra)-、-s-和
–
s(o)
2-；
[0066]
y1、y2和y3各自独立地选自由cr5、nr6和n组成的组，其中y1、y2和y3中的一者是n，并且y1、y2和y3中的一者是nr6；
[0067]
r1和r2各自是独立地选自由以下组成的组的成员：h、卤素、cn、-no2、c
1-4
烷基、c
1-4
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基；
[0068]
r3是选自由以下组成的组的成员：h、卤素、cn、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、c
1-4
卤代烷氧基、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的5-10元杂芳基；
[0069]
当r1、r2和r3各自存在时，至少一者不是h；
[0070]
r4是选自由以下组成的组的成员：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
3-8
环烷基、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的6元杂芳基；
[0071]
每个r5是选自由以下组成的组的成员：h、
–
no2、-s(o)2ra、-s(o)2nrarb、-s(o)(nh)ra、-c(o)ra、-c(o)nrarb、cn、卤素、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
烷氧基甲基、c
1-8
卤代烷基、c
1-8
羟烷基、-nrarb、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的5-10元杂芳基；
[0072]
每个r6是选自由以下组成的组的成员：h、c
1-8
烷基、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的5-10元杂芳基；
[0073]
其中每个ra和rb独立地选自由以下组成的组：h、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、c
1-8
卤代烷氧基和c
1-8
羟烷基，条件是当与ra和rb所附接的基团组合时，未形成n-氧化物和过氧化物键联；
[0074]
并且对于每个r4、r5和r6，每个c
3-8
环烷基、c
6-10
芳基和杂芳基均未被取代或被一至五个rc取代；
[0075]
其中每个rc独立地选自由以下组成的组：卤素、cn、
–
no2、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、-s(o)2rd、-c(o)nrdre和-p(o)rdre；
[0076]
并且rd和re各自独立地选自由以下组成的组：h、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-8
卤代烷氧基。
[0077]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物是其中y是-o-的化合物。
[0078]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物是其中y是
–
o-；并且y1是cr5的化合物。
[0079]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物是其中y是
–
o-；y1是cr5；并且y2是n的化合物。
[0080]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物是其中y是
–
o-；y1是cr5；y2是n并且y3是nh的化合物。
[0081]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物是其中y是
–
o-；y1是nh；y2是n并且y3是cr5的化合物。
[0082]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物是这样的化合物，其中y1是cr5；y2是n；y3是nh；r3不是h；并且每个r5是选自由以下组成的组的成员：-s(o)2ra、-s(o)2nrarb、-s(o)(nh)ra、-c(o)ra、-c(o)nrarb、cn、卤素、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
烷氧基甲基、c
1-8
卤代烷基、c
1-8
羟烷基、-nrarb、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的5-10元杂芳基。
[0083]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-ai)表示：
[0084][0085]
其中虚线键是符合为y1、y2和y3提供的基团的单键或双键；
[0086]
x1是cr1或n；
[0087]
x2是cr2或n；
[0088]
x3是cr3或n；
[0089]
y选自由以下组成的组：-o-、-c(ra)(rb)-、-n(ra)-和-c(ra)(rb)-n(ra)-；
[0090]
y1、y2和y3各自独立地选自由cr5、nr6和n组成的组，其中y1、y2和y3中的一者是n，并且y1、y2和y3中的一者是nr6；
[0091]
r1和r2各自是独立地选自由h、卤素和cn组成的组的成员；
[0092]
r3是选自由h、卤素、cn、-s(o)2ra和c1卤代烷氧基组成的组的成员；
[0093]
当r1、r2和r3各自存在时，至少一者不是h；
[0094]
r4是选自由c
3-5
环烷基、c6芳基和具有1-3个选自o和n的杂原子的6元杂芳基组成的组的成员，其中c
3-5
环烷基、c6芳基和6元杂芳基中的每一者均被1-3个rc取代或未被取代。
[0095]
每个r5是选自由以下组成的组的成员：h、cn、卤素、c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
烷氧基甲基、c
1-3
卤代烷基，
[0096]
每个r6是选自由h和c
1-3
烷基组成的组的成员；
[0097]
其中每个ra和rb独立地选自由以下组成的组：h、c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
卤代烷基、c
1-3
卤代烷氧基和c
1-3
羟烷基；其中每个rc独立地选自由f、cl、cn、ch3组成的组
[0098]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-b)：
[0099][0100]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0101]
y选自由以下组成的组：键、-o-、-c(ra)(rb)-、-n(ra)-、-c(ra)(rb)-n(ra)-、-s-和
–
s(o)
2-；
[0102]
x1是cr1或n；
[0103]
x2是cr2或n；
[0104]
r1和r2各自是独立地选自由以下组成的组的成员：h、卤素、cn、-no2和c
1-4
卤代烷基；
[0105]
r3是选自由以下组成的组的成员：h、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、cn、卤素、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、c
6-10
芳基和5-10元杂芳基；
[0106]
当r1、r2和r3各自存在时，至少一者不是h；
[0107]
r4是选自由以下组成的组的成员：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
3-8
环烷基、c
6-10
芳基、具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的6元杂芳基；
[0108]
每个r5是选自由以下组成的组的成员：
–
no2、-s(o)2ra、-s(o)2nrarb、-s(o)(nh)ra、-c(o)ra、-c(o)nrarb、cn、卤素、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
烷氧基甲基、c
1-8
卤代烷基、c
1-8
羟烷基、-nrarb、c
6-10
芳基和具有1至4个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子环顶点的5-10元杂芳基；
[0109]
其中每个ra和rb独立地选自由以下组成的组：h、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、c
1-8
卤代烷氧基和c
1-8
羟烷基；
[0110]
并且每个c
3-8
环烷基、c
6-10
芳基和杂芳基均未被取代或被一至五个rc取代；
[0111]
其中每个rc独立地选自由以下组成的组：卤素、cn、
–
no2、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基、-s(o)2rd、-c(o)nrdre和-p(o)rdre；
[0112]
并且rd和re各自独立地选自由以下组成的组：h、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-8
卤代烷氧基。
[0113]
在一些实施方案中，式(i-b)化合物是这样的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，其中r4选自由以下组成的组：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、1,2,4-三嗪基和1,3,5-三嗪基，其中的每一者均未被取代或被1至3个独立选择的rc基团取代。
[0114]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-c)：
[0115][0116]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0117]
a1是n或cr
c3
[0118]
y是-o-或
–
nh-；
[0119]
r3是选自由以下组成的组的成员：卤素、cn、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基，其中ra和rb独立地选自由以下组成的组：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基；
[0120]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0121]rc1
、r
c2
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-4
烷基组成的组。
[0122]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-d)：
[0123][0124]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0125]
a1是n或cr
c3
；
[0126]
y是
–
o-或
–
nh-；
[0127]
r3是选自由以下组成的组的成员：卤素、cn、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基，其中ra选自由以下组成的组：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基；
[0128]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0129]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-4
烷基组成的组；并且
[0130]
其余基团具有为式(i)提供的含义。
[0131]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-e)：
[0132][0133]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0134]
y是
–
o-或
–
nh-；
[0135]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0136]ra1
选自由ch3、chf2和cf3组成的组；并且
[0137]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0138]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-f)：
[0139][0140]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0141]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0142]ra1
选自由ch3、chf2和cf3组成的组；并且
[0143]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0144]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-g)：
[0145][0146]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0147]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0148]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0149]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-h)：
[0150][0151]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0152]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0153]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0154]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-i)：
[0155][0156]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0157]
a1是n或cr
c3
[0158]
y是
–
o-或
–
nh-；
[0159]
r3是选自由以下组成的组的成员：卤素、cn、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基，其中ra和rb独立地选自由以下组成的组：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基；
[0160]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0161]rc1
、r
c2
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-4
烷基组成的组；并且
[0162]
其余基团具有为式(i)提供的含义。
[0163]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-j)：
[0164][0165]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0166]
a1是n或cr
c3
[0167]
y是
–
o-或
–
nh-；
[0168]
r3是选自由以下组成的组的成员：卤素、cn、
–
no2、-s(o)2ra、-c(o)nrarb、-p(o)rarb、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基，其中ra和rb独立地选自由以下组成的组：c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
卤代烷基和c
1-4
卤代烷氧基；
[0169]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；并且
[0170]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-4
烷基组成的组；并且
[0171]
其余基团具有为式(i)提供的含义。
[0172]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-k)：
[0173][0174]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0175]
y是
–
o-或
–
nh-；
[0176]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0177]ra1
选自由ch3、chf2和cf3组成的组；并且
[0178]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0179]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-l)：
[0180][0181]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0182]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；
[0183]ra1
选自由ch3、chf2和cf3组成的组；并且
[0184]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0185]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-m)：
[0186][0187]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0188]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；并且
[0189]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0190]
在一些选定的实施方案中，式(i)的化合物由式(i-n)：
[0191][0192]
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物表示；其中
[0193]
r5选自由h、f、cl、cn、i、cf3和ch2oh组成的组；并且
[0194]rc1
和r
c3
各自独立地选自由h、f、cl、cn、cf3、ocf3和c
1-6
烷基组成的组。
[0195]
在一些选定的实施方案中，提供了表1的任一种化合物。
[0196]
鉴定具有所需特征的hif-2α抑制剂
[0197]
本发明部分地涉及鉴定具有至少一种与治疗相关的性质或特征的hif-2α抑制剂。可以通过使用例如本领域公认的测定法或模型(其实例在本文中有描述)来鉴定候选抑制剂。
[0198]
在鉴定之后，可以通过使用提供关于抑制剂特性的数据(如，药代动力学参数、确定溶解度或稳定性的方式)的技术来进一步评价候选抑制剂。候选抑制剂与参考标准品(其可能是当前抑制剂的“最佳类别”)的比较表明此类候选物具有潜在活力。
[0199]
合成方法
[0200]
制备权利要求的化合物的一般方法
[0201]
对于本发明的任何特定化合物的最有效制备，本领域技术人员将认识到片段连接的时间安排和顺序以及存在于任何片段中的官能团的修饰可以在任何给定的化合物的制备中变化。已经使用多种方法来制备本发明的化合物，其中一些在实施例中有举例说明。
[0202]
前药和其他的药物递送和/或半衰期延长方式
[0203]
在本发明的一些方面，本文所述的化合物以前药形式施用。
[0204]
为了实现治疗活性的延长，药物分子可以被工程改造成利用载体进行递送。此类载体要么以非共价方式使用(其中药物部分通过物理化学方式被配制成溶剂-载体混合物)，要么通过载体试剂与药物部分的官能团之一的永久共价附接(一般参见wo 2015/0202317)使用。
[0205]
几种非共价途径受到青睐。举例来说，但不限于，在某些实施方案中，使用包含包封到聚合物载体中的非共价药物的贮库制剂。在此类制剂中，药物分子与载体材料被组合在一起并被加工成使得药物分子分布在散装载体内。实例包括微粒聚合物-药物聚集体
(如，(如，microspheres(phosphorex,inc.))，其作为可注射混悬液施用；配制为凝胶的聚合物-药物分子聚集体(如，lupron(abbvie in c.))，其作为单次弹丸式注射施用；和脂质体制剂(如，(pa cira pharmaceuticals))，其中载体可以是能够溶解药物的聚合或非聚合实体。在这些制剂中，当载体溶胀或物理变质时，可能会发生药物分子的释放。在其他情况下，化学降解使药物能够扩散到生物环境中；此类化学降解过程可以是自水解或酶催化的。在其他限制中，非共价药物封装需要防止药物不受控制的释放，并且药物释放机制对生物降解的依赖性可能会导致患者间的差异。
[0206]
在特定实施方案中，包括小分子和大分子在内的药物分子通过永久共价键与载体缀合。某些在水性流体中表现出低溶解度的小分子治疗剂可以通过与亲水性聚合物的缀合来溶解，其实例在本文别处有描述。关于大分子蛋白质，半衰期延长可以通过例如用棕榈酰基部分的永久共价修饰，以及通过用另一种本身具有延长的半衰期的蛋白质(如，)的永久共价修饰来实现。一般来说，当载体与药物共价缀合时，药物分子表现出降低的生物活性。
[0207]
在某些情况下，与包含非共价聚合物混合物的药物分子或永久共价附接相关联的限制可以通过采用用于使药物与聚合物载体化学缀合的前药途径来成功解决。在这种背景下，与药物部分本身相比无活性或活性较低的治疗剂可预测地转化为活性分子实体。如果需要药物的缓慢或受控释放，则与释放的药物相比，前药的生物活性降低是有利的。在此类情况下，药物的释放随着时间的推移而发生，从而减少了重复和频繁施用药物的必要性。当药物部分本身在胃肠道中不被吸收或吸收不佳时，前药途径也可能是有利的；在这些情况下，前药促进药物部分的吸收，然后在稍后的某个时间(如，经由首过代谢)裂解。生物活性药物分子通常通过载体部分和药物分子的羟基、氨基或羧基基团之间形成的临时键连接到聚合物载体部分。
[0208]
上面描述的途径与若干限制相关联。前药激活可通过载体和药物分子之间的临时键的酶促或非酶促裂解，或两者的依序组合(如，先是酶促步骤，随后是非酶促修饰)而发生。在无酶的体外环境(如，水性缓冲溶液)中，诸如酯或酰胺的临时键联可能会发生水解，但相应的水解速率可能会使得它在治疗上有用的范围之外。相比之下，在体内环境中，通常存在酯酶或酰胺酶，并且酯酶和酰胺酶可导致水解动力学的显著催化加速，从两倍到几个数量级(参见，如，greenwald等人，(1999)j med chem 42(18):3857-67)。
[0209]
如本文所述，前药可分类为i)生物前体和ii)载体连接的前药。生物前体不含有载体基团，并通过官能团的代谢产生而被激活。相反，在载体-连接的前药中，活性物质经由生物活性实体的官能团处的临时键联缀合至载体部分。优选的官能团是羟基或氨基基团。附接化学和水解条件两者都取决于所用官能团的类型。载体可以是生物学上惰性的(如，peg)或可以具有靶向特性(如，抗体)。载体-连接的前药的载体部分的裂解产生目标生物活性实体，并且生物活性实体的去保护官能团的性质通常有助于其生物活性。
[0210]
专利和科学文献描述了许多大分子前药，其中的临时键是不稳定的酯键。在这些情况下，生物活性实体的官能团是羟基基团或羧酸(参见如cheng等人(2003)bioconjugate chem 14:1007-17)。此外，对于生物大分子和某些小分子药物而言，将载体与生物活性实体的一个或多个氨基基团(如蛋白质的n-末端或赖氨酸氨基)连接常常是有利的。在前药的制
备过程中，由于与羟基或酚基基团相比，氨基基团具有更大的亲核性，因此氨基基团可能更能被化学选择性地处理。这尤其适用于含有多种多样的不同反应性官能团的蛋白质和肽，其中非选择性缀合反应导致需要广泛表征或纯化的非所需的产物混合物，从而降低反应产率和活性部分的治疗功效。
[0211]
一般来说，酰胺键比酯键更稳定地抵抗水解，并且酰胺键的裂解速率可能对于载体连接的前药中的治疗效用而言太慢。结果，添加结构化学组分以实现对前药酰胺键的可裂解性的控制可能是有利的。这些既不是由载体实体也不是由药物提供的额外的裂解控制化学组分一般被称为“接头”。前药接头可以对临时键的水解速率产生重大影响，并且接头的化学性质的变化通常会导致特定的性质。用于靶向释放的特定酶对含胺生物活性部分的前药激活需要接头的结构显示被相应的内源酶识别为底物的结构基序。在这些情况下，临时键的裂解发生在由酶催化的一步过程中。例如，阿糖胞苷的酶促释放受蛋白酶纤溶酶的影响，该酶在各种类型的肿瘤块中的浓度都相对较高。
[0212]
患者间变异性是占主导的酶促裂解的主要缺点。受试者之间的酶水平可能显著不同，从而导致酶促裂解引起的前药激活的生物学变化。酶水平也可能根据施用部位而变化(如，对于皮下注射，身体的某些区域比其他区域产生更可预测的治疗效果)。此外，很难建立酶依赖性载体连接的前药的药代动力学特性的体内-体外相关性。
[0213]
采用与药物部分中的氨基基团临时键联的其他载体前药基于级联机制。由掩蔽基团和激活基团的结构组合组成的接头化合物能够实现级联裂解。掩蔽基团凭借第一临时键联(诸如酯或氨基甲酸酯)附接至激活基团。激活基团通过第二临时键联(如氨基甲酸酯)附接至药物分子的氨基基团。第二临时键联的稳定性或对水解的敏感性取决于掩蔽基团的存在或不存在。在掩蔽基团的存在下，第二临时键联高度稳定，并且不太可能以治疗上有用的动力学释放药物分子，而在不存在掩蔽基团的情况下，该键联变得高度不稳定，导致药物部分的快速裂解和释放。
[0214]
第一临时键联的裂解是级联机制中的限速步骤。第一步可诱导激活基团的分子重排(如，如greenwald等人(1999)j med chem 42:3657-67中所述的1,6-消除)，并且重排使得第二临时键联更加不稳定，从而诱导其裂解。理想地，第一临时键联的裂解速率与给定治疗方案中药物分子所需的释放速率相同。此外，理想的是，第二临时键联的断裂在其不稳定性已被第一临时键裂解诱导后基本上是瞬时的。
[0215]
另一个实施方案包括基于三甲基锁内酯化的含聚氨基的前药(参见如greenwald等人(2000)j med chem 43(3):457-87)。在该前药系统中，经取代的邻羟基苯基-二甲基丙酸通过作为第一临时键联的酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团连接至peg，并且凭借作为第二临时键联的酰胺键连接至药物分子的氨基基团。药物释放中的速率决定步骤是第一键联的酶促裂解，然后是通过内酯化进行的快速酰胺裂解，从而释放芳族内酯副产物。greenwald等人描述的前药系统的主要缺点是在临时键联裂解之后释放高反应性且潜在有毒的芳族小分子副产物，如醌甲基化物(quinone methide)或芳族内酯。潜在有毒的实体与药物以1:1的化学计量释放，并可能呈现高体内浓度。
[0216]
在基于1,6-消除的包含芳族激活基团的级联前药的某些实施方案中，掩蔽基团在结构上与载体分离。这可以通过采用在聚合物载体和激活基团之间的稳定键来实现，其中稳定键不参与级联裂解机制。如果载体不充当掩蔽基团并且激活基团借助于稳定键偶联至
载体，则避免了潜在有毒副产物(诸如激活基团)的释放。激活基团和聚合物的稳定附接也压制了具有不确定药理学的药物-接头中间体的释放。
[0217]
先前段落中描述的途径的第一个实例包括基于扁桃酸激活基团的聚合物前药系统(参见如shabat等人(2004)chem eur j 10:2626-34)。在这种途径中，掩蔽基团通过氨基甲酸酯键连接至激活基团。激活基团经由酰胺键永久缀合至聚丙烯酰胺聚合物。在通过催化性抗体酶促激活掩蔽基团之后，掩蔽基团通过环化裂解并释放药物；激活基团在药物释放之后仍连接至聚丙烯酰胺聚合物。类似的前药系统是基于扁桃酸激活基团和可酶促裂解的酯连接的掩蔽基团(参见如lee等人(2004)angew chem 116:1707-10)。
[0218]
当使用以上提及的接头时，1,6-消除步骤仍产生高反应性芳族中间体。即使芳族部分保持永久附接至聚合物载体，但仍可产生具有潜在有毒副产物的副反应或免疫原性作用。因此，使用不依赖酶且在裂解期间不产生反应性芳族中间体的脂肪族前药接头来生成用于形成含胺活性剂的聚合物前药的接头技术是有利的。一个此类实例使用peg5000-马来酸酐对组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶中的氨基基团进行可逆修饰(参见，如(1987)garman等人febs lett 223(2):361-65)。功能性酶在ph为7.4的缓冲液中孵育后通过马来酰胺酸键联的裂解而从peg-upa缀合物的再生遵循半衰期大致为6小时的一级动力学。马来酸键联的缺点是缀合物缺乏在较低的ph值下的稳定性。
[0219]
进一步的途径包括基于n,n-双-(2-羟乙基)甘氨酸酰胺(二羟乙基甘氨酸(bicine))接头的peg级联前药系统(参见如(2004)j med chem47:726-34)。在该系统中，两个peg载体分子经由临时键连接至与药物分子的氨基基团偶联的二羟乙基甘氨酸分子。前药激活中的第一步涉及连接两个peg载体分子与二羟乙基甘氨酸激活基团的羟基基团的第一临时键联的酶促裂解。peg和二羟乙基甘氨酸之间的不同键联导致不同的前药激活动力学。前药激活中的第二步涉及将二羟乙基甘氨酸激活基团连接至药物分子的氨基基团的第二临时键联的裂解。该系统的一个缺点是该第二临时二羟乙基甘氨酸酰胺键联的水解速率缓慢，这导致释放二羟乙基甘氨酸-修饰的前药中间体，该中间体与天然母体药物分子相比可能表现出不同的药代动力学、免疫原性、毒性和药效学特性。
[0220]
在特定实施方案中，将二肽用于靶向或靶向性转运的前药开发，因为它们是酶或生物转运系统的底物。二肽前药形成的非酶促途径(即，经历分子内环化以形成相应的二酮哌嗪(dkp)并释放活性药物的能力)尚未明确定义。
[0221]
在一些实施方案中，二肽经由酯键附接至药物部分，如针对药物扑热息痛(paracetamol)的二肽酯所描述的(gomes等人(2005)bio&med chem lett)。在该情况下，环化反应由肽的n-端胺在酯碳原子上的亲核攻击组成，从而形成四面体中间体，接着质子从胺转移至离去基团氧阴离子，同时形成肽键以得到环状dkp产物和游离药物。该方法在体外适用于含羟基药物，但已发现其在体内与酯键的酶促水解竞争，这是因为相应的二肽酯以与在缓冲液中相比快得多的速率释放扑热息痛((gomes等人(molecules 12(2007)2484-2506)。可以通过在二肽基序中掺入至少一种非天然氨基酸来解决基于二肽的前药对肽酶的易感性。然而，能够裂解酯键的内源酶并不限于肽酶，并且此类前药裂解的酶依赖性仍然会导致无法预测的体内性能。
[0222]
在一些实施方案中，酶依赖性被有意地工程化至dkp前药中，诸如其中二肽酯前药在二肽的氨基末端被甲酰化，并且酶促去甲酰化被用来引发二酮哌嗪形成和随后的酯-二
肽键裂解，然后释放药物分子(参见如usp 7,163,923)。作为进一步的实例，八肽通过酯键联附接至长春碱的4-羟基基团，并在特异性酶促去除n-末端六肽后通过dkp形成而进行酯键裂解(参见brady等人(2002)j med chem45:4706-15)。
[0223]
dkp形成反应的范围也已扩展到酰胺前药。举例来说，usp5,952,294描述了使用二酮哌嗪形成进行的阿糖胞苷的二肽基酰胺前药的前药激活。在这种情况下，在二肽的羰基和阿糖胞苷的芳族氨基基团之间形成临时键联。然而，由于不存在载体或其他半衰期延长部分或官能团，此类缀合物不太可能实现缓慢释放效果。
[0224]
还已经描述了包含生物活性肽诸如glp-1的二肽前药，其能够通过二肽延伸的二酮哌嗪形成而释放肽(参见如wo 2009/099763)。生物活性肽部分可以在其氨基酸侧链残基之一上包含额外的peg链，以实现生物活性肽的延长的循环。然而，这种途径与几个显著的缺点相关。首先，必须将peg链连接至肽而不损害其生物活性，这对于许多基于肽的生物活性剂来说可能是难以实现的。其次，由于聚乙二醇化肽本身具有生物活性，因此二肽前部分对肽的生物活性有影响，并可能对其受体结合特性产生负面影响。
[0225]
可以与本发明的化合物一起使用的特定示例性技术包括由proly nx(san francisco,ca)和ascendis pharma(palo alto,ca)开发的那些。prolynx技术平台利用新型接头集，所述新型接头集被预编程成以不同的速率裂解从而允许小分子和肽从循环的半固体大分子缀合物中受控、可预测且持续地释放。该技术允许将治疗剂的所需稳态血清水平维持数周至数月。
[0226]
ascendis技术平台结合了前药和持续释放技术的益处，以增强小分子和肽的特性。在循环过程中，专有前药以由生理ph和温度条件控制的预定速率释放未经修饰的活性母体治疗剂。因为治疗剂以其未经修饰的形式释放，所以它保留了其原始的作用机制。
[0227]
用于增强抑制剂特性的修饰
[0228]
改进本文公开的治疗模式的一种或多种物理特性和/或施用这些治疗模式的方式通常是有益的并且有时是必要的。物理特性的改进包括例如增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期；以及/或者调节生物活性的方法。
[0229]
本领域已知的修饰包括聚乙二醇化、fc-融合和白蛋白融合。尽管通常与大分子剂(如多肽)相关，但最近已经用特定的小分子评价了此类修饰。举例来说，chiang,m.等人小小分子-fc缀合物保留了强有力的fc受体和腺苷2a受体相互作用，并显示出与未缀合的小分子相比优越的特性。还描述了peg分子与小分子治疗剂的共价附接(li,w.等人,progress in polymer science,2013 38:421-44)。
[0230]
其他已知的修饰包括氘化以改进药代动力学、药效学和毒性特征。由于氘的原子质量较大，因此碳-氘键的裂解需要比碳-氢键更多的能量。由于这些更强的键更难断裂，因此与非氘化形式相比，药物代谢的速率更慢，这允许更低的给药频率并可能进一步降低毒性。(charles schmidt,nature biotechnology,2017,35(6):493-494；harbeson,s.和tung,r.,medchem news,2014(2):8-22)。
[0231]
治疗和预防用途
[0232]
本发明考虑了本文所述的hif-2α抑制剂在治疗或预防广泛的疾病、病症和/或疾患和/或其症状中的用途。虽然下文详细描述了特定用途，但应理解本发明不受此限制。此外，尽管下文阐述了特定疾病、病症和疾患的一般类别，但一些疾病、病症和疾患可能是多
于一个类别的成员，而其他疾病、病症和疾患可能不是任何公开类别的成员。
[0233]
在一些实施方案中，本文所述的hif-2α抑制剂以有效逆转、停止或减缓hif-2α-介导的失调的进展的量施用。
[0234]
与肿瘤学有关的病症.本文所述的hif-2α抑制剂可用于治疗或预防增殖性疾患或病症，包括癌症，例如子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌(诸如转移性去势抵抗性前列腺癌)、睾丸癌、胃肠道癌(如，食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠或直肠癌)、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮肤癌、头或颈部癌、肝癌、胆囊癌、心脏癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、脑癌(如，胶质瘤)、神经节癌、中枢神经系统(cns)癌和周围神经系统(pns)癌，以及造血系统和免疫系统(如，脾脏或胸腺)的癌症。本发明还提供了治疗或预防其他与癌症有关的疾病、病症或疾患的方法，所述其他癌症相关疾病、病症或疾患包括例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导的癌症(如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌和乳头状瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱导的癌症、转移和血管生成。在特定实施方案中，肿瘤或癌症是结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤或白血病。术语与癌症有关的疾病、病症和疾患的使用意在广义地指与癌症直接或间接相关的疾患，并且包括如血管生成和癌前疾患诸如发育不良。
[0235]
在某些实施方案中，癌症可以是转移性的或处于变成转移性的风险中，或者可以发生在扩散组织中，包括血液或骨髓的癌症(如，白血病)。
[0236]
在一些实施方案中，本发明提供了用hif-2α抑制剂和至少一种额外的治疗剂或诊断剂治疗增殖性疾患、癌症、肿瘤或癌前疾患的方法，其实例在本文别处阐述。
[0237]
治疗本文所述的癌症的方法可以适合作为一线疗法、二线疗法或三线疗法。
[0238]
在一些实施方案中，所述疾病或病症是vhl-相关的，例如vhl-相关的肾细胞癌。
[0239]
在一个实施方案中，本文所述的化合物可用于治疗铁过载病症。铁过载病症可能是原发性或继发性的。在一个实施方案中，铁过载病症可能是血色沉着病。在其他实施方案中，本文所述的化合物可用于治疗红细胞增多症，诸如例如真性红细胞增多症。在另一个实施方案中，本文所述的化合物可用于治疗帕恰克-庄综合征(pacak-zhuang syndrome)。在又一个实施方案中，本文所述的化合物可用于治疗红细胞增多症。
[0240]
与免疫有关以及与炎症有关的病症.可用本发明的化合物和组合物治疗或预防的与免疫有关以及与炎症有关的疾病、病症和疾患的非限制性清单包括关节炎(如，类风湿性关节炎)、肾衰竭、狼疮、哮喘、牛皮癣、结肠炎、胰腺炎、过敏、纤维化、手术并发症(如，其中炎性细胞因子阻止愈合)、贫血和纤维肌痛。可能与慢性炎症相关的其他疾病和病症包括阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease)、充血性心力衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、动脉硬化、骨质疏松症、帕金森氏病(parkinson's disease)、感染、炎性肠病(如，克罗恩氏病(crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、慢性阻塞性肺病(copd)、动脉粥样硬化、过敏性接触性皮炎和其他湿疹、系统性硬化症、移植和多发性硬化症。
[0241]
在本公开的特定实施方案中，hif-2α抑制剂被用来通过提供佐剂活性来增加或增强对抗原的免疫响应。在特定的实施方案中，将至少一种抗原或疫苗与至少一种本发明的hif-2α抑制剂组合施用给受试者以延长对该抗原或疫苗的免疫响应。还提供了治疗性组合物，其包含至少一种抗原剂或疫苗组分(包括但不限于病毒、细菌和真菌或其部分，蛋白质，
肽，肿瘤特异性抗原和核酸疫苗)与至少一种本发明的hif-2α抑制剂的组合。
[0242]
在一些实施方案中，如本文所述的hif-2α抑制剂可以与免疫压制剂组合以减少免疫效应细胞的数量。
[0243]
其他病症.本发明的实施方案考虑将本文所述的hif-2α抑制剂施用给受试者以治疗或预防可能受益于至少某种水平的hif-2α抑制的任何其他病症。此类疾病、病症和疾患包括例如心血管(如心脏缺血)和代谢(如糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖症)病症。
[0244]
药物组合物
[0245]
本发明的hif-2α抑制剂可以为适合于施用给受试者的组合物的形式。一般而言，此类组合物是“药物组合物”，其包含一种或多种hif-2α抑制剂和一种或多种药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在某些实施方案中，hif-2α抑制剂以治疗上可接受的量存在。所述药物组合物可用于本发明的方法；因此，例如，所述药物组合物可以离体或体内施用给受试者以实施本文所述的治疗和预防方法和用途。
[0246]
本发明的药物组合物可以被配制成与预期的施用方法或途径相容；本文阐述了示例性施用途径。此外，所述药物组合物可与如本文所述的其他治疗活性剂或化合物组合使用，以便治疗或预防如本发明所考虑的疾病、病症和疾患。
[0247]
含有活性成分(如，hif-2α功能抑制剂)的药物组合物可以为适合于经口使用的形式，例如呈片剂、胶囊、糖锭剂(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性混悬剂、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊，或糖浆、溶液、微珠或酏剂的形式。可根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备旨在用于经口使用的药物组合物，并且此类组合物可含有一种或多种剂，诸如例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂以便提供药学上精致且可口的制品。片剂、胶囊等含有与适合于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
[0248]
适用于经口施用的片剂、胶囊等可以未被包衣或通过已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并从而提供持续作用。例如，可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。它们也可以通过本领域已知的技术进行包衣以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。额外的剂包括可生物降解或生物相容性的颗粒或聚合物质，诸如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物，或乙烯基乙酸乙酯共聚物以控制所施用组合物的递送。例如，可以将经口用剂包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(分别通过使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrolate))微胶囊来进行)，或者包埋在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用于制备以上提及的制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。
[0249]
用于经口使用的制剂也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合，或为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
[0250]
水性悬浮液含有与适合于制造其的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂可以是助
悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(如卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(如，对于十七亚乙基氧鲸蜡醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(如，聚乙烯失水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。
[0251]
油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或者矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(诸如上文所阐述的那些)和调味剂以提供可口的经口用制品。
[0252]
适用于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂在本文中有举例说明。
[0253]
本发明的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
[0254]
药物组合物通常包含治疗有效量的本发明所考虑的hif-2α抑制剂和一种或多种药学和生理学上可接受的配制药剂。合适的药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、去污剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是可能补加有用于肠胃外施用的药物组合物中常见的其他物质的生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。本领域技术人员将容易地认识到可用于本文所考虑的药物组合物和剂型中的各种各样的缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为一个实例，缓冲剂组分可以是水溶性物质，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括例如tris缓冲剂、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)和n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)。
[0255]
在已经配制药物组合物之后，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式、使用前需要复原的冻干形式、使用前需要稀释的液体形式或其他可接受的形式储存。在一些实施方案中，药物组合物在一次性使用的容器(如，一次性使用的小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于如))中提供，而在其他实施方案中提供了多次使用的容器(如，多次使用的小瓶)。
[0256]
制剂还可以包含载体以保护组合物免于从体内快速降解或消除，诸如控制释放制剂，其包括脂质体、水凝胶、前药和微囊化递送系统。例如，可以将延时材料，诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯单独地与蜡组合地使用。任何药物递送装置都可用于递送hif-2α抑制剂，包括植入物(如，可植入泵)和导管系统、缓慢注射泵和设备，所有这些都是本领域技
术人员所熟知的。
[0257]
一般通过皮下或肌内施用的贮库型注射剂也可用于在限定的时间段内释放本文公开的hif-2α抑制剂。贮库型注射剂通常是基于固体或基于油的并且通常包含至少一种本文所述的制剂组分。本领域普通技术人员熟悉贮库型注射剂的可能的制剂和用途。
[0258]
药物组合物可以是无菌可注射的水溶液或油状悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用本文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制品也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、cremophor el
tm
(basf,parsippany,nj)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及它们的合适混合物。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或混悬介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂。可以通过包含延迟吸收的剂(如，单硬脂酸铝或明胶)来实现特定可注射制剂的延长吸收。
[0259]
本发明考虑了将hif-2α抑制剂以栓剂形式用于直肠施用。栓剂可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体并因此会在直肠中熔化以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
[0260]
本发明所考虑的hif-2α抑制剂可以是目前已知或将来开发的任何其他合适的药物组合物(例如，用于鼻腔或吸入用途的喷雾剂)的形式。
[0261]
施用途径
[0262]
本发明考虑了将hif-2α抑制剂及其组合物以任何适当的方式施用。合适的施用途径包括经口、肠胃外(如，肌内、静脉内、皮下(如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(脑实质内)和脑室内)、经鼻、经阴道、舌下、眼内、经直肠、局部(如，透皮)、经颊和吸入。一般通过皮下或肌内施用的贮库型注射剂也可用于在限定的时间段内释放本文公开的hif-2α抑制剂。
[0263]
本发明的特定实施方案考虑了经口施用。
[0264]
组合疗法
[0265]
本发明考虑了将hif-2α抑制剂单独地或与一种或多种活性治疗剂组合地使用。额外的活性治疗剂可以是小的化学分子；大分子，诸如蛋白质、抗体、肽体、肽、dna、rna或此类大分子的片段；或细胞或基因疗法。组合疗法可以靶向不同但互补的作用机制，并从而对潜在的疾病、病症或疾患具有协同治疗或预防作用。此外或可替代地，组合疗法可以允许一种或多种剂的剂量减少，从而改善、减少或消除与一种或多种剂相关的副作用。
[0266]
此类组合疗法中的活性治疗剂可以被配制成单一组合物或单独的组合物。如果分开施用，组合中的每种治疗剂可以同时或大约同时或在不同时间给予。此外，即使在以下情况情况下，治疗剂也是被“组合”施用的：治疗剂具有不同的施用形式(如，经口用胶囊和静脉内施用)，它们以不同的给药间隔给予，一种治疗剂以恒定给药方案给予而另一种被向上滴定、向下滴定或停用，或者组合中的每种治疗剂均在剂量上被独立地向上滴定、向下滴定、增加或减少，或在患者的治疗过程中被停用和/或恢复使用。如果所述组合被配制成单独的组合物，在一些实施方案中，单独的组合物在试剂盒中一起提供。
[0267]
在一些实施方案中，额外的治疗剂是免疫调节剂。可用于本发明的合适的免疫调
节剂包括cd40l、b7和b7rp1；针对刺激性受体的活化单克隆抗体(mab)，诸如抗cd40、抗cd38、抗icos和4-ibb配体；树突状细胞抗原负载(体外或体内)；抗癌疫苗，诸如树突状细胞癌疫苗；细胞因子/趋化因子，诸如il1、il2、il12、il18、elc/ccl19、slc/ccl21、mcp-1、il-4、il-18、tnf、il-15、mdc、ifna/b、m-csf、il-3、gm-csf、il-13和抗-il-10；细菌脂多糖(lps)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido1)抑制剂和免疫刺激寡核苷酸。
[0268]
在某些实施方案中，本发明提供了用于肿瘤生长的肿瘤压制的方法，其包括施用本文所述的hif-2α抑制剂与信号转导抑制剂(sti)的组合以实现对肿瘤生长的相加或协同压制。如本文所用，术语“信号转导抑制剂”是指选择性地抑制信号传导通路中的一个或多个步骤的剂。本发明的信号转导抑制剂(sti)包括：(i)bcr/abl激酶抑制剂(如，)；(ii)表皮生长因子(egf)受体抑制剂，包括激酶抑制剂和抗体；(iii)her-2/neu受体抑制剂(如，)；(iv)akt家族激酶或akt通路的抑制剂(如，trop2抑制剂奥雷帕霉素)；(v)细胞周期激酶抑制剂(如，夫拉平度)；和(vi)磷脂酰肌醇激酶抑制剂。参与免疫调节的剂也可与本文所述的hif-2α抑制剂组合使用，以压制癌症患者的肿瘤生长。
[0269]
在一些实施方案中，额外的治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂诸如噻替哌和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、异丙硫丹(improsulfan)和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯多巴benzodopa、卡波醌、美妥多巴和乌多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、氯萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、诺维贝辛、芬乃斯特、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、阿扎丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、加利车霉素、卡比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、埃柔比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊马度胺、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)，含或不含亚叶酸；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-fu；雄激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如氨基格鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝他布昔；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；二氮醌；艾福米辛；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹达莫；硝氨吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；米托溴醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；格塞图辛；阿糖胞苷(ara-c)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉醇，如太平洋紫杉醇、白蛋白-太平洋紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂和铂配位络合物，诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂；长春碱；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；米托恩醌；替尼泊苷；
道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；蒽环霉素；精氨酸酶抑制剂(参见pct/us2019/020507)和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0270]
化学治疗剂还包括起到调控或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲昔芬、雷洛昔芬、奥那司酮和托瑞米芬；和抗雄激素，诸如阿比特龙、恩杂鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，组合疗法包括包含一种或多种化学治疗剂的化疗方案。在某些实施方案中，组合疗法包括施用激素或相关激素剂。
[0271]
可以与hif-2α抑制剂组合使用的额外治疗模式包括放射疗法、针对肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、t细胞佐剂、骨髓移植物或抗原呈递细胞(如，树突状细胞疗法)，包括用于刺激此类抗原呈递细胞的tlr激动剂。
[0272]
在某些实施方案中，本发明考虑了将本文所述的化合物与过继细胞疗法组合使用，过继细胞疗法是一种新型且有希望的个体化免疫疗法形式，其中将具有抗肿瘤活性的免疫细胞施用给癌症患者。正在使用肿瘤浸润淋巴细胞(til)和被工程化成表达例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的t细胞来探究过继细胞疗法。过继性细胞疗法通常涉及从个体收集t细胞，对其进行遗传修饰以靶向特定抗原或增强它们的抗肿瘤效果，将它们扩增至足够数量，并将经遗传修饰的t细胞输注到癌症患者中。t细胞可以从随后扩增的细胞将被重新输注到其中的患者(如自体)收集，或者可以从供体患者(如同种异体)收集。
[0273]
在某些实施方案中，本发明考虑将本文所述的化合物与基于rna干扰的疗法组合使用来沉默基因表达。rnai始于将较长的双链rna裂解成小干扰rna(sirna)。将sirna的一条链掺入被称为rna-诱导的沉默复合物(risc)的核糖核蛋白复合物中，然后将其用于鉴定与掺入的sirna链至少部分互补的mrna分子。risc可以结合至mrna或裂解mrna，两者都抑制翻译。
[0274]
在某些实施方案中，本发明考虑将本文所述的化合物与调节腺苷水平的剂组合使用。此类治疗剂可对催化atp转化为腺苷的胞外核苷酸(ectonucleotide)起作用，包括将atp水解为adp并将adp水解为amp的胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(entpd1，也称为cd39或分化簇39)，以及将amp转化为腺苷的胞外5'-核苷酸酶(nt5e或5nt，也称为cd73或分化簇73)。cd39和cd73的酶促活性在校准递送到各种细胞(如免疫细胞)的嘌呤能信号(purinergic signal)的持续时间、幅度和化学性质方面发挥着关键作用。这些酶促活性的更改可改变若干病理生理学事件(包括癌症、自身免疫疾病、感染、动脉粥样硬化症和缺血性再灌注损伤)的过程或决定其结果，表明这些胞外酶代表用于管理各种病症的新型治疗靶标。在一个实施方案中，cd73抑制剂是在wo2017/120508、wo2018/067424、wo2018/094148和wo2020/046813中描述的那些。
[0275]
可替代地，此类治疗剂可以是腺苷2受体(a2r)拮抗剂。腺苷可以结合至并激活四种不同的g蛋白偶联受体：a1r、a
2a
r、a
2b
r和a3r。腺苷与在t细胞、自然杀伤细胞和髓系细胞(诸如树突状细胞)上表达的a
2a
r受体结合会导致细胞内环amp水平升高以及此类细胞的成熟和/或激活受损。这个过程显著削弱了针对癌细胞的免疫系统的激活。此外，a
2a
r参与选择性地增强抗炎细胞因子，促进pd-1和c tla-4的上调，促进lag-3和foxp3 调节性t细胞的生
成，以及介导对调节性t细胞的抑制。pd-1、ctla-4和其他免疫检查点在本文中有进一步讨论。鉴于a2r拮抗剂的不同作用机制，将a2r拮抗剂组合在本文所述的组合中可以提供至少一种累加效应。在一个实施方案中，本发明考虑与wo2018/136700、wo2018/204661、wo2018/213377或wo2020/023846中描述的腺苷受体拮抗剂的组合。
[0276]
在某些实施方案中，本发明考虑将本文所述的化合物与磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)、特别是pi3kγ同种型的抑制剂组合使用。pi3kγ抑制剂可以通过调节髓样细胞，诸如通过抑制压制性髓样细胞、削弱免疫压制性肿瘤浸润性巨噬细胞或通过刺激巨噬细胞和树突状细胞来刺激抗癌免疫响应，以产生有助于有效t-细胞响应的细胞因子，从而导致癌症发展和扩散减少。pi3kγ抑制剂包括pct/us2020/035920中描述的那些。
[0277]
在某些实施方案中，本发明考虑将本文所述的化合物与精氨酸酶抑制剂组合使用，所述精氨酸酶抑制剂已被证明负责或参与炎症-触发的免疫功能障碍、肿瘤免疫逃逸、免疫压制和感染性疾病的免疫病理学。示例性精氨酸酶化合物可以见于例如pct/us2019/020507和wo/2020/102646中。
[0278]
免疫检查点抑制剂.本发明考虑将本文所述的hif-2α功能抑制剂与免疫检查点抑制剂组合使用。
[0279]
作为所有癌症的特征的大量遗传和表观遗传改变提供了免疫系统可以用来将肿瘤细胞与其正常对应物区分开来的多种抗原。在t细胞的情况下，通过t细胞受体(tcr)的抗原识别启动的响应的最终幅度(如，细胞因子产生或增殖的水平)和质量(如，产生的免疫响应的类型，诸如细胞因子产生的模式)受共刺激和抑制信号(免疫检查点)之间的平衡调控。在正常生理条件下，免疫检查点对于自身免疫的预防(即维持自身耐受性)以及还对于当免疫系统对致病性感染作出响应时保护组织免受伤害是至关重要的。免疫检查点蛋白的表达作为重要的免疫抗性机制可被肿瘤失调。
[0280]
t细胞已成为努力在治疗上操纵内源性抗肿瘤免疫力的主要焦点，因为：i)它们能够选择性识别所有细胞区室中蛋白质衍生的肽；ii)它们能够直接识别和杀死表达抗原的细胞(通过cd8 效应t细胞；也称为细胞毒性t淋巴细胞(ctl))；和iii)它们能够通过cd4 辅助t细胞协调多种免疫应答，其整合了适应性和先天效应子机制。
[0281]
在临床环境中，免疫检查点的阻断—其导致抗原特异性t细胞响应的放大—已被证明是人类癌症治疗中的一种有前途的途径。
[0282]
t细胞介导的免疫包括多个连续步骤，每个步骤通过平衡刺激信号和抑制信号来调控以优化响应。虽然免疫响应中几乎所有的抑制信号最终都会调节细胞内信号传导通路，但许多是通过膜受体启动的，膜受体的配体要么是膜结合的，要么是可溶的(细胞因子)。虽然调控t-细胞激活的共刺激和抑制受体和配体在癌症中相对于正常组织通常不会过表达，但在组织中调控t细胞效应功能的抑制性配体和受体通常在肿瘤细胞或与肿瘤微环境相关的非转化细胞上过表达。可溶性和膜结合的受体—配体免疫检查点的功能可以使用激动剂抗体(对于共刺激通路)或拮抗剂抗体(对于抑制通路)进行调节。因此，与目前批准用于癌症疗法的大多数抗体相比，阻断免疫检查点的抗体不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体以增强内源性抗肿瘤活性。[参见pardoll,(2012年4月)nature rev.cancer 12:252-64]。
[0283]
免疫检查点(配体和受体)的例子(其中的一些在各种类型的肿瘤细胞中被选择性
地上调，是用于阻断的候选者)包括pd-1(程序性细胞死亡蛋白1)；pd-l1(pd-1配体)；btla(b和t淋巴细胞衰减因子)；ctla4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)；tim-3(t细胞膜蛋白3)；lag3(淋巴细胞激活基因3)；tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)；以及杀伤细胞抑制性受体，其可根据其结构特征被分为两类：i)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，和ii)c型凝集素受体(ii型跨膜受体家族的成员)。文献中描述了其他不太明确的免疫检查点，包括受体(如，2b4(也称为cd244)受体)和配体(如，某些b7家族抑制性配体，诸如b7-h3(也称为cd276)和b7-h4(也称为b7-s1、b7x和vctn1))两者。[参见pardoll,(2012年4月)nature rev.cancer 12:252-64]。
[0284]
本发明考虑将本文所述的hif-2α功能抑制剂与前面提到的免疫检查点受体和配体以及尚未描述的免疫检查点受体和配体的抑制剂组合使用。某些免疫检查点调节剂目前已获批准，并且许多其他调节剂正在开发中。2011年获批治疗黑色素瘤时，全人源化ctla4单克隆抗体伊匹单抗(ipilimumab)(bristol-myers squibb)成为美国首个获得监管批准的免疫检查点抑制剂。包含ctla4和抗体(ctla4-ig；阿巴西普(bristol-myers squibb))的融合蛋白已被用于治疗类风湿性关节炎，并且其他融合蛋白已被证明对爱泼斯坦巴尔病毒敏感的肾移植患者有效。下一类获得监管批准的免疫检查点抑制剂是针对pd-1及其配体pd-l1和pd-l2。已获批准的抗p d-1抗体包括用于各种癌症(包括鳞状细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤和尿路上皮癌)的纳武单抗(bristol-myers squibb)和派姆单抗(merck)。已批准的抗pd-l1抗体包括用于某些癌症(包括尿路上皮癌)的阿维鲁单抗(bavencio,emd serono&pfizer)、阿替利珠单抗(tecentriq；roche/genentech)和德瓦鲁单抗(imfinzi；astrazeneca)。虽然没有批准的靶向tigit或其配体cd155和cd112的治疗剂，但正在开发的那些包括bms-986207(bristol-myers squibb)、mtig7192a/rg6058(roche/genentech)和omp-31m32(oncomed)。
[0285]
在本发明的一方面，将要求保护的hif-2α抑制剂与免疫肿瘤学剂组合，该免疫肿瘤学剂是(i)刺激性(包括共刺激性)受体的激动剂或(ii)t细胞上的抑制(包括共抑制)信号的拮抗剂，这两者都会导致抗原特异性t细胞响应的放大。某些刺激性和抑制性分子是免疫球蛋白超家族(igsf)的成员。结合至共刺激性或共抑制性受体的膜结合配体的一个重要的家族是b7家族，其包括b7-1、b7-2、b7-h1(pd-l1)、b7-dc(pd-l2)、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)、b7-h6和b7-h7(hhla2)。结合至共刺激性或共抑制性受体的膜结合配体的另一个家族是结合至同源tnf受体家族成员的tnf家族分子，包括cd40和cd40l、ox-40、ox-40l、cd70、cd27l、cd30、cd3ol、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、taci、april、bcma、lt13r、light、dcr3、hvem、vegi/tl1a、tramp/dr3、edar、eda1、xedar、eda2、tnfr1、淋巴毒素a/tnf13、tnfr2、tnfa、lt13r、淋巴毒素a 1132、fas、fasl、relt、dr6、troy、ngfr。
[0286]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是抑制t细胞激活的细胞因子(如，il-6、il-10、tgf-b、vegf和其他免疫压制细胞因子)或刺激t细胞激活以刺激免疫响应的细胞因子。
[0287]
在一方面，t细胞响应可以被所公开的hif-2α抑制剂与以下中的一种或多种的组合刺激：(i)抑制t细胞激活的蛋白质的拮抗剂(如，免疫检查点抑制剂)，诸如ctla-4、pd-1、
pd-l1、pd-l2、lag-3、tim-3、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd69、半乳糖凝集素-1、tigit、cd113、gpr56、vista、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim-1和tim-4，和/或(ii)刺激t细胞激活的蛋白质的激动剂，诸如b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27、cd40、dr3和cd2。可与本发明的hif-2α抑制剂组合用于治疗癌症的其他剂包括nk细胞上抑制性受体的拮抗剂或nk细胞上激活受体的激动剂。例如，本文的化合物可以与kir的拮抗剂诸如利瑞鲁单抗(lirilumab)组合。作为另一个实例，本文所述的化合物可以与乐伐替尼或卡博替尼组合。
[0288]
用于组合疗法的另一些其他剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核细胞的剂，包括但不限于csf-1r拮抗剂，诸如csf-1r拮抗剂抗体，包括rg7155(wo11/70024、wo11/107553、wo11/131407、wo13/87699、wo13/119716、wo13/132044)或fpa-008(wo11/140249；wo13/169264；wo14/036357)。
[0289]
在另一方面，所公开的hif-2α抑制剂可以与以下物质一起使用：一种或多种连接阳性共刺激性受体的激动剂，减弱通过抑制性受体的信号传导的阻断剂，拮抗剂，以及一种或多种全身提高抗肿瘤t细胞的频率的剂，克服肿瘤微环境内不同免疫压制通路(如，阻断抑制性受体接合(如，pd-l1/pd-1相互作用)、耗竭或抑制treg(如，使用抗-cd25单克隆抗体(如，达克珠单抗)或通过离体抗cd25珠耗竭)，或者逆转/防止t细胞无能或衰竭)的剂，以及在肿瘤位点触发先天免疫激活和/或炎症的剂。
[0290]
在一方面，免疫肿瘤学剂是ctla-4拮抗剂，诸如拮抗性ctla-4抗体。合适的ctla-4抗体包括例如(伊匹单抗)或曲美木单抗(tremelimumab)。
[0291]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是pd-1拮抗剂，诸如拮抗性pd-1抗体。合适的pd-1抗体包括例如(纳武单抗)、(纳武单抗)、(派姆单抗)或medi-0680(amp-514；wo2012/145493)。免疫肿瘤学剂还可包括匹地利珠单抗(ct-011)，尽管其对pd-1结合的特异性受到质疑。另一种靶向pd-1受体的途径是由融合到igg1的fc部分的pd-l2的胞外结构域(b7-dc)组成的重组蛋白，称为amp-224。在另一个实施方案中，该剂是津贝利单抗(zimberelimab)。
[0292]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是pd-ll拮抗剂，诸如拮抗性pd-ll抗体。合适的pd-l1抗体包括，例如，(阿替利珠单抗；mpdl3280a；wo2010/077634)、德瓦鲁单抗(medi4736)、bms-936559(wo2007/005874)和msb0010718c(wo2013/79174)。
[0293]
在另一方面，免疫-肿瘤学剂是lag-3拮抗剂，诸如拮抗性lag-3抗体。合适的lag3抗体包括例如bms-986016(wo10/19570,wo14/08218)或imp-731或imp-321(wo08/132601,wo09/44273)。
[0294]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是cd137(4-1bb)激动剂，诸如激动性cd137抗体。合适的cd137抗体包括，例如，乌瑞芦单抗(urelumab)和pf-05082566(wo12/32433)。
[0295]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是gitr激动剂，诸如激动性gitr抗体。合适的gitr抗体包括，例如，bms-986153、bms-986156、trx-518(wo06/105021,wo09/009116)和mk-4166(wo11/028683)。
[0296]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是ox40激动剂，诸如激动性ox40抗体。合适的ox40抗体包括例如medi-6383或medi-6469。
[0297]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是ox40l拮抗剂，诸如拮抗性ox40l抗体。合适的ox40l拮抗剂包括例如rg-7888(wo06/029879)。
[0298]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是cd40激动剂，诸如激动性cd40抗体。在又一个实施方案中，免疫肿瘤学剂是cd40拮抗剂，诸如拮抗性cd40抗体。合适的cd40抗体包括，例如，卢卡木单抗或达西组单抗。
[0299]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是cd27激动剂，诸如激动性cd27抗体。合适的cd27抗体包括，例如，伐立鲁单抗。
[0300]
在另一方面，免疫肿瘤学剂是mga271(至b7h3)(wo11/109400)。
[0301]
本发明涵盖任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0302]
可在组合疗法中用于治疗与心血管和/或代谢有关的疾病、病症和疾患的治疗剂的实例包括抑制胆固醇的酶促合成的他汀类(如，和)；隔离胆固醇并防止其吸收的胆汁酸树脂(如和)；阻止胆固醇吸收的依折麦布降低甘油三酯并可能适度增加hdl的纤维酸(如)；适度降低ldl胆固醇和甘油三酯的烟酸(如，)；和/或上述的组合(如，(依折麦布与辛伐他汀)。可以作为与本文所述的hif-2α抑制剂组合使用的候选物的可替代胆固醇治疗包括各种补充剂和草药(如大蒜(garlic)、二十八烷醇(policosanol)和guggul)。
[0303]
本发明涵盖任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0304]
可用于与免疫有关以及与炎症有关的疾病、病症或疾患的组合疗法的治疗剂的实例包括但不限于以下：非甾体抗炎药(nsaid)，诸如阿司匹林、布洛芬和其他丙酸衍生物(阿米洛芬、苯氧沙洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、米罗洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和噻沙洛芬)、乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸(clidanac)、双氯芬酸、芬氯芬酸、芬克洛酸、芬替扎克(fentiazac)、呋罗芬酸(fuirofenac)、异丁芬酸(ibufenac)、伊索克酸(isoxepac)、奥西平酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美汀、齐多美辛和佐美酸)、芬那酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸)、联苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳)、昔康类(oxicams)(依索昔康、吡罗昔康(piroxicam)、舒多昔康和替诺昔康)、水杨酸盐(乙酰水杨酸、柳氮磺胺吡啶)和吡唑啉酮(阿扎丙宗、贝比派瑞bezpiperylon、非普拉宗、莫非保松、羟基保泰松、保泰松)。其他组合包括环氧合酶-2(cox-2)抑制剂。
[0305]
用于组合的其他活性剂包括类固醇，诸如泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。这种组合可能是特别有利的，因为可以通过逐渐减少所需的类固醇剂量来减少或甚至消除类固醇的一种或多种不利影响。
[0306]
可组合使用以治疗例如类风湿性关节炎的活性剂的额外实例包括一种或多种细胞因子压制抗炎药(csaid)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如tnf、lt、il-10、il-2、il-6、il-7、il-8、il-15、il-16、il-18、emap-ii、gm-csf、fgf或pdgf。
[0307]
活性剂的特定组合可以在自身免疫和随后的炎性级联的不同点干扰，并且包括
tnf拮抗剂，诸如嵌合、人源化或人tnf抗体、r抗tnf抗体片段(如，cdp870)和可溶性p55或p75 tnf受体、其衍生物、p75tnfrigg或p55tnfr1gg可溶性il-13受体(sil-13)，以及还有tnfa-转化酶(tace)抑制剂；同样，il-1抑制剂(如，白介素-1-转换酶抑制剂)可能是有效的。其他组合包括白介素11、抗p7s和p-选择素糖蛋白配体(psgl)。与本文所述的hif-2α抑制剂组合使用的剂的其他实例包括干扰素-131a干扰素-13lb克帕松；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉比滨；以及针对其他人类细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(如针对cd40配体和cd80的抗体)。
[0308]
给药
[0309]
本发明的hif-2α抑制剂可以以取决于例如施用目标(如，所需的解决程度；施用制剂的受试者的年龄、体重、性别和健康和身体状况；施用途径；及疾病、病症、疾患或其症状的性质)的量施用给受试者。给药方案还可以考虑与所施用的一种或多种剂相关的任何不良影响的存在、性质和程度。有效剂量量和给药方案可以容易地从例如安全性和剂量递增试验、体内研究(如动物模型)和本领域技术人员已知的其他方法确定。
[0310]
一般来说，给药参数规定剂量量应小于可能对受试者产生不可逆毒性的量(最大耐受剂量(mtd))，并且不小于对受试者产生可测量效果所需的量。此类量由例如与adme相关的药代动力学和药效学参数决定的，同时要考虑到施用途径和其他因素。
[0311]
有效剂量(ed)是在使用它的一部分受试者中产生治疗响应或期望效果的剂的剂量或量。剂的“中位有效剂量”或ed50是在50％的施用剂的群体中产生治疗响应或所需效果的剂的剂量或量。尽管ed50通常用作剂效果的合理预期的量度，但不一定是临床医生在考虑所有相关因素后可能认为合适的剂量。因此，在某些情况下，有效量大于计算的ed50，在其他情况下，有效量小于计算的ed50，并且在其他情况下，有效量与计算的ed50相同。
[0312]
此外，本发明的hif-2α抑制剂的有效剂量可以是当以一剂或多剂施用给受试者时相对于健康受试者产生期望结果的量。例如，对于经历特定病症的受试者，有效剂量可以是使此病症的诊断参数、测量结果、标志物等改善至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或大于90％的剂量，其中100％被定义为正常受试者表现出的诊断参数、测量结果、标志物等。
[0313]
在某些实施方案中，本发明考虑的hif-2α抑制剂可以每天一次或多次以约0.01mg/kg受试者体重/天至约50mg/kg受试者体重/天，或约1mg/kg受试者体重/天至约25mg/kg受试者体重/天的剂量水平施用(如，经口施用)，以获得所需的治疗效果。
[0314]
对于经口用剂的施用，所述组合物可以以片剂、胶囊等形式提供，该片剂、胶囊含有1.0至1000毫克活性成分，特别是1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分。
[0315]
在某些实施方案中，所需的hif-2α抑制剂的剂量包含在“单位剂型”中。短语“单位剂型”是指物理上离散的单元，每个单元含有预定量的单独的或与一种或多种额外剂组合的足以产生所需效果的hif-2α抑制剂。应当理解，单位剂型的参数将取决于具体的剂和要
达到的效果。
[0316]
试剂盒
[0317]
本发明还考虑了试剂盒，其包括本文所述化合物及其药物组合物。试剂盒一般为容纳各种组件的物理结构的形式，如下所述，并且可以被用于例如实施上述方法。
[0318]
试剂盒可以包括本文公开的化合物中的一种或多种(在例如无菌容器中提供)，其可以是适合于施用给受试者的药物组合物的形式。本文所述的化合物可以以即用形式(如，片剂或胶囊)或以例如需要在施用前复原或稀释的形式(如，粉末)提供。当本文所述的化合物为需要由使用者复原或稀释的形式时，试剂盒还可以包括与本文所述的化合物一起包装或与本文所述的化合物分开包装的稀释剂(如，无菌水)、缓冲液、药学上可接受的赋形剂等。当考虑组合疗法时，试剂盒可以分开地包含几种剂，或者它们可能已经组合在试剂盒中。试剂盒的每个组件可以封装在单独的容器中，并且所有各种容器都可以在单个包装中。本发明的试剂盒可以针对适当地维护容纳在其中的组件所必需的条件(如，冷藏或冷冻)进行设计。
[0319]
试剂盒可含有标签或包装插页，其包括其中组件的识别信息和它们的使用说明书(如，给药参数、一种或多种活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学、不良作用、禁忌症等)。标签或插页可以包括制造商信息，诸如批号和有效期。标签或包装插页可以例如整合到容纳组件的物理结构中，单独地包含在物理结构内，或粘贴到试剂盒的组件(如，安瓿、管或小瓶)上。
[0320]
标签或插入物可以另外包括以下或并入到以下上：计算机可读介质，诸如磁盘(如，硬盘、卡、存储盘)、光盘(诸如cd-或dvd-rom/ram)、dvd、mp3、磁带，或电子存储介质(诸如ram和rom)，或这些的混合(诸如磁/光存储介质、flash介质或存储型卡)。在一些实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但提供了用于从远程源例如经由互联网获得说明书的方式。
[0321]
实验
[0322]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并不旨在限制发明人视为其发明的范围，也不旨在表示进行了以下实验或它们是可能进行的所有实验。应当理解，以现在时写的示例性描述不一定被执行，而是可以执行该描述以生成其中描述的性质的数据等。已努力确保就所用数字(如，量、温度等)而言的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
[0323]
除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度以摄氏度(℃)计，并且压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：wt＝野生型；bp＝碱基对；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；aa＝氨基酸；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dl＝分升；μl或μl＝微升；ml或ml＝毫升；l或l＝升；μm＝微摩尔；mm＝毫摩尔；m＝摩尔；kda＝千道尔顿；im＝肌内(通过肌内)；ip＝腹膜内(通过腹膜内)；sc或sq＝皮下(通过皮下)；qd＝每日一次；bid＝每天两次；qw＝每周一次；qm＝每月一次；hplc＝高效液相色谱；bw＝体重；u＝单位；ns＝非统计学显著的；pbs＝磷酸盐缓冲盐水；ihc＝免疫组织化学；dmem＝杜尔贝科氏改良的伊戈尔培养基；edta＝乙二胺四乙酸。
[0324]
材料和方法
[0325]
在指出之处或可在下面的实施例中使用以下通用材料和方法：
[0326]
分子生物学中的标准方法在科学文献中有所描述(参见，如，sambrook和russell(2001)molecular cloning,第3版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.；和ausubel等人(2001)current protocols in molecular biology,第1-4卷,john wiley and sons,inc.new york,n.y.，其描述了细菌细胞中的克隆和dna突变形成(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷))。
[0327]
科学文献描述了蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生和蛋白质的糖基化(参见，如，coligan等人(2000)current protocols in protein science,第1-2卷,john wiley and sons,inc.,ny)。
[0328]
如果文献包含测定法或实验程序，则此类测定法或程序可用作评价本文所述化合物的替代基础。
[0329]
所有反应均使用涂有特氟隆的磁力搅拌棒在指示的温度下进行，并且在说明时在惰性气氛下进行。通过tlc(具有荧光f254的硅胶60，其用短波/长波紫外灯可视化)和/或lcms(agilent 1100系列lcms，在254nm下使用二元溶剂体系[含0.1％tfa的mecn/含0.1％tfa的h2o]使用以下任一个柱：agilent eclipse plus c18[3.5μm,4.6mm i.d.x 100mm]进行紫外检测)监测反应。使用自动化系统(由teledyne isco制造的combiflash rf )在硅胶上进行快速色谱，检测波长为254和280nm。反相制备型hplc在agilent 1260infinity系列hplc上进行。使用二元溶剂体系(含0.1％tfa的mecn中/含0.1％tfa的h2o)洗脱样品，在gemini c18柱(21.2mm i.d.x 250mm)上进行梯度洗脱，在254nm下检测。浓缩通过制备型hplc获得的最终化合物。除非另有说明，否则报告的产率是分离的产率。如通过lcms(agilent 1100系列lcms，使用二元溶剂体系[含0.1％tfa的mecn/含0.1％tfa的h2o]使用以下柱：agilent eclipse plus c18柱[3.5μm,4.6mm i.d.x 100mm])在254nm处进行uv检测)测定，所有测定的化合物都被纯化至≥95％纯度。1h nmr谱在配备有oxford as400磁体的varian 400mhz nmr光谱仪上记录。化学位移(δ)被报告为相对于作为内部参考的残留未氘化溶剂的百万分之几(ppm)。
实施例
[0330]
实施例1：3-氟-5-[(7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氨基]苄腈
[0331][0332]
步骤a.向含有4-溴-7-氟-1h-吲唑(5.00g,23.3mmol,1.0当量)的烧瓶中加入3,4-二氢-2h-吡喃(5.92ml,69.9mmol,3.0当量)和dcm(50ml)。添加ptsoh h2o(0.443g,2.33mmol,10mol％)并将反应混合物搅拌16小时。将反应物在饱和nahco3水溶液和etoac之间分配。将水层分离并用额外的etoac反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2,己烷
→
20％etoac)纯化，得到thp保护的吲唑，为黄色油状物(4.02g,13.3mmol,57％)。
[0333]
步骤b.向含有来自步骤a的产物(2.05g,6.88mmol,1.0当量)的烧瓶中加入ch3cn(34ml)。将反应混合物冷却至0℃并加入nasme(0.964g,13.8mmol,2.0当量)。加热至60℃并搅拌4小时后，将反应混合物用h2o猝灭并用etoac稀释。将水层分离并用额外的etoac反萃取。合并有机层，经mgso4干燥，并减压浓缩。粗硫醚无需进一步纯化即可用于下一步。
[0334]
步骤c.将含有来自步骤b的粗硫醚的烧瓶内容物溶解在dcm(34ml)中并冷却至0℃。加入75％mcpba(4.73g,20.6mmol,3.0当量)。将反应混合物升温至室温并加入etoac(15ml)以使混合物均匀。1小时后，将反应混合物冷却至0℃并用饱和na2s2o3水溶液和饱和nahco3水溶液猝灭并用dcm稀释。将水层分离并用额外的dcm反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷至50％etoac)纯化，得到吲唑砜，为白色固体(1.55g,4.32mmol,63％，经2步，esi ms[m na]

，对于c
13h15
brn2o3s,计算值381.0，实测值381.0)。
[0335]
步骤d.向含有来自步骤c的产物(500mg,1.39mmol,1.0当量)的小瓶中加入甲苯(7ml)，然后加入3-氨基-5-氟-苄腈(284mg,2.10mmol,1.5当量)、pd brettphos iii(63mg,0.070mmol,5mol％)、brettphos(37mg,0.070mmol,5mol％)和cs2co3(0.903g,2.78mmol,2.0当量)。将反应混合物用氮气吹扫，加盖，加热至100℃并搅拌15小时。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
50％etoac)纯化，得到吲唑产物(548mg,1.32mmol,95％,esi ms[m na]

，对于c
20h19
fn4o3s，计算值437.1，实测值437.0)。
[0336]
步骤e.将来自步骤d的产物(300mg,0.725mmol)溶解在dcm(4ml)中。加入tfa(2ml)，并将反应混合物升温至
40
℃并搅拌40分钟。将反应物在饱和nahco3水溶液和dcm之间分配。将水层分离并用额外的dcm反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，dcm至60％etoac)纯化，得到标题化合物，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.40(s,1h),9.58(s,1h),8.40(s,1h),7.72(d,j＝8.2hz,1h),7.59
–
7.54(m,1h),7.53
–
7.43(m,2h),7.04(d,j＝8.2hz,1h),3.27(s,3h)。esi ms[m h]

，对于c
15h11
fn4o2s，计
算值331.1，实测值331.0。
[0337]
实施例2：3-氟-5-[(3-氟-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氨基]苄腈
[0338][0339]
步骤a.向中间体4-溴-7-甲基磺酰基-1-(噁烷-2-基)吲唑(1.0g,2.79mmol,1.0当量)于乙腈(7.8ml)和乙酸(0.31ml)中的溶液中加入selectfluor(1.97g,5.58mmol,2.0当量)并将反应物加热至90℃并保持5小时。随后将反应混合物用h2o(20ml)稀释并萃取到etoac(3
×
20ml)中。分离各层，将有机层用盐水洗涤并经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到4-溴-3-氟-7-(甲磺酰基)-1h-吲唑(308mg,38％产率)。esi ms[m h]

，对于c8h6brfn2o2s计算值292.9，实测值293.0。
[0340]
步骤b.向0℃下的来自步骤a的4-溴-3-氟-7-(甲磺酰基)-1h-吲唑(308mg,1.05mmol,1.0当量)于dmf(3.2ml)中的溶液中加入nah(60％的在油中的分散体，47mg,1.16mmol,1.1当量)，并将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。然后滴加2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(0.24ml,1.37mmol,1.3当量)并将反应物温热至室温过夜。然后将反应混合物冷却至0℃，加入h2o(5ml)和etoac(20ml)。分离各层并将有机层用h2o(2
×
5ml)、盐水洗涤并经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(200mg，45％产率)。
[0341]
步骤c.向在氮气下的来自步骤b的产物(200mg，0.47mmol，1.0当量)、3-氨基-5-氟苄腈(78mg，0.56mmol，1.2当量)和碳酸铯(309mg，0.95mmol，2.0当量)在脱气甲苯(2.4ml)中的溶液中添加brettphos pd g3(40mg,0.047mmol,0.10当量)和brettphos(23mg,0.047mmol,0.10当量)。将反应容器抽真空并重新充入氮气。将这个过程重复两次，并将反应物加热到100℃并保持16小时。此时，将反应物经过滤，并将滤饼用etoac洗涤。随后真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(100mg,44％产率)。
[0342]
步骤d.向来自步骤c的产物(100mg,0.20mmol)于ch2cl2(2ml)中的溶液中滴加tfa(2ml)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过反相hplc(mecn/h2o)纯化，得到3-氟-5-[(3-氟-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氨基]苄腈(10mg，14％产率)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.82(d,j＝8.3hz,1h),7.49(ddd,j＝1.9,1.3,0.5hz,
1h),7.43
–
7.37(m,1h),7.25
–
7.37(m,1h),6.99(d,j＝8.3hz,1h),3.18(s,3h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-131.9,-110.8。esi ms[m h]

，对于c
15h10
f2n4o2s计算值349.0，实测值349.1。
[0343]
实施例3：3-氟-5-[(7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0344][0345]
步骤a.向中间体4-溴-7-甲基磺酰基-1-(噁烷-2-基)吲唑(0.99g,2.76mmol,1.0当量)于脱气二噁烷(9.7ml)中的混合物中加入3-羟基-5-氟苄腈(454mg,3.31mmol,1.2当量)、n,n-二甲基甘氨酸(85mg,0.83mmol,0.3当量)、cs2co3(1.80g,5.52mmol,2.0当量)和cui(52mg,0.27mmol,0.1当量)。将反应物加热至120℃并保持16小时。此时，将反应物经过滤，并将滤饼用etoac洗涤。随后在真空中除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至40％的在己烷中的etoac)纯化，得到3-氟-5-[7-甲基磺酰基-1-(噁烷-2-基)吲唑-4-基]氧基苄腈(435mg，38％产率)。esi ms[m na]

，对于c
20h18
fn3o4s计算值438.1，实测值438.0。
[0346]
步骤b.向来自步骤a的产物(40mg,0.096mmol)于ch2cl2(2ml)中的溶液中滴加tfa(2ml)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过反相hplc(mecn/h2o)纯化，得到3-氟-5-[(7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(20mg,63％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.72(s,1h),8.26(s,1h),7.89
–
7.79(m,3h),7.74
–
7.71(m,1h),7.69
–
7.63(m,1h),6.75(d,j＝8.1hz,1h),3.34(s,3h).
19
f nmr(376mhz,dmso-d6)δ-107.2.esi ms[m h]

，对于c
15h10
fn3o3s计算值332.0，实测值332.1。
[0347]
实施例4：4-(2,4-二氟苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑
[0348][0349]
标题化合物以与实施例3类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.35(s,1h),7.79(d,j＝8.2hz,1h),7.70
–
7.52(m,2h),7.34
–
7.22(m,1h),6.46(d,j＝8.2hz,1h),3.32(s,3h).
19
f nmr(376mhz,dmso-d6)δ-125.5,-112.2.esi ms[m h]

，对于c
14h10
f2n2o3s计算值325.0，实测值325.1。
[0350]
实施例5：4-(3-氯苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑
[0351][0352]
标题化合物以与实施例3类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.68(s,1h),8.22(s,1h),7.83(d,j＝8.2hz,1h),7.52(t,j＝8.2hz,1h),7.45
–
7.38(m,2h),7.26
(ddd,j＝8.2,2.3,1.0hz,1h),6.60(d,j＝8.2hz,1h),3.33(s,3h)。esi ms[m h]

，对于c
14h11
cln2o3s，计算值323.0，实测值323.1。
[0353]
实施例6：4-(3,4-二氯苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑
[0354][0355]
标题化合物以与实施例3类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.69(s,1h),8.26(s,1h),7.82(d,j＝8.2hz,1h),7.76(d,j＝8.6hz,1h),7.68(d,j＝2.7hz,1h),7.30(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),6.66(d,j＝8.2hz,1h),3.32(s,3h)。esi ms[m h]

，对于c
14h10
cl2n2o3s，计算值357.0，实测值357.0。
[0356]
实施例7：4-(3-氯-5-氟苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑
[0357][0358]
标题化合物以与实施例3类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.71(s,1h),8.25(s,1h),7.84(d,j＝8.1hz,1h),7.44
–
7.39(m,1h),7.31
–
7.22(m,2h),6.73(d,j＝8.2hz,1h),3.32(s,3h)。esi ms[m h]

for c
14h10
clfn2o3s，计算值341.0，实测值341.0。
[0359]
实施例8：3-[(3-氯-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈
[0360][0361]
向3-氟-5-[(7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(实施例3)(14.6mg,0.032mmol,1.0当量)于mecn(1ml)中的溶液加入k2co3(4.6mg,0.032mmol,1.0当量)和n-氯代琥珀酰亚胺(9.0mg,0.065mmol,2.0当量)。将反应物在室温搅拌16小时。此时，真空除去溶剂，得到粗残余物，将其通过反相hplc(mecn/h2o)纯化，得到3-[(3-氯-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(5.0mg，41％产率)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.95(d,j＝8.2hz,1h),7.51
–
7.45(m,1h),7.45
–
7.42(m,1h),7.39
–
7.34(m,1h),6.79(d,j＝8.2hz,1h),3.23(3h,s)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-108.8。esi ms[m h]

，对于c
15
h9clfn3o3s计算值366.0，实测值366.1。
[0362]
实施例9：3-氯-4-(3-氯-5-氟苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑
[0363]
[0364]
标题化合物以与实施例8类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.87(s,1h),7.89(d,j＝8.2hz,1h),7.43
–
7.36(m,1h),7.28
–
7.20(m,2h),6.77(d,j＝8.2hz,1h),3.34(s,3h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h9cl2fn2o3s，计算值375.0，实测值375.0。
[0365]
实施例10：4-(3-氰基-5-氟苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑-3-甲腈
[0366][0367]
向3-[(3-氯-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(实施例8，19mg,0.052mmol,1.0当量)在脱气的二噁烷(0.10ml)中的溶液中加入zn(cn)2(4.1mg,0.035mmol,0.66当量)，然后加入
t
buxphos pd g3(4.2mg,0.0052mmol,0.1当量)和
t
buxphos(2.3mg,0.0052mmol,0.1当量)和脱气的于h2o中的koac溶液(0.0625n,0.1ml,0.12当量)。将反应物加热至100℃并保持2小时。此时，真空除去溶剂，得到粗残余物，将其通过反相hplc(mecn/h2o)纯化，得到4-(3-氰基-5-氟苯氧基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑-3-甲腈(10mg，53％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.96(d,j＝8.2hz,1h),7.88
–
7.81(m,1h),7.80
–
7.69(m,2h),6.93(d,j＝8.2hz,1h),3.36(s,3h)。
19
f nmr(376mhz,dmso-d6)δ-107.1。esi ms[m h]

，对于c
16
h9fn4o3s计算值357.0，实测值357.1。
[0368]
实施例11：3-氟代-5-{[3-(羟甲基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基]氧基}苄腈
[0369][0370]
步骤a.向3-氟-5-[(7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(实施例8)(435mg,1.04mmol,1.0当量)于dmf(4ml)中的溶液加入k2co3(287mg,2.08mmol,2.0当量)和i2(529mg,2.08mmol,2.0当量)。将反应物加热至50℃并保持3小时。此时，将反应物用etoac(30ml)稀释，用饱和水性na2s2o3和盐水洗涤。分离各层，将有机层经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至30％的在己烷中的etoac)纯化，得到3-[(3-碘-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(330mg，70％产率)。esi ms[m h]

，对于c
15
h9ifn3o3s计算值457.9，实测值458.0。
[0371]
步骤b.向来自a的3-[(3-碘-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(40mg,0.087mmol,1.0当量)于脱气dmf(0.44ml)中的溶液加入(三丁基锡烷基)甲醇(42mg,0.13mmol,1.5当量)和pdcl2d ppf(9.5mg,0.013mmol,0.15当量)。将反应物加热至105℃并保持4小时。此时，真空除去溶剂，得到粗残余物，将其通过反相hplc(m ecn/h2o)纯化，得到3-氟-5-{[3-(羟甲基)-7-甲磺酰基-1h-吲唑-4-基]氧基}苄腈。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.85
–
7.82(m,1h),7.77(d,j＝9.0hz,1h),7.75
–
7.73(m,1h),7.72
–
7.68(m,1h),6.82(s,2h),6.52(s,1h),6.27(d,j＝8.9hz,1h),3.18(s,3h)。
19
f nmr(376mhz,dmso-d6)δ-107.1。esi ms[m h]

，对于c
16h12
fn3o4s计算值361.0，实测值361.0。
[0372]
实施例12：5-[7-(二氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基氧基]-3-氟苄腈
[0373][0374]
步骤a.在-78℃下将3-氟-5-[7-甲基磺酰基-1-(噁烷-2-基)吲唑-4-基]氧基苄腈(实施例3，步骤a的产物)(300mg,0.72mmol)于thf(1ml)中的溶液滴加至lihmds(1m/thf,0.87ml)于脱气thf(3.6ml)中的溶液中。45分钟后，滴加三氟乙酸2,2,2-三氟乙酯(0.21g,1.08mmol)。将所得混合物在-78℃下搅拌15分钟，然后用1m硫酸猝灭并在室温下搅拌1小时。粗产物无需进一步纯化即可使用。
[0375]
步骤b.在室温下，将于mecn(1.9ml)中的来自步骤a的产物(0.72mmol)用selectfluor(561mg,1.6mmol)处理。将混合物搅拌48小时，然后用etoac稀释并通过过滤。柱色谱(sio2,0
→
30％etoac/hex)得到所需产物(34mg，10％产率，两步)。esi ms[m h]

，对于c
17
h7f6n3o4s，计算值464.0，实测值464.0。
[0376]
步骤c.将来自步骤b的产物(34mg,0.07mmol)溶解在thf(1ml)中。加入一滴水，然后加入et3n(0.03ml,0.21mmol)。观察到完全水解后，将反应物浓缩到硅藻土上并通过柱色谱(sio2,0
→
40％etoac/hex)纯化，得到所需产物(15mg，58％产率)，为白色固体。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ11.13(s,1h),8.17(s,1h),7.89(d,j＝8.3hz,1h),7.38
–
7.29(m,2h),7.21(dt,j＝8.8,2.3hz,1h),6.68(d,j＝8.3hz,1h),6.30(t,j＝53.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f3n3o3s计算值368.0，实测值368.0。
[0377]
实施例13：5-[7-(二氟甲基磺酰基)-3-碘-1h-吲唑-4-基氧基]-3-氟苄腈
[0378][0379]
在室温下将5-[7-(二氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基氧基]-3-氟苄腈(实施例12)(61mg,0.17mmol)于mecn(1.6ml)中的溶液用k2co3(46mg,0.34mmol)处理，然后用i2(85mg,0.34mmol)处理。3小时后，将反应物过滤并减压浓缩。通过柱色谱(sio2,0
→
50％etoac/hex)纯化，得到所需产物，为白色固体。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ11.18(s,1h),7.89(d,j＝8.4hz,1h),7.37
–
7.29(m,2h),7.21(dt,j＝8.8,2.3hz,1h),6.64(d,j＝8.3hz,1h),6.29(t,j＝53.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f3in3o3s计算值393.9，实测值494.0。
[0380]
实施例14：3-氟-5-[7-(三氟甲基)-1h-吲唑-4-基氨基]苄腈
[0381][0382]
步骤a：向0℃下的4-溴-7-(三氟甲基)-1h-吲唑(102mg,0.38mmol)于dmf(3.8ml)中的溶液中加入氢化钠(60wt％的于油中的分散体，18mg,0.46mmol)。将反应物在0℃下搅拌15分钟，然后加入2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(0.081ml,0.46mmol)，并将反应物搅拌30分钟，然后用h2o猝灭。将反应物用etoac和h2o稀释。将有机物用水(2x)和盐水洗涤，经mgso4干燥并减压浓缩。获得的粗产物无需进一步纯化即可使用。
[0383]
步骤b：将来自步骤a的产物(0.38mmol)、3-氨基-5-氟苄腈(78mg,0.57mmol)、pd-brettphos-g3(36mg,0.04mmol)、brettphos(21mg,0.04mmol)和cs2co3(248mg,0.76mmol)合并在烧瓶中，并抽真空并用n2回填数次。添加叔丁醇(3.8ml)并将混合物密封并加热至85℃过夜。冷却至室温后，将反应物用etoac和h2o稀释。将有机物用水(2x)和盐水洗涤，经mgso4干燥并减压浓缩。将粗产物在90％v/v tfa/h2o中复溶并在室温下搅拌30分钟。将反应物用甲苯稀释并减压浓缩。通过制备型hplc(c18,mecn/h2o,0.1％tfa梯度)进行纯化，得到所需产物(21mg,17％，两步)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.54(s,1h),9.41(s,1h),8.33(s,1h),7.61
–
7.54(m,1h),7.49(s,1h),7.45
–
7.34(m,2h),6.99(d,j＝8.0hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f4n4，计算值321.1，实测值321.1。
[0384]
实施例15：3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0385][0386]
步骤a.将3-溴-6-氯-2-氟苯甲醛(25g,105mmol)和肼一水合物(50ml)在1,2-二甲氧基乙烷(125ml)中的混合物在回流下加热过夜。将反应混合物冷却至室温，浓缩。将残余
物用etoac稀释并用h2o洗涤。分离有机层，经mgso4干燥，过滤并蒸发，得到黄白色固体。将粗产物用己烷洗涤并直接用于下一步(22.9g,94％)。
[0387]
步骤b.将来自步骤a的产物(22.9g,99.1mmol)溶解在dmf(220ml)中并冷却至0℃(冰浴)，缓慢地分批添加nah(60％于矿物油中)(5.15g,128.8mmol,1.3当量)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在0℃下滴加氯甲基甲基醚(10.4g,128.8mmol，1.3当量)于dmf(30ml)中的溶液。使它升温至室温并搅拌3小时。将反应混合物用h2o(1.5l)小心地猝灭。收集固体并用h2o洗涤。用于下一步骤而无需进一步纯化。
[0388]
步骤c.将来自步骤b的产物(99.1mmol)与xantphos(5.73g,9.9mmol,0.1当量)、pd2(dba)3(4.54g,4.96mmol,0.05当量)、dipea(34.5ml,198.2mmol,2.0当量)和苄硫醇(12.2ml,104mmol,1.05当量)在n2下合并在脱气的甲苯(250ml)中。将反应混合物在100℃下搅拌8小时。冷却后，通过经由过滤除去固体。用etoac洗涤浓缩溶液。将粗物质通过柱色谱(sio2，0至25％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(25.8g；两步82％)。
[0389]
步骤d.将来自步骤c的产物(25.8g,80.8mmol,)与四丁基氯化铵(56.1g,202mmol,2.5当量)和h2o(3.64g,202mmol,2.5当量)合并于mecn(270ml)中。分批加入n-氯代琥珀酰亚胺28.1g,210mmol,2.6当量)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后将更多的n-氯代琥珀酰亚胺(5.4g,40.4mmol,0.5当量)加入到反应混合物中。让它搅拌15分钟，然后加入另一批n-氯代琥珀酰亚胺(5.4g,40.4mmol,0.5当量)。让它搅拌15分钟。浓缩反应混合物。将残余物用etoac稀释并用h2o洗涤。分离有机层，经mgso4干燥、过滤并蒸发。将粗物质通过柱色谱(sio2，0至25％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(14.5g；61％)。
[0390]
步骤e.将来自步骤d的产物(14.5g,49mmol,)与18-冠醚-6(0.65g,2.4mmol,0.05当量)和kf(11.4g,197mmol,4.0当量)合并于mecn(75ml)中。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物用h2o稀释，用etoac萃取。分离有机层，用h2o洗涤，经mgso4干燥，过滤并蒸发。将粗物质通过柱色谱(sio2，0至25％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(8.0g；56％)。
[0391]
步骤f.将来自步骤e的产物(4.2g,14.4mmol)与khf2(0.34g,4.32mmol,0.3当量)在n2下合并于dmso(30ml)中。将混合物超声处理2分钟。将tmscf3(4.08g,28.8mmol,2.0当量)滴加到混合物中。在室温下搅拌20分钟之后，将反应混合物用h2o稀释，用etoac萃取。分离有机层，用h2o洗涤4次，经mgso4干燥，过滤并蒸发。将粗物质通过柱色谱(sio2，0至25％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(4.2g；88％)。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.35(s,1h),8.19(d,j＝8.2hz,1h),7.47
–
7.37(d,j＝8.2hz,1h),6.07(s,2h),3.36(s,3h)。
[0392]
步骤g.向来自步骤f的产物(400mg,1.21mmol,1.0当量)于dmf(7.1ml)中的混合物中加入3-羟基-5-氟苄腈(315mg,2.42mmol,2.0当量)和碳酸钾(334mg,2.42mmol,2.0当量)。将反应物加热至90℃并保持5小时。完成后，将反应物用h2o稀释并萃取到etoac(2
×
30ml)中。分离各层，将有机层用盐水洗涤并经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到3-氟-5-{[1-(甲氧基甲基)-7-(三氟甲磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基}苄腈(350mg,74％产率)。esi ms[m h]

，对于c
15h11
f4n3o4s计算值430.0，实测值430.1。
[0393]
步骤h.向来自步骤g的中间体溶液(350mg,0.80mmol)中加入4n于二噁烷中的hcl(5ml)，并将反应物在室温搅拌1小时。随后在真空中除去溶剂并通过柱色谱(sio2，梯度0％
至50％的在己烷中的etoac)纯化粗残余物，得到3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(265mg，86％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ11.21(s,1h),8.23(s,1h),7.96(d,j＝8.4hz,1h),7.45
–
7.31(m,2h),7.26
–
7.22(m,1h),6.68(d,j＝8.4hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-104.8,-79.0。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f4n3o3s计算值386.0，实测值386.0。
[0394]
实施例16：4-苯氧基-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0395][0396]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.12(s,1h),7.85(d,j＝8.5hz,1h),7.54
–
7.44(m,2h),7.40
–
7.30(m,1h),7.23
–
7.16(m,2h),6.58(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h9f3n2o3s；计算值343.0，实测值343.0。
[0397]
实施例17：4-(对-氯苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0398][0399]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.17(s,1h),7.86(d,j＝8.5hz,1h),7.51
–
7.40(m,2h),7.19
–
7.10(m,2h),6.57(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8clf3n2o3s；计算值376.9，实测值377.0。
[0400]
实施例18：4-(对-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0401][0402]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.16(s,1h),7.85(d,j＝8.5hz,1h),7.18(d,j＝6.2hz,4h),6.53(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8f4n2o3s；计算值361.0，实测值361.0。
[0403]
实施例19：对-[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基氧基]苄腈
[0404][0405]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.18(s,1h),7.92(d,j＝8.4hz,1h),7.85
–
7.75(m,2h),7.36
–
7.28(m,2h),6.67(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f3n3o3s；计算值368.0，实测值368.0。
[0406]
实施例20：4-(对-甲氧基苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0407][0408]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.11(s,1h),7.83(d,j＝8.5hz,1h),7.17
–
7.08(m,2h),7.03
–
6.94(m,2h),6.55(d,j＝8.5hz,1h),3.85(s,3h)。esi ms[m h]

，对于c
15h11
f3n2o4s；计算值373.0，实测值373.1。
[0409]
实施例21：4-[(6-甲基吡嗪-2-基)氧基]-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑
[0410][0411]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.53
–
8.46(m,1h),8.45
–
8.40(m,1h),8.20(s,1h),8.11(d,j＝8.4hz,1h),7.20(d,j＝8.4hz,1h),2.42(s,3h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-81.1。esi ms[m h]

，对于c
13
h9f3n4o3s计算值359.0，实测值359.1。
[0412]
实施例22：5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苯-1,3-二甲腈
[0413][0414]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.34(s,1h),8.20
–
8.19(m,1h),8.11
–
8.09(m,2h),8.07(d,j＝8.4hz,1h),6.78(d,j＝8.4hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-80.9。esi ms[m h]

，对于c
16
h7f3n4o3s计算值393.0，实测值393.0。
[0415]
实施例23：4-[(5-氯吡啶-3-基)氧基]-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑
[0416][0417]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.60(dd,j＝2.1,0.5hz,1h),8.56(dd,j＝2.4,0.5hz,1h),8.34(s,1h),8.06(d,j＝8.4hz,1h),7.99(dd,j＝2.0hz,1h),6.75(d,j＝8.4hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-81.1。esi ms[m h]

，对于c
13
h7clf3n3o3s计算值377.9，实测值378.0。
[0418]
实施例24：5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]吡啶-3-甲腈
[0419][0420]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.92(dd,j＝1.7,0.5hz,1h),8.88(dd,j＝2.7,0.5hz,1h),8.37(s,1h),8.28(dd,j＝2.7,1.7hz,1h),
8.07(d,j＝8.4hz,1h),6.78(d,j＝8.4hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-77.7。esi ms[m h]

，对于c
14
h7f3n4o3s计算值369.0，实测值369.0。
[0421]
实施例25：4-(3,5-二氟苯氧基)-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑
[0422][0423]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.28(s,1h),8.05(d,j＝8.5hz,1h),7.07
–
6.96(m,3h),6.78(d,j＝8.5hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-108.9,-81.2。esi ms[m h]

，对于c
14
h7f5n2o3s计算值379.0，实测值379.0。
[0424]
实施例26：4-(3,5-二氟苯氧基)-7-(三氟甲基)-1h-吲唑
[0425][0426]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.87(s,1h),8.20(s,1h),7.73(d,j＝8.0hz,1h),7.35
–
7.17(m,1h),7.13
–
7.04(m,2h),6.71(d,j＝8.1hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,dmso-d6)δ-107.8,-107.7,-59.6。esi ms[m h]

，对于c
14
h7f5n2o计算值315.0，实测值315.1。
[0427]
实施例27：3-氯-5-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0428][0429]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.24(s,1h),7.96(dt,j＝8.4,0.5hz,1h),7.65
–
7.59(m,1h),7.48(dd,j＝2.3,1.9hz,1h),7.42(dd,j＝2.3,1.3hz,1h),6.64(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7clf3n3o3s，计算值402.7，实测值402.0。
[0430]
实施例28：3-甲基-5-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0431][0432]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.20(s,1h),7.90(dd,j＝8.4,0.6hz,1h),7.46
–
7.45(m,1h),7.33
–
7.27(m,2h),6.57(d,j＝8.5hz,1h),2.49
–
2.42(m,3h)。esi ms[m h]

，对于c
16h10
f3n3o3s，计算值382.3，实测值382.1。
[0433]
实施例29：4-[3-氯-5-(三氟甲氧基)苯氧基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0434][0435]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.23(s,1h),7.93(dd,j＝8.4,0.6hz,1h),7.25
–
7.22(m,1h),7.18-7.09(dd,j＝1.8hz,1h),7.03
–
7.01(m,1h),6.66(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7clf6n2o4s，计算值461.7，实测值461.1。
[0436]
实施例30：7-(三氟甲基磺酰基)-4-(3,4,5-三氟苯氧基)-1h-吲唑
[0437][0438]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.23(s,1h),7.91(dt,j＝8.4,0.6hz,1h),6.96
–
6.85(m,2h),6.63(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h6f6n2o3s，计算值397.3，实测值397.1。
[0439]
实施例31：4-(3-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0440][0441]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.18(s,1h),7.88(dt,j＝8.4,0.6hz,1h),7.51
–
7.41(m,1h),7.09
–
7.04(m,1h),7.03
–
7.00(m,1h),6.98
–
6.91(m,1h),6.62(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8f4n2o3s，计算值361.3，实测值361.1。
[0442]
实施例32：4-[3-(三氟甲基)苯氧基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0443][0444]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.21(s,1h),7.90(dq,j＝8.5,0.5hz,1h),7.69
–
7.60(m,2h),7.51
–
7.49(m,1h),7.46
–
7.39(m,1h),6.57(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f6n2o3s，计算值411.3，实测值411.0。
[0445]
实施例33：4-(4-氯-3-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0446][0447]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.22(s,1h),7.90(dt,j＝8.4,0.5hz,1h),7.52(ddd,j＝8.6,8.2,0.3hz,1h),7.09
–
7.03(m,1h),7.01-6.97(m,1h),6.62(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h7clf4n2o3s，计算值395.7，实测值395.0。
[0448]
实施例34：2-氟-4-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0449][0450]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.21(s,1h),8.00
–
7.94(m,1h),7.78
–
7.71(m,1h),7.13
–
7.05(m,2h),6.77(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f4n3o3s，计算值386.3，实测值386.1。
[0451]
实施例35：2-氯-5-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0452][0453]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.24(d,j＝1.7hz,1h),7.92(dt,j＝8.5,0.6hz,1h),7.67
–
7.61(m,1h),7.55
–
7.53(m,1h),7.43
–
7.40(m,1h),6.59(d,j＝8.3hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7clf3n3o3s，计算值402.7，实测值402.0。
[0454]
实施例36：2-氟-5-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0455][0456]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.24(s,1h),7.91(dd,j＝8.4,0.5hz,1h),7.54
–
7.44(m,2h),7.40
–
7.33(m,1h),6.54(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f4n3o3s，计算值386.3，实测值386.1。
[0457]
实施例37：4-(3,4-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0458][0459]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ9.43(s,1h),8.22(s,1h),7.89(dd,j＝8.5,0.6hz,1h),7.34
–
7.25(m,1h),7.11
–
7.06(m,1h),6.99
–
6.95(m,1h),6.58(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h7f5n2o3s，计算值379.3，实测值379.0。
[0460]
实施例38：4-(3-氯-4-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0461][0462]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.22(s,1h),7.89(d,j＝8.4hz,1h),7.32
–
7.25(m,2h),7.13
–
7.09(m,1h),6.56(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h7clf4n2o3s，计算值395.7，实测值395.1。
[0463]
实施例39：3-(三氟甲基)-5-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0464][0465]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.23(s,1h),7.96(d,j＝8.4hz,1h),7.88(s,1h),7.73(d,j＝1.9hz,1h),7.69(s,1h),6.63(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
16
h7f6n3o3s，计算值436.0，实测值436.1。
[0466]
实施例40：4-(3-氯-5-氟苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0467][0468]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.97(s,1h),8.41(d,j＝1.3hz,1h),8.04(d,j＝8.5hz,1h),7.62
–
7.27(m,3h),6.71(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h7clf4n2o3s，计算值395.0，实测值395.1。
[0469]
实施例41：4-(3-氯苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0470]
[0471]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.93(s,1h),8.38(s,1h),8.04(d,j＝8.5hz,1h),7.64
–
7.52(m,2h),7.45(ddd,j＝8.1,2.0,1.0hz,1h),7.36(ddd,j＝8.1,2.3,1.0hz,1h),6.60(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8clf3n2o3s，计算值377.0，实测值377.0。
[0472]
实施例42：3-[[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]氧基]苄腈
[0473][0474]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.96(s,1h),8.41(s,1h),8.03(d,j＝8.5hz,1h),7.99(d,j＝1.7hz,1h),7.86(ddd,j＝6.0,2.6,1.5hz,1h),7.77
–
7.70(m,3h),6.62(d,j＝8.5hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f3n3o3s，计算值368.0，实测值368.1。
[0475]
实施例43：4-氯-3-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0476][0477]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.53(s,1h),8.27(dd,j＝1.8,0.5hz,1h),8.06(d,j＝8.5hz,1h),8.02
–
7.95(m,2h),6.63(d,j＝8.4hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7clf3n3o3s，计算值402.0，实测值402.0。
[0478]
实施例44：4-氟-3-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0479][0480]
标题化合物以与实施例15类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.54(s,1h),8.30(dd,j＝7.5,2.1hz,1h),8.07(d,j＝8.5hz,1h),8.02(ddd,j＝8.6,4.4,2.1hz,1h),7.81(dd,j＝10.4,8.7hz,1h),6.74(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f4n3o3s，计算值386.0，实测值386.0。
[0481]
实施例45：3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氨基]苄腈
[0482][0483]
步骤a.向搅拌着的4-氯-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)吲唑
(48mg,0.12mmol,1.0当量)在甲苯(0.78ml)中的溶液中加入3-氨基-5-氟苄腈(20mg,0.14mmol,1.2当量)、brettphos pd g3(10.6mg,0.012mmol,0.1当量)、brettphos(6.3mg,0.012mmol,0.1当量)，然后加入cs2co3(77mg,0.23mmol,2.0当量)。将混合物在超声处理的同时脱气5分钟，然后在剧烈搅拌下加热过夜。冷却至室温后，将反应物在h2o和etoac之间分配。将有机物用h2o(3x)和盐水洗涤，经mgso4干燥，然后真空浓缩。将粗产物通过柱色谱(sio2，己烷/etoac)纯化，得到所需的芳基胺产物(47mg，80％产率)。
[0484]
步骤b.在室温下向搅拌的3-氨基-5-氟苄腈(47mg,0.09mmol,1.0当量)溶液中加入纯tfa(1ml)，然后加热2小时。然后减压蒸发tfa并使用反相hplc纯化所得粗品，得到芳基胺吲唑(15mg，42％)。1h nmr(400mhz,cd3od-d4)δ8.38(s,1h),7.88(d,j＝8.5hz,1h),7.58(t,j＝1.9hz,1h),7.53
–
7.48(m,1h),7.34(dd,j＝8.1,3.7hz,1h),7.05(d,j＝8.6hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od-d4)δ
–
81.4(s,3f),
–
110.2(s,1f)。esi ms[m h]

，对于c
15
h8f4n4o2s，计算值385.3，实测值385.1。
[0485]
实施例46：(3,5-二氟苯基)[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]胺
[0486][0487]
标题化合物以与实施例45类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.13(s,1h),7.84(d,j＝8.5hz,1h),6.94(d,j＝8.5hz,1h),6.91
–
6.81(m,3h),6.72(tt,j＝2.3,8.8hz,1h)。esi ms[m h]

，用于c
14
h8f5n3o2s；计算值378.0，实测值378.1。
[0488]
实施例47：(3-氯-5-氟苯基)[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基]胺
[0489][0490]
标题化合物以与实施例45类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.10(s,1h),7.83(d,j＝8.5hz,1h),7.14(m,1h),7.04
–
6.93(m,2h),6.91(d,j＝8.5hz,1h),6.81(br.,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8clf4n3o2s；计算值394.0，实测值394.0。
[0491]
实施例48：2-氟-5-[7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基氨基]苄腈
[0492][0493]
标题化合物以与实施例45类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.07(s,1h),7.81(d,j＝8.5hz,1h),7.63
–
7.57(m,2h),7.34(m,1h),6.81(br.,1h),6.68(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，用于c
15
h8f4n4o2s；计算值385.0，实测值385.1。
[0494]
实施例49：6,8-二氟-1-(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)-1,2,3,4-四氢喹啉
[0495][0496]
标题化合物以与实施例45类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.86(d,j＝8.6hz,1h),7.66(s,1h),7.03
–
6.95(m,1h),6.93
–
6.85(m,1h),6.79(d,j＝8.6hz,1h),4.14
–
4.04(m,2h),2.92
–
2.81(m,2h),2.15
–
2.01(m,2h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-116.5,-81.4。esi ms[m h]

，对于c
17h12
f5n3o3s计算值418.1，实测值418.0。
[0497]
实施例50：n-[(2-氟苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0498][0499]
将4-氯-1-(甲氧基甲基)-7-(三氟甲基磺酰基)吲唑(33mg,0.1mmol,1当量)、2-氟苄胺(3滴)和ipr2net(4滴)在乙醇(0.25ml)中的溶液加热至回流，直到通过lcms分析确定起始吲唑被消耗。在温和的n2气流下除去溶剂。将残余物立即溶解在含3m hcl的甲醇(～0.5ml)中并在室温下搅拌直至如通过lcms分析确定完成。在温和的n2气流下除去溶剂。通过制备型hplc(5
–
95％mecn/h2o 0.1％tfa)纯化残余物，并将含有产物的级分冻干，得到呈白色固体的产物。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.29(bs,1h),8.69(t,j＝5.9hz,1h),8.49(bs,1h),7.68(d,j＝8.7hz,1h),7.47
–
7.31(m,2h),7.31
–
7.13(m,2h),6.44(d,j＝8.8hz,1h),4.67(d,j＝5.8hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h11
f4n3o2s计算值374.1，实测值374.0。
[0500]
实施例51：n-苄基-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0501][0502]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.26(bs,1h),8.79(t,j＝6.1hz,1h),8.48(bs,1h),7.65(d,j＝8.7hz,1h),7.44
–
7.33(m,4h),7.30
–
7.23(m,1h),6.42(d,j＝8.8hz,1h),4.64(d,j＝5.9hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h12
f3n3o2s计算值356.1，实测值356.1。
[0503]
实施例52：n-[(4-氟苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0504][0505]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.28(bs,1h),8.76(t,j＝6.1hz,1h),8.47(bs,1h),7.65(d,j＝8.7hz,1h),7.50
–
7.35(m,2h),7.29
–
7.10(m,2h),6.42(d,j＝8.8hz,1h),4.62(d,j＝6.0hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h11
f4n3o2s计算值374.1，实测值374.1。
[0506]
实施例53：n-[(2,4-二氟苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0507][0508]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.26(s,1h),8.61(t,j＝5.8hz,1h),8.45(bs,1h),7.66(d,j＝8.7hz,1h),7.44(td,j＝8.7,6.6hz,1h),7.28(ddd,j＝10.6,9.3,2.6hz,1h),7.06(tdd,j＝8.5,2.6,1.0hz,1h),6.42(d,j＝8.8hz,1h),4.60(d,j＝5.7hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h10
f5n3o2s计算值392.1，实测值392.1。
[0509]
实施例54：n-[(2-氯-4-氟苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0510][0511]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.32(bs,1h),8.67(t,j＝5.7hz,1h),8.48(bs,1h),7.69(d,j＝8.7hz,1h),7.54(dd,j＝8.8,2.6hz,1h),7.46(dd,j＝8.7,6.2hz,1h),7.23(td,j＝8.5,2.7hz,1h),6.37(d,j＝8.7hz,1h),4.65(d,j＝5.6hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h10
clf4n3o2s计算值408.0，实测值408.0。
[0512]
实施例55：n-[[4-氟-2-(三氟甲基)苯基]甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0513][0514]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.35(bs,1h),8.73(t,j＝5.7hz,1h),8.49(bs,1h),7.78
–
7.66(m,2h),7.66
–
7.49(m,2h),6.29(d,j＝8.7hz,1h),4.74(d,j＝5.6hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
16h10
f7n3o2s计算值442.1，实测值442.0。
[0515]
实施例56：n-[(3,5-二氯苯基)甲基]-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-胺
[0516][0517]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.33(bs,1h),8.73(t,j＝6.2hz,1h),8.46(bs,1h),7.69(d,j＝8.7hz,1h),7.54(t,j＝1.9hz,1h),7.47(d,j＝1.9hz,2h),6.42(d,j＝8.7hz,1h),4.66(d,j＝6.1hz,2h)。esi ms[m h]

，对于c
15h10
cl2f3n3o2s计算值424.0，实测值424.0。
[0518]
实施例57：n-(3,3-二氟环丁基)-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-胺
[0519][0520]
标题化合物以与实施例50类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od-d4)δ8.36(s,1h),7.78(d,j＝8.6hz,1h),6.38(d,j＝8.8hz,1h),4.22
–
4.15(m,1h),3.24
–
3.11(m,2h),2.81
–
2.68(m,2h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od-d4)δ
–
81.71(s,3f),
–
85.1(d,j＝280hz,1f),
–
98.0(d,j＝235hz,1f)。esi ms[m h]

，对于c
12h10
f5n4o2s，计算值356.0，实测值356.1。
[0521]
实施例58：3-氟-5-[(3-甲基-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0522][0523]
步骤a.向0℃下的3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(实施例15)(266mg,0.69mmol,1.0当量)于dmf中的溶液中滴加溴(0.106ml,2.06mmol,3.0当量)。将反应物在室温搅拌3.5小时。此时，将反应物用etoac(30ml)稀释，用饱和na2s2o3水溶液和盐水洗涤。分离各层，将有机层经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至30％的在己烷中的etoac)纯化得到3-[(3-溴-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(210mg，66％产率)。esi ms[m h]

，对于c
15
h6brf4n3o3s计算值463.9，实测值463.9。
[0524]
步骤b.向0℃下的来自步骤a的产物(210mg,0.45mmol,1.0当量)于dmf(2.3ml)中的溶液中加入nah(60％的在油中的分散体，22mg,0.54mmol,1.2当量)并将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。然后滴加2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(0.10ml,0.58mmol,1.3当量)并将反应物温热至室温过夜。然后将反应混合物冷却至0℃，添加h2o(5ml)和etoac(20ml)。分离各层并将有机层用h2o(2
×
5ml)、盐水洗涤并经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(200mg，定量产率)。
[0525]
步骤c.向在氮气下的来自步骤b的产物(130mg,0.22mmol,1.0当量)于脱气的二噁烷(1.0ml)和h2o(0.2ml)中的溶液中加入三甲基硼氧六环(trimethylboroxine)(0.040ml,0.28mmol,1.3当量)、k2co3(90mg,0.65mmol,3.0当量)和pdcl2dppf(16mg,0.022mmol,0.1当量)。将反应容器抽真空并重新充入氮气。这个过程重复两次，并将反应物加热到120℃并保持16小时。此时，将反应物经过滤，并将滤饼用etoac洗涤。随后真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(20mg,17％产率)。
[0526]
步骤d.向来自步骤c的产物(20mg,0.037mmol)的溶液中加入4n的于二噁烷中的hcl(2ml)并将反应物在室温搅拌1小时。随后在真空中除去溶剂并通过反相hplc(mecn/h2o)纯化粗残余物，得到3-氟-5-[(3-甲基-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(5.0mg，34％产率)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.08
–
7.93(m,1h),7.67
–
7.58(m,2h),7.57
–
7.53(m,1h),6.64(d,j＝8.5hz,1h),2.73(s,3h)。
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-108.2,-81.2。esi ms[m h]

，对于c
16
h9f4n3o3s计算值400.0，实测值400.0。
[0527]
实施例59：4-[(3-氯苯基)甲基]-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑
[0528][0529]
步骤a.向在氮气下的4-氯-1-(甲氧基甲基)-7-(三氟甲基磺酰基)吲唑(200mg,0.609mmol,1.0当量)和pd(amphos)cl2(43.1mg,0.0609mmol,0.10当量)的混合物中加入3-氯苄基氯化锌(0.5m于thf中，1.46ml，1.2当量)。将反应物在室温搅拌1小时。此时，将反应物用饱和nh4cl水溶液猝灭并萃取到etoac(2
×
20ml)中。分离各层，将有机层用盐水洗涤并经无水na2so4干燥。真空除去溶剂得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到4-[(3-氯苯基)甲基]-1-(甲氧基甲基)-7-(三氟甲磺酰基)-1h-吲唑(200mg,78％产率)。esi ms[m h]

，对于c
17h14
clf3n2o3s计算值419.0，实测值419.0。
[0530]
步骤b.向来自步骤a的4-[(3-氯苯基)甲基]-1-(甲氧基甲基)-7-(三氟甲磺酰基)-1h-吲唑(40mg,0.096mmol)的溶液中加入4m的于二噁烷中的hcl(3ml)并将反应物在室温搅拌1小时。随后在真空中除去溶剂并通过反相hplc(mecn/h2o)纯化粗残余物，得到4-[(3-氯苯基)甲基]-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑(27mg，76％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(s,1h),7.97(dd,j＝7.7,0.5hz,1h),7.29
–
7.26(m,2h),7.25
–
7.22(m,1h),7.20
–
7.17(m,1h),7.14
–
7.17(m,1h),4.40(s,2h)。
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-79.0。esi ms[m h]

，对于c
15h10
clf3n2o2s计算值375.0，实测值375.0。
[0531]
实施例60：4-(3-氰基-5-氟苯氧基)-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-3-甲腈
[0532][0533]
标题化合物以与实施例10类似的方式合成。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.18(d,j＝8.5hz,1h),7.72
–
7.60(m,3h),6.91(d,j＝8.5hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-108.0,-80.9。esi ms[m h]

，对于c
16
h6f4n4o3s计算值411.0，实测值411.0。
[0534]
实施例61：3-[(3-氯-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈
[0535][0536]
向3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(实施例15)(80mg,0.20mmol,1.0当量)在dmf(2ml)中的溶液加入k2co3(55.3mg,0.40mmol,2.0当量)和n-氯代琥珀酰亚胺(53.4mg,0.40mmol,2.0当量)并将反应混合物在室温下搅拌3小时。随后在真空中除去溶剂从而得到粗残余物，将其通过柱色谱(sio2，梯度0％至20％的在己烷中的etoac)纯化从而得到3-[(3-氯-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]-5-氟苄腈(27mg，32％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ10.87(s,1h),7.96(d,j＝8.5hz,1h),7.47
–
7.32(m,2h),7.25
–
7.22(m,1h),6.63(d,j＝8.4hz,1h)。
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-104.7,-78.9。esi ms[m-h]-，对于c
15
h6clf4n3o3s计算值417.9，实测值418.0。
[0537]
实施例62：间-[3-氯-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-4-基氧基]苄腈
[0538][0539]
标题化合物以与实施例61类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ7.89(d,j＝8.5hz,1h),7.70
–
7.59(m,2h),7.56
–
7.52(m,1h),7.48(m,1h),6.50(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7clf3n3o3s；计算值401.9，实测值402.0。
[0540]
实施例63：3-氯-4-(间-氯苯氧基)-7-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑
[0541][0542]
标题化合物以与实施例61类似的方式合成。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ7.86(d,j＝8.5hz,1h),7.44(t,j＝8.0hz,1h),7.36
–
7.32(m,1h),7.14
–
7.11(m,1h),6.52(d,j＝8.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h7cl2f3n2o3s；计算值410.9，实测值412.0。
[0543]
实施例64：3-氟-5-[(5-氟-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈
[0544][0545]
向3-氟-5-[(7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)氧基]苄腈(实施例15)(50mg，0.129mmol)于乙腈(0.4ml)和乙酸(0.016ml)中的溶液中加入selectfluor(109mg,0.301mmol)，并将反应混合物加热至90℃并保持16小时。将反应混合物真空浓缩，并将粗残余物通过反相hplc(mecn/h2o)纯化，得到3-氟-5-[(5-氟-7-三氟甲磺酰基-1h-吲唑-4-基)
氧基]苄腈(5mg，10％产率)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.20
–
8.15(m,1h),8.01(s,1h),7.52
–
7.46(m,2h),7.44
–
7.37(m,1h)。
19
f nmr(376mhz,cd3od)δ-140.3,-108.7,-80.8。esi ms[m h]

，对于c
15
h6f5n3o3s计算值404.0，实测值404.0。
[0546]
实施例65：3-[(6-氯-1h-吲唑-4-基)氨基]-5-氟苄腈
[0547][0548]
步骤a.向含有4-溴-6-氯-1h-吲唑(2.00g,8.69mmol,1.0当量)的烧瓶中加入3,4-二氢-2h-吡喃(2.18g,26.1mmol,3.0当量)和thf(30ml)。加入ptsoh.h2o(0.330g,1.73mmol,20mol％)并将反应混合物温热至50℃并搅拌4小时。将反应物在饱和nahco3水溶液和etoac之间分配。将水层分离并用额外的etoac反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
50％etoac)纯化，得到thp保护的吲唑，为橙色油状物(1.14g,3.6mmol,42％)。
[0549]
步骤b.向含有来自步骤a的产物(100mg,0.317mmol,1.0当量)的小瓶中加入甲苯(2ml)，然后加入3-氨基-5-氟-苄腈(40mg,0.317mmol,1.0当量)、pd brettphos iii(29mg,0.032mmol,10mol％)、brettphos(17mg,0.032mmol,10mol％)和cs2co3(0.210g,0.634mmol,2.0当量)。将反应混合物用氮气吹扫，加盖，加热至95℃并搅拌15小时。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
40％etoac)纯化，得到吲唑产物(81mg,0.218mmol,69％,esi ms[m na]

，对于c
19h16
clfn4o，计算值393.10，实测值393.0)。
[0550]
步骤c.将来自步骤b的产物(81mg，0.218mmol)溶解在dcm(1ml)中。添加tfa(0.5ml)并将反应物在室温下搅拌1.5小时。将反应物在饱和nahco3水溶液与dcm之间分配。将水层分离并用额外的dcm反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
80％etoac)纯化，然后通过制备型反相hplc(20％至80％梯度的乙腈和含0.1％tfa的水)纯化得到标题化合物，为白色粉末。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.21(s,1h),8.10(d,j＝1.0hz,1h),7.41
–
7.38(m,1h),7.35
–
7.27(m,2h),7.19(dd,j＝1.5,1.0hz,1h),6.87(d,j＝1.5hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h8clfn4，计算值287.0，实测值287.0。
[0551]
实施例66:3-氟-5-({1h-吡唑并[3,4-c]吡啶-4-基}氨基)苄腈
[0552][0553]
步骤a.向含有4-溴-1h-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.00g,5.05mmol,1.0当量)的烧瓶中加入3,4-二氢-2h-吡喃(0.90ml,10.1mmol,2.0当量)和thf(25ml)。加入ptsoh.h2o(0.140g,0.758mmol,15mol％)并将反应混合物升温至50℃并搅拌16小时。将反应物在饱和nahco3水溶液和etoac之间分配。将水层分离并用额外的etoac反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
50％etoac)纯化，得到thp保护的吲唑，为黄色油状物(0.98g,3.6mmol,69％,esi ms[m h]

，对于c
11h12
brn3o，计算值282.0，实测值282.0)。
[0554]
步骤b.向含有来自步骤a的产物(600mg,2.13mmol,1.0当量)的小瓶中加入甲苯(10ml)，然后加入3-氨基-5-氟-苄腈(434mg,3.20mmol,1.5当量)、pd brettphos iii(154mg,0.170mmol,8mol％)、brettphos(91mg,0.170mmol,8mol％)和cs2co3(1.40g,4.26mmol,2.0当量)。将反应混合物用氮气吹扫，加盖，加热至100℃并搅拌15小时。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
80％etoac)纯化，得到吲唑产物(266mg,0.789mmol,37％esi ms[m h]

，对于c
18h16
fn5o，计算值338.1，实测值338.2)。
[0555]
步骤c.将来自步骤b的产物(50mg，0.148mmol)溶解在dcm(1ml)中。添加tfa(1ml)并将反应物在室温下搅拌1.5小时。将反应物在饱和nahco3水溶液与dcm之间分配。将水层分离并用额外的dcm反萃取。合并有机层，并经mgso4干燥。减压浓缩并通过快速色谱(sio2，己烷
→
80％etoac)纯化，然后通过制备型反相hplc(20至80％梯度的乙腈和含0.1％tfa的水)纯化，得到标题化合物，为黄色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.69(s,1h),9.00(s,1h),8.49(s,1h),8.18(s,1h),7.54(s,1h),7.50
–
7.39(m,2h)。esi ms[m h]

，对于c
13
h8fn5，计算值254.1，实测值254.1。
[0556]
实施例67：3-氟-5-({1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基}氨基)苄腈
[0557][0558]
将含有4-氯-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(80mg,0.519mmol,1.0当量)、3-氨基-5-氟-苄腈(140mg,1.04mmol,2.0当量)和nbuoh(2ml)的小瓶加热至105℃。减压浓缩并通过反相hplc(20至80％梯度的乙腈和含0.1％tfa的水)纯化，得到标题化合物，为白色粉末。1h nmr
(400mhz,dmso-d6)δ10.49(s,1h),8.55(s,1h),8.36(s,1h),8.26
–
8.17(m,2h),7.58
–
7.52(m,1h)。esi ms[m h]

，对于c
12
h7fn6，计算值255.1，实测值255.1。
[0559]
实施例68：3-氟-5-{[7-(三氟甲基)-1h-吡唑并[3,4-c]吡啶-4-基]氧基}苄腈.
[0560][0561]
步骤a.向4-溴-7-氯-1h-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.20g,5.16mmol,1.0当量)于dmf(25ml)中的溶液中分批加入nah(0.25g,6.19mmol,1.2当量,60％)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后经10分钟滴加2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(1.10ml,6.19mmol,1.2当量)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。将反应物用nh4cl水溶液猝灭并在etoac和水之间分配。将有机相用盐水洗涤，经na2so4干燥并减压蒸发。将所得残余物通过硅胶色谱(0至25％梯度的在己烷中的etoac)纯化，得到产物，为无色油状物(1.83g,98％)。esi ms[m h]

，对于c
12h17
brcln3osi，计算值362.0，实测值362.0。
[0562]
步骤b.将来自步骤a的产物(1.83g,5.05mmol,1.0当量)溶解在丙腈(34ml)中，并依序添加碘代三甲基硅烷(0.72ml,5.05mmol,1.0当量)和碘化钠(2.26g,15.14mmol,3.0当量)。将混合物在室温搅拌1小时并蒸发溶剂。将所得固体溶解在h2o中并用2m naoh将ph调节至碱性。然后加入二氯甲烷，分离有机相，经na2so4干燥，过滤并浓缩，得到所需产物，为橙色固体(2.0g，87％)，其无需进一步直接用于下一步纯化。esi ms[m h]

，对于c
12h17
brin3osi，计算值454.0，实测值454.0。
[0563]
步骤c.将步骤b的产物(2.0g,4.40mmol,1.0当量)溶解在氮气气氛下的圆底烧瓶内的无水dmf(12ml)中。然后依次添加cui(1.23g,6.16mmol,1.4当量)、2,2-二氟-2-(氟磺酰基)乙酸甲酯(2.8ml,22.0mmol,5.0当量)和hmpa(3.8ml,22.0mmol,5.0当量)。将反应混合物在80℃下搅拌16小时。完成后，蒸发溶剂，并将残余物溶解在etoac中并用1n nh4cl洗涤3次。分离有机层，经无水na2so4干燥，过滤并减压蒸发。将所得残余物通过硅胶色谱(0至12％梯度的在己烷中的etoac)纯化，得到呈黄色固体的产物(450mg，25％)。esi ms[m h]

，对于c
13h17
brf3n3osi，计算值396.0，实测值396.0。
[0564]
步骤d.将来自步骤c的产物(120mg,0.30mmol,1.0当量)溶解在dmf(3.0ml)中，并加入3-羟基-5-氟-苄腈(83mg,0.604mmol,2.0当量)，然后加入k2co3(84mg,0.604mmol,2.0当量)。将反应物在120℃下搅拌5小时。将反应混合物用etoac稀释，然后用饱和氯化钠溶液洗涤。分离有机层，经无水na2so4干燥，过滤并减压蒸发。将所得残余物通过硅胶色谱(0至15％梯度的在己烷中的etoac)纯化，得到呈黄色固体的产物(28mg,20％)。esi ms[m h]

，对于c
20h20
f4n4o2si，计算值453.0，实测值453.0。
[0565]
步骤e.将步骤d的产物(28mg,0.062mmol)溶解在三氟乙酸和dcm(1:1,3.0ml)的混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物真空浓缩，将残余物溶解在dmso(2ml)中，并通过反相hplc(20至80％梯度的乙腈和含0.1％tfa的水)纯化产物，得到标题化合物，为淡黄色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.27(d,j＝1.3hz,1h),8.12(s,1h),7.80(ddd,j＝8.4,2.4,1.3hz,1h),7.74(s,1h),7.69(dt,j＝9.9,2.3hz,1h),6.55(s,1h)。esi ms[m h]

，对于c
14
h6f4n4o，计算值323.0，实测值323.0。
[0566]
实施例69：4-(3-氯-5-氟苯氧基)-7-(三氟甲基)-1h-吡唑并[3,4-c]吡啶.
[0567][0568]
标题化合物以与实施例68类似的方式合成。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.25(d,j＝1.3hz,1h),8.08(s,1h),7.39(ddd,j＝8.7,2.3,1.8hz,1h),7.31(s,1h),7.28(dt,j＝9.8,2.2hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
13
h6clf4n3o，计算值332.0，实测值332.0。
[0569]
实施例70：3-氟-5-[4-(三氟甲基磺酰基)-1h-吲唑-7-基氧基]苄腈
[0570][0571]
步骤a.向0℃下的4-溴-7-氟-1h-吲唑(5g,23mmol,1.0当量)于dmf(60ml)中的溶液中加入氢化钠(29mmol,1.25当量)。在0℃下搅拌30分钟后，逐滴加入氯甲基甲基醚(2.0ml,26mmol,1.1当量)。添加后，撤去冰浴，将反应物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用饱和nh4cl水溶液猝灭，并将水相用etoac(3
×
30ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至30％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(4.3g，70％产率)。esi ms[m h]

，对于c9h8brfn2o，计算值259.0，实测值259.0。
[0572]
步骤b.将来自步骤a的产物(4.2g,16.3mmol,1.0当量)溶解在干燥的二噁烷(54ml)中，并将搅拌的溶液抽真空并用氮气重新填充三次。向该溶液中加入苄硫醇(2.3ml,19.6mmol,1.2当量)、et3n(6.8ml,49mmol,3.0当量)、xanthos(940mg,1.63mmol,0.1当量)
和pd
2(
dba)3(750mg,0.82mmol,0.05当量)，此后将所得混合物抽真空并用氮气重新填充三次。在100℃下搅拌90分钟后，将反应混合物用水猝灭，并将水相用etoac(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0to 20％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物(5.3g,93％产率)。esi ms[m h]

，对于c
16h15
fn2os，计算值303.1，实测值303.0。
[0573]
步骤c.将来自步骤b的产物(4.5g,15mmol,1.0当量)溶解在acoh/h2o(9:1,50ml)中。经5分钟将ncs(7.9g,60mmol,4.0当量)分成约1g的部分添加到该溶液中。将所得混合物在室温下搅拌30分钟并通过lc-ms监测。反应完成后，将混合物倒入水中并用nahco3处理。将水相用etoac(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到呈白色固体的所需产物(3.6g,87％产率)。esi ms[m h]

，对于c9h8clfn2o3s，计算值279.0，实测值279.0。
[0574]
步骤d.将来自步骤c的产物(3.6g,13mmol,1.0当量)溶解在mecn(13ml)中。向该溶液中加入18-冠醚-6(0.18g,0.7mmol,0.05当量)和氟化钾(0.32g,52mmol,4.0当量)。将所得混合物在室温下搅拌1小时并通过lc-ms监测。将反应混合物用水猝灭，并将水相用toac(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到呈白色固体的所需产物(2.7g,80％产率)。esi ms[m h]

，对于c9h8f2n2o3s，计算值263.0，实测值263.0。
[0575]
步骤e.将来自步骤d的产物(2.7g,10.3mmol,1.0当量)溶解在干燥的dmso(20ml)中，并将搅拌的溶液抽真空并用氮气重新填充三次。向该溶液中依次加入氟化氢钾(0.24g,3.1mmol,0.3当量)和三氟甲基三甲基硅烷(3.0ml,20.6mmol,2.0当量)。将所得混合物在室温下搅拌15分钟并通过lc-ms监测。将反应混合物用水猝灭，并将水相用etoac(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至20％的在己烷中的etoac)纯化，得到呈白色固体的所需产物(2.0g,63％产率)。esi ms[m h]

，对于c
10
h8f4n2o3s，计算值313.0，实测值313.0。
[0576]
步骤f.将来自步骤e的产物(0.18g,0.6mmol,1.0当量)溶解在干燥的dmf(1.2ml)中。向该溶液中加入3-氟-5-羟基苄腈(0.16g,1.2mmol,2.0当量)和k2co3(0.16g,1.2mmol,2.0当量)，并将所得混合物加热至80℃。30分钟后，将混合物用水处理，并将水相用etoac萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并通过旋转蒸发进行浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至30％的在己烷中的etoac)纯化，得到呈白色固体的所需产物(0.24g,96％产率)。esi ms[m h]

，对于c
17h11
f4n3o4s，计算值430.0，实测值430.0。
[0577]
步骤g.向来自步骤f的产物(0.24g,0.56mmol)中加入4n的于二噁烷中的hcl(6ml)，并将混合物在室温下搅拌。15小时后，将反应混合物通过旋转蒸发浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱(0至50％的在己烷中的etoac)纯化，得到所需产物，为白色固体(0.12g，54％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.55(s,1h),7.91(d,j＝8.2hz,1h),7.40
–
7.35(m,2h),7.26
–
7.23(m,1h),6.91(d,j＝8.2hz,1h)。esi ms[m h]

，对于c
15
h7f4n3o3s，计算值386.02，实测值386.0。
[0578]
分析方法：
[0579]
lc:agilent 1100系列；质谱仪：agilent g6120ba，单四极杆
[0580]
lc-ms方法：agilent zorbax eclipse plus c18,4.6
×
100mm,3.5μm,35℃,1.5ml/min流速，2.5分钟0％至100％b梯度和0.5分钟在100％b下的洗涤；a＝0.1％甲酸/5％乙腈/94.9％水；b＝0.1％甲酸/5％水/94.9％乙腈
[0581]
快速柱：isco rf
[0582]
反相hplc：isco-ez或agilent 1260；柱：kinetex 5μm evo c18100a；250
×
21.2mm(phenomenex)
[0583]
生物学实施例
[0584]
hif-2α荧光素酶786-0细胞系的产生：
[0585]
根据制造商的指南，通过用cignal lenti hif luc reporter慢病毒(cls-007l,qiagen)转导786-o细胞(atcc,crl-1932)来产生稳定的细胞系。简而言之，用慢病毒以25的感染复数(moi)转导0.3x106个786-0细胞，持续24小时。转导后，向细胞中补充补加有10％fbs(目录号a3160502,gibco)、2mm glutamax(目录号35050-061,invitrogen)和100单位的青霉素和100μg链霉素/ml(目录号15070063，thermo fisher)的新鲜rpmi 1640培养基(目录号11875085,thermo fisher,)，再持续24小时。在含有4μg/ml嘌呤霉素的细胞培养基中进行抗生素选择。在7天的抗生素选择之后，将稳定的存活细胞池扩大并用于荧光素酶报告子测定中。
[0586]
hif-2α萤光素酶报告子测定：
[0587]
在第一天，将20ul在optimem(目录号31985088,thermo fisher)中的hif-luc-786-0细胞接种到384孔白色不透明板(corning 3570)的每个孔中并在37℃和5％co2下孵育。孵育4小时后，将20微升在optimem中的2x测试化合物添加到细胞中。最终测定条件包括每孔20,000个在1％dmso中的细胞，测试化合物浓度范围为50um至0um。在37℃和5％co2下孵育20小时后，按照制造商推荐的程序，使用one-glo萤光素酶测定试剂(e6110，promega)测定萤光素酶活性。简而言之，将40ul one-glo荧光素酶试剂添加到每个孔中，并使用envision 2102multilabel reader测量荧光素酶信号。基于dmso(最大活性)和无细胞对照孔(基线活性)计算每个测试孔中的最大活性百分比。测试化合物的ic50值由使用标准四参数拟合方程拟合的化合物剂量响应曲线确定。
[0588]
hif-2α闪烁亲近测定(spa)：
[0589]
氚标记的化合物n-(3-氯苯基)-4-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-5-胺获自american radiolabeled chemicals inc.，并且铜螯合物pvt spa珠来自perkinelmer(cat#rpnq0095)。含有pas-b结构域(240-350)的组氨酸标记的hif-2α蛋白质在内部制备和纯化。
[0590]
使用hp d300分配器将溶解在dmso中的化合物分配到白色384-孔聚苯乙烯非结合平透明底板(greiner bio-one,目录号781903)中。将10微升在缓冲液(25mm tris-hcl，ph 7.4，150mm nacl，0.15％bsa和.001％tween 20)中的his-标记的hif-2α蛋白添加到化合物孔中，并在室温下孵育1小时。向孔中加入10微升spa珠混合物，并再孵育45分钟，然后加入10ul的3h-示踪剂溶液。最终测定条件包括每孔含有50nm hif-2α蛋白质、25nm放射性标记的示踪剂和3ug珠以及于2％dmso中的化合物。使用用于发光检测的microbeta微孔板计数器(perkinelmer)读取板。测试化合物的ic
50
值由使用标准四参数拟合方程拟合的化合物剂量响应曲线确定并列在表1中。
[0591]
表1
[0592]
选定化合物的效力
[0593]
小于1μm( )、1μm至10μm( )、大于10μm( )
[0594][0595][0596]
n.d.未确定
[0597]
本文描述了本发明的特定实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了上述描述后，所公开的实施方案的变化对于本领域的工作人员来说是显而易见的，并且预计那些熟练的技术人员可能会适当地采用这样的变化。因此，意图本发明能以不同于本文具体描述的方式实施，并且本发明包括如适用法律允许的所附权利要求书中所列举主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变型中的任何组合。
[0598]
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入一样。