耐乙醇片球菌及其活化方法、菌剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种耐乙醇片球菌及其活化方法、菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.泡菜是一种传统的发酵蔬菜制品，泡菜以新鲜蔬菜等为主要原料，添加或不添加辅料，经食用盐或食用盐水泡渍，在厌氧条件下通过附着在蔬菜表面的乳酸菌发酵，调味或不调味等工艺加工而成的蔬菜制品。经过发酵作用，不仅可以保留蔬菜本身的营养物质，而且使其更具有独特的风味。泡菜不仅能够提高人们的食欲，还能在发酵的过程中产生对人体有益的乳酸菌，抑制肠道中腐败菌的生长，促进人体的消化。
3.但是，泡菜在腌制过程中会产生对人体健康不利的亚硝酸盐，他们主要来自于蔬菜中含量较高的硝酸盐。蔬菜吸收氮肥或土壤中的氮素，积累无毒的硝酸盐，在腌制过程中硝酸盐被一些亚硝酸盐还原细菌转变成亚硝酸盐，从而产生毒性。泡菜中亚硝酸盐的危害主要有：（1）亚硝酸盐进入血液后可与血红蛋白结合，使血红蛋白氧化变为高铁血红蛋白，从而失去携氧能力，导致组织缺氧；（2）亚硝酸盐极易与胺合成n-亚硝胺，亚硝胺是一种致癌物质。因此在泡菜的腌制过程中如果产生过多亚硝酸盐会不利于人们的健康，存在食品安全问题。所以找到一种有效降低泡菜中亚硝酸盐含量的方法至关重要。
4.传统泡菜依靠蔬菜原料表面的微生物在自然条件下发酵而成，但自然发酵泡菜中微生物种类复杂多样，泡菜质量不稳定难以进行工业化生产。目前市场上对泡菜发酵剂的需求越来越高，利用发酵剂可以缩短发酵周期，获得较为稳定的质量。泡菜中的优势菌种在发酵过程中发挥了主导作用，利用优势菌种作为发酵剂制备风味优良的泡菜，是当前市场需求的趋势所在。


技术实现要素：

5.基于此，本技术从川南传统洞藏泡菜水中分离出来一种菌株，经分子生物学、系统进化分析和形态学分析鉴定为耐乙醇片球菌，命名为pediococcus ethanolidurans m1117，其16s rrna序列已存入ncbi数据库，genbank登录号为on102795，该菌种于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cctcc no. m 2022210。
6.本技术还提供了一种所述耐乙醇片球菌m1117的活化方法，包括以下步骤：步骤s1. 将耐乙醇片球菌m1117采用划线法，在mrs琼脂固体培养基上接种，并在30~45℃条件下，于恒温培养箱中培养36~48h，获得单菌落；步骤s2. 将单菌落接种在mrs肉汤培养基中，于30~45℃、100~220r/min条件下，振荡培养18~36h，活化，得到耐乙醇片球菌m1117培养液。
7.本技术还提供了一种菌剂，所述菌剂包含所述的耐乙醇片球菌m1117。
8.本技术还提供了所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤s1. 将耐乙醇片球菌m1117培养液在 6000~15000 r/min、4℃条件下，离心10~20 min，弃上清液，收集菌体；步骤s2. 在菌体中加入冻干保护剂，混合均匀，置于-25~-15℃预冻10~24h，然后真空冷冻干燥，得到直投式菌剂。
9.在本技术公开的菌剂的制备方法中，所述步骤s1中，所述耐乙醇片球菌m1117培养液的浓度为107~109cfu/ml。
10.在本技术公开的菌剂的制备方法中，所述步骤s2中，所述冻干保护剂以质量分数计，包括：5~10%脱脂乳粉、3~8%海藻糖、3~8%蔗糖、2~5%甘油，余量为水。
11.在本技术公开的菌剂的制备方法中，所述步骤s2中，所述菌体与冻干保护剂的质量体积比为1:3~8。
12.本技术还公开了所述菌剂在泡菜中的应用。
13.本技术还提供了所述泡菜的制备方法，包括以下步骤：步骤s1. 取无病虫害的新鲜辣椒，洗净、自然风干，备用；步骤s2. 将玻璃坛用沸水灭菌10~30min，然后加入冷却开水，再加入5~10g/l冰糖和50~70g/l泡菜盐；步骤s3. 待冰糖、泡菜盐溶解后，依次加入10~50g/l生姜、10~50g/l大蒜和1~3g/l花椒，得到泡菜卤水；步骤s4. 在无菌超净工作台里，将菌剂接种到泡菜卤水中；步骤s5. 将辣椒以质量比1:3~5放入泡菜卤水中，再加入泡菜卤水体积分数1~3%的白酒；步骤s6. 将玻璃坛放置于20~30℃恒温培养箱中，连续密封发酵8~15天。
14.在本技术公开的泡菜的制备方法中，所述步骤s4中，所述菌剂的接种量为辣椒重量的1~3%。
15.发明的有益效果是：本发明提供了一种耐乙醇片球菌，该耐乙醇片球菌（pediococcus ethanolidurans）m1117从川南传统洞藏泡菜水中分离出来，经药敏实验，该耐乙醇片球菌m1117对于大部分抗生素高度敏感、或者中度敏感，因此耐乙醇片球菌m1117是安全可适用于泡菜发酵的。
16.该耐乙醇片球菌的活性较好且生长较快，具有良好的兼性，其制作的发酵直投式菌剂能用于泡菜的制备。耐乙醇片球菌能够在发酵初期进行正常的繁殖、代谢，且具有良好的耐盐能力，在发酵过程中大大降低亚硝盐的含量和峰值，接种耐乙醇片球菌m1117的辣椒在整个发酵过程中，亚硝酸盐含量均低于2mg/kg，明显小于腌渍蔬菜产品中亚硝酸盐的含量。通过接种该耐乙醇片球菌m1117制成的菌剂，用于制备低亚硝酸盐泡菜，改善了泡菜的色泽和风味，缩短了发酵时间，降低了亚硝酸盐的含量，提高了产品的安全性。
附图说明
17.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以
鼠李糖-松三糖-备注：“ ”为利用，
“‑”
为不利用请参见图1所示，该菌株进行16s rdna测序构建的16s rdna系统发育树，结果表明该菌株为耐乙醇片球菌。
27.请参见图2、3所示，由图2的革兰氏染色镜检结果与图3的扫描电镜结果佐证本技术提供的菌株为耐乙醇片球菌。
28.该菌株经分子生物学、系统进化分析和形态学分析、生理生化特征分析鉴定为耐乙醇片球菌，命名为pediococcus ethanolidurans m1117。耐乙醇片球菌m1117的16s rrna序列已存入ncbi数据库，genbank登录号为om 033504。耐乙醇片球菌m1117于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cctcc no. m 2022210。
29.耐乙醇片球菌的药敏实验：采用纸片扩散法测定耐乙醇片球菌m1117对抗生素的敏感性，实验结果见表2。对耐乙醇片球菌m1117进行抗生素的敏感实验，以确保其用于泡菜发酵的安全性。请参见表2所示，耐乙醇片球菌m1117对于绝大多数抗生素高度敏感，对少数抗生素中度敏感、耐药。因此耐乙醇片球菌m1117是安全可适用于泡菜发酵的。
30.表2 耐乙醇片球菌m1117对抗生素的药敏性结果抗生素英文名称抑菌圈直径（mm）药物敏感性氨苄西林ampicillin31s阿莫西林amoxicillin25s盘尼西林penicillin29s头孢噻吩cephalothin23s头孢西丁cefoxitin24s亚胺培南imipenem45s庆大霉素gentamicin20s卡那霉素kanamycin11r红霉素erythromycin37s替考拉宁telithromycin19i万古霉素vancomycin14r环丙沙星ciprofloxacin14r氯霉素chloramphenicol35s四环素tetracycline30s磺胺甲恶唑sulfamethoxazole16s克林霉素clindamycin40s利福平rifampicin32s备注：“s”为敏感，“i”为中度敏感，“r”为耐药。
31.实施例2本技术提供了一种耐乙醇片球菌m1117的活化方法，包括以下步骤：步骤s1. 将耐乙醇片球菌m1117采用划线法，在mrs琼脂固体培养基上接种，并在
30~45℃条件下，于恒温培养箱中培养36~48h，获得单菌落；步骤s2. 将单菌落接种在mrs肉汤培养基中，于30~45℃、100~220r/min条件下，振荡培养18~36h，活化得到耐乙醇片球菌m1117培养液。
32.具体地，耐乙醇片球菌m1117的培养温度为30℃、33℃、35℃、37℃、40℃等，优选为37℃。
33.具体地，耐乙醇片球菌m1117在mrs琼脂固体培养基上接种后，于恒温培养箱中培养36h、40h、45h、48h等，优选为48h。
34.具体地，将单菌落接种在mrs肉汤培养基中，于100r/min、120r/min、150r/min、160r/min、180r/min、220r/min等转速下振荡培养，优选为160r/min。培养时间为36h、40h、45h、48h等，优选为48h。
35.实施例3本技术提供了一种菌剂，该菌剂包含耐乙醇片球菌m1117。
36.该菌剂的制备方法，包括以下步骤：步骤s1. 将耐乙醇片球菌m1117培养液在 6000~15000 r/min、4℃条件下，离心10~20 min，弃上清液，收集菌体；步骤s2. 在菌体中加入冻干保护剂，混合均匀，置于-25~-15℃预冻10~24h，然后真空冷冻干燥，得到直投式菌剂。
37.具体地，步骤s1中，耐乙醇片球菌m1117培养液的离心转速为6000 r/min、8000 r/min、10000 r/min、12000 r/min、15000 r/min等，离心时间为10min、12min、15min、18 min、20 min，优选为8000 r/min下离心15min。
38.具体地，步骤s2中，预冻温度为-15℃、-18℃、-20℃、-25℃、-30℃等，预冻时间为10h、12h、15h、20h、24h等，优选为-20℃，冷冻12h。
39.在一个具体的实施方式中，步骤s1中，耐乙醇片球菌m1117培养液的浓度为107~109cfu/ml。
40.在一个具体的实施方式中，步骤s2中，冻干保护剂以质量分数计，包括：5~10%脱脂乳粉、3~8%海藻糖、3~8%蔗糖、2~5%甘油，余量为水。
41.具体地，脱脂乳粉的质量分数为5%、6%、8%、10%等，优选为8%。
42.具体地，海藻糖的质量分数为3%、4%、5%、8%等，优选为5%。
43.具体地，蔗糖的质量分数为3%、4%、5%、8%等，优选为5%。
44.具体地，甘油的质量分数为2%、3%、4%、5%等，优选为3%。
45.在一个具体的实施方式中，步骤s2中，菌体与冻干保护剂的质量体积比为1:3~8。具体地，菌体与冻干保护剂的质量体积比可以为1:3、1:5、1:6、1:8等，优选为1:5。
46.实施例4请参见图5所示，本技术提供一种泡菜的制备方法，该方法采用上述耐乙醇片球菌m1117进行发酵，得到低亚硝酸盐泡菜，具体包括以下步骤：步骤s1. 取无病虫害的新鲜辣椒，洗净、自然风干，备用；步骤s2. 将玻璃坛用沸水灭菌10~30min，然后加入冷却开水，再加入5~10g/l冰糖和50~70g/l泡菜盐；步骤s3. 待冰糖、泡菜盐溶解后，依次加入10~50g/l生姜、10~50g/l大蒜和1~3g/l
花椒，得到泡菜卤水；步骤s4. 在无菌超净工作台里，将菌剂接种到泡菜卤水中；步骤s5. 将辣椒以质量比1:3~5放入泡菜卤水中，再加入泡菜卤水体积分数1~3%的白酒；步骤s6. 将玻璃坛放置于20~30℃恒温培养箱中，连续密封发酵8~15天。
47.具体地，步骤s2中，玻璃坛用沸水灭菌10min、15min、20min、30min等，优选为20min；冰糖的加入量为5g/l、8g/l、10g/l、12g/l、15g/l等，优选为10g/l；泡菜盐的加入量为50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l等，优选为60g/l。
48.具体地，步骤s3中，生姜的加入量为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l等，优选为30g/l；大蒜的加入量为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l等，优选为30g/l；花椒的加入量为1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l等，优选为2g/l。
49.具体地，辣椒与泡菜卤水的质量比可以为1:3、1:3.5、1:4、1:5等，优选为1:4。
50.具体地，步骤s5中，辣椒的加入量为，优选为；白酒的加入量为1%、2%、3%等，优选为2%。
51.具体地，步骤s6中，泡菜的发酵温度为20℃、25℃、30℃等，发酵时间为8天、10天、12天、15天等，优选为25℃，发酵10天。
52.在一个具体的实施方式中，步骤s4中，菌剂的接种量为辣椒重量的1~3%。具体地，菌种的接种量为1%、1.5%、2%、2.5%、3%，优选为2%。
53.本技术将耐乙醇片球菌m1117应用于泡菜的制备，得到低亚硝酸盐泡菜。该方法能有效降低泡菜发酵过程中产生的亚硝酸盐含量，改善泡菜色泽和风味，缩短发酵时间，提高泡菜食用的安全性。
54.对照例1辣椒自然发酵，得到泡菜，即在实施例4中，不接种耐乙醇片球菌m1117菌剂，其余同实施例4。
55.实验例1对发酵过程中的盐度、ph值、亚硝酸盐含量的测定。
56.对实施例2和对照例1连续发酵过程的泡菜进行盐度、ph值、亚硝酸盐含量测定，结果如图6~8所示。
57.请参见图6所示，实施例2（接种发酵，jz）与对照例1（自然发酵，zr）的泡菜在发酵的12h后，接种发酵的盐度始终小于自然发酵的盐度。
58.请参见图7所示，实施例2（接种发酵，jz）与对照例1（自然发酵，zr）在发酵过程中，接种发酵的ph值始终小于自然发酵的ph值。
59.请参见图8所示， 实施例2（接种发酵，jz）与对照例1（自然发酵，zr）在发酵过程中，接种发酵的亚硝酸盐含量始终小于自然发酵的亚硝酸盐含量，且在整个发酵过程中始终低于2mg/kg。
60.基于上述各实施例，本发明提供了一种耐乙醇片球菌，该耐乙醇片球菌（pediococcus ethanolidurans）m1117从川南传统洞藏泡菜水中分离出来，，经药敏实验，该耐乙醇片球菌对于大部分抗生素高度敏感、或者中度敏感，因此耐乙醇片球菌m1117是安全可适用于泡菜发酵的。
61.该耐乙醇片球菌的活性较好且生长较快，具有良好的兼性，其制作的发酵直投式菌剂能用于泡菜的制备。耐乙醇片球菌能够在发酵初期进行正常的繁殖、代谢，且具有良好的耐盐能力，在发酵过程中大大降低亚硝盐的含量和峰值，接种耐乙醇片球菌m1117的辣椒在整个发酵过程中，亚硝酸盐含量均低于2mg/kg，明显小于腌渍蔬菜产品中亚硝酸盐的含量。通过接种该耐乙醇片球菌m1117制成的菌剂，用于制备低亚硝酸盐泡菜，改善了泡菜的色泽和风味，缩短了发酵时间，降低了亚硝酸盐的含量，提高了产品的安全性。
62.以上仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。