一种山羊源OSKM及其构建方法与应用与流程

一种山羊源oskm及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种山羊源oskm及其构建方法与应用。


背景技术：

2.胚胎干细胞具有自我更新能力和分化多能性两大特点，使得在体外获得各种不同的细胞、组织甚至器官成为可能。但是人胚胎干细胞来源于人的胚胎，存在伦理问题；另外，自其他个体胚胎干细胞在真正应用时，免疫排斥问题也无法解决，因此胚胎干细胞在实际临床应用中受到很大限制。而将体细胞重编程得到的诱导性多能干细胞(ipsc)可以有效避免胚胎干细胞在应用过程中存在的伦理问题和免疫排斥问题。
3.目前本领域家畜诱导多能干细胞重编程的方法多以逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体及质粒载体等为制备ipsc的常用载体。然而逆转录病毒载体和慢病毒载体在将携带基因插入宿主时会导致突变，并可能改变临近基因的表达模式，有增加ipsc细胞的致瘤风险的缺点，腺病毒载体和质粒载体的诱导效率又极低。虽然有研究证实，利用多蛋白表达系统和化学小分子，以及合成mrna，microrna也可以将小鼠和人的成体细胞重编程为多能干细胞，虽然这些方法避免了将外源基因插入体细胞染色体的可能，但诱导ipsc细胞的操作过程繁琐，效率极低。
4.诱导多能干细胞重编程过程需要将与胚胎干细胞(escs)增殖、更新和多能性的相关转录因子传递到体细胞，随后触发内源性多能性因子的转录和翻译激活，诱导其转化为escs样细胞。在建立家畜ipsc的研究中常用的基因为takahashi的经典四因子oskm：oct-4、sox-2、c-myc、klf-4，由于构建自体来源的oskm基因时，容易引起klf-4基因突变，进而致使无法达到体外重编程的目的，所以现有关于山羊体细胞重编程的报道使用的oskm基因均为其他物种源。由于物种基因间差异，使用其他物种源基因将影响重编程效率。另外，虽然病毒载体插入宿主时容易引起宿主基因突变，但是病毒载体的转染率要高于质粒载体的转染率，所以本领域采用oskm四因子进行体外重编程时，大多采用病毒载体。所以，如何构建获得一种能够成功用于体外重编程的自体来源的oskm，以及如何提高采用质粒载体进行体外重编程的转染率，一直是本领域亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建山羊源oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因表达载体的方法，采用本发明构建所得的山羊源oskm，能够显著提高山羊体细胞重编程的效率。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种构建山羊源oskm的方法，包括如下步骤：以山羊体细胞为模板pcr扩增得到oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因，将oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因与线性化载体进行连接，得山羊源oskm；所述扩增得到oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因的引物序列为：
8.oct-4：f:atggcgggacacc，r:tcagtttgcatgc；
9.sox-2：f:atgtacaacatga，r:tcacatgtgcgag；
10.c-myc：f:atgcccctcaacg，r:ttaggcgcaagag；
11.klf-4：f:atgaggcagccac，r:ttaaaagtgcctt。
12.优选的，分别pcr扩增获得oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因时，退火温度分别为54℃、56℃、60℃、64℃。
13.优选的，所述连接包括如下步骤：以oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因片段为模板，进行pcr扩增，使oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因各自带有2a肽序列，得到四种基因片段；以四种基因片段为模板，进行pcr扩增，使所述四种基因片段各自带有15-20bp的识别位点，然后与线性化载体进行连接。
14.优选的，使oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因各自带有2a肽序列的pcr引物为：
15.oct-4 2a：
16.f:atggcgggacacctcgct
17.r:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaatttttcagtttgcatgcat；
18.sox-2 2a：
19.f:tactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtccaatgtacaacatgatg
20.r:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaattttttttcacatgtgcgagag；
21.c-myc 2a：
22.f:tactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtccaatgcccctcaacgtc
23.r:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaatttttttttaggcgcaagagtt
24.klf-4 2a:
25.f:tactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtccaatggctgtcagcgac
26.r:ttaaaagtgcctcttcatgt。
27.优选的，使四种基因片段各自带有15-20bp识别位点的pcr引物为：
28.oct-4 clon：f:gatcggccggatatcgaattcatggcgggacacctcgct
29.r:ccccagccagtttgagtaaatcaaagttaagagtttgtttgacagg；
30.sox-2 clon：f:tttactcaaactggctggggatg
31.r:ccccagccagtttgagtaaatcaaagttaagagtttgtttgacagg；
32.c-myc clon：f:tttactcaaactggctggggatg
33.r:cccagccagtttgagtaaagatttggctcaattatatatttgaagg；
34.klf-4 clon：f:ctttactcaaactggctggggatg
35.r:aggcgcgccaagcttgcggccgcttaaaagtgcctcttcatgtgtaagg。
36.优选的，所述线性化载体为：酶切质粒pb-tre-hrl，回收的载体pb-tre骨架。
37.本发明还提供了一种采用上述方法构建所得的山羊源oskm。
38.本发明还提供了一种上述方法或上述山羊源oskm在诱导山羊成纤维细胞重编程中的应用。
39.本发明还提供了一种诱导山羊成纤维细胞重编程的方法，包括如下步骤：将重编程载体转入山羊成纤维细胞中，培养基培养，所述重编程载体包括上述山羊源oskm。
40.优选的，所述重编程载体还包括：pbase、ef1α、pnhl、hrl和slarget质粒。
no.14)
57.klf-4 2a:
58.f:tactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtccaatggctgtcagcgac(seq id no.15)
59.r:ttaaaagtgcctcttcatgt(seq id no.16)。本发明对于使oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因各自带有2a肽序列的pcr扩增体系没有特殊限定，对于pcr扩增的变性温度和延伸温度没有特殊限定，退火温度优选为60℃。
60.在本发明中，使四种基因片段各自带有15-20bp识别位点的pcr引物优选为：
61.oct-4 clon：f:gatcggccggatatcgaattcatggcgggacacctcgct(seq id no.17)，
62.r:ccccagccagtttgagtaaatcaaagttaagagtttgtttgacagg(seq id no.18)；
63.sox-2 clon：f:tttactcaaactggctggggatg(seq id no.19)
64.r:ccccagccagtttgagtaaatcaaagttaagagtttgtttgacagg(seq id no.20)；
65.c-myc clon：f:tttactcaaactggctggggatg(seq id no.21)
66.r:cccagccagtttgagtaaagatttggctcaattatatatttgaagg(seq id no.22)；
67.klf-4 clon：f:ctttactcaaactggctggggatg(seq id no.23)
68.r:aggcgcgccaagcttgcggccgcttaaaagtgcctcttcatgtgtaagg(seq id no.24)。本发明对于使四种基因片段各自带有15-20bp识别位点的pcr扩增体系没有特殊限定，对于pcr扩增的变性温度和延伸温度没有特殊限定，退火温度优选为60℃。
69.在本发明中，所述线性化载体优选为：酶切质粒pb-tre-hrl，回收的载体pb-tre骨架。本发明所述pb-tre-hrl质粒获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞，所述质粒pb-tre-hrl带有dox(四环霉素)调控系统，可随时调控外源基因表达。dox调控系统可严格调控外源基因的表达，在没有诱导剂的情况下可将外源基因泄漏表达最小化，并保持该系统对dox诱导的高灵敏度。本发明对于酶切质粒pb-tre-hrl的具体方法没有特殊限定，对于载体pb-tre骨架的具体回收方法没有特殊限定。
70.本发明还提供了一种采用上述方法构建所得的山羊源oskm，以及上述方法或该山羊源oskm在诱导山羊成纤维细胞重编程中的应用。
71.本发明还提供了一种诱导山羊成纤维细胞重编程的方法，包括如下步骤：将重编程载体转入山羊成纤维细胞中，培养基培养，所述重编程载体包括上述山羊源oskm。
72.在本发明中，所述重编程载体优选的还包括：pbase、ef1α、pnhl、hrl和slarget质粒。本发明选择的pbase、ef1α、pnhl、hrl和slarget五种质粒均属于piggybac载体系统，本发明首次采用piggybac载体系统构建质粒诱导山羊体细胞重新编程。常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。而本发明将piggybac转座子载体和辅助质粒同时转染到哺乳动物细胞中，由于转座子在转座酶的作用下，目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。在本发明中，pnhl质粒中含有猪源nanog和lin28两基因，获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞，hrl质粒中含有人源rarg和lrh1两基因，获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞，slarget质粒中含有猿猴病毒源larget，获赠于内蒙古农业大学刘莫宁，本发明采用多基因组合进行山羊体细胞重编程，可提高重编程效率。
73.本发明对于将重编程载体转入山羊成纤维细胞中的具体方法没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用电转染法将重编程载体转入山羊成纤维细胞中。在本发明中，将重编程载体转入山羊成纤维细胞中，采用培养基培养，培养的第1-7天使用的培养基优选为包括m15、dox、bfgf和lif，所述bfgf和lif的浓度分别优选为12ng/ml和1000iu/ml，培养的第8-14天使用的培养基优选为包括m15、dox和lif，所述lif的浓度优选为1000iu/ml。本发明对于培养基中各成分的具体来源没有特殊限定。
74.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
75.实施例1
76.构建山羊源oskm
77.(1)山羊源oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因的获取
78.以山羊胚胎cdna为模板pcr扩增得到oct-4、sox-2、c-myc基因；以山羊胎儿耳部成纤维细胞cdna为模板pcr扩增得到klf-4基因。pcr扩增得到oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因使用的引物序列如表1所示，pcr扩增的体系如表2所示，pcr扩增的程序如图1所示，其中oct-4、sox-2、c-myc、klf-4的退火温度分别为54℃、56℃、60℃、64℃。
79.表1扩增得到oct-4、sox-2、c-myc和klf-4基因的引物序列
[0080][0081][0082]
表2 pcr扩增体系
[0083][0084]
(2)线性化载体的获取
[0085]
使用ecor i和not i对质粒pb-tre-hrl(获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞)进行酶切，酶切后回收载体pb-tre骨架，酶切体系如表3所示。酶切反应条件为37℃、45min。
[0086]
表3酶切体系
[0087][0088]
配制1.0％琼脂糖的核酸电泳胶，在电压为110v的条件下，待目的条带移动至合适位置后，使用takara公司胶回收试剂盒进行线性载体基因片段的回收。
[0089]
(3)克隆载体的连接
[0090]
以步骤(1)获得的oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因片段为模板，设计引物(见表4)进行pcr扩增(pcr扩增体系见表2，pcr扩增的程序如图1所示，其中退火温度为60℃)使oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因两两之间带有2a肽序列，得到基因片段oct-4-2a、sox-2-2a、c-myc-2a、klf-4-2a；
[0091]
表4使oct-4、sox-2、c-myc、klf-4基因带有2a肽序列的引物序列
[0092][0093]
以oct-4-2a、sox-2-2a、c-myc-2a、klf-4-2a基因片段为模板，设计引物(见表5)进行pcr扩增(pcr扩增体系见表2，pcr扩增的程序如图1所示，其中退火温度为60℃)，使oct-4-2a、sox-2-2a、c-myc-2a和klf-4-2a每个基因片段带有15-20bp的识别位点，得到基因片段oct-4-clon、sox-2-clon、c-myc-clon、klf-4-clon；
[0094]
表5使四个基因片段带有15-20bp识别位点的引物序列
[0095][0096]
使用vazyme公司multis one step cloning kit产品进行克隆载体的连接，连接体系如表6所示。
[0097]
表6克隆载体连接体系
[0098][0099]
将配置好的体系放于pcr仪器中，37℃反应15min，然后置于冰上，进行后续转化实验。
[0100]
使用dh5a感受态进行质粒扩增送至华大基因公司测序，序列正确的菌液使用qiagen公司plamid midi kit产品进行质粒提取，得山羊源oskm。
[0101]
实施例2
[0102]
山羊体细胞重编程
[0103]
本实验所用奶山羊细胞系均来自内蒙古赛科星研究院。
[0104]
准备饲养层细胞：在电转染前3～4天解冻饲养层细胞至10cm培养皿用m10培养液培养。在电转染前1h将m10培养液换为m15 dox培养液。
[0105]
将所需试剂37℃预热，将电转液室温放置，将电转仪开机预热。
[0106]
将实施例1所得山羊源oskm(goskm)与质粒pbase(获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞)、ef1α(获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞)、pnhl(获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞)、hrl(获赠于内蒙古赛克星研究院赵丽霞)和slarget(获赠于内蒙古农业大学刘莫宁)配置dnamix，如表7所示。
[0107]
表7 dna mix体系
[0108][0109]
将成纤维细胞弃液，dpbs清洗。加入4ml trypsin-edta，37℃消化3～5min。加入4ml r终止消化，重悬细胞。细胞计数。将1
×
106细胞移入15ml离心管，1300r/min离心3min，弃液。将100μl电转液加在混好的dna上，混匀后加至细胞重悬，吸至电转杯。将电转杯放入电转仪，选定程序(u-023)进行电转染。将电转杯取出，加入1ml预热的m15培养液，将电转杯中全部液体移入15ml离心管。将电转细胞按1：4的比例移入有饲养层细胞的10cm培养皿中，放入38.5℃培养箱。24h后换液，之后每隔一天换液一次。5-7天便可观察克隆形态。重编程后7天使用培养基为m15 dox bfgf(12ng/ml) lif(1000iu/ml)，7-14天使用m15 dox lif(1000iu/ml)。
[0110]
上述使用的m10培养液和m15培养液的组成分别如表8和表9所示。
[0111]
表8 m10培养液
[0112][0113]
表9 m15培养液
[0114]
[0115][0116]
采用上述山羊体细胞重编程方法克隆培养第7天的结果如图2所示。以未经重编程方法进行克隆培养的山羊成纤维体细胞(见图3)作为对照，可见本发明山羊体细胞重编程方法能够在7天内克隆获得ipsc，且克隆形态良好。本发明在10cm细胞培养皿中，使用1
×
106个成纤维体细胞进行重编程，最终成功得到725个克隆，表明本发明方法重编程效率高，比本领域现有的重编程方法好。
[0117]
实施例3
[0118]
与实施例2的区别在于准备饲养层细胞步骤为：在电转染前3～4天解冻奶山羊成纤维细胞至10cm培养皿用m10培养液培养，细胞传代4代。待成纤维细胞汇合至60～70％时进行电转染。在电转染前1h将m10培养液换为m15 dox培养液。将电转细胞按1：8的比例移入有饲养层细胞的10cm培养皿中，放入38.5℃培养箱，其余均同实施例2。克隆培养第7天的结果如图4所示。
[0119]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。