抗人NGF抗体及其制备方法和用途与流程

抗人ngf抗体及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及治疗性单克隆抗体领域，更具体地，涉及一种抗ngf抗体或其抗原结合片段及其用途。


背景技术：

2.神经生长因子(nerve growth factor，ngf)是最早被发现的神经营养因子，它具有神经元营养和促突起生长的双重生物学功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。ngf包含α、β、γ三个亚单位，β亚单位是ngf发挥神经再生与修复作用的活性亚单位。目前已知的ngf受体包括高亲和力的酪氨酸激酶受体(tropomyosin receptor kinase a，trka)和低亲和力的p75神经营养因子受体(p75neurotrophin receptor，p75ntr)。
3.尽管最初ngf的主要作用是促进神经元的存活和分化，然而最近二十年来越来越多的研究表明ngf与持续性或慢性疼痛相关。1993年有报道称大鼠给予一定剂量的外源ngf可诱发疼痛(lewin gr等,j neurosci,1993,13:2136-2148)，之后又发现人静脉注射ngf可产生全身性的肌肉疼痛，并且局部给药还会诱发注射部位的痛觉过敏和异常性疼痛(petty bg等,ann neurol,1994,36:244-246)。还有研究显示ngf会上调感觉神经元中神经肽的表达。与trka和p75ntr受体结合后，ngf会增加疼痛的响应，上调表达一种称为伤害感受器的感觉神经元，这个过程使得神经元对潜在的疼痛刺激更加敏感(holmes d,nat rev drug discov,2012,11:337-338)。目前研究已证实，退行性关节病的关节软骨中ngf/trka的表达亢进，风湿病性关节炎、间质性膀胱炎的患者中ngf水平上升。若能够开发与ngf特异性结合、且具有抑制其功能的单克隆抗体，则有望对以疼痛为代表的与ngf相关的各种疾病的预防、诊断、治疗起到积极作用。
4.在全球范围内有数以千万计的患者在遭受着慢性疼痛带来的痛苦，而这个数字随着人口增加还在不断增加。当前临床上使用的用于慢性疼痛治疗的药物包括非甾体类抗炎药、抗惊厥药、阿片类药物等，然而这些药物有很多的不足，其中，非甾体抗炎药的疗效有限，并且具有包括消化道出血和肾脏毒性等副作用；而阿片类药物具有成瘾等副作用。该领域亟需能缓解疼痛、无毒性、防滥用的非阿片类止痛药，因此通过抑制ngf治疗慢性疼痛的方法价值非常明确。到目前为止，有许多抗人ngf抗体处于研发或临床开发阶段，其中进展最快的包括pfizer/lilly公司的抗ngf单克隆抗体tanezumab和regeneron/sanofi公司的fasinumab。tanezumab是最先开发的抗ngf抗体药物，据报道它对退行性关节病相伴的关节痛、慢性腰痛、与间质性膀胱炎相伴的膀胱痛等疼痛显示出了强大且范围广的镇痛效果(lane ne等,n engl j med,2010,363:1521-1531)，目前该药物正在进行骨关节炎、背部疼痛、癌症疼痛等适应症的iii期临床实验。fasinumab治疗骨关节炎痛的ii/iii期临床研究数据显示，4种剂量fasinumab治疗组的患者在疼痛缓解方面取得了具有统计学意义的显著改善。另一方面,多个ngf抑制剂的临床实验也表明，ngf抗体可能面临被限制用于重病人群、不能长期使用和剂量限制等问题，使得ngf抗体的临床应用需要进一步的安全验证。
no：11所示的cdr-l3氨基酸序列；
15.(6)重链可变区包含seq id no：38所示的cdr-h1氨基酸序列，和seq id no：40所示的cdr-h2氨基酸序列，和seq id no：42所示的cdr-h3氨基酸序列；和轻链可变区包含seq id no：44所示的cdr-l1氨基酸序列，和seq id no：46所示的cdr-l2氨基酸序列，和seq id no：12所示的cdr-l3氨基酸序列；
16.(7)重链可变区包含seq id no：52所示的cdr-h1氨基酸序列，和seq id no：53所示的cdr-h2氨基酸序列，和seq id no：42所示的cdr-h3氨基酸序列；和轻链可变区包含seq id no：55所示的cdr-l1氨基酸序列，和seq id no：56所示的cdr-l2氨基酸序列，和seq id no：12所示的cdr-l3氨基酸序列；
17.(8)重链可变区包含seq id no：52所示的cdr-h1氨基酸序列，和seq id no：53所示的cdr-h2氨基酸序列，和seq id no：42所示的cdr-h3氨基酸序列；和轻链可变区包含seq id no：55所示的cdr-l1氨基酸序列，和seq id no：57所示的cdr-l2氨基酸序列，和seq id no：12所示的cdr-l3氨基酸序列；
18.(9)重链可变区包含seq id no：52所示的cdr-h1氨基酸序列，和seq id no：54所示的cdr-h2氨基酸序列，和seq id no：42所示的cdr-h3氨基酸序列；和轻链可变区包含seq id no：55所示的cdr-l1氨基酸序列，和seq id no：57所示的cdr-l2氨基酸序列，和seq id no：12所示的cdr-l3氨基酸序列。
19.进一步的，所述的抗原或其抗原结合片段为鼠源的、嵌合的或者人源化的。
20.在一些实施例中，所述抗体为鼠源的或嵌合的，其重链可变区进一步包含鼠igg1、igg2a、igg2b、igg3或其变体的重链fr区；和其轻链可变区包含鼠κ、λ链或其变体的轻链fr区。
21.优选的，上述鼠源或嵌合抗体分别包含如seq id no：13或15所示的重链可变区氨基酸序列；和分别包含如seq id no：14或16所示的轻链可变区氨基酸序列。
22.更优选的，本发明中的鼠源抗体#56和嵌合抗体ab5c1包含如seq id no：13所示的重链可变区氨基酸序列；和如seq id no：14所示的轻链可变区氨基酸序列。
23.更优选的，本发明中的鼠源抗体#2和嵌合抗体ab5d1包含如seq id no：15所示的重链可变区氨基酸序列；和如seq id no：16所示的轻链可变区氨基酸序列。
24.在一些实施例中，所述抗体为人源化的。制备人源化抗体可以用cdr移植技术、表面重塑技术、计算机模拟技术或其他现有技术来完成。
25.本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体#56通过cdr移植进行人源化改造。由此产生的人源化抗体，较优选的，其重链可变区包含选自seq id nos：17、19、21或23所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自seq id nos：18、20、22或24所示的氨基酸序列。更优选的，由此产生的所述人源化抗体ab5c2、ab5c3、ab5c4和ab5c5，其重链可变区分别包含如seq id no：17、19、21或23所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如seq id no：18、20、22或24所示的氨基酸序列。
26.本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体#56通过表面重塑技术进行人源化改造。较优选的，由此产生的所述人源化抗体ab5c6，其重链可变区包含如seq id no：25所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含如seq id no：26所示的氨基酸序列。
27.本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体#2通过cdr移植进行人源化改造。由此产
生的人源化抗体，较优选的，其重链可变区包含选自seq id nos：27、29、31或33所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自seq id nos：28、30、32或34所示的氨基酸序列。更优选的，由此产生的所述人源化抗体ab5d2、ab5d3、ab5d4和ab5d5，其重链可变区分别包含如seq id no：27、29、31或33所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如seq id no：28、30、32或34所示的氨基酸序列。
28.本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体#2通过表面重塑技术进行人源化改造。较优选的，由此产生的所述人源化抗体ab5d6，其重链可变区包含如seq id no：35所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含如seq id no：36所示的氨基酸序列。
29.在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明抗体的序列进行替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少80％同源；更优地，本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
30.在一些实施例中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段为进一步包含人或鼠的抗体恒定区的全长抗体；或仅包含fab、fab'、f(ab')2或scfv的抗原结合片段。
31.在该方面的一个优选例中，其重链恒定区序列选自人iggl、igg2、igg3或igg4。
32.在该方面的一个优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定序列。
33.在一个实施例中，所述的抗体结合人ngf。具体的，所述的抗体能够阻断人ngf和相应的人ngf受体之间的相互作用。所述抗体或其抗原结合片段与ngf结合的kd值为≤5
×
10-11
m，优选的为1
×
10-11
m或更小的kd。
34.在本发明的第二个方面，提供了编码上述抗体或其抗原结合片段的dna分子。优选的，编码所述抗体或其抗原结合片段重链可变区的dna分子分别如seq id no：58、60和62所示，和编码所述抗体或其抗原结合片段轻链可变区的dna分子分别如seq id no：59、61和63所示。
35.例如，编码本发明优选嵌合抗体ab5c1重链可变区的dna分子如seq id no：58所示，和编码其轻链可变区的dna分子如seq id no：59所示。
36.又如，编码本发明优选人源化抗体ab5c2重链可变区的dna分子如seq id no：60所示，和编码其轻链可变区的dna分子如seq id no：61所示。
37.再如，编码本发明优选人源化抗体ab5c6重链可变区的dna分子如seq id no：62所示，和编码其轻链可变区的dna分子如seq id no：63所示。
38.在本发明的第三个方面，提供了一种表达载体，该载体包含上述dna分子。
39.在本发明的第四个方面，提供了用上述表达载体转染的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为cho细胞。
40.在本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物。该药物组合物包含至少一种药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述抗体或其抗原结合片段。
41.在本发明的第六个方面提供了所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物的用途，优选的用于治疗任何与ngf相关的疾病，特别是与ngf相关的疼痛疾病。这些疾病，通常与
ngf表达亢进及水平上升相关。所述疾病包括但不限于退行性关节病、风湿病性关节炎、间质性膀胱炎、骨坏死、腰痛或糖尿病性周围神经病变等。
42.优选的，在制备治疗所述疾病的药物中可以使用嵌合的、人源化的抗ngf抗体其抗原结合片段；较优选地，使用人源化的抗ngf抗体其抗原结合片段。
43.本发明人发现，本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下优点：
44.1、本发明提供的抗体具有高的亲和力，亲和力常数kd值≤5
×
10-11
m，能够有效阻断ngf和其受体之间的结合，阻断疼痛的响应；
45.2、本发明提供的抗体与抗原结合的特异性极强，可以预期其临床给药剂量也将降低；
46.3、本发明提供的抗体采用cho细胞表达，具有产量高、活性高、纯化工艺简单以及生产成本低的优势。
47.发明详述
48.缩写和定义
49.hngf人神经生长因子
50.cdr用imgt编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
51.elisa酶联免疫吸附测定
52.fr抗体构架区：将cdr区排除在外的免疫球蛋白可变区
53.hrp辣根过氧化物酶
54.igg免疫球蛋白g
55.kabat由elvinakabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统
56.imgt由lafranc等人提出的国际免疫遗传学信息体系
57.mab单克隆抗体
58.pcr聚合酶链式反应
59.v区在不同抗体之间序列可变的igg链区段。其延伸到轻链的109位kabat残基和重链的第113位残基。
60.vh免疫球蛋白重链可变区
61.vk免疫球蛋白κ轻链可变区
62.kd平衡解离常数
63.kd解离速率常数
64.kon结合速率常数
65.术语解释
66.本发明所使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，涵盖全长抗体(例如，igg1或igg4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如fab、f(ab’)2或scfv片段)以及经过修饰的抗体(例如人源化、糖基化等)。抗体的实例包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、结构域抗体、单链抗体、fab、fab’、f(ab’)2片段等。本发明还包括具有糖基化修饰的抗ngf抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点，例如在寡糖链上去岩藻糖修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能；在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(cdc)。
67.术语“单克隆抗体或mab”，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如cdr-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
[0068]“抗体片段”和“抗原结合片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、85％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段实例包括但不限于：fab、fab
′
、f(ab
′
)2和fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子，例如scfv、单抗体(技术来自genmab)；纳米抗体(技术来自domantis)；结构域抗体(技术来自ablynx)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于holliger等,nat biotechnol,2005,23:1126-1136中。
[0069]“fab片段”由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
[0070]“fab
′
片段”含有一条轻链和一条重链的vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个fab
′
片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab
′
)2分子。
[0071]“f(ab
′
)2片段”含有两条轻链和两条重链的vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab
′
)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab
′
片段组成。
[0072]“fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
[0073]“单链fv抗体”或“scfv抗体”，是指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。对于scfv综述，可参见pluckthun,1994,the pharmacology of monoclonal antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,rosenburg和moore主编,springer-verlag,berlin,heidelberg,第269-315页。还参见国际专利申请公开号wo88/01649和美国专利no.4,946,778号和no.5,260,203号。
[0074]“fc”区含有包含抗体的ch1和ch2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过ch3结构域的疏水作用保持在一起。
[0075]“抗原结合片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。
[0076]
本文所用术语“超变区”或“cdr区”或“互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。cdr区序列可以由imgt、kabat、chothia和abm方法来定义或本领域熟知的任何cdr区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。抗体cdr可鉴定为最初由kabat等人定义的高变区，例如，轻链可变结构域的24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)位残基和重链可变结构域的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)位残基，参见kabat ea等,1991,sequences of proteins of immunological interest,public health service,national institutes of health,bethesda,md.；cdr的位置亦可鉴定为最初由chothia等人描述的“超变环”(hvl)结构来界定的。imgt(immunogenetics)也提供了包括cdr的免疫球
蛋白可变区的编号系统，根据imgt编号定义cdr区，例如，轻链可变结构域的27-32(l1)、50-52(l2)和89-97(l3)位残基和重链可变结构域的26-35(h1)、51-57(h2)和93-102(h3)位残基，参见如lefranc mp等,dev comp immunol,2003,27:55-77，其通过引用并入本文。用于cdr鉴定的其它方法包括“abm定义”，其为kabat与chothia之间的折衷且使用oxford molecular
′
s abm抗体模型软件得到；或cdr的“接触定义”，其基于所观察的抗原接触且阐述于maccallum rm等,j.mol biol,1996,262:732-745中。cdr的“构型定义”方法中，cdr的位置可鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基，参见例如makabe k等,j biol chem,2008,283:1156-1166。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的cdr，包括但不限于kabat定义、imgt定义、chothia定义、abm定义、接触定义和/或构型定义中的任一者来定义。
[0077]
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核表达系统或原核表达系统中表达嵌合抗体分子。在本发明的一优选实施方案中，所述的ngf嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链fr区。所述ngf嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b或igg3或其变体的重链fr区。人抗体的恒定区可选自人源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区，优选包含人源的igg1重链恒定区。
[0078]“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的抗体，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物抗体)的高变区残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(fr)残基可被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于供体抗体的残基。这些修饰能进一步提高抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区，而所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(fc)的至少一部分。更详细的情况可参见引用文献jones pt等,nature,1986,321:522-525。
[0079]
本文使用的术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(kd)表示，其中kd值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kd或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(malmqvist m,nature,1993,361:186-187)。kd/kon的比率等于解离常数kd(通常参见davies等,annual rev biochem,1990,59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例3中所述的fortebio octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如biacore)或kinexa来测量解离
常数。当平衡结合常数(kd)为≤5
×
10-11
m，优选为≤1
×
10-11
m，本发明的抗体被认为特异性地结合至ngf表位。
[0080]
本文中使用的术语“标记”或“标记的”指掺入可检测标志物，例如通过掺入放射性标记的氨基酸或将能通过经标记亲合素(例如含有能通过光学方法或量热法来检测的荧光标志物或酶促活性的链霉亲合素)来检测的生物素模块附着至多肽。在某些情况中，标记物或标志物还可以是治疗性的。本领域知道而且可以使用多种标记多肽和糖蛋白的方法。用于多肽的标记物的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)、荧光标记物(例如fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、受到二级报告物识别的预定确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、表位标签)。
[0081]
同源抗体
[0082]
在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明抗ngf抗体的期望的功能特性。
[0083]
例如，本发明提供了人源化的结合ngf的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自seq id nos：17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优地，所述重链可变区包含与选自seq id nos：17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自seq id nos：18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区包含与选自seq id nos：18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。
[0084]
具有保守修饰的抗体
[0085]
术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和pcr介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代是指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体cdr区中的一个或多个氨基酸残基。
[0086]
在某些实施方式中，本发明的抗体包含含有cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列的重链可变区和含有cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3序列的轻链可变区，其中，这些cdr序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留了本发明抗ngf抗体的期望的功能特性。因此，本发明提供了分离的结合ngf抗体或其抗原结合部分，其包含含有cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列的重链可变区和含有cdr-l1、cdr-l2和
cdr-l3序列的轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区cdr-h1序列包含选自seq id no：1和2所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区cdr-h2序列包含选自seq id no：3和4所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区cdr-h3序列包含选自seq id no：5和6所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区cdr-l1序列包含选自seq id no：7和8所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区cdr-l2序列包含选自seq id no：9和10所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区cdr-l3序列包含选自seq id nos：11和12所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
[0087]
单克隆抗体制备
[0088]
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体方法学，例如kohler g和milstein c,nature,1975:256:495中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备单克隆抗体的其它方法，例如b淋巴细胞的病毒或致癌转化。
[0089]
用于制备杂交瘤的优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。
[0090]
为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如pcr扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cdna克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的dna，并且可以将dna插入到表达载体中，从而使得目的基因与转录和翻译调控序列可操作的连接，转染宿主细胞进行表达，表达宿主优选真核表达载体，更优选哺乳动物细胞，例如cho及其衍生细胞系。
[0091]
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白a或蛋白g的亲和层析纯化。随后或备选地，可将特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析而纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化例如由wilkinson d论述(the scientist,2000,8:25-28,the scientist,inc.,philadelphia pa)。
[0092]
本发明的嵌合或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的dna可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为创造嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如cabilly等人的美国专利no.4,816,567)。通过将编码vh的dna可操作的连接至编码重链恒定区(ch1、ch2和ch3)的另一dna分子可以将编码vh区的分离的dna转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat ea等,1991,sequences of proteins of immunological interest,public health service,national institutes of health,bethesda,md)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是最优选为igg1或igg4恒定区。
[0093]
为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠cdr区插入人源框架序列(参见winter的美国专利no.5,225,539和queen等的美国专利nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。还可以利用转基因动物，例如，humab小鼠(medarex,inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如lonberg等,nature,
1994,368:856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“km小鼠
tm”(参见专利wo02/43478)进行抗体人源化改造。其他抗体人源化改造的方法包括表面重塑技术和噬菌体展示技术等。
[0094]
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。
附图说明
[0095]
图1、间接elisa法测定不同抗人ngf鼠单克隆抗体结合hngf的效价。
[0096]
图2、竞争elisa法测定抗人ngf鼠源单抗#56阻断hngf和其受体trka结合能力。
[0097]
图3-1、抗hngf人源化抗体ab5c2、ab5c3、ab5c4、ab5c5和ab5c6与鼠源抗体#56重链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为cdr区序列(根据imgt系统定义)。
[0098]
图3-2、抗hngf人源化抗体ab5c2、ab5c3、ab5c4、ab5c5和ab5c6与鼠源抗体#56轻链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为cdr区序列(根据imgt系统定义)。
[0099]
图4-1、抗hngf人源化抗体ab5d2、ab5d3、ab5d4、ab5d5和ab5d6与鼠源抗体#2重链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为cdr区序列(根据imgt系统定义)。
[0100]
图4-2、抗hngf人源化抗体ab5d2、ab5d3、ab5d4、ab5d5和ab5d6与鼠源抗体#2轻链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为cdr区序列(根据imgt系统定义)。
[0101]
图5、抗hngf抗体抑制ngf依赖性细胞生存信号的测定。
[0102]
图6、ab5c1对手术后伤口模型的影响。注：与模型组相比，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0103]
图7、ab5c1对部分小鼠坐骨神经结扎模型的影响。注：与模型组相比，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0104]
图8、ab5c1和ab5c2对尿酸钠诱导的小鼠急性痛风关节炎模型的影响。注：与模型组相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
[0105]
图9、ab5c1和ab5c6对完全弗氏佐剂诱导的炎症疼痛模型的影响。注：与模型组相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
具体实施方式
[0106]
实施例1、抗hngf鼠源单克隆抗体的制备
[0107]
以重组人ngf(hngf，peprotech公司)，20μg/只以完全弗氏佐剂充分乳化后，对四周龄的balb/c小鼠进行皮下多点免疫注射，免疫周期为三周一次。第3次免疫后第10天通过眼窝取血，elisa测试抗人ngf抗体滴度以监测小鼠免疫应答效果。融合前3天对产生抗人ngf抗体滴度最高的小鼠加强免疫一次。3天后，取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤sp2/0细胞株相融合。混合5
×
108sp2/0细胞与5
×
108小鼠脾细胞在50％聚乙二醇(peg，分子量为1450)和5％二甲基亚砜(dmso)溶液中融合。用iscove培养基(含有10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mm次黄嘌呤，0.4μm氨基蝶呤和16μm胸苷)来调整脾脏细胞数至7.5
×
105/ml，以0.2ml加入96孔培养板的孔内。置于37℃，5％co2的培养箱内。10天后，采用高通量elisa法分别检测上清中抗体与fc标签的人trka受体竞争结合hngf的能力，以此筛选出与
人trka受体竞争的阳性孔(方法参见实施例3)。再将孔内的杂交瘤细胞进行亚克隆，同样以竞争elisa法筛选，获得了3个阳性杂交瘤单克隆细胞株a2、a56和a98。
[0108]
在补充10％fcs的rpmi 1640培养基中培养产生特异性抗体的克隆。当细胞密度达到大约5
×
105个细胞/ml时，用无血清培养基替换该培养基。2至4天后，将培养过的培养基离心，以收集培养物上清液。将蛋白g柱用于纯化抗体。用150mm nacl透析单克隆抗体洗脱液。通过0.2μm滤器将透析的溶液过滤除菌，以获得待测试的纯化的鼠单克隆抗体#2、#56和#98。
[0109]
实施例2、抗hngf鼠源抗体效价测定
[0110]
采用间接elisa法测定纯化鼠源抗体#2、#56和#98与hngf结合的效价。其中，每孔分别以100μl 0.2μg/ml hngf包被酶标板(corning公司)，4℃放置16-20h。将96孔板中pbs缓冲液吸掉，用pbst(ph 7.4，pbs含0.05％吐温20)缓冲液洗板1次后，加入200μl/孔pbst/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，用pbst缓冲液洗板3次后，加入用pbst/1％脱脂奶粉稀释至适合浓度的待测抗hngf鼠源抗体，100μl/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，用pbst洗板3次后，以50μl/孔用pbst/1％脱脂奶粉稀释(稀释比例1：5000)的hrp标记的羊抗鼠igg的多克隆抗体(jackson laboratory)作为检测抗体，室温孵育1h。pbst洗板3次后，加入100μl/孔tmb，室温孵育显色10-30min。加入50μl/孔0.2m硫酸终止反应。酶标仪在od450 nm处检测吸光值，其结果示于图1。
[0111]
从图1中可以看出，鼠源抗体#2、#56和#98均能与hngf结合，其中#56的结合效价最优。
[0112]
实施例3、抗hngf鼠源抗体与ngf受体trka的结合抑制测定
[0113]
以100μl 2.5μg/ml hngf包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(pbs)的脱脂奶封闭各孔0.5h，用pbst洗孔。然后每孔加入50μl 2μg/ml带人fc标签的trka(北京义翘神州生物)和50μl不同浓度的#56抗体(10-0.15μg/ml)的混合液。以未加入#56抗体的作为阴性对照，以hrp标记的羊抗人igg fc的多克隆抗体(jackson laboratory)作为检测抗体，利用tmb显色并记录od450/690nm的吸光度。从图2中可以看出，#56抗体能够特异性阻断ngf与其受体trka的结合。
[0114]
实施例4、抗hngf鼠源抗体亲和力分析试验
[0115]
采用生物薄膜干涉技术(bli)对纯化的鼠单克隆抗体#56、#2与抗原的结合亲和力常数进行测定(fortebio octet red&qk系统，pall公司)。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nm，将human ngf(his-tag)亲和偶联ni-nta传感器。经亲和力分析动力学拟合曲线后，分析以上数据计算得出亲和力常数，鼠单克隆抗体#56的结合常数kon值＝7.23
×
105/ms，解离常数kd值＝8.89
×
10-6
/s，平衡解离常数kd值＝kd/kon＝1.23
×
10-11
m(0.0123nm)；鼠单克隆抗体#2的结合常数kon值＝1.83
×
106/ms，解离常数kd值＝2.92
×
10-5
/s，平衡解离常数kd值＝kd/kon＝1.59
×
10-11
m。鼠单克隆抗体#56与#2针对hngf都具有极高的结合亲和力，可达到10-11
m数量级。
[0116]
实施例5、抗hngf鼠源单抗的亚型鉴定及可变区扩增
[0117]
抗体亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清液，采用isostrip
tm
小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(santa cruz biotechnology)鉴定抗体亚型。单抗#56亚型经鉴定为igg1(kappa)，单抗#2亚型经鉴定为igg1(kappa)。
[0118]
抗体可变区扩增：将候选杂交瘤细胞a56和a2培养至总数量107个细胞，1000rpm离心10min收集细胞，并以trizol试剂盒(invitrogen)提取总rna，用反转录试剂盒smarter race合成第一链cdna，以第一链cdna为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区dna序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，设计特异性的巢式pcr引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。采用常规pcr方法扩增目的基因，将扩增产物测序后，得到杂交瘤克隆a56分泌抗体#56的重链可变区序列seq id no：13和轻链可变区序列seq id no：14；该抗体的重链cdr(cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)的氨基酸序列分别如seq id no：1，3和5所示，其轻链cdr(cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)的氨基酸序列分别如seq id no：7，9和11所示。杂交瘤克隆a2分泌抗体#2的重链可变区序列seq id no：15和轻链可变区序列seq id no：16；该抗体的重链cdr(cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)的氨基酸序列分别如seq id no：2，4和6所示，其轻链cdr(cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)的氨基酸序列分别如seq id no：8，10和12所示。以上cdr区序列采用imgt方法定义，也可以采用任何其他的本领域公知的cdr区序列确定方法来鉴定可变区内cdr区的氨基酸残基。
[0119]
实施例6、抗hngf鼠源抗体的人源化
[0120]
6.1抗体可变区基因序列测定和抗体分型测定
[0121]
根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列，采用cdr移植抗体人源化改造方法进行人源化改造。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：把各杂交瘤细胞分泌的抗体的氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；分析考察hla-dr亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；之后利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体氨基酸序列中可与ngf作用以及维护空间构架的关键氨基酸，将其嫁接回已经选择的人胚胎系抗体框架。
[0122]
其中，鼠源抗体#56以人ighv4-38-2*02重链可变区和人igkv1-33*01轻链可变区为模板序列，共构建了4个不同的人源化抗体，分别为ab5c2、ab5c3、ab5c4和ab5c5。同时构建了一株人鼠嵌合抗体ab5c1，是将鼠源抗体的重链可变区序列嫁接至人igg1重链恒定区，将鼠源抗体的轻链可变区序列嫁接至人kappa轻链恒定区而获得。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表1所示。
[0123]
其中，鼠源抗体#2以人ighv1-46*01重链可变区和人igkv1-nl1*01轻链可变区为模板序列，共构建了4个不同的人源化抗体，分别为ab5d2、ab5d3、ab5d4和ab5d5。同时构建了一株人鼠嵌合抗体ab5d1，是将鼠源抗体的重链可变区序列嫁接至人igg1重链恒定区，将鼠源抗体的轻链可变区序列嫁接至人kappa轻链恒定区而获得。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表1所示。
[0124]
表1人源化抗体可变区氨基酸序列
[0125][0126][0127]
此外，还采用表面重塑方法对上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列进行人源化改造。表面重塑方法是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，该方法仅替换与人抗体表面氨基酸差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性的基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。具体的，表面重塑人源化改造过程涉及以下步骤：首先将各杂交瘤细胞分泌的抗体的氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；之后利用计算机模拟技术，选择solvent accessibility大于30％时，将暴露的表面氨基酸替换成人胚胎系抗体氨基酸。对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构象的残基尽量不替换。其中，鼠源抗体#56以人ighv4-38-2*02重链可变区和人igkv1-33*01轻链可变区为模板序列，构建了人源化抗体ab5c6；鼠源抗体#2以人ighv1-46*01重链可变区和人igkv1-nl1*01轻链可变区为模板序列，构建了人源化抗体ab5d6。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表1所示。
[0128]
采用实施例4的方法检测得到的人源化抗体的亲和力，结果见表2。
[0129]
表2人源化抗体的亲和力测定结果
[0130][0131]
本发明制备的鼠源单抗#56和#2及其衍生的10个人源化抗体ab5c2、ab5c3、ab5c4、ab5c5、ab5c6、ab5d2、ab5d3、ab5d4、ab5d5和ab5d6的cdr区的氨基酸序列如表3-1至表3-2所示，其中抗体可变区所包含的cdr的氨基酸序列分别采用kabat和imgt方法来定义，人源化抗体中cdr区突变的氨基酸序列以下划线标出。
[0132]
表3-1、关于示例性的抗人ngf抗体#56及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0133][0134]
表3-2、关于示例性的抗人ngf抗体#2及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0135]
g418以及200nm mtx(sigma)。为了实现较高水平的表达，用受mtx药物抑制的dhfr基因共扩增转染的抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子及elisa方法测定各细胞系的分泌率，选出高水平表达抗体的细胞株。收集抗体的条件培养基，用于测定其体外和体内生物学活性。
[0142]
实施例7、抗hngf抗体的体外中和活性测定
[0143]
利用tf-1细胞(人血液白血病细胞)培养法测定抗ngf抗体的生物活性。tf-1细胞培养法是基于tf-1细胞系对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)高度依赖性，利用ngf与tf-1细胞表面的ngf高亲和力受体trka结合后诱导tf-1细胞增殖来进行的。tf-1细胞(atcc)以每毫升105细胞的密度重新悬浮，96孔板中每孔加入50μl含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养基(life technologies corporation)，之后加入50μl不同浓度的抗体和50μl 800ng/ml hngf。空白对照组仅加入培养基，阴性对照组为不加入抗hngf抗体。室温下振摇30分钟，每孔加入100μl 105/ml的tf-1细胞，于37℃，5％co2培养箱中培养5-6天。每孔加入20μl mtt(2.5mg/ml)继续培养4h后，加入100μl 10％sds孵育过夜。在激发波长570nm和发射波长620nm下利用酶标仪测定细胞的增殖情况。每个处理设三个重复，每个重复测定两次。
[0144]
结果见图5，从图上可以看出，在抗体浓度0.005-0.3μg/ml条件下，抗hngf抗体对ngf的结合能力相对较低；在浓度高于0.3μg/ml时，加入的抗人ngf单克隆抗体与ngf结合后，降低ngf促进tf-1细胞增殖的作用，表明ngf单抗能够拮抗ngf的功能。此外，从结果可以看出，抗ngf人源化抗体ab5c2、ab5c6及鼠单克隆抗体#56的ngf结合能力要优于嵌合抗体ab5c1。
[0145]
实施例8、抗hngf抗体的体内镇痛药效学研究
[0146]
8.1手术后伤口模型药效学研究
[0147]
本实验通过手术刀伤于小鼠后脚掌的屈肌位置，导致小鼠的伤害性刺激，最终引起小鼠热痛觉过敏；并观察对照组和给药组抗ngf抗体对该种疼痛类型的影响。
[0148]
spf级别c57bl/6j雄性小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，体重25g左右，按体重随机分为2组，每组10只。测量前先将受试动物放入hargreaves装置(336型，iitc life science)，光照强度设置为17％，光照截止时间为25s，适应一段时间。给药前，每只小鼠依次测量足底的基础热痛阈值，即从强光辐射开始至小鼠出现缩足反应的时间，即热痛反应时间。每次0.5-2h，共计三次，取其平均值作为基线(t0值)。手术处理前，受试药组按10mg/kg剂量皮下注射ab5c1，模型组注射等体积剂量(10ml/kg)的pbs缓冲液。1h后，用手术刀将小鼠右脚掌切开，分离屈肌，垂直切位两部分。缝合伤口，恢复阶段，测试手术部位1、24、48、72、96h后的热痛反应时间的平均值，即热痛阈值(s)，并按下列公式计算热痛阈值提高百分率：热痛阈值提高百分率＝(给药后平均热痛阈值—给药前平均热痛阈值)/给药前平均热痛阈值
×
100％。对数据进行统计分析，实验数据以均数
±
标差(means
±
sd)表示，若数据符合正态分布，采用spss 18.0软件，单因素方差分析或t-test；处理前后影响因素不同，采用配对t-test；评分统计采用非参数检验，mann-whitney检验或者kruskal-wallis检验，p≤0.05具有显著性差异，p≤0.01有非常显著性差异。
[0149]
从图6中可以看到手术后1h的各组小鼠因疼痛而热痛阈值降低，但随着时间的延长，受试药组与模型组的热痛阈值差异越来越大，经student’s t-test检验，t24 h～72h时间段统计意义显著，表明与模型组小鼠相比，受试药ab5c1预治疗显著降低了手术后疼痛。
在t72 h时，受试药组热痛阈值已恢复到最初值，而模型组则仍处于较低的值；在t96 h时，两组均恢复到起始值。
[0150]
8.2坐骨神经结扎模型的药效学研究
[0151]
观察抗ngf抗体在小鼠坐骨神经结扎诱导的慢性疼痛模型中的作用。spf级别c57bl/6j雌性小鼠，体重25g左右，按体重随机分为3组，每组5只。测量前先将受试动物放入hargreaves装置(参数设置如8.1)适应一段时间。每只小鼠依次测量足底基础热痛阈值，每次0.5-2h，共计三次，取其平均值作为基线(d0值)。用手术刀将小鼠右侧股骨部位划开，分离筋膜和肌肉部分，找出坐骨神经；于坐骨神经的1/3～1/2处用7-0丝线结扎于坐骨神经位置。逐层缝合，恢复到原来状态。阴性对照组进行假手术操作但未结扎坐骨神经。手术后第10天(d10)和第17天(d17)，对受试药组按100mg/kg剂量皮下注射ab5c1，阴性对照组和模型组分别注射等体积剂量(20ml/kg)的pbs缓冲液，测量d10、d17给药前和给药后d12、d14、d16、d18、d20、d21和d23的热痛阈值，并计算热痛阈值提高百分率(％)，公式同8.1。对数据进行统计分析，使用软件及分析方法同8.1
[0152]
从表4数据看出，在结扎后第10天，经热痛敏实验仪器测量，各组热痛阈值与实验前测量的基础热痛阈值相比均出现下降趋势；ab5c1组，模型组和阴性对照组热痛阈值提高百分率分别为：-56.31％
±
6.98％，-50.99％
±
8.19％和-20.42％
±
5.35％，前两组与阴性对照组经t-test统计分析，有统计学意义，p＝0.014《0.05。于第10天皮下给药48h(d12)后，测量各组的热痛阈值，发现给药组ab5c1热痛阈值提高百分率为-23.65％
±
5.17％，与阴性对照组相当(-18.70％
±
5.98％)，均值远高于模型组(-51.44％
±
1.28％)，且统计学意义非常显著，说明受试药在48h有镇痛作用明显好于对照组；但在给药后第4-7天(d14-d17)热痛阈值呈现下降趋势，如图7所示，于第7天热痛阈值提高百分率与模型组值几乎一致，说明随着时间的延长，药物在小鼠体内不断地代谢和降解。
[0153]
在给药一周后，于d17进行第二次给药，观察到在二次给药后24h(d18)和72h(d20)，受试药ab5c1热痛阈值提高百分率远高于模型组，具体数值见表3所示，且统计学差异显著，推测48h的药效也有统计学差异，间接验证了第一次给药的数据，说明受试药ab5c1在给药后0-72h内对坐骨神经结扎模型有治疗作用。
[0154]
表4、给药后小鼠热痛阈值
[0155][0156]
8.3尿酸钠诱导的小鼠痛风关节炎模型药效学研究
[0157]
观察抗ngf抗体在尿酸钠诱导的小鼠急性痛风关节炎模型影响。spf级别c57bl/6j雄性小鼠，体重25g左右，按体重随机分为3组，每组8只。测量前先将受试动物放入hargreaves装置(参数设置如8.1)适应一段时间。每只小鼠依次测量静息时足底基础热痛阈值，每次0.5-2h，共计三次，取其平均值作为基线(d0值)。对受试药组按10mg/kg剂量皮下注射ab5c1和ab5c2，模型组注射等体积剂量(10ml/kg)的pbs缓冲液。给药1h后，将2.5％尿酸钠(sigma)溶液注射于踝关节部位30μl；造模后4、24、48h测量足后热痛阈值，每次0.5-2h，共计三次，取平均值作为实际阈值，并计算热痛阈值提高百分率(％)，公式同8.1。对数据进行统计分析，使用软件及分析方法同8.1。
[0158]
从图8可以看出在给药后4-6h，ab5c1和ab5c2均明显延长了痛风模型中小鼠热痛阈值，在4-6h、24h和48h时，ab5c1统计学差异非常显著，而ab5c2仅在给药当天统计学差异显著；但两组药物的均值与模型组比较还是很高的，明显延长了小鼠的热痛阈值。
[0159]
8.4完全弗氏佐剂诱导的炎症疼痛模型药效学研究
[0160]
为了研究抗hngf抗体在慢性周围炎症性小鼠模型中是否能够减轻疼痛，在c57bl/6j小鼠的后足皮下注射完全弗氏佐剂造成热痛觉过敏，对疼痛进行测量。spf级别c57bl/6j雄性小鼠，体重25g左右，按体重随机分为3组，每组8只。测量前先将受试动物放入hargreaves装置(参数设置如8.1)适应一段时间。每只小鼠依次测量静息时足底基础热痛阈值，每次0.5-2h，共计三次，取其平均值作为基线(d0值)。对受试药组按10mg/kg剂量皮下注射ab5c1和ab5c6，模型组注射等体积剂量(10ml/kg)的pbs缓冲液。于给药1h后，将50μl 0.5％的完全弗氏佐剂(bd公司)溶液注射于踝关节部位；造模4、24、48、72h和96h后测量后肢足底的热痛阈值，每次0.5-2h，共计三次，取平均值作为实际阈值，并计算热痛阈值提高百分率(％)，公式同8.1。对数据进行统计分析，使用软件及分析方法同8.1。
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图9表明在给药后4-72h，ab5c6热痛阈值高于模型组和受试药ab5c1组，且统计学差异显著；而ab5c1药效则稍差于ab5c6，仅在48h统计学差异显著。96h后，二者均无统计学
差异。总之，受试药在治疗免疫炎症疼痛模型上均有预防作用，且ab5c6好于ab5c1。
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虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导，做出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求所限定的范围。