一种用于胃癌筛查、预后及免疫治疗评估的分子标记物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物标志物技术领域，尤其涉及一种用于胃癌筛查、预后及免疫治疗评估的分子标记物及其应用。


背景技术：

2.胃癌是全球范围内死亡率位列第三的恶性肿瘤，胃癌预后相关机制尚不明确，肿瘤的异质性使得很难准确评估每个患者的预后。因此，迫切需要对新型生物标志物进行综合研究，以提高胃癌患者的个体评价和生存率。n6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine,m6a)是mrna中最为普遍的修饰，通过修饰癌/抑癌基因表达，参与了肿瘤的发生发展。最近的研究发现有氧糖酵解升高(通常称为warburg效应)是一种新的肿瘤代谢特征。糖酵解、免疫浸润、免疫治疗反应与临床预后之间存在密切的相互作用，糖酵解调控分子的异常表达是其发挥作用的主要原因。但是，是否m6a修饰导致糖酵解调控分子表达异常，进而参与了胃癌的发生发展，以及免疫治疗效果，目前尚无相关研究。此外，糖酵解可能会受肿瘤微环境的影响而产生变化，对单一靶点的抑制可能不足以抑制肿瘤增殖，甚至可能引起耐药性，多个糖酵解酶分子靶点的联合生物标记物的应用值得特别重视。因此需要在胃癌筛查中建立检测更加方便，且能够预测患者预后及免疫治疗响应的分子标记物组合，从而为胃癌患者的诊断和治疗提供临床指导。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种用于胃癌筛查、预后及免疫治疗评估的分子标记物及其应用，能够准确鉴定出免疫治疗相应情况的胃癌患者类群。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种用于胃癌的分子标记物，所述标志物为vcan基因、nup50基因、dcn基因、slc35a3基因、pkp2基因和ankzf1基因中的一种或多种。
6.本发明还提供了所述分子标记物在胃癌筛查中的应用。
7.本发明还提供了所述分子标记物在胃癌免疫疗效评价和追踪中的应用。
8.本发明还提供了所述分子标记物在胃癌预后评估中的应用。
9.本发明还提供了一种含有分子标志物的试剂盒。
10.本发明提供了一种用于胃癌筛查、预后及免疫治疗评估的分子标记物及其应用，所述标志物为vcan基因、nup50基因、dcn基因、slc35a3基因、pkp2基因和ankzf1基因中的一种或多种。本发明筛选出6个潜在的与胃癌发生发展、预后及免疫治疗响应相关的基因，并建立了以vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf1这6个基因为基础的风险预测模型。本发明的分子标记物具有极佳的敏感性，可以用于胃癌的诊断、免疫疗效评价和追踪以及预后评估。
附图说明
11.图1为tcga数据库胃癌样本分为训练集(a,c)和验证集(b,d),vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因组构建风险模型，(a,b)基于风险模型的风险得分图,(c,d)基于于风险模型的生存状态图；
12.图2为tcga数据库胃癌样本分为训练集(a)和验证集(b),vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因组构建风险模型，聚类分析热图显示了在不同风险状态下，6个基因的表达水平；
13.图3为tcga数据库胃癌样本分为训练集(a)和验证集(b),vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因组构建风险模型，kaplan-meier生存曲线对高、低风险组患者的生存期进行比较分析；
14.图4为tcga数据库胃癌样本分为训练集(a)和验证集(b),vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因组构建风险模型，在胃癌患者中的roc曲线分析；
15.图5为利用vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因组构建风险模型，评估免疫治疗的预后预测价值。tcia数据库(a-d)，tide数据库(e)；
16.图6为收集10例临床胃癌病人的肿瘤组织及癌旁组织，qrt-pcr技术检测vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf16个基因的mrna表达情况，结果表明单基因vcan、nup50、slc35a3、pkp2、ankzf1在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，可作为的胃癌诊断的生物标志物；
17.图7为利用tcga数据库标本，进行6个基因组构建风险模型及单基因在胃癌患者中的roc曲线分析。结果表明6个基因的联合预测auc面积高于单基因的auc面积，表明6个基因的联合预测模型具有更加良好和准确的预测能力；
18.图8为利用tcga数据库标本，进行6个基因组构建风险模型用于免疫治疗评估的roc曲线分析。结果表明该风险模型具有良好的评估价值。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
20.实施例1标志物的筛选
21.(1)利用公共数据库tcga胃癌患者肿瘤组织基因表达数据和生存数据获取胃癌预后相关的六基因组合：从tcga数据库中获得23个m6a基因和324个糖酵解相关基因(glycolysis-related genes，grgs)的表达谱。确定m6a调节相关的grgs标准为：与23个m6a基因表达相关系数|pearson r|》0.3并且p《0.001，筛选得到122个差异表达基因；接下来利用多因素cox回归分析，进一步筛选与预后密切相关的基因，得到7个基因，排除1个在胃癌组织中表达低于正常组织的基因，最终确定6个基因：vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf1；利用lasso回归分析，剔除非必要或多重共线性的基因；根据6个基因的表达量构建公式计算患者的风险评分，根据危险评分中位值分为低风险组和高风险组；利用数据集tgga胃癌组织标本，验证基于6个基因建立的风险模型，对比低风险组和高风险组生存曲线是否存在显著差异，并计算模型的敏感性和特异性。利用ips和tide计算方法，发现无论单独或联合抗pd-1/ctla-4治疗，低风险组对免疫治疗有更好的反应。
22.(2)根据(1)中胃癌患者队列生存数据鉴定出六个基因各自的最显著生存下的高表达和低表达分组；
23.(3)根据步骤(2)中六个基因各自的高表达和低表达分组，鉴定出胃癌患者对免疫治疗的响应情况；
24.(4)在待测胃癌患者队列中获取步骤1中的六个基因表达；
25.收集10对胃癌患者的肿瘤组织标本与癌旁正常胃粘膜标本，采用qrt-pcr技术检测6个基因的表达情况。
26.trizol用于mrna提取，sybrgreen方法用于定量pcr。actin作为2-δδct
的内部对照。肿瘤癌旁正常组织的平均mrna水平设置为1.0，和其他mrna水平标准化为该基线。actin和各个基因的检测引物序列如下：
27.actin-上游引物：5
’‑
ttccttcctgggcatggagtcc-3’(seq id no.1)；
28.actin-下游引物：5
’‑
tggcgtacaggtctttgcgg-3’(seq id no.2)；
29.vcan-上游引物：5
’‑
gtaacccatgcgctacataaagt-3’(seq id no.3)；
30.vcan-下游引物：5
’‑
ggcaaagtaggcatcgttgaaa-3’(seq id no.4)；
31.nup50-上游引物：5
’‑
tctggaggaggacgcttttct-3’(seq id no.5)；
32.nup50-下游引物：5
’‑
ggggcactggttatgttgttt-3’(seq id no.6)；
33.dcn-上游引物：5
’‑
atgaaggccactatcatcctcc-3’(seq id no.7)；
34.dcn-下游引物：5
’‑
gtcgcggtcatcaggaactt-3’(seq id no.8)；
35.slc35a3-上游引物：5
’‑
cagtggctgtccctagtaatttt-3’(seq id no.9)；
36.slc35a3-下游引物：5
’‑
agaactgccatgagtcctaca-3’(seq id no.10)；
37.pkp2-上游引物：5
’‑
gtgggcaacggaaatcttcac-3’(seq id no.11)；
38.pkp2-下游引物：5
’‑
ccagcctttagcatgtcatagg-3’(seq id no.12)；
39.ankzf1-上游引物：5
’‑
gttcaacttgtgaccagacctt-3’(seq id no.13)；
40.ankzf1-下游引物：5
’‑
gctttaggttaaaccgatgcca-3’(seq id no.14)；
41.结果如图6所示，胃癌组织中vcan、nup50、slc35a3、pkp2、ankzf1的mrna水平均显著高于癌旁组织，可作为的胃癌诊断的生物标志物。
42.(5)利用tcga数据库数据，进行总体生存时间的roc分析，结果如图7所示，6个基因联合检测auc值高于单个基因检测auc，因此该6个基因可作为的胃癌预后的生物标志物。
43.(6)利用tcga数据库数据，进行免疫治疗效果的roc分析，结果如图8所示，6个基因联合检测auc值为0.702，因此该6个基因联合检测具有良好的预测性能，可作为的胃癌免疫疗效评价的生物标志物。
44.由以上实施例可知，本发明提供了一种用于胃癌筛查、预后及免疫治疗评估的分子标记物及其应用，所述标志物为vcan基因、nup50基因、dcn基因、slc35a3基因、pkp2基因和ankzf1基因中的一种或多种。本发明筛选出6个潜在的与胃癌发生发展、预后及免疫治疗响应相关的基因，并建立了以vcan、nup50、dcn、slc35a3、pkp2、ankzf1这6个基因为基础的风险预测模型。本发明的分子标记物具有极佳的敏感性，可以用于胃癌的诊断、免疫疗效评价和追踪以及预后评估。
45.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。