一组基于酿酒酵母rDNA位点的多拷贝整合质粒工具包

一组基于酿酒酵母rdna位点的多拷贝整合质粒工具包
技术领域
1.本发明涉及一组基于酿酒酵母rdna位点的多拷贝整合质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。


背景技术：

2.酿酒酵母是常用的真核微生物宿主，在酿酒酵母中引入异源基因时，一般选择高拷贝的质粒游离表达，或者通过同源重组整合在基因组上进行整合型表达。大部分的基因和蛋白质都需要进行过量表达，但是随着传代次数增加，游离的质粒会丢失造成菌株性状退化；而整合型表达每次仅能在基因组上实现1个拷贝，要实现高拷贝整合则需要多次整合，操作繁琐。
3.酿酒酵母的rdna位点是较好的多拷贝整合位点，可以用于异源基因的高拷贝整合。在酿酒酵母的rdna位点整合时，筛选标签匮乏，一般仅有2-3种氨基酸缺陷型筛选标签和抗生素筛选标签可供高拷贝整合使用，并且构建整合表达框的过程操作繁琐，耗时。


技术实现要素：

4.为了扩大筛选标签，并且简化构建rdna位点的整合框，本发明中检验了7种已报道的筛选标签，用于rdna整合，检验上述标签在rdna位点多拷贝整合的效果。并且基于上述标签构建了一个包含7个质粒的整合工具包，利用该工具包，可以极大的简化rdna位点多拷贝整合表达框的构建。并在酿酒酵母中进行验证，酿酒酵母包括模式菌株s288c及其衍生菌株。使用该组质粒可以经过一次转化，在酿酒酵母基因组实现多拷贝整合，整合菌株的稳定性好，可用于基因的过量表达。
5.本发明提供了酿酒酵母筛选基因表达框，所述基因表达框由弱启动子序列和带有降解标签deg的筛选基因序列组成。
6.在一种实施方式中，所述弱启动子包括p
ade6
、p
leu2
、p
ura3
、p
pma1
、p
zwf1
、p
aro7
、p
pyc1
、p
ade3
、p
yef3
、p
erg1
，所述筛选基因包括sctrp1、klleu2、klura3、sphis5和natmx。
7.在一种实施方式中，所述筛选基因sctrp1、klleu2、klura3、sphis5和natmx的核苷酸序列记载于公开号为cn113403334a的专利文献中。
8.在一种实施方式中，将筛选基因sctrp1的起始密码子替换为aag。
9.在一种实施方式中，将筛选基因sctrp1的起始密码子替换为aag的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.在一种实施方式中，将筛选基因klleu2的起始密码子替换为gug。
11.在一种实施方式中，将筛选基因klleu2的起始密码子替换为gug的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.本发明提供了含有所述的酿酒酵母筛选基因表达框的整合表达框。
13.在一种实施方式中，所述整合表达框由26s rdna位点的上下游同源臂序列、终止子序列及目的蛋白表达框及权利要求1～3所述基因表达框组成；按26s rdna位点的上游同
源臂、上游终止子序列、绿色荧光蛋白表达框、下游终止子序列、反向的基因表达框、26s rdna位点的下游同源臂的顺序连接。
14.在一种实施方式中，所述rdna位点为酿酒酵母基因组上的26s rdna位点；所述上游终止子序列包括t
rfc5-t
pol30
、t
mtd1-t
rpf2
、t
dsf1-t
hxt13
、t
rrp12-t
taf3
或t
adh1
；所述下游终止子序列包括t
sec13-t
pnp1
、t
leu2-t
nfs1
、t
tim21-t
gsc2
、t
rna14-t
bub2
或t
cyc1
及反向的t
tdh3
终止子。
15.在一种实施方式中，所述上游终止子序列和下游终止子序列均公开于专利cn113403334a中。
16.在一种实施方式中，所述26s rdna的上游同源臂序列如seq id no.1所示，26s rdna的下游同源臂序列如seq id no.2所示。
17.在一种实施方式中，所述目的蛋白表达框包括一个启动子p
gal7
，启动子p
gal7
的上游包含一个终止子序列t
gal10
，启动子p
gal7
下游为绿色荧光蛋白。
18.本发明提供了含有所述的整合表达框的重组质粒。
19.在一种实施方式中，以t载体为载体骨架；将t载体上的转录复制起始位点与氨苄抗性基因分别与上下游同源臂序列连接。
20.本发明提供了含有所述的酿酒酵母筛选基因表达框，或所述的整合表达框，或所述的重组质粒的微生物细胞。
21.在一种实施方式中，所述微生物细胞包括酿酒酵母。
22.在一种实施方式中，所述酿酒酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1及其衍生菌株和/或酿酒酵母s288c及其衍生菌株。
23.本发明提供了所述基因表达框，或所述重组质粒在构建及筛选高拷贝酿酒酵母、或在酿酒酵母过表达外源基因中的应用。
24.在一种实施方式中，所述酿酒酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1及其衍生菌株和/或酿酒酵母s288c及其衍生菌株。
25.在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株c800(matα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3δ1；mal2-8c；suc2；gal80::kanmx)公开于文献gao,s.；zhou,h.；zhou,j.,et al.,promoter-library-based pathway optimization for efficient(2s)-naringenin production from p-coumaric acid in saccharomyces cerevisiae[j].j agric food chem 2020,68(25),6884-6891.中。
[0026]
本发明的有益效果：
[0027]
本发明构建了一组可在酿酒酵母中整合表达的多拷贝整合质粒，能够整合至酿酒酵母的26s rdna位点，可以使质粒稳定表达，且通过筛选基因、弱启动子的组合，能够获得较高的荧光强度及拷贝数量。将筛选基因sctrp1和klleu2的起始密码子替换为aag或gug，可进一步提升荧光强度、提升拷贝数量。拷贝数量可在15-20之间，转化子数量可降低至13～42个，降低了筛选的难度并能获得更多的高拷贝的阳性转化子。采用本发明的整合质粒可简化异源基因在酿酒酵母中的整合表达。
附图说明
[0028]
图1为多拷贝质粒工具包的基因型示意图。
[0029]
图2为一次转化后可以获得的转化子数量分布图。
[0030]
图3为多拷贝重组菌株的荧光强度分布图。
具体实施方式
[0031]
ynb：1.74g/l酵母氮源基础培养基、5g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、50mg/l的色氨酸、50mg/l亮氨酸、50mg/l组氨酸、50mg/l尿嘧啶。
[0032]
ynb-trp：1.74g/l酵母氮源基础培养基、5g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸、50mg/l组氨酸、50mg/l尿嘧啶。
[0033]
ynb-leu：1.74g/l酵母氮源基础培养基、5g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、50mg/l组氨酸、50mg/l尿嘧啶、50mg/l的色氨酸。
[0034]
ynb-ura：1.74g/l酵母氮源基础培养基、5g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸、50mg/l组氨酸、50mg/l的色氨酸。
[0035]
ynb-his：1.74g/l酵母氮源基础培养基、5g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸、50mg/l尿嘧啶、50mg/l的色氨酸。
[0036]
ypd-nat：10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖、诺尔斯菌素100mg/l。
[0037]
ypd-hph：10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖、潮霉素300mg/l。
[0038]
固体培养基中添加20g/l的琼脂粉。
[0039]
t载体：购自takara公司，货号3271。
[0040]
诺尔丝菌(nourseothricin sulfate,cas：96736-11-7)素购自索莱宝(solarbio,n9210)潮霉素(hygromycin b solution,cas：3128-04-9)购自生工生物工程(上海)股份有限公司(b540725)。
[0041]
各种抗生素以母液形式添加到培养基中，诺尔丝菌素母液浓度为100g/l，工作浓度为100mg/l；潮霉素母液浓度为300g/l，工作浓度为300mg/l。
[0042]
酿酒酵母c800(matα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3δ1；mal2-8c；suc2；gal80::kanmx)用于基因的表达。e.coli jm109用于分子克隆。
[0043]
诺唯赞qpcr试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司，chamq universal sybr qpcr master mix，货号q711-02。
[0044]
实时荧光定量pcr仪为德国罗氏lightcycler 480ii。
[0045]
下述实施例中使用的pct111、pcta31、pctg122、pct23、pct37、pct36、pct45公开于公开号为cn113403334a的专利文献中。
[0046]
实施例1：构建多拷贝的质粒表达工具包
[0047]
使用引物rdnaup-f/rdnaup-r和rdnadn-f/rdnadn-r从酿酒酵母c800基因组上扩增26s rdna的上下游同源臂序列；使用引物t-f/t-r扩增t载体(takara，货号3271)。将上述扩增的片段纯化后经过gibson组装获得过渡质粒prt-simple。
[0048]
使用引物对rtrp1-f/rtrp1-r、rleu2-f/rleu2-r、rura3-f/rura3-r、rtrp1aag-f/rtrp1aag-r、rhis5-f/rhis5-r、rnat-f/rnat-r和rhph-f/rhph-r从质粒pct111、pctg122、pct23、pcta31、pct45、pct36和pct37上扩增trp1deg、klleu2gugdeg、klura3deg、trp1aagdeg、sphis5deg、natmxdeg和hphmxdeg的整合框，所述整合框包括了筛选标签的表达框序列、报告基因egfp的表达框p
gal7-egfp和双向启动子序列(即在同源臂之间除了同源臂以外的部分)；使用引物rtrp1-f/rtrp1-r、rleu2-f/rleu2-r、rura3-f/rura3-r、
rtrp1aag-f/rtrp1aag-r、rhis5-f/rhis5-r、rnat-f/rnat-r和rhph-f/rhph-r分别扩增并线性化质粒载体prt-simple。
[0049]
分别将上述含有筛选标签的整合框与线性化质粒经过gibson组装，获得质粒prt111、prt122、prt23、prt34、prt45、prt36和prt37，可以用于后续验证多拷贝整合能力。
[0050]
本发明中所用的核苷酸序列见表1。质粒和菌株的基因型见表2。所有引物序列见表3。
[0051]
表1所有的核苷酸序列
[0052]
[0053][0054]
表2质粒和菌株的基因型
[0055][0056]
表3关键引物序列
[0057]
[0058][0059]
实施例2：多拷贝整合质粒工具整合能力验证
[0060]
使用表3中的引物rdna-f/rdna-r分别扩增prt111、prt122、prt23、prt34、prt45、prt36和prt37中的整合表达框。将pcr产物回收精制后通过酿酒酵母高效转化方法整合到酿酒酵母菌株c800中。将转化后的菌体依次涂布在ynb-trp、ynb-leu、ynb-ura、ynb-trp、ynb-his、ypd-nat和ypd-hph筛选平板上，30℃，培养3-5d，获得单菌落。对获得的单菌落进行计数，同时接种单菌落进行培养，检测荧光强度。
[0061]
挑取上述不同荧光强度的转化子单菌落，接种到含有1.5ml ynb培养基的48深孔板中，220rpm，30℃培养20-24h后，取200μl发酵液在酶标仪中检测发酵液的荧光强度。酶标仪为美国biotek公司(synergy h1)，激发波长488nm，发射波长520nm。
[0062]
经过一次转化后，prt111、prt122、prt23、prt34、prt45、prt36和prt37可以获得的转化子数量分布见图2，平均可以获得转化子数量依次为187、797、433、473、26、13和42个。每种筛选标签都可以获得较为适中的转化子数量。每个组合获得的多拷贝重组菌株的荧光强度分布范围见图3。其平均荧光强度依次为33195、376466、211679、177743、319725、
169796和52826。因此质粒prt122、prt23、prt34、prt45和prt36是可以稳定获得高拷贝转化子的组合。
[0063]
实施例3：转化子整合拷贝数计算
[0064]
挑取不同荧光强度的转化子单菌落，接种在含有10ml的ypd培养基的250ml摇瓶中，220rpm，30℃培养24h后，吸取500μl菌液，13500rpm离心3min后去上清液。菌体沉淀根据已报道的方法，提取基因组dna(dymond,j.s.,preparation of genomic dna from saccharomyces cerevisiae.2013,methods enzymol 529,153-60.)。使用引物qegfp-f/qegfp-r进行实时荧光定量pcr，内参基因选择act1，内参引物为qact-f/qact-r。
[0065]
发现可以稳定获得高拷贝转化子的质粒prt122、prt23、prt34、prt45和prt36，经过转化，其转化子的平均拷贝数分布在15-20之间，荧光强度最高的一批转化子的拷贝数超过了25。
[0066]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。