一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法

1.本发明涉及的是一种快速分离肌梭的方法，具体涉及一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法。


背景技术：

2.肌梭是骨骼肌内的牵张感受器。肌梭形态结构的改变，对于肌梭及其所在的骨骼肌的生理功能起着至关重要的作用。研究肌梭形态结构最理想的方法是：从固定的肌肉组织中分离出完整的肌梭进而进行相关研究。固定后的组织脆性较大,分离时极易损伤，传统的机械分离技术难度大，产出率低。为此，本发明旨在探索一种从固定组织中快速分离肌梭的方法，为进一步研究肌梭的形态结构和功能提供新的实验方法。


技术实现要素：

3.针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法，将肌肉内的结缔组织进行分解，使组织软化有助于肌梭的快速辨认和分离。
4.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法，包括以下步骤：
5.1、新鲜的骨骼肌标本置入10％中性甲醛固定液中过夜；
6.2、将固定好的肌肉组织流水冲洗，去除固定液；
7.3、冲洗后的骨骼肌组织放入高浓度分解液中进行消化；
8.4、消化好的肌肉组织转入低浓度分解液中，在体视显微镜下观察、分离肌梭；
9.5、分离出的肌梭放入预冷的pb溶液中,进行后续免疫组化染色。
10.所述的步骤3中的分解液采用200g/l koh分解液。
11.所述的步骤4中的分解液采用100g/l koh分解液。
12.所述的步骤5具体如下：将分离出的肌梭必须先放入预冷的pb溶液中进行过渡、缓冲；然后进行常规免疫荧光染色：0.5％triton穿透、山羊血清封闭，滴加抗-vglut1(ab77822，1:200)一抗，4℃过夜；alexa fluor 555红色荧光标记二抗(invitrogen，1：500)，37℃孵育2h；滴加含dapi的抗淬灭封片剂(ab188804)封片，荧光显微镜(leica tcs sp8)观察、拍照。
13.本发明具有以下有益效果：
14.1、在较高浓度(200g/l)koh溶液中消化，在低浓度溶液中分离肌梭，每个比目鱼肌可分离的肌梭明显多于传统的分离技术(每块比目鱼肌可分离出4～10个肌梭)，表明该方法有助于快速、高效的分离肌梭；
15.2、用koh消化法分离出的肌梭，表面干净，免疫染色结果清晰，核袋纤维和核链纤维的区分简单易行。
附图说明
16.下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；
17.图1为本发明的koh消化分解出的肌梭及梭内肌示意图(a完整肌梭及周围的梭外肌；b肌梭赤道部；c神经末梢(近赤道部)；d游离的梭内肌纤维末端和梭外肌纤维(箭头所示为梭外肌纤维上的神经末梢)(n神经末梢；c梭囊，if梭内肌，ef梭外肌))；
18.图2为本发明的肌梭赤道部免疫染色示意图(a抗-vglut1标记的肌梭感觉神经末梢；b、ddapi标记的梭内肌纤维细胞核；c光镜下的梭内肌纤维赤道部(c核链纤维；b核袋纤维)；e为cd叠加，显示梭内肌纤维类型)。
具体实施方式
19.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
20.参照图1-2，本具体实施方式采用以下技术方案：一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法，包括以下步骤：
21.1、新鲜的骨骼肌标本置入10％中性甲醛固定液中过夜；
22.2、将固定好的肌肉组织流水冲洗，去除固定液；
23.3、冲洗后的骨骼肌组织放入高浓度分解液中进行消化；
24.4、消化好的肌肉组织转入低浓度分解液中，在体视显微镜下观察、分离肌梭；
25.5、分离出的肌梭放入预冷的pb溶液中,进行后续免疫组化染色。
26.实验例：一种甲醛固定的肌肉组织肌梭的快速分离方法，具体包括：
27.1、4％多聚甲醛固定液灌流大鼠,分离比目鱼肌，4％多聚甲醛固定液中过夜。固定好的肌肉组织流水冲洗，放入相应的分解液中进行消化；体视显微镜下观察、分离肌梭，拍照。
28.2、主要试剂溶液如下：采用以下消化液来分离肌梭：(1)胶原酶消化液：nb4胶原酶3mg/ml，中性蛋白酶1mg/ml，i型胶原酶2mg/ml；(2)不同浓度koh分解液(g/l)：100，200和500；
29.3、免疫荧光染色鉴定肌梭的免疫学活性：将分离出的肌梭进行常规免疫荧光染色：pbs洗涤、0.5％triton穿透、山羊血清封闭，滴加抗-vglut1(ab77822，1:200)一抗，4℃过夜；alexa fluor 555红色荧光标记二抗(invitrogen，1：500)，37℃孵育2h；滴加含dapi的抗淬灭封片剂(ab188804)封片，荧光显微镜(leica tcs sp8)观察、拍照。
30.实验结果如下：
31.1、消化方法对梭内肌纤维的影响：
32.(1)胶原酶混合液(37℃)5小时内肌肉组织无明显变化；
33.(2)不同浓度koh在不同温度条件下的消化：
34.室温(20-25℃)条件下,肌肉内的结缔组织分解需要5h以上(100g/l的koh中需要10h以上)，时间太长，不利于控制消化进度；60℃条件下，约10-15min后，肌肉组织即出现明显挛缩变形；不利于肌梭的分离；37℃-40℃条件下，500g/l的koh消化能力太强，容易消化过度，肌细胞可见明显变形；在200g/l的koh溶液中，孵育约30min，肌纤维之间的结缔组织开始分解，解剖显微镜下用显微镊轻轻拨开肌纤维，沿着神经纤维的走行、借助于明显膨大
的赤道部梭囊即可很快辨认、分离出完整的肌梭(如图1a)。研究发现，高浓度koh消化后直接移入pbs，肌纤维立即出现肿胀变形，肌梭折光性降低；如在200g/lkoh溶液中消化20-25min，然后将整个肌肉组织转移至低浓度的100g/l koh中游离肌梭，然后转入冷pbs，肌梭能够保持良好的形态。如图1所示：该种方法分离出的肌梭表面干净，梭囊完整，神经末梢清楚，梭内肌纤维的横纹清晰。
35.借助于koh消化，每块比目鱼肌可分离出15-22个完整肌梭(18
±
2.6，n＝12)，明显多于传统的机械分离技术4-10(6.1
±
2.1)，p《0.001。
36.2、肌梭免疫活性的检测
37.用抗-vglut1标记肌梭感觉神经末梢，dapi染色显示梭内肌纤维核的分布，协助判断梭内肌纤维的类型。结果如图2所示，游离出的肌梭，感觉神经末梢清晰，梭内肌纤维结构完整。
38.综上，本实验例的结果表明：
39.1、胶原酶对于固定的肌肉组织消化效果不明显；在较高浓度(200g/l)koh溶液中骨骼肌组织结缔组织易分解消化；
40.2、在低浓度溶液中分离肌梭，每个比目鱼肌可分离的肌梭明显多于传统的分离技术(每块比目鱼肌可分离出4～10个肌梭)，表明该方法有助于快速、高效的分离肌梭。
41.3、用koh消化法分离出的肌梭，表面干净，免疫染色结果清晰，核袋纤维和核链纤维的区分简单易行。
42.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。