基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法与流程

1.本发明涉及虾青素技术领域，具体涉及到基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法。


背景技术：

2.虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一，其系统名称为3，3
′‑
二羟基-4，4
′‑
二酮基-β，β
′‑
胡萝卜素(3，3
′‑
dihydroxy-β，β
′‑
carotene-4，4
′‑
dione)，分子式为c
40h52
o4,相对分子量为596.86，虾青素全反式异构体的分子结构如下所示：
[0003][0004]
该分子结构中的碳骨架由中央多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，同时在每个芳香环上各有一个羟基(－oh)及一个酮基(＝o)。因此，虾青素除有一般的类胡萝卜素的化学性质外，还具有特殊的抗氧化活性。
[0005]
近年来人们对虾青素的抗氧化活性进行了广泛的研究。在体外实验发现它有淬灭单线态氧的能力，同时能有效清除氧自由基。体外细胞实验研究了几种类胡萝卜素淬灭单线态氧的效果，结果发现虾青素淬灭效果最佳，而β-胡萝卜素最差。虾青素清除过氧化氢的能力强于玉米黄素、角黄素及β-胡萝卜素。天然虾青素比角黄素、β-胡萝卜和玉米黄素更有效地防止不饱和脂肪酸的脂质过氧化。因此经研究发现虾青素类似维生素e(ve)，为脂溶性抗氧化剂，但其抗氧化活性高于ve，也高于β-胡萝卜、玉米黄素、叶黄素(lutein)和角黄素等类胡萝卜素。
[0006]
目前，虾青素主要通过以下四种途径获得：(1)化学合成；(2)从甲壳类水产品废弃物中提取；(3)从藻类中提取；(4)利用微生物(如雨生红球藻和红发夫酵母等)发酵生产。由于虾青素分子结构复杂，合成困难，所以化学合成生产的虾青素价格比较昂贵；而从甲壳类水产品废弃物中提取的方法，也面临着原材料来源和收集困难、供应不稳定的问题。因此，目前国内外的研究重点都放在了利用微生物来生产获取虾青素的途径上。
[0007]
研究发现虾青素在野生红发夫酵母所具有的十几种类胡萝卜素中占的比例最大，达到了40％-95％，因此，红发夫酵母被认为是工业化发酵生产虾青素的优良的潜在菌株。
[0008]
目前利用红法夫酵母提取虾青素的方法有如：专利公开号cn103553994a利用三氯甲烷富集乙醇中的虾青素；专利公布号cn109965279a含≤250ppm的二氯甲烷且含≤500ppm的甲醇，但是甲醇，二氯甲烷与三氯甲烷对人体有毒有害，产品用于食品添加有安全隐患。
专利公开号cn102340998b将油脂加入研磨的虾青素颗粒再加热，使虾青素完全溶解于油脂，工艺繁复设备要求高。
[0009]
而且红法夫酵母属于单细胞真核微生物，其细胞壁厚度约为0.1～0.3μm。酵母细胞壁的主要构成为：葡聚糖(35％～45％)、甘露聚糖(40％～45％)、蛋白质(5％～10％)、几丁质(1％～2％)、脂类(3％～8％)和无机盐(1％～3％)。因此，红法夫酵母的细胞壁异常坚硬，不利于胞内虾青素的提取，给红法夫酵母虾青素的研究、开发及利用带来了不便。
[0010]
但目前红法夫酵母细胞破壁的方法主要有：酸热法破壁、碱法破壁、酶法破壁和有机溶剂破壁。研究发现，酸热法破壁效果较好，碱法破壁次之，虽然二甲基亚砜法破壁所得的提取液中虾青素浓度最高，但仅限于小规模检测使用，而虾青素在碱性条件下容易发生不可逆地酯化反应，虽然提取液中总类胡萝卜素的浓度很高，但该碱法破壁已逐渐被淘汰。
[0011]
但目前未有相关的利用食品级试剂从红法夫酵母制备虾青素精油的报道。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法。
[0013]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法，包括以下步骤：
[0014]
s1、物料前处理：取红法夫酵母初始料，加入水搅拌均匀，浸泡0～24h，获得红法夫酵母湿料；
[0015]
s2、酸法破壁：往步骤s1中的红法夫酵母湿料，加入酸性物质搅拌均匀，并在20℃～70℃下处理10～120min，获得红法夫酵母破壁液；
[0016]
s3、收集红法夫酵母菌体：往步骤s2中的红法夫酵母破壁液加入有机溶剂，混合均匀后离心分离，获得红法夫酵母破壁料；
[0017]
s4、提取红法夫酵母中虾青素：往步骤s3中的红法夫酵母破壁料加入有机溶剂搅拌均匀，并在氮气保护下，20℃～70℃下处理10～180min，离心分离，获得红法夫酵母虾青素提取液；
[0018]
s5、浓缩虾青素提取液：将步骤s4中的红法夫酵母虾青素提取液在氮气保护下去除有机溶剂，获得红法夫酵母虾青素粗品；
[0019]
s6、粗制虾青素精油：将步骤s5中的红法夫酵母虾青素粗品在氮气保护下加入适量油脂，饱和无机盐水振荡，萃取油相，反复多次至水相无色，获得虾青素精油粗制品；
[0020]
s7、精制虾青素精油：将步骤s6中的虾青素精油粗制品在低温下静置沉淀，过滤或离心去除沉淀与不溶物，获得虾青素精油精制品；
[0021]
s8、获取虾青素精油成品：将步骤s7中的虾青素精油精制品加入适量除水剂，过滤或分层获得虾青素精油成品；
[0022]
s9、保存虾青素精油：将步骤s8中的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存。
[0023]
进一步的，步骤s1中红法夫酵母初始料为发酵后红法夫酵母发酵液，所述红法夫酵母发酵液至少采用以下三种方法中的一种方法处理获得，包括离心收集的菌泥、喷雾干燥所得的菌粉、碱法破壁后喷雾所得的菌粉。
[0024]
进一步的，步骤s1中红法夫酵母初始料与水的质量-体积比为1：0.2～5。
[0025]
进一步的，步骤s2中红法夫酵母湿料与酸性物质的质量-体积比为1：0.5～5。
[0026]
进一步的，酸性物质包括有机酸、无机酸中的一种或多种；所述有机酸包括非食品级乳酸、食品级乳酸中的一种或多种。
[0027]
进一步的，步骤s3中红法夫酵母破壁液与有机溶剂的质量-体积比为1：0.2～1；所述步骤s4中红法夫酵母破壁料与有机溶剂的质量-体积比为1：0.2～5。
[0028]
进一步的，步骤s3、s4中有机溶剂包括食品级乙醇、无水乙醇、丙醇、丙二醇中的一种或多种。
[0029]
进一步的，步骤s6中油脂包括植物性油脂、动物性油脂、矿物脂中的一种或多种；所述植物性油脂包括大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油中的一种或多种；所述动物性油脂包括猪油、牛油、羊油、鸡油、鱼油、黄油中的一种或多种。
[0030]
进一步的，步骤s6中无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。
[0031]
进一步的，步骤s8中除水剂包括无水硫酸钠、无水硅胶、无水硫酸镁中的一种或多种。
[0032]
本发明的有益效果：由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法，利用食品级试剂(食品乙醇，食品乳酸)通过合理工艺途径，使红发夫酵母中部分磷脂溶于油脂并增加虾青素在油脂中的溶解度，在不添加额外辅料的情况下使精油中虾青素的含量从300mg/l提升至1200mg/l，从而获得高品质的虾青素精油。本发明的工艺简单、成本低廉，使用较低比例的乙醇和乳酸，即可获得高收率的虾青素精油。
附图说明
[0033]
图1为本发明优选实施例中基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法的流程图；
[0034]
图2为萃取虾青素粗制品的图片；
[0035]
图3为虾青素精油粗制品的图片；
[0036]
图4为虾青素精油成品油的图片，从左往右，第一瓶为现有技术获得的精油样品300mg/l，第二、三瓶为本技术获得的精油样品1g/l，第四瓶为本技术冻沉后的精油样品1g/l；
[0037]
图5和6为冻沉处理的虾青素精油的图片。
具体实施方式
[0038]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0039]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0040]
参照图1所示，本发明的优选实施例，基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法，包括以下步骤：
[0041]
s1、物料前处理：取红法夫酵母初始料，加入水搅拌均匀，浸泡0～24h，获得红法夫酵母湿料；
[0042]
其中，红法夫酵母初始料为发酵后红法夫酵母发酵液，该红法夫酵母发酵液采用三种处理方法：1)离心收集的菌泥，2)喷雾干燥所得的菌粉，3)碱法破壁后喷雾所得的菌粉；且红法夫酵母初始料与水的质量-体积比为1：0.2～5；
[0043]
s2、酸法破壁：往步骤s1中的红法夫酵母湿料，加入酸性物质搅拌均匀，并在20℃～70℃下处理10～120min，获得红法夫酵母破壁液；
[0044]
其中，酸性物质包括有机酸、无机酸中的一种或多种；所述有机酸包括非食品级乳酸、食品级乳酸中的一种或多种；红法夫酵母湿料与酸性物质的质量-体积比为1：0.5～5；
[0045]
s3、收集红法夫酵母菌体：往步骤s2中的红法夫酵母破壁液加入有机溶剂，混合均匀后离心分离，获得红法夫酵母破壁料；
[0046]
其中，红法夫酵母破壁液与有机溶剂的质量-体积比为1：0.2～1，使用有机溶剂的目的在于调节液体密度便于离心，该有机溶剂包括食品级乙醇、无水乙醇、丙醇、丙二醇中的一种或多种，但本技术的有机溶剂并不限制于此，其他能够达到此效果的均属于本技术的保护范围；
[0047]
s4、提取红法夫酵母中虾青素：往步骤s3中的红法夫酵母破壁料加入有机溶剂搅拌均匀，并在氮气保护下，20℃～70℃下处理10～180min，离心分离，获得红法夫酵母虾青素提取液；
[0048]
其中，红法夫酵母破壁料与有机溶剂的质量-体积比为1：0.2～5，该有机溶剂包括食品级乙醇、无水乙醇、丙醇、丙二醇中的一种或多种，但本技术的有机溶剂并不限制于此，其他能够达到此效果的均属于本技术的保护范围；
[0049]
s5、浓缩虾青素提取液：将步骤s4中的红法夫酵母虾青素提取液在氮气保护下去除有机溶剂，获得红法夫酵母虾青素粗品；
[0050]
其中，该去除有机溶剂的方法包括但不限于塔式蒸馏，旋转蒸馏，减压蒸馏，减压蒸发，多效蒸发，渗透汽化等溶剂去除方法；
[0051]
s6、粗制虾青素精油：将步骤s5中的红法夫酵母虾青素粗品在氮气保护下加入适量油脂，饱和无机盐水振荡，萃取油相，反复多次至水相无色，获得虾青素精油粗制品，如图2和3所示；
[0052]
其中，油脂包括植物性油脂、动物性油脂、矿物脂中的一种或多种；所述植物性油脂包括大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油中的一种或多种；所述动物性油脂包括猪油、牛油、羊油、鸡油、鱼油、黄油中的一种或多种；无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种，但是该油脂和无机盐并不限制于此，其他能够达到同等效果的均属于本技术的保护范围，
[0053]
s7、精制虾青素精油：将步骤s6中的虾青素精油粗制品在低温下静置沉淀，过滤或离心去除沉淀与不溶物，获得虾青素精油精制品；
[0054]
s8、获取虾青素精油成品：将步骤s7中的虾青素精油精制品加入适量除水剂，过滤或分层获得虾青素精油成品，如图4所示；
[0055]
其中，除水剂包括无水硫酸钠、无水硅胶、无水硫酸镁中的一种或多种，其作用在于去除虾青素精油精制品中微量水，但其他与无水硫酸钠同等效果的除水剂，均属于本申
请的保护范围；
[0056]
s9、保存虾青素精油：将步骤s8中的虾青素精油成品充氮，并置于4
°
c黑暗处密闭保存，如图4、5、6所示。
[0057]
具体见下述实施例
[0058]
实施例一
[0059]
s1、物料前处理：取红法夫酵母碱法破壁料300g，加入800ml的水搅拌均匀，获得红法夫酵母湿料；
[0060]
s2、酸法破壁：将步骤s1中的红法夫酵母湿料，加入200ml分析纯乳酸搅拌均匀，50℃处理30min，获得红法夫酵母破壁液；
[0061]
s3、收集红法夫酵母菌体：将步骤s2中的红法夫酵母破壁液加入200ml无水乙醇(分析纯)，混合均匀后离心分离，获得红法夫酵母破壁料；
[0062]
s4、提取红法夫酵母中虾青素：将步骤s3中的红法夫酵母破壁料加入1000ml无水乙醇搅拌均匀，氮气保护下55℃处理60min，离心分离获得红法夫酵母虾青素提取液，萃取重复2次，综合萃取率99.5％；
[0063]
s5、浓缩虾青素提取液：将步骤s4中的红法夫酵母虾青素提取液氮气保护下去除乙醇获得红法夫酵母虾青素粗品；
[0064]
s6、粗制虾青素精油：将步骤s5中的红法夫酵母虾青素粗品氮气保护下加入100ml油脂，饱和食盐水振荡萃取油相，反复多次至水相无色，获得虾青素精油粗制品；
[0065]
s7、精制虾青素精油：将步骤s6中的虾青素精油粗制品低温静置沉淀，过滤或离心去除沉淀与不溶物，获得虾青素精油精制品；
[0066]
s8、获取虾青素精油成品：将步骤s7中的虾青素精油精制品加入适量无水硫酸钠，过滤或分层获得虾青素精油成品，使用50：50—甲醇—二氯甲烷溶解hplc检测，反式虾青素含量为1.06g/l；
[0067]
s9、保存虾青素精油：将步骤s8中的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存，保存半年后检测反式虾青素含量为0.97g/l。
[0068]
实施例二
[0069]
s1、物料前处理：取红法夫酵母发酵液经喷雾干燥所得的菌粉300g，加入600ml的水搅拌均匀，获得红法夫酵母湿料；
[0070]
s2、酸法破壁：将步骤s1中的红法夫酵母湿料，加入400ml 80％食品级乳酸搅拌均匀，50℃处理20min，获得红法夫酵母破壁液。
[0071]
s3、收集红法夫酵母菌体：将步骤s2中的红法夫酵母破壁液加入200ml无水乙醇，混合均匀后离心分离，获得红法夫酵母破壁料；
[0072]
s4、提取红法夫酵母中虾青素：将步骤s3中的红法夫酵母破壁料加入1000ml无水乙醇搅拌均匀，氮气保护下45℃处理60min，离心分离获得红法夫酵母虾青素提取液，萃取重复4次，综合萃取率45％，萃余红法夫酵母虾青素剩余41％，乳酸破壁液携带10％；
[0073]
s5、浓缩虾青素提取液：将步骤s4中的红法夫酵母虾青素提取液氮气保护下去除乙醇获得红法夫酵母虾青素粗品；
[0074]
s6、粗制虾青素精油：将步骤s5中的红法夫酵母虾青素粗品氮气保护下加入70ml油脂，饱和食盐水振荡萃取油相，反复多次至水相无色，获得虾青素精油粗制品；
[0075]
s7、精制虾青素精油：将步骤s6中的虾青素精油粗制品低温静置沉淀，过滤或离心去除沉淀与不溶物，获得虾青素精油精制品；
[0076]
s8、获取虾青素精油成品油：将步骤s7中的虾青素精油精制品加入适量无水硫酸钠，过滤或分层获得虾青素精油成品，使用50：50—甲醇—二氯甲烷溶解hplc检测，反式虾青素含量为1.13g/l；
[0077]
s9、保存虾青素精油：将步骤s8中的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存，保存半年后检测反式虾青素含量为1.12g/l。
[0078]
实施例三
[0079]
s1、物料前处理：取红法夫酵母发酵液离心收集得菌泥600g，加入400ml的水搅拌均匀，获得红法夫酵母湿料；
[0080]
s2、酸法破壁：将步骤s1中的红法夫酵母湿料，加入400ml 80％食品级乳酸搅拌均匀，45℃处理20min，获得红法夫酵母破壁液。
[0081]
s3、收集红法夫酵母菌体：将步骤s2中的红法夫酵母破壁液加入200ml无水乙醇，混合均匀后离心分离，获得红法夫酵母破壁料；
[0082]
s4、提取红法夫酵母中虾青素：将步骤s3中的红法夫酵母破壁料加入1000ml无水乙醇搅拌均匀，氮气保护下45℃处理60min，离心分离获得红法夫酵母虾青素提取液，萃取重复4次，综合萃取率42％，萃余红法夫酵母虾青素剩余47％，乳酸破壁液携带8％；
[0083]
s5、浓缩虾青素提取液：将步骤s4中的红法夫酵母虾青素提取液氮气保护下去除乙醇获得红法夫酵母虾青素粗品；
[0084]
s6、粗制虾青素精油：将步骤s5中的红法夫酵母虾青素粗品氮气保护下加入80ml油脂，饱和食盐水振荡萃取油相，反复多次至水相无色，获得虾青素精油粗制品；
[0085]
s7、精制虾青素精油：将步骤s6中的虾青素精油粗制品低温静置沉淀，过滤或离心去除沉淀与不溶物，获得虾青素精油精制品；
[0086]
s8、获取虾青素精油成品：将步骤s7中的虾青素精油精制品加入适量无水硫酸钠，过滤或分层获得虾青素精油成品，使用50：50—甲醇—二氯甲烷溶解hplc检测，反式虾青素含量为1.05g/l；
[0087]
s9、保存虾青素精油：将步骤s8中的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存，保存半年后检测反式虾青素含量为1.02g/l。
[0088]
对比实施例一
[0089]
本实施例与实施例二的区别在于：将步骤s1中红法夫酵母初始料与水的质量-体积比设为不在1：0.2～5范围内，
[0090]
或步骤s2中红法夫酵母湿料与酸性物质的质量-体积比设为不在1：0.5～5范围内，
[0091]
或步骤s3中红法夫酵母破壁液与有机溶剂的质量-体积比设为不在1：0.2～1范围内；
[0092]
或步骤s4中红法夫酵母破壁料与有机溶剂的质量-体积比设为不在1：0.2～5范围内。
[0093]
其他步骤均与实施例二相同，其获得的虾青素精油成品，使用50：50—甲醇—二氯甲烷溶解hplc检测，反式虾青素含量在300-550mg/l间。
[0094]
将获得的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存，保存半年后检测反式虾青素含量在290-540mg/l间。
[0095]
对比实施例二
[0096]
本实施例与实施例二的区别在于：将步骤s2酸法破壁采用乙酸或盐酸，获得红法夫酵母破壁液。
[0097]
其他步骤均与实施例二相同，其获得的虾青素精油成品，使用50：50—甲醇—二氯甲烷溶解hplc检测，反式虾青素含量在600-750mg/l间。
[0098]
将获得的虾青素精油成品充氮，并置于4℃黑暗处密闭保存，保存半年后检测反式虾青素含量在595-740mg/l间。
[0099]
本发明的基于红法夫酵母制备虾青素精油的方法，利用食品级试剂(食品乙醇，食品乳酸)通过合理工艺途径，使红发夫酵母中部分磷脂溶于油脂并增加虾青素在油脂中的溶解度，在不添加额外辅料的情况下使精油中虾青素的含量从300mg/l提升至1200mg/l，从而获得高品质的虾青素精油。本发明的工艺简单、成本低廉，使用较低比例的乙醇和乳酸，可获得高收率的虾青素精油。
[0100]
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
[0101]
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。