用于治疗神经变性障碍的方法

用于治疗神经变性障碍的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术享有35 u.s.c.
§
119(e)规定的2019年4月29日提交的美国临时专利申请号62/840,235的优先权，其整体特此通过引用并入本文。


背景技术：

3.帕金森病(pd)是神经变性(degenerative)障碍，其特征在于黑质致密部(substantia nigra pars compacta)(snc)中产生多巴胺(da)的神经元损失、da水平降低——主要在尾状核和核壳中、不溶性α-突触核蛋白聚集体(即，路易体(lewy bodies)和路易轴突)积累以及临床症状的缓慢进行性恶化。目前用于pd的药物疗法改善该疾病的多种运动体征和症状，但尚未确定必定减缓或阻止pd进展的药物。迫切需要能够改变临床进展的疾病改善疗法，然而，找到这种疗法的努力受到限制，部分是因为关于疾病改善疗法所针对的pd中促进da神经元退化的致病过程的不确定。帕金森病是包括路易体痴呆、多系统萎缩和其它罕见疾病在内的数种神经变性疾病中的一种，其特征在于α-突触核蛋白代谢、积累和聚集异常。
4.仍需要用于神经变性障碍如pd、路易体痴呆、多系统萎缩和单纯自主神经衰竭(pureautonomic failure)的疾病改善疗法。本技术解决了这种需要。


技术实现要素：

5.如本文所述，本发明涉及用于治疗突触核蛋白病，包括路易体痴呆、多系统萎缩或单纯自主神经衰竭的组合物和方法。
6.一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的路易体痴呆的方法。该方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
7.在另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的多系统萎缩的方法。该方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
8.在另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的单纯自主神经衰竭的方法。该方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
9.在另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自：带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍、桑菲列普综合征和相关粘多糖病(mucopolysaccaridoses)、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。该方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
10.在本文描述的本发明的以上方面或任何其它方面的各种实施方式中，通过注射、口服或鼻内给予gm1或其衍生物。在某些实施方式中，注射是腹膜内的。
11.在某些实施方式中，gm1或其衍生物是缀合的或工程化的。
12.在某些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载剂(carrier)。
13.在某些实施方式中，gm1或其衍生物在纳米颗粒或外来体中被给予。
14.在某些实施方式中，向路易体痴呆已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在某些实施方式中，向处于路易体痴呆早期阶段的对象给予包含gm1的组合物。
15.在某些实施方式中，向多系统萎缩已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在某些实施方式中，向处于多系统萎缩早期阶段的对象给予包含gm1的组合物。
16.在某些实施方式中，向单纯自主神经衰竭已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在某些实施方式中，向处于自主神经衰竭早期阶段的对象给予包含gm1的组合物。
17.在某些实施方式中，向疾病或障碍已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在某些实施方式中，向处于疾病或障碍早期阶段的对象给予包含gm1的组合物。
18.在某些实施方式中，gm1是合成的。在某些实施方式中，gm1是猪的或羊的。在某些实施方式中，gm1源自猪脑或羊脑。
19.在另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自路易体痴呆、多系统萎缩、单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍、桑菲列普综合征和相关粘多糖病、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。该方法包括向对象给予编码唾液酸酶neu3的核酸。
20.在另一方面，本发明包括治疗有需要的对象中的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自路易体痴呆、多系统萎缩、单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍、桑菲列普综合征和相关粘多糖病、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。该方法包括向对象给予编码b3galt4的核酸。
21.在本文描述的以上方面或任何其它方面的各种实施方式中，核酸被包含在工程化病毒、质粒或非病毒载体中。在某些实施方式中，工程化病毒是腺伴随病毒(aav)。
22.在某些实施方式中，唾液酸酶neu3的表达处于神经元特异性启动子的控制下。在某些实施方式中，b3galt4的表达处于神经元特异性启动子的控制下。
23.在某些实施方式中，核酸包含与seq id no:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸包含与seq id no:1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
24.在某些实施方式中，工程化病毒被通过颅内立体定位注射(intracranial stereotaxicinjection)给予对象。
25.在某些实施方式中，核酸在纳米颗粒或外来体中被给予。
26.在某些实施方式中，向疾病或障碍已呈晚期后的对象给予核酸。在某些实施方式中，向处于疾病或障碍早期阶段的对象给予核酸。
附图说明
27.以下对本发明优选实施方式的详细描述将在结合附图阅读时被更好地理解。为示例本发明，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
28.图1a-1c示例了早期起始gm1给予(在aav-a53tα-突触核蛋白注射后24小时开始)
smirnov d＝0.2945,p《0.0001)，其中与盐水处理组相比，早期gm1组中具有较小尺寸的聚集体数量较大并且较大尺寸的聚集体较少的明显转变。图6b显示，延迟gm1处理组(n＝8)(浅灰色条柱)中纹状体α-突触核蛋白阳性聚集体的尺寸分布也显著不同于盐水处理组(n＝7)(深灰色条柱)中的聚集体尺寸分布(kolmogorov-smirnov d＝0.154,p《0.0001)，其中与gm1组相比，盐水处理组中较大尺寸的聚集体数量较大。图6c显示了盐水处理的动物(左侧)和早期起始gm1处理的动物(右侧)的纹状体中的α-突触核蛋白免疫组织化学染色的显微照片。在gm1处理的动物中，聚集体的尺寸显著较小。箭头指向大α-突触核蛋白阳性聚集体。图6d显示了盐水处理的动物(左侧)和延迟起始gm1处理的动物(右侧)的纹状体中的α-突触核蛋白免疫组织化学染色的显微照片。在延迟起始gm1处理的动物中，聚集体的尺寸较小，但效果不如早期起始gm1动物中那么显著。箭头指向大α-突触核蛋白阳性聚集体。
34.图7a-7b示例了sn切片的免疫组织化学染色，以可视化aav-a53t-α突触核蛋白注射后8周的盐水处理的动物(图7a)和延迟起始gm1处理的动物(图7b)中的ser129磷酸化α-突触核蛋白。与gm1处理的动物相比，盐水处理的动物中有更多的ser129磷酸化α-突触核蛋白染色，并且与gm1处理的动物相比，盐水处理的动物中染色呈现强度更大并且呈现填充更多的神经元。
35.图8示例了图2所示图像的全长wes免疫印迹。
36.图9示例了在gm1的存在下，gfp-α-syn的摄取减少。来自稳定表达gfp标记的野生型人α-syn的mn9d细胞的条件培养基(cm)被应用于正常的分化的sh-sy5y细胞24小时，其中在培养基中添加或不添加gm1神经节苷脂(100μm)。gfp-α-syn被摄取到对照sh-sy5y细胞中，并且在gm1的存在下，gfp-α-syn的摄取减少。
37.图10示例了以下发现：在早期症状阶段(aav-a53t载体注射后2周)，在盐水处理的动物中，在sn中不溶性pser29突触核蛋白(蛋白酶k消化后)被高度表达。在接受gm1(30mg/kg/天)2周(在aav-a53t注射后24小时开始)的动物中，与盐水处理的动物相比，有较少sn神经元表达不溶性pser129，并且每个神经元的pser129表达减少。由于不溶性pser129的水平被用作突触核蛋白聚集的指标，这些数据表明在gm1的存在下体内突触核蛋白磷酸化和聚集减少。
38.图11示例了以下发现：在早期症状阶段(载体注射后2周)，在突触核蛋白病正在发生时但显著细胞死亡发生之前，与gm1处理的动物(n＝8/grp)相比，在盐水处理的动物中beclin-1的蛋白质表达显著增加(***p＝0.0004)。
具体实施方式
39.定义
40.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的测试实践，本文描述了优选的材料和方法。在描述和主张本发明时，将使用以下术语。
41.还应理解，本文中使用的术语仅以描述具体实施方式为目的，而不意图限制。
42.冠词“一种”和“一个”在本文中用于指代该冠词的语法对象的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)。例如，“一个/种要素”意为一个/种要素或多于一个/种要素。
43.如本文在提及诸如数量、持续时间等可测量值时所用，“约”意为包括指定数值的
±
20％或
±
10％，更优选地
±
5％，甚至更优选地
±
1％，并且还更优选地
±
0.1％的差异，因为这种差异适于执行所公开的方法。
44.术语“裂解”指代共价键的断裂，如在核酸分子的主链中。裂解可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链裂解和双链裂解均是可能的。双链裂解可以因两个不同的单链裂解事件而发生。dna裂解可以导致平整末端或交错末端产生。在某些实施方式中，融合多肽可以用于靶向裂解的双链dna。
45.如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指代不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失(删除，deletion)。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，抗体的cdr区域内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以利用本文所述的功能测定法测试改变后的抗体的结合抗原的能力。
[0046]“疾病”是动物的如下健康状态：其中动物不能维持稳态，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物的“障碍”是如下健康状态：其中动物能够维持稳态，但其中动物的健康状态较其不存在障碍时不利。如果不治疗，障碍不一定导致动物健康状态进一步下降。
[0047]“有效量”或“治疗有效量”在本文中被可互换地使用，并且指代如本文所述有效实现具体生物学结果或提供治疗性或预防性益处的化合物、制剂、材料或组合物的量。这种结果可以包括但不限于通过本领域的任何适当手段确定的抗肿瘤活性。
[0048]“编码”指代多核苷酸(如基因、cdna或mrna)中的具体核苷酸序列充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，该聚合物和大分子具有限定的核苷酸(即，rrna、trna和mrna)序列或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质。因此，如果基因相应的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(其用作基因或cdna的转录模板)均可以被称为编码该蛋白质或该基因或cdna的其它产物。
[0049]
如本文所用，“内源”指代来自或产自生物体、细胞、组织或系统内部的任何材料。
[0050]
如本文所用，术语“外源”指代引自或产在生物体、细胞、组织或系统外部的任何材料。
[0051]
如本文所用，术语“表达”定义为被其启动子驱动的具体核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0052]“表达载体”指代包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的表达顺式作用元件；其它表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，
如并入重组多核苷酸的黏粒、质粒(例如，裸露或被包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台(sendai)病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0053]
如本文所用，“同源”指代两个聚合分子之间，例如两个核酸分子如两个dna分子或两个rna分子之间，或两个多肽分子之间，的亚单位序列同一性。当一个亚单位位置在这两个分子均被同一单体亚单位占据时，例如，如果在两个dna分子中的每一个中的位置均被腺嘌呤占据，则其在那个位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源性位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中半数位置(例如，10个亚单位长度的聚合体中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或同源，则这两个序列是90％同源的。
[0054]
如本文所用，“同一性”指代两个聚合分子之间，具体是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间，的亚单位序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个中的一个位置被精氨酸占据，则其在那个位置具有同一性。同一性或两个氨基酸序列在比对中在相同位置具有相同残基的程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一性位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中半数位置(例如，10个氨基酸长度的聚合体中的5个位置)相同，则这两个序列具有50％同一性；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，则这两个氨基酸序列具有90％同一性。
[0055]
如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或可用于传递本发明的组合物和方法的有用性的任何其它表达介质。本发明试剂盒的说明材料可以例如被固定至容纳本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与容纳核酸、肽和/或组合物的容器一起装运。可选地，说明材料可以与容器分开装运，目的是说明材料和化合物由接受者配合地使用。
[0056]“分离的”意为从天然状态改变的或取出的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态共存材料部分地或完全地分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以在非天然环境如例如宿主细胞中存在。
[0057]
如本文所用，术语“修饰的”意为本发明的分子或细胞的改变状态或结构。分子可以以多种方式被修饰，包括化学上、结构上和功能上。可以通过引入核酸来修饰细胞。
[0058]
如本文所用，术语“调节”意为介导对象的响应水平的可检测的增加或降低——与对象在不存在治疗或化合物的情况下的响应水平相比，和/或与其它方面相同但未经治疗的对象的响应水平相比。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或响应，从而介导对象(优选地，人)中的有益的治疗响应。
[0059]
在本发明的环境中，对于常见的核酸碱基使用以下缩写。“a”指代腺苷，“c”指代胞嘧啶，“g”指代鸟苷，“t”指代胸苷，“u”指代尿苷。
[0060]
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，使得编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子(一个或多个)。
[0061]
术语“可操作地连接”指代调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列
是可操作地连接的。总体上，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区域的情况下处于同一阅读框中。
[0062]
组合物的“肠胃外”给予包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或输注技术。
[0063]
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合体。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下公知常识：核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可利用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段——即从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，利用普通克隆技术和pcr
tm
等，以及通过合成手段。
[0064]
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指代由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指代短链——其例如在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚体，也指代更长的链——其在本领域中总体上被称为蛋白质，其有多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0065]
如本文所用，术语“启动子”被定义为被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动多核苷酸序列的特异性转录所需的dna序列。
[0066]
如本文所用，术语“启动子/调控序列”意为与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，此序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以是例如使基因产物以组织特异性方式表达的启动子/调控序列。
[0067]“组成型”启动子是如下核苷酸序列：其在与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中在细胞的大部分或所有生理条件下产生。
[0068]“诱导型”启动子是如下核苷酸序列：其在与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致基因产物在细胞中基本上仅在启动子相应的诱导物在细胞中存在时产生。
[0069]“组织特异性”启动子是如下核苷酸序列：其在与编码基因的或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，导致基因产物在细胞中基本上仅在细胞是启动子相应的组织类型的细胞时产生。
[0070]
术语“对象”旨在包括其中免疫应答可以被引发的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文所用，“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，如羊类、牛类、猪类、犬类、猫类和鼠类哺乳动物。优选地，对象是人。
[0071]“目标位点”或“目标序列”指代这样的基因组核酸序列：其限定在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性地结合的核酸部分。
[0072]
如本文所用，术语“治疗性”意为治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗作用。
[0073]
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”指代将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已被用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞及其后代。
[0074]
术语“转基因”指代已经或即将被人工插入到动物(具体是哺乳动物，并且更具体是活体动物的哺乳动物细胞)的基因组中的遗传物质。
[0075]
如本文所用，术语“治疗”疾病意为降低对象经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重性。
[0076]
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意为启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制通过rna聚合酶进行的转录的起始和多核苷酸的表达。
[0077]“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
[0078]
范围：贯穿本公开，本发明的各种方面可以以范围形式展示。应理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，对范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应被视为已具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这无论范围的宽度而适用。
[0079]
描述
[0080]
本发明涉及用于治疗有需要的对象中的突触核蛋白病的组合物和方法，所述突触核蛋白病包括但不限于路易体痴呆、多系统萎缩、单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍(包括诸如桑菲列普综合征和相关粘多糖病的障碍)、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。
[0081]
一方面，本发明提供了治疗有需要的对象中的路易体痴呆的方法，所述方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
[0082]
在另一方面，本发明提供了治疗有需要的对象中的多系统萎缩的方法，所述方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。
[0083]
在另一方面，本发明提供了治疗有需要的对象中的单纯自主神经衰竭的方法，所述方法包括向对象给予包含gm1或其衍生物的组合物。在一些实施方式中，给予是全身性的。
[0084]
在一些实施方式中，gm1或其衍生物的给予是全身性的。在一些实施方式中，gm1或其衍生物通过注射、口服地或鼻内地给予。在一些实施方式中，注射是腹膜内的。
[0085]
在一些实施方式中，gm1或其衍生物通过纳米颗粒被给予。
[0086]
在一些实施方式中，gm1或其衍生物是缀合的或工程化的。
[0087]
在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载剂。
[0088]
在一些实施方式中，向在路易体痴呆已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在
一些实施方式中，向多系统萎缩已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。在一些实施方式中，向单纯自主神经衰竭已呈晚期后的对象给予包含gm1的组合物。
[0089]
在某些方面，本发明提供了治疗突触核蛋白病的方法，所述突触核蛋白病选自路易体痴呆、多系统萎缩、单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍(包括诸如桑菲列普综合征和相关粘多糖病的障碍)、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。方法包括向对象给予编码唾液酸酶neu3的核酸。给予编码唾液酸酶neu3的核酸将有效增加对象中的gm1水平。在一些实施方式中，核酸被包括在工程化病毒、质粒或非病毒载体中。在一些实施方式中，工程化病毒是腺伴随病毒(aav)。在一些实施方式中，唾液酸酶neu3的表达处于神经元特异性启动子的控制下。在一些实施方式中，工程化病毒通过颅内立体定位注射而被给予对象。
[0090]
在某些方面，本发明提供了治疗突触核蛋白病的方法，所述突触核蛋白病选自路易体痴呆、多系统萎缩、单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍(包括诸如桑菲列普综合征和相关粘多糖病的障碍)、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。方法包括向对象给予编码b3galt4的核酸。给予编码b3galt4的核酸将有效增加对象中的gm1水平。在一些实施方式中，核酸被包括在工程化病毒、质粒或非病毒载体中。在一些实施方式中，工程化病毒是腺伴随病毒(aav)。在一些实施方式中，b3galt4的表达处于神经元特异性启动子的控制下。在一些实施方式中，工程化病毒通过颅内立体定位注射而被给予对象。
[0091]
不希望受理论束缚，促进pd和其它突触核蛋白病的一种潜在致病机制可以涉及神经节苷脂合成和表达的失调，这可能促进α-突触核蛋白的代谢、积累和聚集异常，以及促进pd中的da神经元和突触核蛋白病中的其它神经元类型的整体易损性和退化。神经节苷脂是具有神经酰胺锚(anchor)、寡糖和一个或多个唾液酸残基的鞘糖脂。脑中的主要神经节苷脂种类是gm1、gd1a、gd1b和gt1b，其均贡献质膜和胞内膜的脂质组成。gm1和其它神经节苷脂是被称为脂筏(lipid rafts)的膜信号传导结构域的组分，并且在这方面，gm1有助于调控信号转导以指导神经元发育和细胞存活以及调节多种细胞功能。进一步，已发现至少四种与pd相关的蛋白质(lrrk2、parkin、pink1和α-突触核蛋白)与脂筏关联，并且一些与gm1(以及其它筏标志物)共定位，表明gm1-筏关联的改变可以影响依赖于这些蛋白质的细胞功能。除在质膜处发挥的作用外，gm1还在胞内作用，在胞内其影响ca
2
稳态、线粒体功能和溶酶体完整性，以及对正常细胞功能和存活至关重要的其它过程。溶酶体功能障碍可以导致神经退化，并且α-突触核蛋白积累增加已被与溶酶体功能障碍联系起来。临床前研究已显示，用gm1治疗可以在不同类型的病变后是神经营养性的或神经保护性的，导致显著的生化和行为恢复。具体地，在pd的神经毒素(mptp)诱导模型中，gm1拯救受损的snc da神经元，增加纹状体da水平并增强残留da神经元中的da合成能力。对pd患者中的gm1的临床研究也提供以gm1使用减缓症状进展的证据。尽管有gm1和pd相关的积极临床前和临床发现，gm1发挥其潜在神经保护作用的机制仍然是不确定的。
[0092]
α-突触核蛋白纤颤和聚集被认为是pd病理生理学的重要促成因素，含α-突触核蛋白的胞质包含物是该疾病的组织学标志。α-突触核蛋白积累和聚集(即，突触核蛋白病)还发生在pd以外的突触核蛋白病以及跨越贮积障碍范围，如桑菲列普综合征(粘多糖病iii型)。再现疾病这方面的pd和其它突触核蛋白病的动物模型的最新进展已在在各种启动子
的控制下或利用α-突触核蛋白直接至snc da神经元或其它脑区域中的其它神经元类型的病毒载体递送而表达人α-突触核蛋白的转基因动物中实现。具体地，若干研究已证明了在snc靶向的aav驱动的人突变a53tα-突触核蛋白过表达后小鼠、大鼠和非人灵长类动物的pd相关和进行性神经病理学(包括不溶性α-突触核蛋白聚集体的发展)和行为特征。α-突触核蛋白与gm1的结合在体外抑制纤丝形成——取决于gm1的存在量，gm1对α-突触核蛋白的a53t突变体具有类似作用。另外，gm1和α-突触核蛋白的相互作用在体外导致对乙酰化α-突触核蛋白的纤丝聚集的完全抗性，产生与富gm1膜的结合可以保护单体α-突触核蛋白免于致病性聚集的可能性。利用aav-a53tα-突触核蛋白大鼠模型，进行研究以考察体内gm1神经节苷脂给予可防止α-突触核蛋白毒性和pd相关病理变化和行为缺陷发展的程度。
[0093]
载体
[0094]
本发明提供了载体。在某些实施方式中，载体是腺伴随病毒(aav)载体。在某些实施方式中，载体(例如aav载体)编码b3galt4基因，其涉及gm1神经节苷脂生物合成。
[0095]
aav——属于依赖病毒属(dependovirus)的细小病毒——具有若干特征使其特别适于基因治疗应用。例如，aav可以感染宽范围的宿主细胞，包括非分裂细胞。此外，aav可以感染来自多种物种的细胞。重要地，aav还未被与任何人类或动物疾病关联，并且没有呈现在整合后改变宿主细胞的生理性质。最后，aav在宽范围的物理和化学条件下是稳定的，这使其符合生产、储存和运输要求。
[0096]
aav基因组——包含约4,700个核苷酸的线性单链dna分子(aav-2基因组由4,681个核苷酸组成，aav-4基因组4,767)——总体上包含内部非重复片段，其各端侧接反向末端重复序列(itr)。itr为约145个核苷酸的长度(aav-1具有143个核苷酸的itr)，并具有多种功能，包括充当复制起点和充当病毒基因组的包装信号。
[0097]
基因组的内部非重复部分包括两个大型开放阅读框(orf)，被称为aav复制(rep)和衣壳(cap)区域。这些orf编码复制和衣壳基因产物，其实现完全aav病毒粒子的复制、组装和包装。更具体地，至少四种病毒蛋白的家族从aav rep区域起表达：rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，该蛋白质全部均以其表观分子量命名。aavcap区域编码至少三种蛋白质：vp1、vp2和vp3。
[0098]
aav是辅助体依赖性病毒，即其需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘苗病毒)共感染以形成功能完全的aav病毒粒子。在不存在与辅助病毒共感染的情况下，aav建立潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中或以游离基因形式存在，但不产生感染性病毒粒子。随后辅助病毒的感染“拯救”该整合的基因组，允许其被复制并包装到病毒衣壳中，从而重构感染性病毒粒子。虽然aav可以感染来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须与宿主细胞是同一物种的。因此，例如，人aav在已用犬类腺病毒共感染的犬类细胞中复制。
[0099]
为产生含有异源核酸序列的感染性重组aav(raav)，可以用含有异源核酸序列但缺少aav辅助功能基因(rep和cap)的aav载体转染合适的宿主细胞系。然后可以在单独的载体上提供aav辅助功能基因。此外，可以在载体上仅提供aav生产必要的辅助病毒基因(即，附加功能基因(accessory function genes))，而非提供具有复制能力的辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒或牛痘苗病毒)。
[0100]
总而言之，aav辅助功能基因(即，rep和cap)和附加功能基因可以被提供在一个或
多个载体上。辅助和附加功能基因产物然后可以在宿主细胞中表达，在宿主细胞中其将以反式(in trans)作用于含有异源核酸序列的raav载体。然后含有异源核酸序列的raav载体将被复制和包装——如同其是野生型(wt)aav基因组，形成重组病毒粒子。当患者的细胞被所得raav病毒粒子感染时，异源核酸序列进入患者细胞并在其中表达。由于患者的细胞缺乏rep和cap基因以及附加功能基因，raav不能进一步复制和包装其基因组。此外，在没有rep和cap基因的来源的情况下，wtaav不能在患者的细胞中形成。
[0101]
有11种已知的aav血清型，aav-1至aav-11(mori,et al.,2004,virology 330(2):375-83)。aav-2是人群中最普遍的血清型；一项研究估计总人群中至少80％已感染有wt aav-2(berns and linden,1995,bioessays 17:237-245)。aav-3和aav-5在人群中也是普遍的，感染率上至60％(georg-fries,et al.,1984,virology 134:64-71)。aav-1和aav-4是猿猴分离株，尽管这两种血清型均可以转导人细胞(chiorini,et al.,1997,j virol 71:6823-6833；chou,et al.,2000,mol ther 2:619-623)。在6种已知的血清型中，aav-2是最好表征的。例如，aav-2已被用于宽范围的体内转导实验，并且已被证明转导多种不同的组织类型，包括：小鼠(美国专利号5,858,351；美国专利号6,093,392)、狗肌肉；小鼠肝脏(couto,et al.,1999,proc.natl.acad.sci.usa 96:12725-12730；couto,et al.,1997,j.virol.73:5438-5447；nakai,et al.,1999,j.virol.73:5438-5447；和snyder,et al.,1997,nat.genet.16:270-276)；小鼠心脏(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa 97:13801-13806)；兔肺(flotte,et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:10613-10617)；和啮齿动物光感受器(flannery et al.,1997,proc.natl.acad.sci.usa 94:6916-6921)。
[0102]
可以利用aav-2的宽组织趋向性以递送组织特异性转基因。例如，aav-2载体已被用于递送以下基因：囊性纤维化跨膜传导调控基因，至兔肺(flotte,et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:10613-10617)；因子niii基因(burton,et al.,1999,proc.natl.acad.sci.usa 96:12725-12730)和因子ix基因(nakai,et al.,1999,j.virol.73:5438-5447；snyder,et al.,1997,nat.genet.16:270-276；美国专利号6,093,392)，至小鼠肝脏、狗和小鼠肌肉(美国专利号6,093,392)；促红细胞生成素基因，至小鼠肌肉(美国专利号5,858,351)；血管内皮生长因子(vegf)基因，至小鼠心脏(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa97:13801-13806)；和芳香族1-氨基酸脱羧酶基因，至猴神经元。某些raav递送的转基因的表达在实验动物中具有治疗作用；例如，因子ix的表达被报道在b型血友病的狗模型中使表型正常恢复(美国专利号6,093,392)。此外，raav递送至小鼠心肌的negf的表达导致新血管形成(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa 97:13801-13806)，并且raav递送至帕金森病猴的脑的aadc的表达导致多巴胺能功能恢复。
[0103]
将目标蛋白递送至哺乳动物细胞通过以下完成：首先生成包含编码目标蛋白的dna的aav载体，然后将所述载体给予哺乳动物。因此，本发明应被解释为包括包含编码目标多肽(一种或多种)的dna的aav载体。在装备本发明后，包含编码这种/这些多肽(一种或多种)的dna的aav载体的生成对于技术人员而言将是显而易见的。
[0104]
在某些实施方式中，本发明的raav载体包含若干必需dna元件。在某些实施方式中，这些dna元件包括至少两拷贝的aav itr序列、启动子/增强子元件、转录终止信号、编码目标蛋白或其生物活性片段的dna侧接的任何必需的5’或3’非翻译区。本发明的raav载体还可以包括目标蛋白的内含子的部分。此外，任选地，本发明的raav载体包含编码突变的目
标多肽的dna。
[0105]
在某些实施方式中，载体包含启动子/调控序列，该启动子/调控序列包含能够驱动异源基因在多种不同细胞类型中高水平表达的广泛宿主(promiscuous)启动子。这种启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即刻(immediate)早期启动子/增强子序列、劳斯肉瘤病毒启动子/增强子序列等。在某些实施方式中，本发明的raav载体中的启动子/调控序列是cmv即刻早期启动子/增强子。然而，用于驱动异源基因表达的启动子序列也可以是诱导型启动子，例如但不限于类固醇诱导型启动子，或者可以是组织特异性启动子，如但不限于，肌肉组织特异性的骨骼α-肌动蛋白启动子和肌肉肌酸激酶启动子/增强子等。
[0106]
在某些实施方式中，本发明的raav载体包括转录终止信号。尽管本发明的载体中可以包括任何转录终止信号，但在某些实施方式中，转录终止信号是sv40转录终止信号。
[0107]
在某些实施方式中，本发明的raav载体包含编码目标多肽或目标多肽的生物活性片段的分离的dna。本发明应被解释为包括目标多肽的任何哺乳动物序列，已知的或未知的。因此，本发明应被解释为包括来自除人之外的哺乳动物的基因，其多肽的作用方式基本上类似于人多肽。优选地，包含编码目标多肽的基因的核苷酸序列与编码目标多肽的基因具有约50％同源性，更优选地约70％同源性，甚至更具体地约80％同源性，以及最优选地约90％同源性。
[0108]
进一步，本发明应被解释为包括野生型蛋白质序列的天然存在的变体或重组衍生的突变体，该变体或突变体使得其编码的多肽如全长多肽一样在治疗上有效，或者在本发明的基因治疗方法中甚至比全长多肽在治疗上更有效。
[0109]
本发明还应被解释为包括编码保留多肽生物活性的变体的dna。这种变体包括这样的蛋白质或多肽：已经或可以用重组dna技术修饰，使得该蛋白质或多肽具有增强其用于本文所述方法的适用性的另外的性质，例如但不限于，赋予该蛋白质在胞质中增强的稳定性和该蛋白质的增强的比活性的变体。类似物与天然存在的蛋白质或肽的区别可在于保守氨基酸序列差异，或不影响序列的修饰，或两者。例如，可以形成保守氨基酸变化，其虽然改变蛋白质或肽的一级序列，但通常不改变其功能。
[0110]
本发明不是限于实验实施例中示例的具体raav载体；而是，本发明应被解释为包括任何合适的aav载体，包括但不限于基于aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-9等的载体。
[0111]
本发明还包括以有效提供治疗效果的量治疗患有疾病或障碍的哺乳动物的方法。该方向包括向哺乳动物给予编码目标多肽的raav载体。优选地，哺乳动物是人。
[0112]
一般，单次注射中给予的病毒载体基因组/哺乳动物的数量在约1
×
108至约5
×
10
16
范围内。优选地，单次注射中给予的病毒载体基因组/哺乳动物的数量为约1
×
10
10
至约1
×
10
15
；更优选地，单次注射中给予的病毒载体基因组/哺乳动物的数量为约5
×
10
10
至约5
×
10
15
；并且最优选地，单次注射中给予哺乳动物的病毒载体基因组的数量为约5
×
10
11
至约5
×
10
14
。
[0113]
当本发明的方法包括多位点同时注射，或包括经数小时(例如，约少于1小时至约2或3小时)的时间段至不同位点的注射的若干多位点注射时，给予的病毒载体基因组的总数可以与单位点注射方法所述相同，或是其分数或倍数。
[0114]
关于在单位点注射中给予本发明的raav载体，在某些实施方式中，将包含病毒的
组合物被直接注射至对象的器官(例如但不限于对象的肝脏)中。
[0115]
关于对哺乳动物的给予，可以将raav载体悬浮在药学上可接受的载剂中，例如，ph为约7.8的hepes缓冲盐水。其它有用的药学上可接受的载剂包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它药学上可接受的盐溶液，如磷酸盐和有机酸盐。这些和其它药学上可接受的载剂的实例被描述于remington’s pharmaceutical sciences(1991,mack publication co.,new jersey)中。
[0116]
本发明的raav载体还可以以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括例如干燥盐配方的载体冻干制剂、用于载体/盐组合物悬浮的无菌水以及载体悬浮和其给予哺乳动物的说明。
[0117]
在某些实施方式中，载体是aav-2载体。在某些实施方式中，载体包含aav骨架和人b3galt4基因。在某些实施方式中，载体包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，载体与seq id no:1具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方式中，载体包含aav骨架和neu3(唾液酸酶)基因。在某些实施方式中，载体包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，载体与seq id no:2具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
[0118]
aav-syn-hb3gatl4-synegfp(seq id no:1)
[0119]
[0120]
[0121]
[0122][0123]
aav-syn-hb3gatl4-synegfp(seq id no:1)的注释：左侧反向末端重复序列1-141，突触蛋白i启动子-i：262-817，hb3galt4:832-1968，sv40聚(a):1993-2221，突触蛋白i启动子-ii：2282-2837，egfp cds:2884-3601，bgh聚腺苷酸化序列：3730-3957，右侧反向末端重复序列4042-4182，氨苄青霉素抗性(bla)orf 5099-5956，puc起点6107-6774。
[0124]
aav-syn-hneu3-synegfp(seq id no:2)
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129][0130]
aav-syn-hneu3-synegfp(seq id no:2)的注释：左侧反向末端重复序列：1-141，突触蛋白i启动子-i:262
–
817，hneu3:833-3190，sv40聚(a):3260-3488，突触蛋白i启动子-ii:3549-4104，egfp cds:4151-4868，bgh聚腺苷酸化序列：4997-5224，右侧反向末端重复序列5309-5449，氨苄青霉素抗性(bla)orf 6366-7223，puc起点7374-8041。
[0131]
药物组合物和制剂
[0132]
还提供了包含gm1或其衍生物的组合物。组合物包括用于给予的药物组合物和制剂，如用于治疗有需要的对象(例如患者)中的突触核蛋白病，包括但不限于路易体痴呆、多系统萎缩或单纯自主神经衰竭、带有突触核蛋白基因突变的遗传形式的帕金森病、与脑中异常α突触核蛋白沉积物相关的溶酶体贮积障碍(包括诸如桑菲列普综合征和相关粘多糖病的障碍)、伴有异常突触核蛋白积累的glccerase(gba)突变。gm1可以源自本领域普通技术人员已知的任何来源，包括但不限于动物源(例如，猪、牛、羊、人等)或合成源(例如人造的、合成的、工程化的、缀合的等)。在某些实施方式中，gm1源自动物脑。gm1可以是包括寡糖部分和脂质部分的完整gm1分子或单独gm1寡糖部分。
[0133]
药物组合物和制剂总体上包括一种或多种任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包括至少一种另外的治疗剂。
[0134]
术语“药物制剂”指代如下制剂：其形式允许其中包含的活性成分的生物活性有效，并且不包含另外的对制剂所给予的对象具有不可接受的毒性的组分。“药学上可接受的载剂”指代药物制剂中除活性成分之外的对对象无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，载剂的选择部分地由具体组合物和/或给予方法决定。因此，有多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物一般以总体组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。载剂被描述于例如remington's pharmaceuticalsciences第16版，osol,a.ed.(1980)中。药学上可接受的载剂在所用剂量和浓度下对接受者是总体上无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘
氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。
[0135]
在一些方面，缓冲剂被包括在组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物一般以总体组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法被更详细地描述于例如remington:the science andpractice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；第21版(2005年5月1日)。
[0136]
制剂可以包括水溶液。制剂或组合物还可以含有多于一种对在治疗的具体适应症、疾病或状况有用的的活性成分，优选活性与组合物互补的的那些，其中对应的活性相互无不利影响。这种活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药物活性剂或药物。在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或状况的量，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过对被治疗对象的定期评估来监测。期望的剂量可以通过组合物的单次弹丸(推注，bolus)给予、组合物的多次弹丸给予或组合物的连续输注给予来递送。
[0137]
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌内、鼻内、口腔(颊部，buccal)、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方式中，组合物被肠胃外给予。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射，利用外周全身性递送，将组合物给予对象。在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，其在一些方面可以被缓冲至选择的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在一定程度上更便于给予，尤其通过注射。另一方面，粘性组合物可以在合适的粘度范围内被配制，以提供与特定组织较长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载剂，其可以是溶剂或分散介质，含有例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适当混合物。
[0138]
gm1或衍生物可以作为纳米颗粒制剂或在外来体中被给予。纳米颗粒包括但不限于脂质体、聚乙二醇化脂质体、功能化聚合物体(polymersomes)、聚合物微球或纳米胶束。纳米颗粒可以是总体上靶向脑或将gm1或衍生物靶向和递送在脑中特定部位的纳米颗粒。天然存在的或制造的外来体可以用作gm1神经节苷脂或衍生物的递送媒介物，以递送至脑，优选地通过鼻内递送途径或口服递送途径。外来体可以被功能化以靶向脑中的特定细胞类型。
[0139]
无菌可注射溶液可以通过以下制备：将组合物掺入溶剂中，例如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等共混。根据期望的给予途径和制剂，组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素。在一些方面可以查阅标准文本以准备合适的制剂。
[0140]
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保预防微生物作用，例如
对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸。通过使用吸收延迟剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以带来可注射药物形式的吸收延长。
[0141]
用于体内给予的制剂总体上是无菌的。无菌可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
[0142]
除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其完全在技术人员的掌握范围内。这种技术在文献中被充分说明，如“molecular cloning:a laboratory manual”,fourth edition(sambrook,2012)；“oligonucleotide synthesis”(gait,1984)；“culture of animal cells”(freshney,2010)；“methods in enzymology”“handbook of experimental immunology”(weir,1997)；“gene transfer vectors for mammalian cells”(miller and calos,1987)；“short protocols in molecular biology”(ausubel,2002)；“polymerase chain reaction:principles,applications and troubleshooting”,(babar,2011)；“current protocols in immunology”(coligan,2002)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并且因此可以在制造和实践本发明时被考虑。对具体实施方式特别有用的技术将在以下部分中讨论。
[0143]
实验实施例
[0144]
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅以示例为目的，并且除非另有说明，不旨在进行限制。因此，本发明不应以任何方式被解释为受限于以下实施例，而是应被解释为包括因本文提供的教导而显而易见的任何和所有变动。
[0145]
在没有进一步描述的情况下，认为本领域普通技术人员能够利用前述描述和以下示例性实施例来制备和利用本发明的化合物和实践主张的方法。因此，以下工作实施例具体地指出了本发明的优选实施方式，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0146]
方法
[0147]
载体
[0148]
aav-a53tα突触核蛋白载体设计的充分细节可以在koprich et al.mol neurodegener 5:43(2010)中找到。简而言之，使用1/2血清型(衣壳以1:1比例表达aav1和aav2血清型蛋白)嵌合腺伴随载体(aav)，其中人a53tα突触核蛋白表达被与巨细胞病毒(cmv)即刻早期增强子序列杂交的鸡β肌动蛋白(cba)启动子驱动。旱獭转录后调控元件(wpre)和牛生长激素聚腺苷酸化序列(bgh-聚a)也被并入，以进一步增强转导后的转录。载体(aav1/2-a53t和空白载体对照)由genedetect ltd.,auckland,new zealand生产。病毒滴度通过定量pcr(applied biosystems 7900qpcr)确定，其中引物指向wpre区域，因此代表溶液中含有待递送基因组的aav的功能性物理颗粒的数量。
[0149]
动物和载体递送
[0150]
所有动物程序被thomas jefferson university institutional animal care and use committee批准，并根据national institutes of health guide for the care and use of laboratory animals进行。成年雄性sprague-dawley大鼠(envigo)——在手术时为250至300g——每笼容纳3只，在12小时亮/暗循环过程中随意取用食物和水。所有手术均在利用氯胺酮(100mg/kg,i.p.)和甲苯噻嗪(10mg/kg,i.p.)的混合物的全身麻醉下进行。在动物被麻醉后，头被剃秃并用聚维酮碘溶液和醇进行手术准备，然后被置于kopf立体
定位框架中，其中切牙条(incisor bar)被设置在水平面0以下约3.5mm处，以实现平坦的颅骨位置。将颅骨顶部的皮肤沿中线切开并缩回(retracted)。利用颅骨下方坐标ap：-5.3，l:2.2，d:7.5——源自前囟，在一侧的sn上形成小钻孔(small burr hole)，并将附接至负载有aav-a53t-突触核蛋白或空白载体对照病毒的hamilton注射器的36号针缓慢降至脑中，并利用电动注射泵以0.2μl/min的速率在sn上方注射2.0μl。在注射完成后的5分钟等待时间后，将针缓慢撤出，闭合皮肤伤口，并给予术后镇痛剂(美洛昔康1mg/kg)。一些大鼠被随机分配以接受每日gm1神经节苷脂(猪脑源gm1，30mg/kg，i.p.，qilu pharmaceutical co.,ltd.)或相似体积的生理盐水注射——从aav-a53t-突触核蛋白手术后24小时开始，并持续6周(早期起始组)。其它动物被随机分配以接受每日gm1神经节苷脂(猪脑源gm1，30mg/kg，i.p.,qilu pharmaceutical co.)或相似体积的生理盐水注射——从aav-a53t-突触核蛋白手术后3周开始，并持续5周(延迟起始组)。基于以下信息选择30mg/kg的剂量：此前发现此剂量的gm1在小鼠的mptp损伤模型中有效；此剂量在跨越各种中枢和外周损伤模型的大量啮齿动物研究中被证明有效刺激再生响应。在研究结束时，将动物安乐死，迅速取出新鲜脑，解剖两侧的2至3个纹状体样品并立即冷冻以供后续分析。将脑的其余部分(包括在前连合的交叉水平处开始的纹状体)浸入固定在4％多聚甲醛中。
[0151]
行为测试
[0152]
利用圆筒测试(cylinder test)分析探索活动期间的前肢使用。测试设备由放置在光线昏暗房间内镜子前的约33cm直径和50cm高度的透明plexiglass圆筒组成，以从所有角度可视化肢体使用。将各节段录像，用于动物实验组盲目观察者的后续分析。在每次测试节段开始之前对aav-a53t-α-突触核蛋白注射侧的对侧爪进行标记，以明确地确定录像带的侧向性(laterality)。测试在暗循环开始前的下午晚期进行。在每个测试节段，将动物轻轻置于圆筒中并对运动录像10分钟。通过对同侧爪、对侧爪(相对于aav-a53t-α-突触核蛋白注射侧)和双爪在圆筒壁上的负重接触评分，来评估前肢使用。对圆筒上的爪位的20次观察进行评分。对壁上的肢体位评分——只有在其发生在动物回到停歇位置并再次用后腿站立(reared)以接触圆筒壁后的情况下。同侧(ipsi)和对侧(contra)爪接触百分比分别以下列计算：[(ipsi 1/2双爪)/总观察数#]*100和[(对侧 1/2双爪)/总观察数#]*100。圆筒测试如下进行：对于即刻起始gm1组在手术前(基线)和手术后3周和6周，对于延迟起始gm1组在手术后3周和8周。
[0153]
纹状体多巴胺和代谢物水平的测量
[0154]
将纹状体样品在0.4m高氯酸中冷超声10秒，并在4℃下以13,000rpm离心10min。取出上清液并用含有内标(异丙肾上腺素，4ng)的milli-q超纯水(电阻率18.2mω
·
cm)稀释1:4。将稀释的样品在4℃下再次以13,000rpm离心5min。样品在载入与hplc系统整合的冷藏(4℃)自动进样器之前被保存在冰上。利用带有电化学检测(带有玻璃碳电极的decade elite电化学检测器)的alexys uhplc系统(antec scientific)进行分析。利用aquity uplc柱1.0
×
100mm beh c18 1.7um(waters corporation)在37℃下实现分离。流动相(ph 3.0)由100mm磷酸、100mm柠檬酸、0.1mm edta.na2、600mg/l辛烷磺酸钠盐和8％乙腈组成。泵流速为50μl/min。分析物在600mv的氧化电位下相对于0mv的参比电极被检测。获取数据并利用clarity软件(v7.4.1)(dataapex)处理。将峰高与内标曲线进行比较，以确定各样品中的da和代谢物浓度。
cocktail,thermo fisher scientific)的ripa缓冲剂中准备组织裂解物，并利用micro bca蛋白质测定试剂盒(thermo fisher scientific)进行定量。对于各样品，制备足以装载两个毛细孔的体积的母混物，从而能够在个体毛细管中测定来自相等样品量的目标(α-突触核蛋白)和对照(β-肌动蛋白)信号，以最小化目标蛋白和对照蛋白产生的化学发光信号中的任何干扰。通过将组织样品裂解物(每孔4μg)、0.1x样品缓冲剂和5x荧光混合物(200mm dtt，5x样品缓冲剂，5x荧光标准品组合并在70℃下变性10分钟，制备样品裂解物母混物。对于各样品，将等量的变性裂解物母混物装载到12-230kda wes分离模块板的两个毛细孔中，并按照制造商的建议进行解析。利用稀释1:25的抗α-突触核蛋白抗体(syn204)(目录号2647s,cell signaling)测定α-突触核蛋白水平，并利用稀释1:50的抗β-肌动蛋白抗体(nb600-503,novus biologicals)测定β-肌动蛋白水平。hrp缀合的抗小鼠(目录号042-205)和抗兔二抗和鲁米诺检测试剂(目录号dm-001)从proteinsimple获得。α-突触核蛋白和β-肌动蛋白的表达水平通过利用compass软件(protein simple)的高斯分布函数计算α-突触核蛋白和β-肌动蛋白化学发光信号的曲线下方面积来确定。最终，将α-突触核蛋白信号相对于β-肌动蛋白信号标准化并展示。利用compass软件(proteinsimple)制备wes蛋白质免疫印迹图像。
[0161]
动物从分析中的排除
[0162]
由于没有aav1/2-a53tα-突触核蛋白注射产生成功病变的证据，来自所有手术组的共9只动物被从分析中排除。由于技术原因或缺乏足够的组织可用于处理，来自早期起始a-53t-α-突触核蛋白/盐水组的2只动物和来自早期起始a-53t-α-突触核蛋白/gm1组的4只动物被从立体学细胞计数分析中排除。此外，由于技术原因或缺乏足够的组织可用于处理，来自延迟起始a-53t-α-突触核蛋白/盐水组的1只动物被从圆筒测试分析和dopac水平分析中排除；来自延迟起始a-53t-α-突触核蛋白/gm1组的2只动物被从立体学细胞计数分析和dopac水平分析中排除。
[0163]
统计学分析
[0164]
所有统计均利用graphpad prism软件(v7)进行。数值以平均值
±
sem展示。实验组之间的比较利用student t检验进行，或者当比较涉及多于两组时，利用单因素方差分析，然后利用bonferroni多重比较检验进行事后比较。所有分析均是双边的。非参数kolmogorov smirnov检验用于检验来自盐水和gm1处理动物的α-突触核蛋白聚集体尺寸的样品是否来自相同的分布(即，h0：两个样品来自相同分布；ha：两个样品不是来自相同分布)。在所有情况下，统计学显著性被设定在p《0.05。
[0165]
实施例1-早期起始gm1给予部分地保护运动行为和纹状体da水平
[0166]
利用圆筒测试评估aav-a53tα-突触核蛋白转导动物的自发前肢使用，并且治疗有显著的主要作用，其中在gm1处理的动物中观察到保护作用(f(5,102)＝16.59,p《0.0001)。接受aav-a53tα-突触核蛋白然后生理盐水6周的动物在爪使用方面产生显著的不对称性，优先用相对于病毒注射侧同侧前爪接触圆筒。在aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周，盐水处理的动物已显示出同侧肢体使用百分比显著增加，其在病毒注射后6周持续被观察到(平均值
±
sem：基线：48.1
±
1.9％；3周：74.2
±
2.7％，6周：72.9
±
2.9％)(图1a)。在aav-a53tα-突触核蛋白注射后24小时开始接受gm1给予的动物中，肢体使用不对称性(同侧肢体使用百分比)在aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周和6周也增加，但这种增加仅在3周时与基线显著
不同(平均值
±
sem：基线：50.1
±
1.8％；3周：67.1
±
3.7％，6周：56.0
±
2.5％)(图1a)。与盐水处理的动物在6周时相比，gm1处理的动物在6周时肢体使用不对称量显著较少(p《0.0001)(图1a)。接受aav空白载体注射的动物在肢体使用方面没有显著变化(％同侧肢体使用：基线：48.8
±
2.3％；3周：53.7
±
4.2％；6周：58.5
±
4.1％；(f(2,9)＝2.521,p＝0.1173)。
[0167]
在aav-a53tα-突触核蛋白注射后6周，在盐水处理的动物中，注射同侧的纹状体da水平是注射对侧(即，非注射侧)的da水平的47.8
±
4.5％。在手术后24小时开始接受gm1给予的动物中，注射同侧的纹状体da水平是注射对侧的da水平的64.0
±
3.5％(t(34)＝2.858,p＝0.0072，vs.盐水处理)(图1b，表1)。在盐水处理的动物中，注射同侧的dopac/da比是对(非注射)侧的154.5
±
9.2％，而在gm1处理的动物中，注射同侧的dopac/da比是对(非注射)侧的112.3
±
9.5％(t(34)＝3.092,p＝0.0040，vs.盐水处理)(图1c)。注射aav空白载体对纹状体da水平没有显著影响(非注射侧：10.57
±
0.47μg/g湿重；注射侧：11.04
±
0.69μg/g湿重；n＝9，p＝0.5775)。
[0168]
表1.aav-a53t-α-突触核蛋白和gm1神经节苷脂给予对纹状体多巴胺(da)和二羟基苯基乙酸(dopac)水平的影响
[0169][0170]ap＝0.0026，vs.aav-a53t/盐水；bp＝0.004，vs.aav-a53t/盐水；^两个样品通过
grubbs检验确定为极端异常值，并从分析中去除。
[0171]
关于在aav-a53tα-突触核蛋白注射后24小时开始gm1给予观察到的积极效果不能解释为gm1通过aav载体干扰a53tα-突触核蛋白基因的转导和α-突触核蛋白的表达。当在aav-a53tα-突触核蛋白注射后1周评估时，纹状体α-突触核蛋白水平在盐水vs.gm1处理的动物中没有差异，表明gm1对a53tα-突触核蛋白转导或向纹状体的运送没有影响(标准化od：分别为0.014
±
0.004和0.017
±
0.007，t(12)＝0.4412,p＝0.6669)(图2a-2b)。在aav-a53tα-突触核蛋白注射后1周snc的免疫组织化学评价也显示在盐水和gm1处理的动物之间th 神经元中的α-突触核蛋白积累没有差异(图2c-2d)。
[0172]
实施例2-早期起始gm1给予部分地保护sn神经元免受α-突触核蛋白诱导的毒性
[0173]
为研究gm1在pd相关病理背景下的潜在保护作用，考查了gm1给予影响a53tα-突触核蛋白过表达黑质da神经元的存活的程度。注射同侧的snc中的th 细胞数量显著减少：与对(非注射)侧相比，aav-a53t-α-突触核蛋白注射导致th 神经元损失60.0
±
2.3％(图3a-3b)。与非注射侧相比，接受早期起始gm1给予的动物具有43.7
±
2.7％的th 神经元损失(t(28)＝4.379,p＝0.0002)(图3a-3b；表2)。类似地，snc中甲酚紫染色细胞的数量被aav-a53t-α-突触核蛋白注射和gm1处理显著影响。与对侧相比，aav-a53t-α-突触核蛋白注射导致甲酚紫染色的神经元损失54.9
±
1.8％。与对侧相比，gm1处理的动物具有仅41.9
±
2.5％的甲酚紫染色神经元损失(t(28)＝3.997,p＝0.0004)(表2)。注射aav空白载体对sn神经元没有显著影响：th 神经元的计数为非注射侧的95.4
±
1.1％；甲酚紫染色神经元的计数为非注射侧的95.6
±
1.3％。
[0174]
表2：aav-a53t-a-突触核蛋白和gm1神经节苷脂给予对黑质致密部多巴胺神经元的影响
[0175][0176]ap＝0.0008，vs.aav-a53t/盐水；bp＝0.002，vs.aav-a53t/盐水；cp＝0.0017，vs.aav-a53t/盐水；dp＝0.0006，vs.aav-a53t/盐水。
[0177]
实施例3-延迟起始gm1给予使运动行为部分地恢复并保护纹状体da水平
[0178]
接受aav-a53tα-突触核蛋白然后盐水8周的动物在爪使用方面也产生显著的不对称性，优先用病毒注射同侧的前爪接触圆筒(图4a)。在aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周测试时，盐水处理的动物显示同侧肢体使用百分比显著增加，这类似于在前述动物中所见，并在病毒注射后8周时持续被观察到(平均值
±
sem；基线：50.9
±
2.4％；3周：74.5
±
3.8％，8周：81.4
±
4.5％)(图4a)。有显著治疗效果支持gm1处理组(f(5,84)＝19.14,p《0.0001)。被分配至gm1组的动物的基线同侧肢体使用百分比(50.0
±
2.0％)与盐水组相当，并在第3周时同侧前肢使用百分比增加(74.9
±
2.8％)，也与盐水组中的观察到的百分比相当。这些动物然后在接下来的5周内每天接受gm1给予，并在第8周再次测试时，显示与第3周刚好在接受gm1处理前时的表现相比同侧前肢使用百分比(61.5
±
2.7％)显著降低(即，对侧肢体使用增加)(p＝0.0075，vs.第3周)(图4b)。
[0179]
在aav-a53tα-突触核蛋白注射后8周，盐水处理动物的脑的病毒注射侧的纹状体da水平是对(非注射)侧的da水平的32.3
±
5.0％。在手术后3周开始接受gm1给予的动物中，脑的病毒同(注射)侧的纹状体da水平是对侧的da水平的55.0
±
3.9％(t(29)＝3.565,p＝
0.0013，vs.盐水处理)(图4c)。盐水处理的动物中注射侧的dopac水平为对侧的69.4
±
7.4％，而在gm1处理的动物中，注射侧的dopac水平为非注射侧的82.0
±
8.4％，增加但与盐水处理的动物没有统计学显著差异(图4d)。盐水处理动物中注射同侧的dopac/da比为对侧的181.1
±
25.4％，而在gm1处理的动物中，注射同侧的dopac/da比为对侧的150.0
±
10.9％，尽管这种差异不是统计学显著的。
[0180]
实施例4-延迟起始gm1给予部分地保护sn神经元免受α-突触核蛋白诱导的毒性
[0181]
考查延迟起始gm1给予可影响a53tα-突触核蛋白过表达黑质da神经元的存活的程度。注射同侧的snc中的th 细胞数量显著减少：与对(非注射)侧相比，aav-a53t-α-突触核蛋白注射导致63.3
±
3.0％的th 神经元损失。与对侧相比，接受延迟起始gm1给予的动物具有50.6
±
2.1％的th 神经元损失(t(27)＝3.58,p＝0.0013)(图5a-5b；表2)。snc中甲酚紫染色细胞的数量也受aav-a53t-α-突触核蛋白注射和延迟起始gm1处理显著影响。与对侧相比，aav-a53t-α-突触核蛋白注射导致甲酚紫染色神经元损失58.2
±
2.6％。与对侧相比，延迟起始gm1处理的动物具有仅45.5
±
2.1％的甲酚紫染色神经元损失(t(27)＝3.796,p＝0.0008)(表2)。
[0182]
实施例5-gm1给予减少α-突触核蛋白聚集
[0183]
由于在前的体外研究表明gm1和α-突触核蛋白(野生型和a53t突变皆是)以潜在地抑制致病性聚集的方式相互作用，假设将gm1给予aav-a53t过表达动物将导致较少的α-突触核蛋白聚集以及因此较小尺寸的聚集体。因此，考查早期或延迟起始gm1给予对纹状体中的α-突触核蛋白阳性肿胀/聚集体的尺寸的影响。与gm1处理(在aav-a53t给予后24小时开始)相比，盐水处理下纹状体α-突触核蛋白阳性聚集体的尺寸分布显著不同(kolmogorov-smirnov d＝0.2945,p《0.0001)，其中与盐水组相比，gm1组中有较小尺寸的聚集体数量较大和较大尺寸的聚集体较少的明确转变(图6a-6c)。在盐水组中测量的最大聚集体尺寸为52.5μm2，而在gm1处理的动物中测量的最大聚集体尺寸为28.8μm2。与盐水处理的动物相比，延迟起始gm1给予的动物中聚集体尺寸分布的测量获得类似的结果。与gm1处理(在aav-a53t给予后3周开始)相比，盐水处理下的纹状体α-突触核蛋白阳性聚集体的尺寸分布显著不同(kolmogorov-smirnov d＝0.154,p《0.0001)，其中与gm1组相比，盐水组中较大尺寸的聚集体数量较大(图6b-6d)。在盐水组中测量的最大聚集体尺寸为66.9μm2，而在gm1处理的动物中测量的最大聚集体尺寸为29.3μm2。与在aav-a53t给予后24小时开始接受gm1的动物相比，在aav-a53t给予后3周开始接受gm1的动物具有较多数量的中等尺寸的聚集体(约7-12μm2)，但与早期起始gm1组一样，与盐水组相比具有较少的较大尺寸的聚集体。尽管ser129磷酸化α-突触核蛋白的积累没有被定量，但gm1处理的和盐水处理的动物的sn中的ser129磷酸化α-突触核蛋白阳性神经元和神经突的免疫组织化学可视化显示，与盐水处理的动物相比，gm1处理的动物中的胞质ser129磷酸化α-突触核蛋白染色强度较低并且核(nuclear)聚集体较少/较小(图7a-7b)。
[0184]
实施例6-讨论
[0185]
gm1神经节苷脂对纹状体da水平和行为具有有益效果，并在pd神经毒素(主要是mptp)模型中保护snc da神经元免于退化。gm1也已显示具有症状效果(symptomaticeffects)，并且长期使用可以减缓pd患者的症状进展。当前结果表明，gm1给予还能够对pd模型中的黑质纹状体da系统发挥神经保护和潜在神经恢复效果，其特征在于
在snc神经元中人类突变α-突触核蛋白(a53t)的定向过表达。这些数据是特别值得注意的——考虑到已被发现在mptp小鼠或非人灵长类pd模型中具有神经保护性的其它化合物尚未将这种临床前成功平移到α-突触核蛋白模型或临床。尽管为何诸如gdnf、neurturin、coq10、cep-1347、gpi-1485、吡格列酮、艾塞那肽(exenatide)等的化合物和在mptp模型中显示出有前景的神经保护作用的其他化合物没有在临床试验中显示出明确的疾病改善作用存在若干可能的原因，但pd的mptp(和其它基于毒素的)模型的相关性和平移性已受到置疑——基于毒素模型不能忠实地复制疾病的关键方面的假设。然而，临床平移失败可能同样是因为关于在临床前模型中的缺陷的测试化合物的具体特征。这里显示，与这些其它化合物不同，gm1在小鼠和非人灵长类mptp模型中具有神经保护性，在基于pd的核心分子特征(即，与异常α-突触核蛋白的积累有关的毒性)再现da神经元退化和功能障碍的aav-α-突触核蛋白模型中具有神经保护性，并且这些临床前成功已被平移到最初临床试验的积极效果。在当前研究中，在aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周的圆筒测试中观察到行为缺陷。虽然在本研究中动物在这3周期间没有被安乐死，但先前对此模型的深入表征(利用与这里所用完全相同的载体和载体浓度)显示，在第3周时观察的圆筒测试缺陷在没有sn da神经元或纹状体da水平显著损失但纹状体中存在中度营养不良轴突形态的情况下出现。在aav-a53tα-突触核蛋白注射后24小时开始用gm1处理的动物在aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周和6周测试时已开始显示注射对侧的前肢使用减少，这种效果变为统计显著性的，其中同侧/对侧前肢使用的比例近似在基线(在aav-a53tα-突触核蛋白注射之前)时观察的比例。在6周时，gm1处理的动物的纹状体da水平也显著高于盐水处理的动物。结果还显示，早期起始gm1处理不干扰α-突触核蛋白的表达或运送。这些结果表明，早期起始gm1治疗，尽管不干扰a53tα-突触核蛋白通过aav载体的转导和α-突触核蛋白的表达/运送，但确实干扰在运动方面设置的从α-突触核蛋白积累开始的病理过程。相当值得注意的是以下发现：延迟起始gm1处理可以显著逆转aav-a53tα-突触核蛋白注射后3周观察到的行为缺陷。如其它提出议，在3周时间点观察到的行为缺陷是相对解剖学完整的黑质纹状体通路的a53tα-突触核蛋白诱导的功能障碍造成的结果。在这个时间点开始gm1治疗能够提供一定保护，免于snc da神经元退化和纹状体da损失——甚至在α-突触核蛋白积累的病理过程已经开始后，并且能够逆转在3周时观察到的前肢使用缺陷，如在aav-a53tα-突触核蛋白注射后8周所观察。这种模型中的gm1的神经保护功效的潜在机制在此时是不完全清楚的。观察到，在给予gm1的动物中，α-突触核蛋白的聚集减少，并且初步观察表明gm1还可以使α-突触核蛋白磷酸化减少，潜在地减少有毒形式的α-突触核蛋白的积累。α-突触核蛋白在ser129处的磷酸化促进α-突触核蛋白纤丝形成，并且沉积在pd脑中路易体中的α-突触核蛋白大部分广泛地在ser129处被磷酸化。a53tα-突触核蛋白以及野生型α-突触核蛋白可以形成不溶性有毒纤丝聚集体，并且突变α-突触核蛋白可以比野生型α突触核蛋白更倾向于聚集和有毒。观察到，aav-a53tα-突触核蛋白注射后早期起始和延迟起始使用gm1均使纹状体中测量的α-突触核蛋白聚集体的尺寸减少。体外研究已显示gm1和α-突触核蛋白之间的直接关联——归因于螺旋α-突触核蛋白与gm1的唾液酸且碳水化合物部分之间的相互作用，并且与gm1的这种关联抑制纤颤。pd中的sn中的gm1和其它复杂神经节苷脂的表达减少，pd sn中的da能神经元中的神经节苷脂生物合成涉及的基因的表达减少。不希望受理论的束缚，可以想到，pd sn中的神经节苷脂并且特别是gm1的水平降低可促进毒性α-突触核蛋白的积累，并且给予gm1
可以提供足量的这种重要的鞘脂，从而至少部分地抑制α-突触核蛋白的毒性聚集，并为sn da神经元提供一定水平的保护。这种可能性得到b4galnt1敲除小鼠研究的支持——b4galnt1敲除小鼠研究没有gm1和其它a-系列神经节苷脂，报告在没有gm1的基因敲除型小鼠中α-突触核蛋白聚集量增加，其至少可以通过给予gm1和半合成gm1衍生物liga-20而部分地减少。
[0186]
在当前研究中观察到的gm1的神经保护作用基于的另一可能机制可以涉及gm1对自噬和溶酶体功能的影响。自噬-溶酶体通路的功能障碍已被提出促成pd病理。a53t-α-突触核蛋白的过表达抑制自噬，并且致病性a53t-α-突触核蛋白不良地通过伴侣蛋白介导的自噬而被处理和清除。在自噬削弱的条件下，gm1，在体内或体外，增加自噬标志物的表达并增强自噬。内源神经节苷脂的消耗导致溶酶体功能受损和自噬抑制，导致路易体疾病的细胞模型中α-突触核蛋白和p123hβ-突触核蛋白的积累。可能在当前研究中自噬过程因a53t-α-突触核蛋白过表达而削弱，促进α-突触核蛋白聚集和da能细胞损失增强，并且gm1处理增强溶酶体功能并增加α-突触核蛋白的自噬清除。现需要另外研究来考察这种关于gm1在此模型中的神经保护作用的潜在机制。
[0187]
用于此研究的aav-a53tα-突触核蛋白模型与先前描述的产生黑质纹状体da系统的特定的和进展性的退化的模型相同。动物在aav-a53tα-突触核蛋白注射后的早期时间点没有被安乐死，因此病理学的进展属性没有被验证。然而，在建立模型时的早期试点研究中，在注射后的前3周检测前肢使用不对称性的稳步增加。尽管进行了通过免疫组织化学对磷酸化ser 129α-突触核蛋白表达有限的考查，但没有足够的组织可用于系统性评价磷酸化ser 129α-突触核蛋白的水平。同样，不溶性磷酸化α-突触核蛋白聚集体的存在未被直接评估。纹状体α-突触核蛋白聚集体已显示在具有aav-介导的a53t-α-突触核蛋白过表达的大鼠中在ser129处被广泛地磷酸化，然而，在当前研究中，仅评估了纹状体中的α-突触核蛋白阳性聚集体总量，并且没有单独分析ser129磷酸化α-突触核蛋白阳性聚集体。
[0188]
当前结果显示，先前在pd的mptp模型中显示具有神经保护性的gm1神经节苷脂在pd的aav-a53tα-突触核蛋白过表达模型中也具有神经保护作用。此模型中的神经保护作用——据推测与pd比神经毒素模型更加病理相关——与gm1在pd患者中的临床结果一致，其中长期利用gm1产生潜在的疾病改善效果的迹象。直接影响pd中潜在疾病过程并且可以减缓神经元细胞死亡和症状进展的治疗的开发仍然是pd群体未满足的需求。基于先前的工作和当前的结果，gm1仍然有潜力成为这样的治疗，具有保护da神经元免于死亡的潜力以及对受损但可活的神经元的拯救和恢复功能，因此指示关于pd的gm1的继续临床开发。
[0189]
实施例7：gm1处理使α-syn的细胞转移减少
[0190]
最近认识到，α-syn的细胞至细胞转移可以是突触核蛋白病进展的重要因素。α-syn的细胞至细胞转移可以作为游离α-syn或作为含α-sy的外来体发生。在此，进行初步研究以评估gm1可以影响α-syn释放和/或被邻近细胞摄取的程度。将稳定表达用gfp标记的人wtα-syn的mn9d多巴胺能细胞培养至～90％汇合并转移至无血清培养基中48小时以生成条件培养基(cm)，将其收集，以1000rpm旋转10分钟并通过无菌40μm过滤器过滤。将正常sh-sy5y细胞(atcc)平铺在8孔室玻片中，并使其在10μm视磺酸中分化7天。用无菌cm或常规培养基替换各孔中50％的培养基。使细胞在100μm gm1的存在或不存在的情况下在cm中生长24小时，在4％多聚甲醛中固定10分钟，并被处理以得到增强的利用gfp免疫荧光的gfp可视
化。gfp-α-syn被摄取至对照sh-sy5y细胞中，然而，在gm1的存在下培养的细胞中gfp-α-syn的水平降低(图9)。这些结果表明，在gm1的存在下，在外来体中释放的被释放α-syn和/或被释放游离α-syn的细胞摄取减少。
[0191]
实施例8：gm1影响体内α-syn磷酸化和聚集
[0192]
迄今为止的研究并未表明gm1给予使α-syn mrna或蛋白质表达本身减少。然而，gm1给予可以影响体内α-syn磷酸化和聚集。一些研究已报告，在体外，gm1和α-syn相互作用，导致纤丝形成不存在和螺旋折叠倾向增加，导致gm1介导的抗聚集保护。在本研究之前尚未证明这在体内可以发生的程度。数据还表明，ser129磷酸化与pd和其它突触核蛋白病中的α-syn毒性积累和神经退化相关，并且在过表达α-syn的大鼠中pser129阳性聚集体增加。在本文中提出，gm1降低α-syn相关神经毒性的能力基于的机制是gm1给予减少α-syn磷酸化，因此减少体内聚集和毒性。为证明这一点，大鼠被准备用于将aav1/2-a53t单侧给予至黑质(sn)中，如本文其它部分所述。在aav给予后24小时开始，一些动物接受每天腹膜内盐水注射，而其它动物接受每天腹膜内注射gm1(30mg/kg)。在盐水或gm1给予开始后2周，对动物进行安乐死。随后将脑切片，并将sn切片用蛋白酶k处理，然后处理用于pser129α-syn免疫荧光。结果显示，与盐水处理的动物相比，在接受2周gm1给予的动物的sn中，各细胞中有显著地较少的pser129α-syn阳性细胞和较少的pser129α-syn(图10)。
[0193]
实施例9：评估在α-突触核蛋白过表达模型中gm1对体内溶酶体功能/自噬过程的作用
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在人pd中，α-syn阳性聚集体的存在与自噬体的积累和溶酶体功能障碍的标志物相关，表明α-syn聚集体的溶酶体介导的清除削弱。各种贮积障碍的病理表型包括增加的α-syn积累和聚集，并且这种增加的α-syn积累和聚集已被与溶酶体功能障碍联系起来。而且，aav-a53t大鼠中由过量α-syn诱导的da神经元退化与自噬活性和溶酶体功能标志物的逐渐下降有联系。观察到，在aav-a53t向sn给予后2周，gm1处理使增加的sn beclin-1水平逆转，表明自噬体的可能早期积累和/或自噬体清除相关问题可能被gm1逆转(图11)。
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其它实施方式
[0196]
本文对变量的任何限定中的要素列举的叙述包括该变量为任何单个要素或所列要素的组合(或子组合)的限定。本文对实施方式的叙述包括该实施方式为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分的组合。
[0197]
本文引用的每一项专利、专利申请和出版物的公开内容其整体特此通过引用并入本文。尽管本发明已被参考具体实施方式而公开，但显而易见，本发明的其它实施方式和变型可被本领域其它技术人员在不背离本发明的真实精神和范围的情况下想到。所附权利要求意图被解释为包括所有这种实施方式和等效变型。