人脐带血血浆外泌体在制备治疗衰老引发的退行性疾病的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及人脐带血血浆外泌体在制备治疗衰老引发的退行性疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.随着年龄的增长，衰老会发生在诸多器官，例如大脑、肌肉、骨骼等，其中以神经系统的退行性变化最为明显。随着器官退行性变化逐渐加剧，最终会导致神经系统、运动系统等出现一系列功能性障碍疾病，这一类疾病称为退行性疾病。目前，退行性疾病主要包括阿尔兹海默症(alzheimer’s disease,ad)、多发性硬化(multiple sclerosis,ms)、帕金森病(parkinson’s disease,pd)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,als)、亨廷顿舞蹈症(huntington disease,hd)以及不同类型脊髓小脑共济失调(spinocerebellar atrophy,sca)等。
3.血液作为循环系统的组分之一，在整个机体中发挥多种重要的生理功能，如代谢功能、免疫功能、信使功能、体温调节、凝血功能等。科研人员通过蛋白质组学等手段，发现人类血液中存在一个动态的、由组织和细胞分泌的信息网络(如多种分泌蛋白等)，参与衰老进程。借助于动物实验，一些研究者试图在血液中探寻引发衰老的关键因子。如conboy等基于小鼠的非长期的异种共生系统和实时的血液交换系统，证明了衰老小鼠血液中的一些因子可使年轻小鼠的某些细胞和组织发生衰老，而年轻小鼠血液中的某些因子对老龄鼠的某些细胞组织的衰老具有治疗作用。
4.脐带血是连接母体和胎儿之间的脐带内的残留血液，里面含有很多活性成分。临床上可以通过保存脐带血，治疗多种疾病，如恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫方面的疾病等，脐带血是很重要的资源。脐带血中含有的丰富造血干细胞，是珍贵的造血干细胞来源。脐带血的造血功能日益受到医学界的认可。脐带血移植，可用于治疗白血病、糖尿病、放射病等多种难以治愈的疾病。
5.外泌体(exosome)是一群由细胞分泌的直径在40-150nm左右、密度范围为1.09-1.18g/ml的具有双层磷脂膜结构的囊泡样物质，包含蛋白质、mrna、mirna及其它信号分子。目前关于外泌体与衰老相关的研究已有较多的报道，但主要还停留在细胞水平。如热休克、缺氧、低温、氧化应激和辐射等刺激会导致细胞衰老，从而增加了外泌体的分泌，并促使外泌体中的生物活性成分发生变化。外泌体与衰老相关的研究主要集中在以下两个方面：(1)衰老细胞所分泌的外泌体较年轻细胞在数量上显著增加。(2)细胞衰老可显著改变外泌体的组分。外泌体同样被报道可能参与调控神经退行性疾病的发生。例如，winston等人检测了神经元来源的外泌体在预测轻度认知障碍与ad中的作用，结果发现与正常人群相比，轻度认知障碍和ad人群中这些外泌体内p-tau、aβ1-42、神经粒蛋白(neurogranin)以及转录阻遏因子-1(repressor element 1-silencing transcription factor)的含量有明显的改变。
6.目前针对衰老引发的退行性疾病多针对于特定靶点，具有单一性及药物依赖性，无法从根源缓解衰老引发的线粒体功能的衰退。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了人脐带血血浆外泌体在制备治疗衰老引发的退行性疾病的药物中的应用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.人脐带血血浆外泌体在制备治疗衰老引发的退行性疾病的药物中的应用。
10.人脐带血血浆外泌体联合年轻人血浆外泌体在制备治疗衰老引发的退行性疾病的药物中的应用。
11.作为本发明的一种优选，所述的年轻人年龄在18-40岁。
12.作为本发明的进一步优选，所述的外泌体由血浆提取和/或超速离心制备得到。
13.一种治疗衰老引发的退行性疾病的药物，包含人脐带血血浆外泌体。
14.作为本发明的进一步优选，所述的药物还包含年轻人血浆外泌体。
15.有益效果：
16.这种依靠人脐带血血浆外泌体对衰老引起的线粒体功能失调治疗的技术方法很大程度上解决了目前神经退行性疾病药物生产成本高、靶点单一等问题，是一种低成本、高效率的神经退行性疾病治疗方式，同时证明了基于本发明的外泌体治疗模式的安全性。
附图说明
17.图1人脐带血血浆外泌体按梯度与ne-4c细胞共培后，衰老指标p21差异表达的情况。
18.图2人脐带血血浆外泌体和年轻人血浆外泌体与ne-4c细胞共培后，衰老指标p21差异表达的情况。
19.图3人脐带血血浆外泌体按梯度与c2c
12
细胞共培后，衰老指标p21差异表达的情况。
20.图4人脐带血血浆外泌体和年轻人血浆外泌体与c2c
12
细胞共培后，衰老指标p21差异表达的情况。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
22.本发明的提供了一种血浆外泌体提取试剂盒以及血浆外泌体注射程序的应用。
23.上述血浆外泌体提取试剂盒的方法包括以下步骤：
24.(1)提前一天超声洗净超速离心机专用的离心管，并晾干。
25.(2)操作前半小时将水浴锅设置为37℃。
26.(3)取出分装好的冷冻血浆，25～37℃水浴融化，融化完成放置冰上。
27.(4)在2-8℃条件下，400g-700g离心2-10分钟，取上清。
28.(5)在2-8℃条件下，2000g-5000g离心20-30分钟，取上清。
29.(6)在2-8℃条件下，8000g-13000g离心50-90分钟，取上清。
30.(7)先在离心管中加入适量pbs稀释，尽量不要有气泡。
31.(8)将血浆倒入离心管，不要有气泡，润洗管壁及管盖，不要有气泡，标记朝外，自由滑入。
32.(9)在2-8℃条件下，使用超速离心机，100000g-160000g离心60-90分钟。
33.(10)结束后，按vacuum，再开舱门。
34.(11)吸弃上清。注意：外泌体在沉淀里。
35.(12)用适量pbs重悬外泌体，注意用pbs淋洗标记过的外侧。
36.上述血浆外泌体注射程序包括以下步骤：
37.(1)收集外泌体，准确确定外泌体体积，将外泌体平均分若干份，放入-20℃冻存；
38.(2)取一支外泌体室温融化，静脉注射入生物体内；
39.(3)每隔一段时间注射一支，共注射至少五次以上。
40.实施例2
41.通过将人脐带血血浆外泌体按25μl、50μl、100μl、200μl的体积梯度与小鼠神经干细胞(ne-4c)共培养,通过western blot检测细胞衰老指标p21的表达水平，研究人脐带血血浆外泌体对ne-4c细胞衰老表达的影响。结果见图1。
42.实施例3
43.通过将人脐带血血浆外泌体和年轻人血浆外泌体按25μl、50μl的体积与小鼠神经干细胞(ne-4c)共培养,通过western blot检测细胞衰老指标p21的表达水平，研究人脐带血血浆外泌体对ne-4c细胞衰老表达的影响。结果见图2。
44.实施例4
45.通过将人脐带血血浆外泌体按25μl、50μl、100μl、200μl的体积梯度与小鼠成肌细胞(c2c12)共培养,通过western blot检测细胞衰老指标p21的表达水平，研究人脐带血血浆外泌体对c2c12细胞衰老表达的影响。结果见图3。
46.实施例5
47.通过将人脐带血血浆外泌体和年轻人血浆外泌体按25μl、50μl的体积与小鼠成肌细胞(c2c12)共培养,通过western blot检测细胞衰老指标p21的表达水平，研究人脐带血血浆外泌体对c2c12细胞衰老表达的影响。结果见图4。