一种植物中没食子单宁的LC-MS/MS检测方法

一种植物中没食子单宁的lc-ms/ms检测方法
技术领域
1.本发明涉及化合物检测方法技术领域,尤其涉及一种植物中没食子单宁的lc-ms/ms检测方法。


背景技术：

2.单宁是一类重要的酚类化合物，根据其水解性可将其分为缩合单宁和水解单宁。没食子单宁(gts)是一系列水解单宁，其分子结构通常以多元醇(糖类)为核心，并以酯键形式在其周围结合若干没食子酸。没食子单宁广泛存在于五倍子、牛膝草、紫背天牛、牡丹等双子叶植物的根、茎、叶、花和果实中。研究表明，没食子单宁类化合物具有抗氧化、抑菌、抗炎、抑制肥胖、抗糖尿病、心脏保护等多重生物活性，因此被广泛应用于食品、保健品、医药和化妆品等领域。
3.由于没食子酸与多元醇集合位点的多样性和没食子酰基数量的差异性，没食子单宁具有复杂的分子结构，这也对其在植物中的测定提出挑战。化合物结构表征的常规策略是通过核磁共振技术，然而核磁共振检测依赖于分离纯化的单体化合物，导致该过程耗时耗力。随着色谱与质谱技术的飞速发展，高效液相色谱-质谱(hplc-ms)仪已逐渐成为代谢物检测的主要工具。目前，质谱技术主要包括非靶向检测技术和靶向检测技术。
4.其中，以飞行时间(tof)和轨道阱(orbitrap)为代表的非靶向检测技术可以对代谢物的离子信息实现全扫，质量分析结果具有超高的分辨率，然而其质谱检测器很容易出现离子饱和，限制了其在代谢物精确定量检测中的使用。以三重四极杆(qqq)为代表的靶向检测技术可以有目的性的缩小扫描范围，进而提高对目标代谢物检测的重复性和灵敏度，结合多级反应监测(mrm)模式广泛用于代谢物定量分析，但是对代谢物的靶向质谱检测需要利用已知的化学标准品进行mrm条件优化。目前可以购买到的没食子单宁化学标准品仅有1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-d-glucose,pgg)。
5.因此，不依赖于化学标准品，快速实现没食子单宁的定性和定量分析仍然是不小的挑战。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种植物中没食子单宁的lc-ms/ms检测方法。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种植物中没食子单宁的lc-ms/ms检测方法，包含如下步骤：
9.1)将植物没食子单宁样品和甲醇溶液混合后顺次进行萃取、离心，得到待测样品；
10.2)将待测样品进行液相色谱分离，使待测样品中没食子单宁类化合物彼此分离；
11.3)将分离的没食子单宁类化合物进行串联质谱检测，得到保留时间和ms/ms信息，建立没食子单宁类化合物的质谱数据库；
12.4)根据ms/ms信息筛选得到mrm定量离子对，在fia模式下设置mrm定量离子对的信
息和保留时间，利用植物没食子单宁样品混样一针进样得到优化mrm质谱条件；
13.5)整合步骤3)中没食子单宁类化合物的离子对、保留时间和步骤4)的优化mrm质谱条件，实现植物中没食子单宁的定性和定量检测。
14.作为优选，步骤1)所述混合之前将植物没食子单宁样品顺次进行液氮速冻、研磨；所述甲醇溶液的浓度为70～100％；所述植物没食子单宁样品和甲醇溶液的质量体积比为0.5～1.5g：8～12ml。
15.作为优选，步骤1)所述萃取的时间为25～35min，所述离心的温度为3～5℃，离心的转速为9000～11000rpm，离心的时间为8～12min。
16.作为优选，步骤2)所述液相色谱检测的条件为：
17.色谱柱：phenomenex kinetex f5色谱柱，3.0
×
100mm，2.6μm
18.柱温：35～45℃
19.进样量：1～3μl
20.流动相：包含流动相a和流动相b，流动相a为质量浓度为0.5～1.5％的甲酸溶液，流动相b为乙腈
21.流动相流速：0.3～0.5ml/min。
22.作为优选，步骤2)所述液相色谱检测中梯度洗脱程序为：
23.0～1min，流动相b占流动相总体积的9～11％，
24.1～3.5min，流动相b占流动相总体积的10～20％，
25.3.5～8min，流动相b占流动相总体积的20～30％，
26.8～15min，流动相b占流动相总体积的30～65％，
27.15～16min，流动相b占流动相总体积的65～98％，
28.16～18min，流动相b占流动相总体积的97～99％，
29.18～18.1min，流动相b占流动相总体积的98～10％，
30.18.1～20min，流动相b占流动相总体积的9～11％。
31.作为优选，所述串联质谱检测包含质谱全扫描和中性丢失扫描，所述质谱全扫描和中性丢失扫描的条件为：
32.扫描方式：esi负离子模式
33.离子源温度：580～620℃
34.离子源电压：4～5kv
35.惰性气体：氮气
36.ida参数：ida采集的峰数量为top 3，mass tolerance为0.5da，离子流阈值为950～1050cps
37.epi参数：dp为55～65v，ce为35～45v，ces为18～22v。
38.作为优选，所述质谱全扫描中，epi离子扫描范围为50～1000da，所述中性丢失扫描中，母离子扫描范围为100～1000da，epi离子扫描范围为50～1000da。
39.作为优选，步骤4)所述mrm定量离子对的信息中，dp为-100～-10v，ce为-50～-2v。
40.本发明的有益效果包括：
41.(1)没食子单宁类化合物检测全面：通过分析没食子单宁裂解规律，发现该类化合物具有中性丢失170da的特性。根据这一特征，利用中性丢失扫描(nl-ida-epi)的离子扫描
方式，不仅可以筛选出所有没食子单宁类化合物，还可以采集其ms/ms信息，有利于没食子单宁类化合物鉴定和质谱数据库的建立。
42.(2)不依赖于化学标准品：本发明的检测方法首先利用液相色谱实现样品中没食子单宁类化合物的分离，其次通过nl-ida-epi扫描模式确定目标代谢物保留时间和ms/ms信息，建立样品没食子单宁类化合物质谱数据库，进而利用ms/ms信息和样品分别筛选mrm定量离子对(q1-q3)和优化mrm质谱条件。本发明的检测方法不仅不依赖于化学标准品，还有利于新化合物或未知化合物的分析检测。
43.(3)高灵敏度：利用液相色谱分离技术、中性丢失扫描技术和mrm模式可有效排除大量干扰离子，降低质谱检测的化学背景，显著提高目标代谢物的信噪比。另外，没食子单宁类化合物分析采用优化的mrm质谱检测条件，使得定量离子对信号达到最强，进一步提高了检测灵敏度。
44.(4)重复性好：本发明检测方法中的nl-ida-epi建库、mrm质谱条件优化和样品上样检测均采用了相同的已优化液相色谱检测条件，保证了目标代谢物具有稳定的保留时间，重现性提高。
45.(5)准确度高：一方面，样品分析采用mrm-ida-epi的扫描方式，采集了代谢物的ms/ms信息，可以与建立的质谱数据库进行比对，有效避免了假阳性的出现，再加上稳定的保留时间，化合物鉴定准确；另一方面，样品代谢物分析采用了优化的mrm质谱条件，使目标代谢物离子对信号达到最强，提高了代谢物定量结果的准确性。
46.(6)操作简单：本发明的检测方法不需要分离纯化的标准品，利用中性丢失性质可检测所有没食子单宁类化合物，mrm质谱条件可利用fia自动优化，建立好的质谱检测方法一针进样可同时对样品中化合物进行定性和定量分析，操作简单，具有广泛的应用性。
附图说明
47.图1为没食子单宁1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖裂解规律图；
48.图2为牡丹雄蕊中没食子单宁类化合物的定性定量检测结果图；
49.图3为牡丹叶片中没食子单宁类化合物的定性定量检测结果图；
50.图4为牡丹幼茎中没食子单宁类化合物的定性定量检测结果图；
51.图5为牡丹根皮中没食子单宁类化合物的定性定量检测结果图。
具体实施方式
52.本发明提供了一种植物中没食子单宁的lc-ms/ms检测方法，包含如下步骤：
53.1)将植物没食子单宁样品和甲醇溶液混合后顺次进行萃取、离心，得到待测样品；
54.2)将待测样品进行液相色谱分离，使待测样品中没食子单宁类化合物彼此分离；
55.3)将分离的没食子单宁类化合物进行串联质谱检测，得到保留时间和ms/ms信息，建立没食子单宁类化合物的质谱数据库；
56.4)根据ms/ms信息筛选得到mrm定量离子对，在fia模式下设置mrm定量离子对的信息和保留时间，利用植物没食子单宁样品混样一针进样得到优化mrm质谱条件；
57.5)整合步骤3)中没食子单宁类化合物的离子对、保留时间和步骤4)的优化mrm质谱条件，实现植物中没食子单宁的定性和定量检测。
58.本发明步骤1)所述混合之前优选将植物没食子单宁样品顺次进行液氮速冻、研磨；研磨优选为研磨至粉末，粉末的粒径优选为40～60目，进一步优选为45～55目，更优选为50目；所述甲醇溶液的浓度(体积浓度)优选为70～100％，进一步优选为80～95％，更优选为85～90％；所述植物没食子单宁样品和甲醇溶液的质量体积比优选为0.5～1.5g：8～12ml，进一步优选为1g：10ml。
59.本发明步骤1)所述萃取的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，更优选为30min；所述萃取优选在超声条件下进行，超声的频率优选为35～45khz，进一步优选为40khz；超声的功率优选为450～550w，进一步优选为480～520w，更优选为500w；所述离心的温度优选为3～5℃，进一步优选为4℃；离心的转速优选为9000～11000rpm，进一步优选为9500～10500rpm，更优选为10000rpm；离心的时间优选为8～12min，进一步优选为9～11min，更优选为10min。
60.本发明步骤1)所述离心完成后取上清液，利用0.22μm的滤器过滤，得到待测样品，待测样品置于-80℃的条件下备用。
61.本发明步骤2)所述液相色谱检测的条件为：
62.色谱仪：岛津lc-20a高效液相色谱仪
63.色谱柱：phenomenex kinetex f5色谱柱，3.0
×
100mm，2.6μm
64.柱温：35～45℃，优选为38～42℃，进一步优选为40℃
65.进样量：1～3μl，优选为1.5～2.5μl，进一步优选为2μl
66.流动相：包含流动相a和流动相b，流动相a为质量浓度为0.5～1.5％的甲酸溶液，优选为1％，流动相b为乙腈
67.流动相流速：0.3～0.5ml/min，优选为0.35～0.45ml/min，进一步优选为0.4ml/min。
68.本发明所述液相色谱检测中梯度洗脱程序为：0～1min(包含1min)，流动相b占流动相总体积的9～11％，1～3.5min(不包含1min，包含3.5min)，流动相b占流动相总体积的10～20％，3.5～8min(不包含3.5min，包含8min)，流动相b占流动相总体积的20～30％，8～15min(不包含8min，包含15min)，流动相b占流动相总体积的30～65％，15～16min(不包含15min，包含16min)，流动相b占流动相总体积的65～98％，16～18min(不包含16min，包含18min)，流动相b占流动相总体积的97～99％，18～18.1min(不包含18min，包含18.1min)，流动相b占流动相总体积的98～10％，18.1～20min(不包含18.1min，包含20min)，流动相b占流动相总体积的9～11％；优选为0～1min，流动相b占流动相总体积的10％，1～3.5min，流动相b占流动相总体积的10～20％，3.5～8min，流动相b占流动相总体积的20～30％，8～15min，流动相b占流动相总体积的30～65％，15～16min，流动相b占流动相总体积的65～98％，16～18min，流动相b占流动相总体积的98％，18～18.1min，流动相b占流动相总体积的98～10％，18.1～20min，流动相b占流动相总体积的10％。
69.本发明所述串联质谱检测包含质谱全扫描和中性丢失扫描，所述质谱全扫描和中性丢失扫描的条件为：
70.质谱仪：ab sciex qtrap 5500
71.离子源：turboionspray大气压化学电离(apci)
72.扫描方式：esi负离子模式
73.离子源温度：580～620℃，优选为600℃
74.离子源电压：4～5kv，优选为4.5kv
75.惰性气体：氮气，curtain gas为30psi，source gas 1和source gas 2为60psi；
76.ida参数：ida采集的峰数量为top 3，mass tolerance为0.5da，离子流阈值为950～1050cps，优选为1000cps；
77.epi参数：dp为55～65v，优选为60v，ce为35～45v，优选为40v，ces为18～22v，优选为20v，cad设置为high。
78.本发明所述质谱全扫描中，epi离子(ms2)扫描范围为50～1000da，没食子单宁类化合物在质谱分析中具有中性丢失170da的现象，中性丢失离子设置为170da，中性丢失扫描中，母离子(ms1)扫描范围为100～1000da，epi离子(ms2)扫描范围为50～1000da。
79.本发明中，质谱全扫描的目的是分析没食子单宁类化合物的裂解规律，确定具有中性丢失170da的特性。
80.本发明中，代表性没食子单宁1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖裂解规律如图1所示，由图1可知，没食子单宁类化合物具有中性丢失170da的特性。
81.本发明步骤4)所述mrm定量离子对的信息中，dp为-100～-10v，优选为-10v、-20v、-30v、-40v、-50v、-60v、-70v、-80v、-90v、-100v；ce为-50～-2v，优选为-2v、-5v、-10v、-15v、-20v、-30v、-35v、-40v、-45v、-50v。
82.本发明通过优化mrm质谱条件，使离子对检测信号达到最强。
83.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
84.实施例1
85.分别取牡丹雄蕊、牡丹叶片、牡丹幼茎、牡丹根皮部位作为没食子单宁检测样品，检测样品经过液氮速冻后研磨至粉末(粒径为45目)。分别称取不同组织部位研磨好的样品，按1g：10ml的比例加入甲醇溶液(浓度为80％)，超声波(超声功率为500w，频率为40khz)辅助萃取30min。采用离心机在4℃、10000rpm的条件下离心10min，离心完成后吸取上清液，利用0.22μm滤器过滤，然后置于-80℃冰箱中，得到待测样品。
86.将待测样品进行液相色谱分离，液相色谱分离采用岛津lc-20a高效液相色谱仪，色谱柱为phenomenex kinetex f5色谱柱(3.0
×
100mm，2.6μm)，柱温为40℃，进样量为2μl，流动相包含流动相a和流动相b，流动相a为质量浓度为1％的甲酸溶液，流动相b为乙腈，流动相流速为0.4ml/min。梯度洗脱程序为：0min，流动相b占流动相总体积的10％，1min，流动相b占流动相总体积的10％，3.5min，流动相b占流动相总体积的20％，8min，流动相b占流动相总体积的30％，15min，流动相b占流动相总体积的65％，16min，流动相b占流动相总体积的98％，18min，流动相b占流动相总体积的98％，18.1min，流动相b占流动相总体积的10％，20min，流动相b占流动相总体积的10％。
87.将液相色谱检测分离得到的没食子单宁类化合物进行质谱检测，质谱检测采用质谱仪ab sciex qtrap 5500，离子源为turboionspray大气压化学电离(apci)，扫描方式为esi负离子模式，离子源温度为600℃，离子源电压为4.5kv，惰性气体为氮气，curtain gas为30psi，source gas 1和source gas 2为60psi；ida参数：ida采集的峰数量为top 3，mass tolerance为0.5da，离子流阈值为1000cps；epi参数：epi离子(ms2)扫描范围为50～
1000da，dp为60v，ce为40v，ces为20v，cad设置为high。然后进行中性丢失扫描，中性丢失扫描中，中性丢失离子为170da，母离子(ms1)扫描范围为100～1000da，epi离子(ms2)扫描范围为50～1000da，其他条件和上述质谱检测条件相同，得到保留时间(表1中rt为保留时间)和ms/ms信息，根据gnps质谱分析平台和文献对没食子单宁类化合物进行鉴定筛选，建立包含保留时间和ms/ms信息的没食子单宁类化合物的质谱数据库，如表1所示。
88.通过鉴定的没食子单宁类化合物的ms/ms信息，筛选出mrm定量离子对(母离子-子离子，q1-q3)。在fia模式下设置没食子单宁类化合物定量离子对和保留时间等smrm参数，根据没食子单宁类化合物的特性，dp参数分别设置为-10v、-20v、-30v、-40v、-50v、-60v、-70v、-80v、-90v和-100v，ce参数分别设置为-5v、-10v、-15v、-20v、-2v、-30v、-35v、-40v、-45v和-50v，利用植物没食子单宁样品混样一针进样对没食子单宁类化合物的mrm质谱条件(dp和ce)进行自动优化，使离子对检测信号达到最强。
89.整合串联质谱检测中没食子单宁类化合物的离子对、保留时间以及优化的mrm质谱条件，通过mrm-ida-epi检测方法实现对牡丹雄蕊、牡丹叶片、牡丹幼茎、牡丹根皮部位没食子单宁类化合物的定性和定量分析。
90.牡丹中没食子单宁类化合物mrm检测条件如表2所示。
91.表1牡丹中没食子单宁类化合物数据库
92.序号rt化合物分子式[m-h]-fragment ions10.76葡萄糖没食子鞣苷c
13h16o10
331.1211,169,151,12520.96葡萄糖没食子鞣苷c
13h16o10
331.0211,169,151,12531.92二没食子酰基葡萄糖c
20h20o14
483.0313,271,211,169,12543.52三酰葡萄糖c
27h24o18
635.0465,313,169,12554.07三酰葡萄糖c
27h24o18
634.9483,465,313,169,12564.20四-o-没食子酰-β-d-葡萄糖c
34h28o22
787.0635,617,465,313,169,12574.85四-o-没食子酰-β-d-葡萄糖c
34h28o22
786.7635,617,465,313,12585.39五没食子酰葡萄糖c
41h32o26
938.8787,769,617,601,599,169,12595.74四-o-没食子酰-β-d-葡萄糖c
34h28o22
786.9635,617,465,313
[0093]
表2牡丹中没食子单宁类化合物mrm检测条件
[0094][0095][0096]
牡丹雄蕊、牡丹叶片、牡丹幼茎、牡丹根皮中没食子单宁类化合物的定性定量检测结果分别如图2～5所示。由图2～5可知，本发明的检测方法具有良好的色谱分离度和稳定的保留时间，没食子单宁化合物检测全面，检测灵敏度高，没有其他化合物离子干扰，化学背景低。
[0097]
本发明的检测方法对没食子单宁类化合物的检测过程不依赖于化学标准品，具有检测全面、灵敏度高、重复性好、准确度高、操作简单等优势，同时实现定性和定量分析。
[0098]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。