抗间皮素艾日布林抗体-药物缀合物及使用方法与流程

抗间皮素艾日布林抗体-药物缀合物及使用方法
1.本披露要求2019年11月7日提交的美国临时专利申请号62/932,373的优先权权益，将其通过引用以其全文并入本文。
2.本披露涉及抗间皮素抗体及其抗原结合片段，以及如抗体-药物缀合物(adc)的缀合物，例如包含艾日布林(eribulin)的缀合物，及其用于治疗和诊断表达间皮素和/或适合于通过破坏微管蛋白或通过施用本文披露的组合物进行治疗的癌症的用途。
3.癌症为全世界发病率及死亡率的主要原因之一，其中在2012年约有1400万新病例及820万癌症相关死亡。癌症死亡的最常见原因为以下癌症：肺癌(159万例死亡)；肝癌(745,000例死亡)；胃癌(723,000例死亡)；结直肠癌(694,000例死亡)；乳癌(521,000例死亡)；及食道癌(400,000例死亡)。预期新癌症病例的数目在接下来的二十年内上升约70％至每年约2200万例新癌症病例(world cancer report 2014[世界癌症报告2014版])。
[0004]
间皮素(糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的细胞表面蛋白质)因其在多种癌症类型(包括间皮瘤、卵巢癌及胰腺癌)中的高表达而成为基于抗体的癌症疗法的有吸引力的靶标(tang等人(2013)anticancer agents med.chem.[医药化学中抗癌药剂]13(2):276-80)。在间皮素基因敲除小鼠不显示任何可检测表型的条件下，虽然缺乏对间皮素的生物功能的充分理解，但已表明间皮素在肿瘤黏附及转移中起作用(bera和pastan(2000)mol.cell biol.[细胞分子生物学]20(8):2902-6；rump等人(2004)j.biol.chem.[生物化学杂志]279(10):9190-8)。间皮素还被认为对某些形式的化学疗法产生耐药性，且被认为通过对细胞具有增生作用来促成肿瘤进展(bharadwaj等人(2011)mol.cancer.[分子癌症]10:106；li等人(2008)mol.cancer ther.[分子癌症治疗学]7(2):286-96)。
[0005]
近期研究已显示间皮素可充当上皮-间质转移(emt)(一种与癌症转移及复发密切相关过程)的主要调节因子(he等人(2017).mol cancer.[分子癌症]16:63)。不希望受理论所束缚，据信(例如通过抗间皮素抗体、抗原结合片段和/或adc结合)抑制间皮素可通过经由抑制tgf-β(转型生长因子β)信号传导诱导反向过程，间质上皮转移(met)来减少emt。相反，据信间皮素的过度表达可经由诱导与肿瘤进展及不良治疗反应相关的癌症干细胞样表型驱动emt(he等人(2017).mol cancer.[分子癌症]16:63；koyama等人(2017).j.clin.invest.[临床研究杂志]127(4):1254-1270)。
[0006]
癌症疗法中通常遭遇的挑战为化学治疗剂的有限治疗指数对正常组织产生显著毒性且因此限制其治疗效用。一种达成较高的靶向癌细胞的特异性方法为通过使用抗体向表达某些肿瘤特异性抗原的细胞传递细胞毒性效应，同时保留表达水平低得多的抗原或不表达任何抗原的正常细胞(awwad等人pharmaceutics[药学](2018)10(3)；lambert和berkenblit(2018)69:191-207)。此类肿瘤特异性靶向可用于增加抗肿瘤活性且减少治疗剂的脱靶细胞毒性。靶向肿瘤特异性抗原的抗体可经由多种机制，包括抑制抗原的生物活性、引发免疫效应活性和/或诱导抗体依赖性细胞毒性传递细胞毒性效应(hendrinks等人international review of cell and molecular biology[细胞和分子生物学国际综述](2017)；therapeutic antibody engineering[治疗性抗体工程](2012):163-196,459-595)。
[0007]
基于抗体的治疗方法选择肿瘤特异性抗原可涉及通过肿瘤细胞特异性表达抗原及稳定杀灭表达抗原的肿瘤细胞。已发现若干人类癌症表达高水平的间皮素，包括肺癌、卵巢癌、胰腺癌及胃癌(hassan等人eur.j.cancer[欧洲癌症杂志](2008)44(1):46-53；hassan等人j.clin.oncol.[临床肿瘤学杂志](2016)34(34):4171-4179)。间皮素表达也已发现于耐药性癌症，如具有kras及stk11突变且对检查点阻断免疫疗法具有不良临床反应的肺癌，及her2-阴性胃癌中。另外，已报导间皮素表达与患有肺腺癌的患者及患有胃癌转移的患者的总存活率之间的相关性，表明高间皮素表达可为恶化临床结果的预测因子(kachala等人(2014)clin.cancer.res.[临床癌症研究]20(4):1020-1028；han等人(2017)j.pathol.transl.med.[病理学与转化医学杂志]51(2):122-128)。人类癌症中间皮素表达的发病率及其与不良临床结果的关联使得间皮素成为肿瘤抗原特异性药物递送方法，例如抗体介导的方法的潜在目标。还已研究与如化学治疗剂的细胞毒性化合物缀合的抗体来增强基于抗体的药物传递至肿瘤细胞的细胞杀灭活性。然而，仍需要提供适合的抗体和/或adc，它们提供有效肿瘤靶向、中靶作用、旁观者杀灭和/或降低的脱靶作用的组合。
[0008]
艾日布林为大环化合物软海绵素b的合成类似物，先前已证明其为微管蛋白聚合、微管组装及微管蛋白依赖性gtp水解的强力抑制剂。微管蛋白构成称作微管的动态丝状细胞骨架蛋白，其参与多种重要细胞功能，包括细胞内迁移及转运、细胞信号传导、维持细胞形状及细胞分裂。癌细胞的快速分裂速率使得其对微管蛋白功能的阻塞特别敏感。因此，软海绵素b及艾日布林已表明体外及体内显著抗癌活性(tan等人(2009)clin cancer res.[临床癌症研究]15(12):4213-4219；vahdat等人(2009)j.clin.oncol.[临床肿瘤学杂志]27(18):2954-2961)。艾日布林的甲磺酸盐(艾日布林甲磺酸盐)当前以商标名halaven
tm
销售以用于治疗患有难治性转移性乳癌的患者。
[0009]
虽然在本领域中(包括在adc情形中)已经报道了艾日布林的使用，但仍然需要以靶向方式更好地将艾日布林递送至特定组织，例如表达间皮素的癌组织。同样地，本领域仍然需要改进的结合间皮素的抗体，其具有优异的特性，例如，在抗原结合和/或有效递送有效负载(如艾日布林)至表达间皮素的靶细胞或组织的能力方面。
[0010]
在各种实施例中，本披露部分地提供新颖抗体及抗原结合片段，其可单独使用、连接至一种或多种另外的药剂(例如adc)或作为较大的大分子(例如双特异性抗体、多特异性抗体，单独或作为连接至呈adc形式的有效负载的多特异性抗体)的一部分使用且作为药物组合物或组合疗法的一部分施用。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列且保留非人类抗体的反应性，同时在人类中免疫原性较小。在某些实施例中，抗体及抗原结合片段可适用于治疗人类癌症患者。
[0011]
在各种实施例中，本披露更具体地涉及能够结合和/或杀灭肿瘤细胞的抗体及抗体-药物缀合物化合物。在各种实施例中，adc复合物还能够在结合之后内化至靶细胞中。披露了包含使艾日布林药物部分连接至抗体部分的接头的adc化合物。抗体部分可为全长抗体或抗原结合片段。
[0012]
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗原结合片段包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)
及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统(kabat,sequences of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列](national institutes of health[美国国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(bethesda,md.)(1987及1991)))所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统(国际免疫遗传信息系统(international immunogenetics information system)())所定义。
[0013]
在一些实施例中，本文所披露的抗体或抗原结合片段包含三个重链互补决定区(hcdr)，其来自包含seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其来自包含seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
[0014]
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗原结合片段为抗间皮素抗体或抗原结合片段。在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列或与所披露序列至少90％一致的序列。在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含：人类igg1重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及人类igκ轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含seq id no:17的重链氨基酸序列及seq id no:18的轻链氨基酸序列。
[0015]
在各种实施例中，本文所披露的抗体或抗原结合片段包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含由seq id no:19(hcdr1)、seq id no:20(hcdr2)及seq id no:21(hcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含由seq id no:22(lcdr1)、seq id no:23(lcdr2)及seq id no:24(lcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含由seq id no:25(hcdr1)、seq id no:26(hcdr2)及seq id no:27(hcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含由seq id no:28(lcdr1)、seq id no:29(lcdr2)及seq id no:30(lcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义。
[0016]
在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含由seq id no:31的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含由seq id no:32的核酸序列编码的氨基酸序列。在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含由seq id no:33的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含由seq id no:34的核酸序列编码的氨基酸序列。在各种实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含由seq id no:35的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链，其包含由seq id no:36的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0017]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为全长抗体。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为单特异性抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或抗原结合片段，或多特异性抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为单链可变片段(scfv)或fab片段。
[0018]
在各种实施例中，抗体或抗原结合片段与治疗剂，例如一种或多种小分子和/或其他抗体或抗原结合片段缀合。在一些实施例中，治疗剂为艾日布林。在一些实施例中，抗体
或抗原结合片段为345a12-hc15-lc4。
[0019]
在各种实施例中，本文所披露的adc包含式(i)：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义；d为治疗剂，例如艾日布林部分；l为将ab共价连接至d的可裂解接头；并且p为1至8的整数。
[0020]
在一些实施例中，p为1至6的整数。在一些实施例中，p为2或6。
[0021]
在一些实施例中，adc包含可裂解接头，该可裂解接头包含可裂解部分，该可裂解部分经固定放置使得在裂解后接头或抗体或抗原结合片段的任何部分不与治疗剂(例如艾日布林)保持结合。在一些实施例中，可裂解接头包含可通过酶(如组织蛋白酶b)裂解的可裂解肽部分。在一些实施例中，可裂解部分包含可裂解肽部分，例如氨基酸单元，如val-cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。
[0022]
在一些实施例中，可裂解接头包含至少一个间隔子单元，该间隔子单元包含至少一个peg部分。在一些实施例中，间隔子单元或接头包含(peg)2。在一些实施例中，间隔子单元经由马来酰亚胺(mal)部分(“mal-间隔子单元”)连接至该抗体部分。在一些实施例中，mal-间隔子单元经由抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基(例如抗体上的lccys80残基)接合至抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，mal-间隔子单元接合至抗体或抗原结合片段上轻链可变区的半胱氨酸残基(例如lccys80)。在一些实施例中，p为2，使得两个-l-d部分连接至抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，各-l-d部分连接至抗体或抗原结合片段上轻链可变区的半胱氨酸残基(例如lccys80)。在一些实施例中，半胱氨酸残基为lccys80，即根据kabat编号系统的抗体或抗原结合片段上的轻链可变区的氨基酸位置80处的半胱氨酸残基。在一些实施例中，可裂解接头包含mal-间隔子单元及可裂解肽部分且可裂解肽部分包含val-cit。在一些实施例中，mal-间隔子单元将抗体或抗原结合片段连接至可裂解部分。
[0023]
在一些实施例中，mal-间隔子单元包含至少一个peg部分。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)2。在一些实施例中，mal-间隔子单元使抗体部分连接至接头中的可裂解部分。在一些实施例中，接头中的可裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸单元。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit。
[0024]
在一些实施例中，adc的可裂解部分直接接合至艾日布林，或间隔子单元将接头中的可裂解部分连接至艾日布林药物部分，且缀合物的裂解从抗体或抗原结合片段及接头释
放艾日布林。
[0025]
在一些实施例中，将可裂解部分连接至艾日布林药物部分的间隔子单元为自消融型。在一些实施例中，自消融型间隔子单元包含对氨基苄氧基羰基(pab)。在一些实施例中，pab间隔子单元经由c-35胺使可裂解部分连接至艾日布林药物部分。在一些实施例中，可裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸单元。在一些实施例中，可裂解接头包含val-cit-pab。在一些实施例中，接头包含val-cit-pab及经由mal部分将接头接合至抗体部分的peg间隔子单元。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit-pab。
[0026]
在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含人类重链及轻链可变区框架，或具有一个或多个回复突变的人类重链及轻链可变区框架。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13之氨基酸序列至少90％一致；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14的氨基酸序列至少90％一致。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含：人类igg1重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及人类igκ轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含seq id no:17的重链氨基酸序列及seq id no:18的轻链氨基酸序列。
[0027]
在各种实施例中，adc具有式(i)：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义；d为艾日布林；l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解接头；并且p为1至8的整数，例如p为2至6或3至4的整数。
[0028]
在一些实施例中，p为1至6的整数。在一些实施例中，p为2或6。
[0029]
在各种实施例中，adc(例如上述adc)的抗体或抗原结合片段包含人类重链及轻链可变区框架，或具有一个或多个回复突变的人类重链及轻链可变区框架。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13至少90％一致；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14至少90％一致。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含：人类igg1重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及人类igκ轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在各种实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含seq id no:17的重链氨基酸序列及seq id no:18的轻链氨基酸序列。
[0030]
在各种实施例中，adc具有式i：
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ
(i)其中ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素且包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:14的氨基酸序列；d为艾日布林；l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解接头；并且p为1至8的整数，例如p为2至6或3至4的整数。
[0031]
在一些实施例中，p为1至6的整数。在一些实施例中，p为2或6。
[0032]
在一些实施例中，adc的抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定区及人类igκ轻链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：igg1重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及igκ轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含seq id no:17的氨基酸序列；及轻链，其包含seq id no:18的氨基酸序列。
[0033]
在各种实施例中，本文提供药物组合物，其包含所述抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc组合物。在一些实施例中，药物组合物包含一种或多种本文所述的抗体或抗原结合片段和/或一种或多种adc以及至少一种药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物包含抗体、抗原结合片段、和/或adc的多个拷贝。在一些实施例中，药物组合物包含本文所披露的adc的多个拷贝，其中adc的平均值p为约1至约6。在一些实施例中，组合物中adc的平均值p为约1.7或2或约6。
[0034]
在各种实施例中，本文提供所述抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc组合物例如治疗癌症的治疗用途。在某些方面中，本披露提供治疗表达由抗体、抗原结合片段和/或缀合物或adc的抗体部分，如间皮素靶向的抗原的癌症的方法。在某些方面中，本披露提供通过施用治疗有效量的本文所述的抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc和/或其中的任一种的方案来杀灭肿瘤细胞或癌细胞或抑制其增殖的方法。在一些实施例中，癌症为表达间皮素的癌症，如间皮瘤、乳癌、子宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、卵巢癌(例如浆液性或透明细胞卵巢癌)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、甲状腺癌、尿道上皮癌、子宫癌、胆管癌或白血病。
[0035]
在某些方面中，本披露提供针对所述的抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc化合物及组合物的用途，例如用于确定患有或疑似患有癌症(例如，表达间皮素的癌症)的受试者是否将对用靶向间皮素的药剂，例如本文所披露的抗体或抗体结合片段、缀合物或adc进行的治疗产生应答。在一些实施例中，该方法包括提供来自受试者的生物样品；使样品与本文披露的抗体或抗原结合片段接触；以及检测抗体或抗原结合片段与样品中的一种或多种癌细胞的结合。
[0036]
在某些其他方面中，本披露提供药物组合物，其包含抗体或抗体结合片段、缀合物和/或adc及药学上可接受之稀释剂、载剂和/或赋形剂。还提供产生所披露的抗体或抗体结合片段、缀合物或adc化合物及组合物的方法。
[0037]
在一些实施例中，提供编码本披露的抗体或抗原结合片段、缀合物或adc的核酸序列。一种或多种核酸可呈经分离核酸的形式，掺入经分离载体中的核酸包含和/或在适合于产生抗体或抗原结合片段的条件下由细胞群体表达的抗体或抗原结合片段形式。
附图说明
[0038]
图1显示通过流式细胞术检测针对人类间皮素的免疫血清的特异性反应性。
[0039]
图2显示通过elisa检测培养物上清液对人类间皮素的特异性反应性。
[0040]
图3显示通过凝胶电泳进行的抗间皮素抗体的in-fusion pcr扩增。
[0041]
图4显示用于in-fusion克隆及表达的抗间皮素克隆。
[0042]
图5显示经纯化的48个rb-hu-xi抗间皮素抗体的总结。
[0043]
图6展示针对抗间皮素-auf缀合物的基于体外细胞的效能结果。
[0044]
图7显示抗间皮素抗体的表位聚类(epitope binning)表征。
[0045]
图8显示人源化345a12抗体的dsc分析结果。使用100℃/小时的扫描速率在25-100℃范围内对345a12f(ab’)2片段进行热分析。
[0046]
图9显示morab-109(345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林)(dar2)在各种基质中的稳定性。
[0047]
图10a及图10b显示在用2.5mg/kg的345a12-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc或2.5mg/kg的102a6a2-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc处理的人类非小细胞肺癌(nsclc)nci-h2110异种移植模型中的抗肿瘤作用(图10a)及体重变化(图10b)(研究m109-004-2016)。
[0048]
图11a及图11b显示用345a12-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc(5、10、15或20mg/kg)(图11a)或345a12-hc15-lc4-dioh艾日布林二聚体adc(5、10或20mg/kg)(图11b)处理的雌性cd-1小鼠的体重变化(研究m109-006-2017)。
[0049]
图12a及图12b显示在用2.5mg/kg的345a12-hc10-lc4-dioh艾日布林二聚体adc或2.5mg/kg的345a12-hc15-lc4-dioh艾日布林二聚体adc处理的人类nsclc nci-h2110异种移植模型中的抗肿瘤作用(图12a)及体重变化(图12b)(研究m109-007-2017)。
[0050]
图13a及图13b显示在用morab-109(dar2或dar6)处理的人类胃癌nci-n87异种移植模型中的抗肿瘤作用(图13a)及体重变化(图13b)(研究m109-010-2018)。
[0051]
图14a及图14b显示在用morab-109(dar2或dar6)或艾日布林处理的人类间皮瘤hay异种移植模型中的抗肿瘤作用(图14a)及体重变化(图14b)(研究m109-010-2018)。
[0052]
图15a及图15b显示在用morab-109(dar6)或艾日布林处理的人类间皮瘤pdx模型(meso7212)中的抗肿瘤作用(图15a)及体重变化(图15b)。
[0053]
图16a及图16b显示在用morab-109或艾日布林的不同dar种类处理的人类间皮瘤pdx模型(meso7212)中的抗肿瘤作用(图16a)及体重变化(图16b)。
[0054]
图17显示不同细胞系中间皮素(msln)表达与艾日布林及morab-109(dar2及dar6)的体外效能(ic
50
)之间的相关性分析。在所有51个细胞系及具有更高间皮素表达水平(平均荧光强度(mfi)等于或》80的facs染色)的细胞系子组中分析morab-109(dar2)的相关性。子组排除具有较低间皮素表达水平的细胞系(mfi《80的facs染色)。
[0055]
图18a-c显示在用5mg/kg至25mg/kg范围内的不同剂量的morab-109(dar2)处理的人类胃癌nci-n87异种移植模型中的抗肿瘤作用(图18a及图18b)及体重变化(图18c)。
[0056]
图19展示在以5mg/kg至25mg/kg范围内的不同剂量的morab-109(dar2)处理后，具有nci-n87肿瘤的小鼠中的总及完整morab-109(dar2)的浓度(μg/ml)。
[0057]
图20a及图20b显示在用morab-109(dar2)(5mg/kg)或艾日布林(0.1或3.2mg/kg)
处理的人类卵巢癌ovcar-3-a1-t1异种移植模型中的抗肿瘤作用(图20a)及体重变化(图20b)。
[0058]
图21a及图21b显示在用morab-109(dar2)(10mg/kg)或艾日布林(0.1或3.2mg/kg)处理的人类nsclc pdx模型(lc-f-25)中的抗肿瘤作用(图21a)及体重变化(图21b)。
[0059]
图22a及图22b显示在用morab-109(dar2)(10mg/kg)或艾日布林(0.2或3.2mg/kg)处理的人类nsclc pdx模型(lxfa-737)中的抗肿瘤作用(图22a)及体重变化(图22b)。
[0060]
图23a及图23b显示在用单次剂量的10mg/kg的morab-109(dar2或dar6)(3只小鼠/组)处理的人类胃癌nci-n87异种移植模型中的抗肿瘤作用(图23a)及体重变化(图23b)。
[0061]
图24a及图24b显示在用单次剂量的10mg/kg的morab-109(dar2或dar6)处理后，来自携带nci-n87肿瘤的小鼠的血浆样品中的morab-109(dar2)(图24a)或morab-109(dar6)(图24b)的dar。
[0062]
图25a及图25b显示在nci-n87胃癌细胞上的morab-109(dar2)(图25a)或bay 94-9343(图25b)的细胞毒性(杀灭％)。单独且在未缀合抗体存在下评估抗msln adc。
[0063]
如通过荧光素酶分析所测量，图26a及图26b显示morab-109(dar2)及345a12-hc15-lc4(图26a)或bay 94-9343及阿奈妥单抗(anetumab)(图26b)的adcc活性。通过相对的曲线下面积(auc)计算adcc活性。
[0064]
图27显示小鼠及人类血浆中抗msln adc、morab-109(dar2)及bay 94-9343的稳定性分析。
[0065]
图28a及图28b显示在用morab-109(dar2)(5mg/kg)、bay 94-9343(5mg/kg)或艾日布林(1mg/kg)处理的人类胃癌nci-n87异种移植模型中的抗肿瘤作用(图28a)及体重变化(图28b)。
[0066]
图29a及图29b显示在用morab-109(dar2)(5mg/kg)、bay 94-9343(5mg/kg)或艾日布林(1mg/kg)处理的人类间皮瘤hay异种移植模型中的抗肿瘤作用(图29a)及体重变化(图29b)。
[0067]
图30a及图30b显示在用morab-109(dar2)(10mg/kg)、bay 94-9343(10mg/kg)、艾日布林(1mg/kg)或dm4(0.3mg/kg)处理的人类间皮瘤pdx模型(meso7212)中的抗肿瘤作用(图30a)及体重变化(图30b)。
[0068]
图31a及图31b显示在用morab-109(dar2)(25mg/kg)、bay 94-9343(dar约4)(25mg/kg)或艾日布林(3.2mg/kg)处理的人类nsclc pdx模型(lxfa-586)中的抗肿瘤作用(图31a)及体重变化(图31b)。
[0069]
图32a及图32b显示在用morab-109(dar2)(25mg/kg)、morab-109(dar2)(12.5mg/kg)、morab-109(dar2)(12.5mg/kg，qwx3)、bay 94-9343(dar约4)(12.5mg/kg)或艾日布林(3.2mg/kg)处理的人类nsclc pdx模型(lxfl-529)中的抗肿瘤作用(图32a)及体重变化(图32b)。
具体实施方式
[0070]
结合附图，通过参考以下详细描述可更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本披露的一部分。应理解，除非上下文另外指示，否则本文中所用的术语仅出于作为实例描述特定实施例的目的且不旨在限制所要求保护的组合物及方法。
[0071]
在本文通篇，描述涉及组合物及使用这类组合物的方法。当本披露描述或主张与组合物相关联的特点或实施例时，此类特点或实施例同等地适用于使用该组合物的方法。同样，当本披露描述或主张与使用该组合物的方法相关联的特点或实施例时，此类特点或实施例同等地适用于该组合物。
[0072]
当值的范围得以表示时，其包括使用该范围内的任何特定值的实施例。此外，对按范围陈述的值的提及包括该范围内的每一值。所有范围均包括其端点且可组合。当通过在前面使用“约”，以近似值表示值时，应理解特定值形成另一实施例。除非上下文另外明确地指示，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。除非另外指示其具体使用情形，否则“或”的使用意指“和/或”。本文所引用的所有参考文献均出于任何目的通过引用并入。在参考文献与本说明书矛盾的情况下，以本说明书为准。
[0073]
应了解，出于清楚起见在单独实施例的情形下描述于本文中的所披露的组合物及方法的某些特点还可以单个实施例的组合形式提供。相反地，出于简便起见在单个实施例的情形下描述的所披露的组合物及方法的各种特点还可单独地或以任何子组合形式提供。定义
[0074]
在本说明书及权利要求通篇使用与描述的方面相关的各种术语。除非另外指示，否则将给与这类术语以其在本领域中的普通含义。其他特别定义的术语以与本文所提供的定义一致的方式来解释。
[0075]
如本文所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确地指示。
[0076]
如本领域普通技术人员自本文所含的教示内容显而易知，在数值及范围的情形下，术语“约”或“近似地”是指近似或接近所叙述值或范围以使得实施例可根据预期执行，如在反应混合物中具有所需量的核酸或多肽的值或范围。因此，这些术语涵盖超出由系统误差产生的值的值。在一些实施例中，约意谓数字量
±
10％。
[0077]
术语“抗体-药物缀合物”、“抗体缀合物”、“缀合物”、“免疫缀合物”及“adc”可互换使用，且是指与抗体部分连接且由以下通式定义的治疗性化合物(例如艾日布林部分)：ab-(l-d)
p
(式i)，其中ab为抗体部分(例如抗体或抗特异性结合片段)，l为接头部分，d为药物部分(例如艾日布林药物部分)，且p为根据抗体部分的药物部分的数目。在包含艾日布林药物部分的adc中，“p”是指连接至抗体部分的艾日布林部分的数目。在一些实施例中，接头l可包括可直接连接至抗体部分及连接至治疗性化合物的可裂解部分，或可裂解部分可通过间隔子单元连接至抗体部分及治疗性化合物中的任一者或两者。在一些实施例中，当间隔子单元将可裂解部分连接至治疗性化合物时，其为自消融型间隔子单元。
[0078]
术语“抗体”在最广泛意义上用于指经由免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别且特异性结合如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合等的靶标的免疫球蛋白分子。抗体的重链由重链可变域(vh)及重链恒定区(ch)构成。轻链由轻链可变域(vl)及轻链恒定域(cl)构成。出于本技术的目的，成熟的重链和轻链可变域各自包含从n-末端至c-末端排列的四个框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)内的三个互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。“抗体”可为天然存在的或人造的，如通过常规杂交瘤技术产生的单克隆抗体。术语“抗体”包括全长单克隆抗体和全长多克隆抗体，以及如fab、fab’、f(ab’)2、fv的抗体片段，以及单链抗体。抗体可以是免
疫球蛋白的五种主要类别中的任一种：iga、igd、ige、igg、以及igm，或其亚类(例如，同种型igg1、igg2、igg3、igg4)。该术语进一步涵盖人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体及含有抗原识别位点的任何经修饰的免疫球蛋白分子，只要其展现所需生物活性即可。
[0079]
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指自实质上均质的抗体群体获得的抗体，即除可能少量存在的可能性天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体为相同的。单克隆抗体针对单一抗原性表位具有高度特异性。相反，常规的(多克隆)抗体制剂通常包括针对不同表位或对其具有特异性的多种抗体。修饰语“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本披露使用的单克隆抗体可通过首先由kohler等人(1975)nature[自然]256:495描述的杂交瘤方法来制造，或可通过重组dna方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)来制造。单克隆抗体还可使用例如clackson等人(1991)nature[自然]352:624-8和marks等人(1991)j.mol.biol.[分子生物学杂志]222:581-97中所述的技术自噬菌体抗体文库分离。
[0080]
本文所描述的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的对应序列相同或同源；只要它们特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物学活性。
[0081]
如本文所使用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。在一些情况下，重链及轻链两者的可变区对应于来源于具有所需特异性、亲和力及活性的一个物种的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一物种(例如人类)的抗体同源以使后一物种中的免疫反应减至最少。
[0082]
如本文所使用，术语“人源化抗体”是指含有来自非人类(例如兔子)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。此类抗体为含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的实质上全部，其中所有或实质上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的可变域且所有或实质上所有框架(fr)区为人类免疫球蛋白序列的可变域。人源化抗体视情况还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常，人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。人源化抗体可通过fv框架区中和/或所置换的非人类残基内残基的取代而进一步修饰，以改进及优化抗体特异性、亲和力和/或活性。
[0083]
如本文所使用，术语抗体的“抗原结合片段”、“抗原结合域”或“抗原结合部分”是指抗体或蛋白质的一个或多个片段，其保留特异性结合于抗原(例如间皮素)的能力。抗原结合片段还可保留内化至表达抗原的细胞中的能力。在一些实施例中，抗原结合片段还保留免疫效应子活性。经显示，全长抗体的片段可执行全长抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”、“抗原结合域”或“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，一种由vl、vh、cl及ch1域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，一种包含通过铰链区处的二硫桥键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh及ch1域组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂的vl及vh域组成的fv片段；(v)dab片段，其包含单一可变域，例如vh域(参见例如ward等人(1989)nature[自然]341:544-6；以及国际公开号wo 1990/005144)；以及(vi)经分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个域vl及vh由独立基因编码，但其可以使用重组方法，通过使其能够以单一蛋白质链形式制造的合成接头来接合，其中vl与vh区域
配对形成单价分子(称为单链fv(scfv))。参见例如bird等人(1988)science[科学]242:423-6；及huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]85:5879-83。此类单链抗体还意欲涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”内，且其在本领域中已知为当结合时可内化至细胞中的示例性结合片段类型(参见例如zhu等人(2010)9:2131-41；he等人(2010)j nucl.med.[核医学杂志]51:427-32；及fitting等人(2015)mabs 7:390-402)。在某些实施例中，scfv分子可以掺入融合蛋白中。还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体。双抗体为二价的双特异性抗体，其中vh及vl域表达于单一多肽链上，但使用太短而不允许相同链上的两个域之间进行配对的接头，由此迫使这些域与另一条链的互补域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如，holliger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]90:6444-8；及poljak等人(1994)structure[结构]2:1121-3)。抗原结合片段使用本领域普通技术人员已知的常规技术获得，且结合片段以与完整抗体相同的方式进行效用(例如，结合亲和力、内化)筛选。抗原结合片段可通过裂解完整蛋白，例如通过蛋白酶或化学裂解来制备。
[0084]
如本文关于抗体或抗原结合片段所使用的“内化”是指抗体或抗原结合片段在与细胞结合后能够穿过细胞的脂质双层膜进入内部隔室(即，“内化”)，通常进入细胞中的降解隔室中。例如，内化性抗间皮素抗体为能够在结合至细胞膜上的间皮素之后进入细胞中的抗体。在一些实施例中，本文所披露的adc中所用的抗体或抗原结合片段经由内化性抗体或内化性抗原结合片段(允许adc在抗原结合之后转移通过细胞膜)靶向细胞表面抗原(例如间皮素)。
[0085]
如本文所使用，术语“间皮素”或“msln”是指任何天然形式的人类间皮素(msln)。该术语涵盖全长间皮素(例如ncbi参考序列：aac50348.1)以及由细胞处理产生的任何形式的人类间皮素。该术语还涵盖天然存在的间皮素的变体，包括但不限于剪接变体、等位基因变体及异形体。间皮素可自人类分离，或可以重组方式或通过合成方法产生。该术语还可涵盖抗间皮素抗体(例如本文披露的抗体)和/或抗原结合片段可特异性结合的任何合成变体。
[0086]
术语“抗间皮素抗体”或“特异性结合间皮素的抗体”是指特异性结合间皮素的抗体或其片段的任何形式，且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体及生物学上功能性抗体片段，只要这类生物学上功能性抗体片段特异性结合间皮素即可。在一些实施例中，本文所披露的adc中使用的抗间皮素抗体为内化性抗体或内化性抗体片段。345a12(例如345a12-hc15-lc4)及102a6a2为示例性内化性人类间皮素抗体。如本文所使用，术语“特异性”、“特异性结合”及“特异性地结合”是指抗体与靶抗原表位的选择性结合。可通过在一组给定条件下将与适当抗原的结合同与不相关抗原或抗原混合物的结合进行比较来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合至适当抗原且亲和力为与不相关抗原或抗原混合物的亲和力的至少2倍、5倍、7倍、10倍更多倍，则认为其具有特异性。“特异性抗体”或“靶标特异性抗体”为仅结合靶抗原(例如间皮素)但不结合(或展现极少结合)至其他抗原的抗体。
[0087]
术语“表位”是指能够由抗体识别且特异性结合的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位可由连续氨基酸或通过多肽的三级折叠而邻接的非连续氨基酸形成。抗体所结合的表位可使用本领域中已知的任何表位定位技术来识别，该表位定位技术包括用于表位识别的x射线结晶学(其通过直接目测抗原-抗体复合物)，以及监测抗体与抗原的片段或突变型变
体的结合，或监测抗体和抗原的不同部分的溶剂可及性。用于给抗体表位作图的示例性策略包括但不限于基于阵列的寡肽扫描、限制性蛋白水解、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换和质谱法(参见，例如，gershoni等人(2007)21:145-56；以及hager-braun和tomer(2005)expert rev.proteomics[蛋白质组学专家评论]2:745-56)。
[0088]
还可使用竞争性结合和表位聚类来确定共有相同或重叠表位的抗体。竞争性结合可使用交叉阻断分析来评估，如“antibodies,a laboratory manual[抗体，实验室手册]”,cold spring harbor laboratory[冷泉港实验室出版社],harlow和lane(1988年第1版,2014年第2版)中所述的分析。在一些实施例中，当在交叉阻断分析中，测试抗体或结合蛋白使参考抗体或结合蛋白(例如，包含cdr和/或选自表1-3中所鉴定的那些可变域的结合蛋白)与靶抗原(如间皮素)的结合减少至少约50％(例如，50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更高或其间的任何百分比)时，鉴定出竞争性结合，和/或反之亦然。在一些实施例中，竞争性结合可归因于共享或类似(例如，部分重叠)的表位，或由于其中抗体或结合蛋白在邻近表位处结合的位阻(参见，例如，tzartos,methods in molecular biology[分子生物学中的方法](morris,编(1998)第66卷,第55-66页))。在一些实施例中，可使用竞争性结合来分选共有类似表位的结合蛋白的群组。例如，竞争结合的结合蛋白可“分箱”为具有重叠或邻近表位的结合蛋白组，而不竞争的结合蛋白归入不具有重叠或邻近表位的不同结合蛋白组。
[0089]
术语“k
on”或“k
a”是指抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的缔合速率常数。该速率可使用如表面等离子体共振、生物层干涉测量术或elisa分析的标准分析来测定。
[0090]
术语“k
off”或“k
d”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。该速率可使用如表面等离子体共振、生物层干涉测量术或elisa分析的标准分析来测定。
[0091]
术语“k
d”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。kd通过ka/kd来计算。该速率可使用如表面等离子体共振、生物层干涉测量术或elisa分析的标准分析来测定。
[0092]
术语“p”或“药物负载”或“药物:抗体比率”或“药物与抗体比率”或“dar”是指每个抗体部分的药物部分的数目，即式(i)的adc中每个抗体或抗原结合片段(ab)的药物负载，或-l-d部分的数目。在包含艾日布林药物部分的adc中，“p”是指连接至抗体部分的艾日布林部分的数目。例如，若两个艾日布林部分连接至抗体部分，则p＝2。在包含式(i)的adc的多个拷贝的组合物中，“平均值p”是指adc群体中每个抗体或抗原结合片段的-l-d部分的平均数目，也称为“平均药物负载”。
[0093]“接头”或“接头部分”在本文中用于指能够将化合物，通常如艾日布林的药物部分共价连接至另一部分，如抗体部分的任何化学部分。接头可能在使化合物或抗体保持活性的条件下易于发生或实质上抵抗酸诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、基于光的裂解、酯酶诱导的裂解和/或二硫键裂解。
[0094]
术语“药剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。术语“治疗剂”或“药物”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。本文所述的艾日布林单体为示例性治疗剂。
[0095]
术语“化学治疗剂”或“抗癌剂”在本文中用于指不管作用机制如何，均有效治疗癌症的所有药剂。转移或血管生成的抑制常常为化学治疗剂的特性。化学治疗剂包括如本文所述的抗体、生物分子及小分子，且涵盖艾日布林。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长
抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或遏制细胞生长和/或细胞增殖的药剂。术语“细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或运作而造成细胞死亡的物质。
[0096]
如本文所使用，术语“艾日布林”或“艾日布林单体”是指软海绵素b的合成类似物，软海绵素b为原先自海洋海绵冈田软海绵(halichondria okadais)分离的大环化合物。艾日布林为微管动力学抑制剂，其被认为结合微管蛋白且通过抑制有丝分裂纺锤体组合件来诱导细胞周期停滞于g2/m期。术语“艾日布林甲磺酸盐”是指以商品名halaven
tm
市售的艾日布林的甲磺酸盐。示例性艾日布林类似物包括美国专利号6,214,865及美国专利号6,653,341中所展示及描述的那些，这些专利关于所披露的艾日布林结构及合成其结构的方法以引用的方式并入本文中。
[0097]
如本文所使用，术语“艾日布林二聚体”是指二聚形式的艾日布林，其中两个艾日布林单体经由共价或非共价键直接地或通过化学接头(例如仲胺、二羟基仲胺)连接。在一些实施例中，艾日布林二聚体可由以下组成：在c-34位置处通过仲胺共价连接的两个艾日布林单体，或在c-35位置处通过二羟基仲胺共价连接的两个艾日布林单体。由在c-34位置处通过仲胺共价连接的两个艾日布林单体组成的艾日布林二聚体在本文中可称为“desoh艾日布林二聚体”。由在c-35位置处通过二羟基仲胺共价连接的两个艾日布林单体组成的艾日布林二聚体在本文中可称为“dioh艾日布林二聚体”。术语“艾日布林二聚体药物部分”是指adc或组合物的组分，其提供艾日布林二聚体的结构，例如式(i)的adc或包含-l-d的组合物中的艾日布林二聚体(d)组分。在一些实施例中，desoh艾日布林二聚体和/或dioh艾日布林二聚体相比于其他艾日布林二聚体形式提供改善的可缀合性。
[0098]
如本文所使用的术语“念珠藻素”是指念珠藻素-1，一种巨环内酯化合物，其最初从蓝藻菌念珠藻属分离，或是指保留抗微管蛋白活性的其任何合成类似物。示例性念珠藻素类似物包括在国际公开号wo 2017/136769中展示及描述的类似物，对于所有其所披露的念珠藻素结构及合成其结构的方法，其以引用的方式并入本文中。术语“念珠藻素药物部分”是指具有念珠藻素结构的adc或组合物的组分。
[0099]
术语“同源物”是指通过例如在对应位置处具有相同或类似的化学残基的序列而展现与另一分子的同源性的分子。
[0100]
如本文所使用，术语“抑制(inhibit或inhibition of)”意指减少可测量的量，且可包括但不需要完全预防或抑制。
[0101]
术语“旁观者杀灭”或“旁观者效应”是指在靶标阳性细胞存在的情况下靶标阴性细胞的杀灭，其中在靶标阳性细胞不存在的情况下未观测到靶标阴性细胞的杀灭。细胞间接触或至少靶标阳性细胞与靶标阴性细胞之间的邻近使得能够进行旁观者杀灭。此类杀灭可与“脱靶杀灭”相区分，该“脱靶杀灭”是指对靶标阴性细胞的无差别杀灭。在靶标阳性细胞不存在的情况下可观测到“脱靶杀灭”。
[0102]
术语“癌症”是指哺乳动物中的生理病状，其中细胞群体的特征为不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。此类癌症的特定实例包括表达间皮素的癌症，如间皮瘤、乳癌、子宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、卵巢癌(例如浆液癌、透明细胞癌或上皮卵巢癌)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、甲状腺癌、尿道上皮癌、子宫癌、胆管癌或白血病。
[0103]
术语“肿瘤”及“赘瘤”是指由过量细胞生长或增殖造成的良性或恶性的任何组织
肿块，包括癌前病变。
[0104]
术语“肿瘤细胞”是指来源于肿瘤的单个细胞或全部细胞群体，包括非致瘤细胞及癌症干细胞。当仅提及缺乏更新及分化能力的那些肿瘤细胞时，如本文所使用的术语“肿瘤细胞”由术语“非致瘤”修饰以将那些肿瘤细胞与癌症干细胞区分开。
[0105]
术语“受试者”与“患者”在本文中可互换用于指任何动物，如任何哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。在一些实施例中，哺乳动物为小鼠。在一些实施例中，哺乳动物为人类。
[0106]“药物组合物”是指呈准许施用活性成分且随后提供一种或多种活性成分的预期生物活性和/或达成治疗效果的形式，且不含对应施用配制品的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。药物组合物可为无菌的。
[0107]“药物赋形剂”包含如辅助剂、载剂、ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、防腐剂等的物质。
[0108]“药学上可接受的”意指美国联邦管理机构或州政府审批通过或可由其审批通过，或美国药典(u.s.pharmacopeia)或其他普遍公认药典中列出可用于动物且更具体地用于人类。
[0109]
例如，本文披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc的“有效量”是足以执行具体陈述的目的(例如，在施用后产生治疗效果，如减小肿瘤生长速率或肿瘤体积、减少癌症症状、或治疗功效的某些其他指标)的量。有效量可以与所陈述目的相关的常规方式来测定。术语“治疗有效量”是指抗体、抗原结合片段、和/或adc的有效治疗受试者的疾病或障碍的量。在癌症的情况下，治疗有效量的抗体、抗原结合片段、和/或adc可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤大小、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤转移、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤生长、和/或缓解一种或多种症状。“预防有效量”是指在必需剂量和时间段下有效达到所需预防结果的量。典型地，由于预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段时用于受试者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。
[0110]
如本文所使用，“治疗”或“治疗性”和语法上相关的术语是指疾病的任何后果的任何改善，如延长的存活期、较低的发病率和/或减轻的由替代性治疗模式引起的副作用。如本领域容易理解的，治疗操作涵盖但不需要疾病的完全根除。如本文所使用的“治疗(treatment/treat)”是指将所述的抗体、抗原结合片段和/或adc施用至受试者，例如患者。治疗可为治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、缓和、改良或影响病症、病症的症状或患该病症(例如癌症)的倾向性。在一些实施例中，除了治疗患有病症的受试者之外，还可预防性提供本文披露的组合物以预防或降低罹患该病症的可能性。
[0111]
在一些实施例中，使用标记的抗体、抗原结合片段、和/或adc。合适的“标记”包括放射性核素、酶、受质、辅因子、抑制因子、荧光部分、化学发光部分、磁性粒子等。
[0112]
如本文所使用的“蛋白质”意谓至少两个共价连接的氨基酸。该术语涵盖多肽、寡肽和肽。在一些实施例中，两个或更多个共价连接的氨基酸通过肽键连接。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，例如当蛋白质使用表达系统和宿主细胞以重组方式制成时。可替代地，蛋白质可包括合成氨基酸(例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸)。“重组蛋白”是使用重组技术、使用本领域中已知的任何技术和方法，即通过表达重组核酸而制成的蛋白质。用于产生重组蛋白的方法及技术在此项技术中众所周知。
[0113]
对于氨基酸序列，序列一致性和/或相似性可使用本领域中已知的标准技术来确定，这些技术包括但不限于smith及waterman(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2:482的局域序列一致性算法、needleman及wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443的序列一致性比对算法、pearson及lipman(1988)proc.nat.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法的检索、这些算法的计算机化实施方案(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575science drive,madison,wis.)的遗传学计算机组(genetics computer group)的威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package)中的gap、bestfit、fasta及tfasta)、由devereux等人(1984)nucl.acid res.[核酸研究]12:387-95所述的最佳拟合序列程序，例如使用默认设定，或通过检验。在一些实施例中，一致性百分比通过fastdb基于以下参数来计算：错配罚分1；空隙罚分1；空隙尺寸罚分0.33；及接合罚分30(“current methods in sequence comparison and analysis[当前序列比较和分析方法]”,macromolecule sequencing and synthesis,selected methods and applications[高分子测序与合成，部分方法与应用],第127-149页(1988),alan r.liss,inc[艾伦利斯出版公司])。
[0114]
通常，本文所披露的蛋白质与其变体，包括靶抗原(如间皮素)的变体、微管蛋白序列的变体及抗体可变域(包括单个变体cdr)的变体之间的氨基酸同源性、相似性或一致性与本文所述序列具有至少80％，例如具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、几乎100％或100％的同源性或一致性。
[0115]
以类似方式，关于抗体及本文所识别的其他蛋白质的核酸序列的“核酸序列一致性百分比(％)”定义为与抗原结合蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的候选序列中的核苷酸残基百分比。具体的方法利用设定成默认参数的wu-blast-2的blastn模块，其中重叠间隔和重叠分数分别设定成1和0.125。
[0116]
尽管引入氨基酸序列变化的位点或区域为预先确定的，但突变本身无需预先确定。举例而言，为使给定位点处的突变的效能优化，可在靶标密码子或区域处进行随机突变诱发且筛选经表达的抗原结合蛋白cdr变异体的所需活性的最佳组合。用于在具有已知序列的dna中的预确定位点处进行取代突变的技术为众所周知的，例如mi3引物突变诱发及pcr突变诱发。抗间皮素抗体及抗原结合片段
[0117]
在各种实施例中，本披露涉及能够结合和/或杀灭肿瘤细胞(例如表达间皮素的肿瘤细胞)的抗体或其抗原结合片段，以及其在缀合物及治疗性组合物中的用途。
[0118]
在一些实施例中，抗体可以单独使用、作为药物组合物或组合疗法的一部分施用、和/或作为adc中的抗体部分施用。在一些实施例中，本文披露的抗间皮素抗体及抗原结合片段可单独使用(即，以未缀合形式)并用作adc中的抗体部分。在一些实施例中，抗间皮素抗体及抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，抗间皮素抗体及抗原结合片段含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列且保留非人类(例如兔子)抗体的反应性，同时在人类中免疫原性较小。在一些实施例中，本文所披露的抗间皮素抗体及抗原结合片段提供相比于本领域技术人员已知的一种或多种抗间皮素抗体改善的稳定性、可配制性、聚集、结合亲和力、治疗功效、脱靶毒性和/或代谢特征中的一项或多项。
[0119]
在各种实施例中，本文所披露的抗体或抗原结合片段特异性结合至间皮素(例如，
如在癌细胞上表达的)。抗体或抗原结合片段可结合至靶抗原，其中如通过例如分析所测量，解离常数(kd)≤1mm、≤100nm或≤10nm或其间任何量。在某些实施例中，kd为1pm至500pm。在一些实施例中，kd在500pm至1μm、1μm至100nm、或100mm至10nm之间。
[0120]
在一些实施例中，抗体部分为包含两个重链及两个轻链的四链抗体(还称为免疫球蛋白)。在一些实施例中，抗体部分为免疫球蛋白的双链半抗体(一个轻链及一个重链)或抗原结合片段。
[0121]
在一些实施例中，抗体部分为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体部分为内化性抗体或其内化性抗原结合片段。在一些实施例中，内化性抗体或其内化性抗原结合片段结合细胞表面上表达的靶标癌抗原且在结合后进入细胞。在一些实施例中，adc的艾日布林药物部分在adc进入之后从adc的抗体部分释放且存在于表达靶标癌症抗原的细胞中(即在adc已内化之后)。
[0122]
在各种实施例中，本文披露的抗体或抗原结合片段可包含取自表3-5中所列的配对集合中的重链及轻链可变域或来自配对重链及轻链集合的六个cdr序列集合，例如表1-2中所列的cdr的集合。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段进一步包含人类重链及轻链框架(任选地具有一个或多个回复突变以改善结合亲和力)和/或人类重链及轻链恒定域或其片段。例如，抗体或抗原结合片段可包含人类igg重链恒定域(如igg1)及人类κ或λ轻链恒定域。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类免疫球蛋白g亚型1(igg1)重链恒定域及人类igκ轻链恒定域。
[0123]
表1-10列出了本披露的示例性抗体的氨基酸及核酸序列。表1.针对抗间皮素抗体的kabat cdr的氨基酸序列表2.针对抗间皮素抗体的imgt cdr的氨基酸序列
表3.针对抗间皮素抗体的可变区的氨基酸序列表4.针对抗间皮素抗体的恒定区的氨基酸序列表5.针对抗间皮素抗体的全长抗体ig链的氨基酸序列
表6.编码针对抗间皮素抗体的kabat cdr的核酸序列表7.编码针对抗间皮素抗体的imgt cdr的核酸序列
表8.编码针对抗间皮素抗体的可变区的核酸序列表9.编码针对抗间皮素抗体的恒定区的核酸序列
表10.编码针对抗间皮素抗体的全长抗体ig链的核酸序列


所列出的核酸序列不包括前导序列。
[0124]
在一些实施例中，本文所披露的抗体或抗原结合片段结合至人类间皮素且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统(kabat，sequences of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列])
所定义。
[0125]
在一些实施例中，本文所披露的抗体或抗原结合片段结合至人类间皮素且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义。
[0126]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含三个重链cdr及三个轻链cdr，其中cdr包括不超过以下的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代：hcdr1(根据kabat的seq id no:1或根据imgt的seq id no:7)、hcdr2(根据kabat的seq id no:2或根据imgt的seq id no:8)、hcdr3(根据kabat的seq id no:3或根据imgt的seq id no:9)；及lcdr1(根据kabat的seq id no:4或根据imgt的seq id no:10)、lcdr2(根据kabat的seq id no:5，或根据imgt的seq id no:11)及lcdr3(根据kabat的seq id no:6或根据imgt的seq id no:12)。
[0127]
在一些实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列且保留非人类(例如兔子)抗体的反应性，同时在人类中免疫原性较小。在一些实施例中，与一种或多种替代性抗间皮素抗体相比，抗间皮素抗体或抗原结合片段提供改善的稳定性、可配制性、结合亲和力、治疗功效和/或降低的聚集水平中的一项或多项。
[0128]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13至少90％一致的序列；和/或轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14至少90％一致的序列。在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列或与seq id no:15至少90％一致的序列；和/或轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列或与seq id no:16至少90％一致的序列。
[0129]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含seq id no:17的重链氨基酸序列或与seq id no:17至少90％一致的序列；和/或seq id no:18的轻链氨基酸序列或与seq id no:18至少90％一致的序列。
[0130]
在一些实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域及人类igκ轻链恒定域。
[0131]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含由seq id no:19(hcdr1)、seq id no:20(hcdr2)及seq id no:21(hcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含由seq id no:22(lcdr1)、seq id no:23(lcdr2)及seq id no:24(lcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含由seq id no:25(hcdr1)、seq id no:26(hcdr2)及seq id no:27(hcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含由seq id no:28(lcdr1)、seq id no:29(lcdr2)及seq id no:30(lcdr3)的核酸序列编码的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义。
[0132]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含由seq id no:31的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含由seq id no:32的核酸序
列编码的氨基酸序列。
[0133]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含由seq id no:33的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含由seq id no:34的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0134]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含由seq id no:35的核酸序列编码的氨基酸序列；及轻链，其包含由seq id no:36的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0135]
在各种实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段为345a12-hc15-lc4。
[0136]
本文所述的抗间皮素抗原结合域可以单独(例如，作为抗体或抗原结合片段)、连接至一种或多种额外药剂连接(例如，作为adc)、或作为较大大分子(例如，双特异性抗体或多特异性抗体)的一部分使用。
[0137]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与治疗剂缀合。在一些实施例中，化学治疗剂为艾日布林。在一些实施例中，化学治疗剂为艾日布林二聚体。
[0138]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为双特异性或多特异性抗体中的抗原结合域和/或为双特异性或多特异性抗体的一部分。在一些实施例中，双特异性或多特异性抗体包含能够结合至间皮素的抗原结合域且包含：三个hcdr，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义。在一些实施例中，多特异性抗体包含一个或多个额外抗原结合域，例如针对相同抗原(即间皮素)或针对其他抗原。
[0139]
在一些实施例中，抗原结合域为抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合域和/或抗原结合片段为单链可变片段(scfv)或fab片段。
[0140]
在一些实施例中，本文所披露的用于单独或作为较大大分子的一部分使用的抗原结合域(例如抗间皮素抗原结合域)可包括其他修饰(例如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入)，同时保留间皮素结合功能。抗体-药物缀合物
[0141]
在各种实施例中，本文进一步提供抗体-药物缀合物(adc)化合物，其包含使化学治疗药物部分(例如艾日布林)连接至本文所披露的抗间皮素抗体的接头。抗体-药物缀合物(adc)化合物可由式i表示：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中ab为本文披露的内化性抗间皮素抗体或其内化性抗原结合片段；d为艾日布林；l为将ab共价连接至d的可裂解接头；并且p为1至8的整数。
[0142]
本披露的adc化合物包括与药物部分(例如艾日布林)缀合(例如通过接头共价连接)的抗体部分(包括其抗原结合片段)，其中药物部分当不缀合于抗体部分时具有细胞毒
性或细胞生长抑制作用。在各种实施例中，药物部分在结合于缀合物中时展现减少的细胞毒性或不展现细胞毒性，但在自接头及抗体部分裂解之后恢复细胞毒性。在各种实施例中，药物部分在结合于缀合物中时展现减少的旁观者杀灭作用或不展现旁观者杀灭作用，但在自缀合物裂解后展现增加的旁观者杀灭作用。
[0143]
在一些实施例中，本文所披露的adc化合物可选择性地将有效剂量的药物部分(例如艾日布林)递送至表达由adc的抗体部分靶向的抗原(例如间皮素)的癌细胞或肿瘤组织。在一些实施例中，所披露的adc化合物通过将艾日布林递送至表达间皮素的细胞或组织而避开不表达间皮素或以更低水平表达间皮素的正常细胞或组织来特异性靶向癌症。在一些实施例中，所披露的adc化合物相较于包含替代性抗体、接头和/或药物部分，例如bay 94-9343的adc具有改善的中靶杀灭和/或降低的脱靶杀灭。在一些实施例中，通过adc，所披露的adc化合物相较于包含替代性抗体、接头和/或药物部分，例如bay 94-9343的adc具有改善的adcc活性保留。在一些实施例中，所披露的adc化合物相较于包含替代性抗体、接头和/或药物部分，例如bay 94-9343的adc具有改善的稳定性(例如血浆稳定性)。在一些实施例中，所披露的adc化合物相较于包含替代性抗体、接头和/或药物部分，例如bay 94-9343的adc具有改善的抗肿瘤功效。
[0144]
在一些实施例中，相较于在评估为单独药物(即不缀合于抗体部分)时的艾日布林剂量，本文所披露的adc化合物可在较低剂量的艾日布林情况下提供有利的抗肿瘤功效。在一些实施例中，相较于在评估为单独药物时的艾日布林，本文所披露的adc化合物的肿瘤特异性靶向提高adc的抗肿瘤活性和/或降低脱靶细胞毒性。例如，在一些实施例中，本文所披露的adc化合物展示有利抗肿瘤活性，其中艾日布林的剂量比当评估为单独药物时的艾日布林剂量低至少10倍、低至少15倍、低至少20倍或低至少30倍。在一些实施例中，所披露的adc化合物表明当评估为单独药物时与艾日布林活性相当或大于艾日布林活性的抗肿瘤活性，同时提供与其自身的艾日布林相比改善的毒理学或安全性特征。
[0145]
在一些实施例中，接头在细胞外部为稳定的，使得adc当存在于细胞外条件中时保持完整，但能够在细胞(例如癌细胞)中内化时裂解。在一些实施例中，当adc进入表达间皮素的细胞时，艾日布林药物部分从抗间皮素抗体部分裂解，且裂解释放未经修饰形式的艾日布林。
[0146]
在一些实施例中，接头包含可裂解部分，该可裂解部分经固定放置使得在裂解后接头或抗体部分的任何部分不与艾日布林药物部分保持结合。在一些实施例中，接头中的可裂解部分为可裂解肽部分。在一些实施例中，相对于包含替代性接头部分的adc，包含可裂解肽部分的adc展现较低聚集水平、改善的抗体:药物比率、癌细胞的中靶杀灭增加、非癌细胞的脱靶杀灭减少和/或较高药物负载(p)。在一些实施例中，增加的效能和/或细胞毒性提供于表达中等水平的间皮素的癌症中。在一些实施例中，可裂解肽部分可通过酶裂解，且接头为可酶裂解接头。在一些实施例中，酶为组织蛋白酶b，且接头为组织蛋白酶可裂解接头。在一些实施例中，与替代性裂解机制相比，该酶可裂解接头(例如组织蛋白酶可裂解接头)展现上述改善特性中的一项或多项。
[0147]
在一些实施例中，接头中的可裂解肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。在一些实施例中，相对于包含替代性氨基酸单元或替代性可裂解部分的adc，包含val-cit的adc展现稳定性增加、脱靶细胞杀灭减少、中靶细
胞杀灭增加、聚集水平降低和/或药物负载更高。
[0148]
在一些实施例中，接头包含至少一个将抗体部分接合至可裂解部分的间隔子单元。在一些实施例中，接头中的间隔子单元可包含至少一个聚乙二醇(peg)部分。例如peg部分可包含-(peg)
m-，其中m为1至10的整数。在一些实施例中，接头中的间隔子单元包含(peg)2。在一些实施例中，不管较短接头长度如何，相对于包含较长间隔子单元(例如(peg)8)的adc，包含较短间隔子单元(例如(peg)2)的adc展现更低的聚集水平和/或更高的药物负载。
[0149]
在一些实施例中，间隔子单元经由马来酰亚胺(mal)部分连接至adc的抗体部分。在一些实施例中，相对于包含经由替代性部分连接至抗体部分的接头的adc，包含经由mal连接至抗体部分的接头的adc展现更高的药物负载。在一些实施例中，接头中的mal经由半胱氨酸残基(例如lccys80)接合至抗体部分。在一些实施例中，接头中的mal接合至抗体或抗原结合片段上轻链可变区的半胱氨酸残基(例如lccys80)。在一些实施例中，p为2，且两个-l-d部分连接至抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，各-l-d部分连接至抗体或抗原结合片段上轻链可变区的半胱氨酸残基(例如lccys80)。在一些实施例中，半胱氨酸残基为lccys80。在一些实施例中，mal-间隔子单元包含peg部分。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)m，例如mal-(peg)2。在一些实施例中，mal-间隔子单元使抗体部分连接至接头中的可裂解部分。在一些实施例中，接头中的可裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸单元。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit。
[0150]
在一些实施例中，接头中的可裂解部分直接接合至adc的艾日布林药物部分，且可裂解部分直接连接至抗体部分或经由间隔子单元连接。在一些实施例中，间隔子单元还使接头中的可裂解部分连接至艾日布林药物部分。在一些实施例中，使接头中的可裂解部分连接至艾日布林药物部分的间隔子单元为自消融型。在一些实施例中，自消融型间隔子能够释放靶细胞中的未经修饰的艾日布林。在一些实施例中，自消融型间隔子单元包含对氨基苯甲基醇，例如对氨基苄氧基羰基(pab)。在一些实施例中，接头中的pab将可裂解部分连接至艾日布林药物部分。在一些实施例中，可裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸单元。在一些实施例中，接头包含val-cit-pab。在一些实施例中，接头包含val-cit-pab及经由mal将接头接合至抗体部分的peg间隔子单元。
[0151]
在一些实施例中，p为1至8、或2至6的整数。在一些实施例中，p为2或6。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit-pab。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit-pab且p为2。在一些实施例中，接头包含mal-(peg)
2-val-cit-pab且p为6。
[0152]
在一些实施例中，抗体部分经由包含mal部分、peg部分、val-cit及pab的接头缀合至艾日布林药物部分。在这些实施例中，马来酰亚胺部分将接头药物部分共价连接至抗体部分，且pab充当自消融型间隔子单元。此类接头可称为“mal-vc-pab”接头、“mal-vcp”、“马来酰亚胺-vcp”或“vcp”接头、“mal-(peg)
2-vcp”接头、或“mal-(peg)
2-val-cit-pab”接头。在一些实施例中，艾日布林药物部分为在c-35位置共价连接的艾日布林。在一些实施例中，mal-(peg)
2-val-cit-pab接头的pab连接至艾日布林药物部分上的c-35胺。
[0153]
345a12-hc15-lc4为示例性抗间皮素抗体，其包含上文在表1-10中所示的序列或由其编码，例如包含重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所披露的adc的抗体部分包含重链可
变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所披露的adc的抗体部分为345a12-hc15-lc4。
[0154]
在一些实施例中，本文所披露的adc包含345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林。在这些实施例中，包含345a12-hc15-lc4的抗体部分经由包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的接头接合至艾日布林药物部分。此类adc可称作“morab-109”。在一些实施例中，本文所披露的adc为morab-109。
[0155]
在一些实施例中，本文所披露的adc为morab-109且具有为2的p。在一些实施例中，当p为2时，adc可称为“morab-109(dar2)”。在其他实施例中，本文所披露的adc为morab-109且具有为6的p。在一些实施例中，当p为6时，adc可称为“morab-109(dar6)”。
[0156]
在各种实施例中，接头经设计以在接头药物部分和/或药物部分单独扩散至相邻细胞之后经由裂解促进旁观者杀灭(相邻细胞，例如不表达间皮素的细胞的杀灭)。在一些实施例中，接头促进细胞内化。在一些实施例中，接头经设计以使细胞外环境中的裂解最小化，且从而降低脱靶组织(例如非癌性组织)的毒性，同时保持结合于靶组织的adc及不表达靶向adc的抗体部分的抗原但包围表达该抗原的靶癌症组织的癌组织的旁观者杀灭。在一些实施例中，包含马来酰亚胺(mal)部分、聚乙二醇(peg)部分、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或“vc”)及pab的接头提供这些功能特征。在一些实施例中，包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的接头在接合抗体部分及艾日布林药物部分时在提供这些功能特征方面尤其有效。在一些实施例中，包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的接头在接合抗间皮素抗体部分(如345a12-hc15-lc4及艾日布林药物部分)时在提供这些功能特征中的一些或全部方面有效。
[0157]
在一些实施例中，抗间皮素抗体或抗原结合片段包含本文中所披露的序列(例如包含表1-3中所披露的六个cdr和/或重链及轻链可变域)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为全长抗体。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为单特异性抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或抗原结合片段，或多特异性抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段为单链可变片段(scfv)或fab片段。
[0158]
在一些实施例中，相对于包含替代性抗体或抗原结合片段的adc，包含抗间皮素抗体(ab)部分及可裂解肽部分的adc展现较低聚集水平、改善的抗体:药物比率、癌细胞的中靶杀灭增加、非癌细胞的脱靶杀灭减少、较高药物负载(p)、提高的细胞毒性和/或效能。在一些实施例中，adc为式(i)的adc：ab-(l-d)
p
(i)其中ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义；d为化学治疗剂(例如艾日布林)；l为将ab共价连接至d的可裂解接头；并且
p为1至8的整数。
[0159]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域及人类igκ轻链恒定域。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含seq id no:17的氨基酸序列；及轻链，其包含seq id no:18的氨基酸序列。
[0160]
在一些实施例中，adc具有式(i)：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中：ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素和/或表达间皮素的细胞且包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义；d为艾日布林；l为将ab共价连接至d的可裂解接头；并且p为1至8的整数。
[0161]
在一些实施例中，靶向间皮素和/或表达间皮素的细胞的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域及人类igκ轻链恒定域。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含seq id no:17的氨基酸序列；及轻链，其包含seq id no:18的氨基酸序列。
[0162]
在一些实施例中，adc具有式(i)：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中：ab为靶向间皮素和/或表达间皮素的细胞的抗体或其抗原结合片段，该片段包含：三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:1(hcdr1)、seq id no:2(hcdr2)及seq id no:3(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:4(lcdr1)、seq id no:5(lcdr2)及seq id no:6(lcdr3)的氨基酸序列，如通过kabat编号系统所定义；或三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:7(hcdr1)、seq id no:8(hcdr2)及seq id no:9(hcdr3)的氨基酸序列；及三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:10(lcdr1)、seq id no:11(lcdr2)及seq id no:12(lcdr3)的氨基酸序列，如通过imgt编号系统所定义；
d为艾日布林；l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解接头；并且p为1至8的整数。
[0163]
在一些实施例中，靶向间皮素和/或表达间皮素的细胞的抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域及人类igκ轻链恒定域。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：igg1重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及igκ轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含seq id no:17的氨基酸序列；及轻链，其包含seq id no:18的氨基酸序列。
[0164]
在一些实施例中，adc具有式(i)：ab-(l-d)
p
ꢀꢀ
(i)其中：ab为抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段能够结合至间皮素且包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:13的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:14的氨基酸序列；d为艾日布林；l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解接头；并且p为1至8的整数。
[0165]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类igg1重链恒定区及人类igκ轻链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含seq id no:15的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含seq id no:17的氨基酸序列；及轻链，其包含seq id no:18的氨基酸序列。
[0166]
在一些实施例中，adc的抗体或抗原结合片段为345a12-hc15-lc4。在一些实施例中，p为1至8。在一些实施例中，p为2或6。在一些实施例中，p为2。
[0167]
在一些实施例中，具有较低含量的艾日布林药物负载(例如，p为2)的本文所披露的adc(例如，包含本文所披露的抗间皮素抗体及接头的adc)可将相同或类似含量的艾日布林传递至癌细胞或传递至肿瘤组织作为具有较高含量的药物负载(例如，p为6)的adc。在一些实施例中，具有较低含量的药物负载(例如p为2)的adc可提供与具有较高含量的药物负载(例如p为6)的adc相当或更优的肿瘤生长抑制和/或体内抗癌治疗功效。
[0168]
在一些实施例中，各艾日布林部分通过可裂解接头经由抗体或片段上的半胱氨酸残基(例如lccys80)接合至靶向间皮素的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，总共两个接头-艾日布林部分连接至靶向间皮素的抗体或抗原结合片段，例如经由抗体或抗原结合片段上的两个半胱氨酸残基连接(即，使得adc具有dar2)。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基为lccys80。
[0169]
用作人类治疗剂(例如，用作肿瘤药剂)的adc的研发和生产可能不仅仅需要鉴定能够结合一个或多个所需靶标且连接至单独使用以治疗癌症的药物的抗体。将抗体连接至药物可对抗体及药物中的一者或两者的活性具有显著且不可预测的作用，这些作用将根据
抗体和/或接头和/或所选择药物的类型而变化。因此，在一些实施例中，对adc的组分进行选择以(i)保持分离的抗体和药物部分所展现的一种或多种治疗特性；(ii)维持抗体部分的特异性结合特性；(iii)优化药物负载以及药物与抗体比率；(iv)允许经由稳定连接至抗体部分而递送(例如，细胞内递送)药物部分；(v)保持adc作为完整缀合物的稳定性直至转运或递送至靶位点为止；(vi)将施用之前或之后的adc的聚集减至最少；(vii)在细胞环境中的裂解之后，允许实现药物部分的治疗作用，例如细胞毒性作用；(viii)展现类似于或优于分离的抗体和药物部分的体内抗癌治疗功效；(ix)使药物部分引起的脱靶杀灭最小化；和/或(x)展现所需的药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理/免疫特征。可能需要筛选这些特性中的各项以识别用于治疗用途的经改善的adc(ab等人(2015)mol.cancer ther.[分子癌症治疗学]14:1605-13)。
[0170]
在一些实施例中，包含接合至化学治疗剂(例如艾日布林)的抗间皮素抗体或抗原结合片段的本文披露的adc表明所需特性的特定组合。这些特性包括但不限于药物负载的有效含量、低聚集水平、储存条件下和/或当在体内循环中时的稳定性(例如血清及基质稳定性)、与未缀合抗体相当的对表达靶标的细胞的保留亲和力、针对表达靶标的细胞的强力细胞毒性、高含量的旁观者杀灭和/或有效的体内抗癌活性，所有特性均与使用其他抗体部分的adc相比较而言。在一些实施例中，即使当在具有中等抗原表达的细胞系中测试时，仍可见这些缀合物的高抗癌活性，表明对adc递送的毒素有效负载的有效敏感性。在一些实施例中，与包含替代性抗体部分的adc相比，包含本文披露的抗间皮素抗体或抗原结合片段的adc展现尤其有利的抗肿瘤细胞毒性和/或效能，以及改善的脱靶毒性及药物代谢及药代动力学(dmpk)曲线。在一些实施例中，相较于包含替代性抗体部分和/或缀合物的adc，包含本文披露的人源化抗间皮素抗体及艾日布林的adc提供出人意料有利的药理学及毒理学特性。
[0171]
本披露的adc化合物可将有效剂量的细胞毒性剂或细胞生长抑制剂选择性递送至癌细胞或肿瘤组织。在一些实施例中，adc的细胞毒性和/或细胞生长抑制活性依赖于细胞中的靶抗原表达水平。在一些实施例中，与表达低水平的相同抗原的癌细胞相比，所披露的adc在杀灭表达高水平靶抗原的癌细胞方面特别有效。在一些实施例中，与表达低水平的相同抗原的癌细胞相比，所披露的adc在杀灭表达中等水平靶抗原的癌细胞方面特别有效。
[0172]
示例性高表达间皮素的癌症包括但不限于卵巢癌(例如浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌)、胰腺癌、间皮瘤、子宫内膜癌、非小细胞肺癌(例如腺癌)及结直肠癌。示例性中等表达间皮素的癌症包括但不限于胃癌、胸腺癌及胆管细胞癌。示例性低表达间皮素的癌症包括但不限于黑素瘤及淋巴瘤。在一些实施例中，表达间皮素的癌症可包括具有突变和/或耐药性的癌症，例如kras/stk11突变肺癌(非小细胞肺腺癌)，例如展现对用pd-1检查点阻断的治疗具有耐药性的那些突变肺癌。药物部分
[0173]
本文所描述的adc中的药物部分(d)可以为任何化学治疗剂。有用的化学治疗剂种类包括例如抗微管蛋白剂。在某些实施例中，药物部分为抗微管蛋白剂。用于所述的adc及组合物中的一个示例性药物部分为艾日布林。用于所述的adc及组合物中的另一个示例性药物部分为艾日布林二聚体。
[0174]
在各种实施例中，所披露的adc中以其天然形式使用的艾日布林的结构如式(ii)
中所示：
[0175]
在各种其他实施例中，所披露的adc中所用的艾日布林的结构如公开号us 20180193478中所示，其以引用的方式并入本文中用于所有艾日布林结构及合成那些结构的方法。药物负载
[0176]
药物负载可由p表示，且在本文中也称为药物与抗体比率(dar)。药物负载可在例如每一抗体部分1至10个药物部分的范围内。在一些实施例中，p为1至10的整数。在一些实施例中，p为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。在一些实施例中，p为2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的整数。在一些实施例中，p为1至8的整数。在一些实施例中，p为1至6的整数。在一些实施例中，p为2至6的整数。在一些实施例中，p为2。在一些实施例中，p为6。
[0177]
在一些实施例中，药物负载可受抗体部分上的连接位点数目限制。在一些实施例中，adc的接头部分(l)经由抗体部分上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团连接至抗体部分。例如，接头可经由游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基基团连接至抗体部分(例如连接至n末端或c末端、连接至一个或多个赖氨酸残基的ε氨基基团、连接至一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团，或连接至一个或多个半胱氨酸残基的硫氢基基团)。与接头连接的位点可为抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或其可例如通过dna重组技术(例如通过将半胱氨酸残基引入氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如通过还原、ph调节或水解)引入抗体部分中。
[0178]
在一些实施例中，可缀合于抗体部分的药物部分的数目受游离半胱氨酸残基的数目限制。例如，在连接为半胱氨酸硫醇基团的情况下，抗体可具有仅一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或可具有仅一个或数个接头可经由其连接的具有足够反应性的硫醇基团。通常，抗体不含有许多可连接至药物部分的游离反应性半胱氨酸硫醇基团。实际上，抗体中的大部分半胱氨酸硫醇残基包含在链间或链内二硫键中。因此，在一些实施例中，缀合至半胱氨酸可能需要至少部分还原抗体。接头-毒素与抗体的过量连接可通过还原可供用于形成二硫键的半胱氨酸残基来使抗体去稳定。因此，在一些实施例中，最佳的药物:抗体比率应当增加adc的效能(通过增加每个抗体所连接的药物部分的数目)，同时不会使抗体部分不稳定。在一些实施例中，最佳比率可为2或6。在一些实施例中，最佳比率为2。
[0179]
在一些实施例中，使用一种或多种位点特异性缀合技术来生产具有确定的药物负载(即，确定的药物与抗体比率(dar))的均质adc产物。在一些实施例中，可以在抗体的轻链
或重链中产生游离半胱氨酸残基以经由残基特异性缀合技术(respect)进行位点特异性缀合。albone等人(2017)cancer biol.ther.[癌症生物学与治疗]18(5):347-57以及国际公开号wo/2016205618和wo/2017106643描述了用于生成respect形式的抗体的示例性方案，将这些文献各自关于进行位点特异性缀合的方法通过引用并入本文。在一些实施例中，使用位点特异性缀合产生adc以经由接头(例如mal-(peg)
2-val-cit-pab接头)使抗体部分共价连接至药物部分。在一些实施例中，使用位点特异性缀合靶向针对包含艾日布林药物部分的adc或组合物的约2的dar。
[0180]
嵌合或人源化至人类恒定区的兔子单克隆抗体可在轻链内产生不成对半胱氨酸，使得那些残基可用于缀合(albone等人(2017)cancer biol.ther.[癌症生物学与治疗]18(5):347-57；国际公开号wo/2016205618)。在一些实施例中，用于位点特异性缀合的抗体部分为respect-l-形式的抗体。本文描述了示例性respect-l-形式的抗体，其在轻链位置80处具有不成对半胱氨酸(lccys80)。如本文所使用，根据kabat编号系统，“lccys80”或“cys80”是指抗体或抗原结合片段上轻链可变区的氨基酸位置80处的半胱氨酸残基。例如，在一些实施例中，在本文所披露的轻链可变区中，lccys80出现在氨基酸位置80处。respect-l-来源的抗体可产生dar为约2的adc。在一些实施例中，例如使用位点特异性缀合达到约2的药物负载和/或平均药物负载。药物组合物
[0181]
在一些实施例中，本披露进一步提供包含一种或多种本文所披露的抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc及药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施例中，本文所述的药物组合物包含至少一种额外药剂。
[0182]
在一些实施例中，本披露进一步提供包含本文所披露的抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc的多个拷贝的药物组合物。在一些实施例中，本披露进一步提供包含本文所披露的adc的多个拷贝的药物组合物。在一些实施例中，组合物中的adc的平均值p为约1至约8。在一些实施例中，组合物中adc的平均值p为约2或约6。在一些实施例中，组合物中adc的平均值p为约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2或约2.3。在一些实施例中，组合物中adc的平均值p为约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
[0183]
在一些实施例中，药物组合物可进一步包含一种或多种额外治疗剂，例如一种或多种能够治疗表达间皮素的癌症、类固醇及其类似物的药剂。治疗性用途及治疗方法
[0184]
本文披露了使用所披露的抗体、抗原结合片段、缀合物、adc和/或药物组合物治疗受试者的病症，例如肿瘤病症的方法。抗体、抗原结合片段、缀合物和/或adc可单独或与第二治疗剂组合施用，且可以按药学上可接受的任何配制品、剂量及给药方案施用。可针对毒性以及功效的指标评估抗体、抗原结合片段和/或adc治疗功效且相应地调整。功效量度包括但不限于体外或体内观测到的细胞生长抑制和/或细胞毒性作用、肿瘤体积减小、肿瘤生长抑制和/或经延长的存活期。
[0185]
确定抗体、抗原结合片段、和/或adc是否对细胞发挥细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的方法是已知的。例如，抗体、抗原结合片段和/或adc的细胞毒性或细胞生长抑制活性可通过以下方式测量：在细胞培养基中暴露表达抗体、抗原结合片段和/或adc的靶蛋白的
哺乳动物细胞；培养细胞达约6小时至约5天的时段；以及测量细胞活力。基于细胞的体外分析还可用于测量adc的活力(增殖)、细胞毒性及对细胞凋亡的诱导(凋亡蛋白酶活化)。
[0186]
对于测定抗体、抗原结合片段和/或adc是否发挥细胞生长抑制作用，可使用胸苷结合分析。例如，可将呈5,000个细胞/所涂铺的96孔板的孔的密度的表达靶标抗原的癌细胞培养72小时时段，且在72小时时段的最后8小时期间暴露于0.5μci的3h-胸苷。在抗体、抗原结合片段和/或adc存在及不存在下测量3h-胸苷与培养物的细胞的结合。
[0187]
为测定细胞毒性，可测量坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴随有质膜的渗透性增加；细胞膨胀及质膜破裂。细胞凋亡的典型特征是膜起泡、细胞质凝聚和内源性核酸内切酶的激活。针对对癌细胞的这些影响中的任一者的测定指示，adc可用于治疗癌症。
[0188]
细胞活力可以例如通过测定细胞中染料(如中性红、锥虫蓝、结晶紫或alamar
tm
蓝)的吸收来测量(参见，例如，page等人(1993)intl.j.oncology[国际肿瘤学杂志]3:473-6)。在此类测定中，在含有染料的培养基中孵育细胞，洗涤细胞，且以分光光度法测量反映细胞对染料的吸收的剩余染料。在某些实施例中，使用结晶紫测定法评估所制备的adc的体外效能和/或细胞毒性。结晶紫是一种三芳基甲烷染料，可积聚在活细胞的细胞核中。在此测定法中，使细胞暴露于adc或对照剂持续一段时间，然后将细胞用结晶紫染色，用水充分洗涤，接着用1％sds溶解且以分光光度法读取。还可使用蛋白质结合染料磺酰罗丹明b(sulforhodamine b，srb)来测量细胞毒性(skehan等人(1990)j.natl.cancer inst.[美国癌症研究所杂志]82:1107-12)。
[0189]
细胞凋亡可例如通过测量dna片段化来定量。用于定量体外测定dna片段化的商业测光方法为可用的。此类测定法的实例(包括tunel(其检测掺入片段化dna中的标记核苷酸)和基于elisa的测定法)在biochemica[生物化学](1999)第2期,第34-37页(罗氏分子生物化学公司(roche molecular biochemicals))中有所描述。
[0190]
细胞凋亡还可通过测量细胞中的形态变化来测定。例如，如同坏死一样，质膜完整性的损失可通过测量对某些染料(例如，荧光染料，如吖啶橙或溴化乙锭)的吸收来测定。用于测量凋亡细胞数目的方法已由duke及cohen,current protocols in immunology[免疫学实验室指南](coligan等人,编(1992)第3.17.1-3.17.16页)描述。细胞还可经dna染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记且观测细胞的沿内部核膜的染色体凝聚及边聚。可经测量以确定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、增加的膜起泡和细胞收缩。
[0191]
还可评估所披露的adc的旁观者杀灭活性。旁观者杀灭活性可例如通过采用两个细胞系的测定法来测定，这两个细胞系中的一个对靶抗原呈阳性，一个对靶抗原呈阴性。细胞系可经标记以进行区分。例如，经nuclight
tm
绿色(nlg)标记的靶标阳性细胞及nuclight
tm
红色(nlr)标记的靶标阴性细胞可经共培养，用adc处理，随后监测细胞毒性。靶标阴性细胞与靶标阳性细胞混合时的杀灭指示旁观者杀灭，而在靶标阳性细胞不存在的情况下的靶标阴性细胞的杀灭指示脱靶杀灭。
[0192]
在一些实施例中，本披露的特征在于通过破坏微管蛋白来杀灭癌细胞或组织、抑制或调节癌细胞或组织的生长、或干扰癌细胞或组织的代谢的方法。该方法可用于破坏微管蛋白提供治疗益处的任何受试者。可受益于破坏微管蛋白的受试者包括但不限于患有以
下或处于以下风险下的受试者：胃癌、卵巢癌(例如上皮卵巢癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、乳癌、子宫内膜癌(例如浆液子宫内膜癌)、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、睪丸生殖细胞癌、头颈癌、肝癌、肾癌、尿道上皮癌、子宫癌、胆管癌、白血病(例如急性骨髓白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤)、骨髓瘤、头颈癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌(例如，神经胶母细胞瘤)、甲状腺癌、结直肠癌和/或皮肤癌(例如，黑素瘤)或其任何癌转移(dumontet及jordan(2010)nat.rev.drug discov.[自然评述药物发现]9:790-803)。
[0193]
在各种实施例中，在表达间皮素的任何细胞或组织，如表达间皮素的癌细胞或组织中可施用所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc。示例性实施例包括抑制间皮素介导的细胞信号传导的方法或杀灭细胞的方法。该方法可以用于表达间皮素的任何细胞或组织，如癌细胞或转移性病变。表达间皮素的癌症的非限制性实例包括间皮瘤、胰腺癌(例如胰腺癌)、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌、上皮卵巢癌)及肺癌(例如非小细胞肺癌、肺腺癌)(wang等人(2012)plos one[公共科学图书馆综合卷]7:e33214)。其他示例性间皮素癌包括子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌、白血病、乳癌、子宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、甲状腺癌、尿道上皮癌、子宫癌及胆管癌。表达间皮素的细胞的非限制性实例包括ovcar3人类卵巢癌细胞、hec-251人类子宫内膜样细胞、h226人类肺鳞状细胞间皮瘤细胞，及包含编码间皮素或其部分的重组核酸的细胞。
[0194]
示例性方法包括使细胞与如本文所述的抗体、抗原结合片段和/或adc以有效量，即足以杀灭细胞的量接触的步骤。该方法可用于例如体外、体内、离体或原位培养物中的细胞上。例如，可在培养基中体外培养表达间皮素的细胞(例如，通过肿瘤或转移性病变的活检而收集的细胞；来自建立的癌细胞系的细胞；或重组细胞)，并且可通过将抗体、抗原结合片段、和/或adc添加至培养基中来影响接触步骤。该方法将导致杀灭表达间皮素的细胞，尤其包括表达间皮素的肿瘤细胞。可替代地，抗体、抗原结合片段和/或adc可通过任何适合的施用途径(例如静脉内、皮下或与肿瘤组织直接接触)向受试者施用以在体内产生作用。此方法还可用于靶向其他细胞表面抗原的抗体及adc。
[0195]
可以在合适的动物模型中评估所披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc治疗性组合物的体内作用。例如，可使用异种癌症模型，其中将癌症外植体或所传代的异种移植组织引入免疫受损动物(如裸小鼠或scid小鼠)中(klein等人(1997)nature med.[自然医学]3:402-8)。可使用测量对肿瘤形成、肿瘤消退或转移等的抑制的测定法预测功效。
[0196]
还可使用体内测定法，这些体内测定法评估通过如细胞凋亡等机制进行的肿瘤死亡促进。在一些实施例中，可检查来自用治疗性组合物治疗的荷瘤小鼠的异种移植物是否存在细胞凋亡灶点且与未经治疗的对照荷异种移植物小鼠进行比较。在经治疗的小鼠的肿瘤中发现的细胞凋亡灶点的程度提供了关于组合物治疗功效的指示。
[0197]
本文进一步提供了治疗癌症的方法。本文所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc可出于治疗目的而施用至非人类哺乳动物或人类受试者。治疗方法需要向患有肿瘤的哺乳动物施用生物学有效量的包含连接至靶向与所表达抗原结合、可获得结合或定位于癌细胞表面上的抗体的艾日布林的抗体、抗原结合片段和/或adc。
[0198]
示例性实施例为将艾日布林递送至表达间皮素的细胞的方法，该方法包括将艾日布林结合至免疫特异性结合至间皮素表位的抗体且使细胞暴露于抗体、抗原结合片段和/或adc。指示本披露的抗体、抗原结合片段和/或adc的表达间皮素的示例性肿瘤细胞包括卵
巢癌细胞、子宫内膜样细胞及肺鳞状细胞间皮瘤细胞。
[0199]
另一示例性实施例为减少或抑制表达靶抗原的肿瘤(例如，表达间皮素的肿瘤)的生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的抗体、抗原结合片段和/或adc。在一些实施例中，该治疗足以减少或抑制患者肿瘤的生长、减少转移性病变的数目或尺寸、减轻肿瘤负荷、减轻原发性肿瘤负荷、降低侵袭性、延长存活时间和/或维持或改善生活质量。在一些实施例中，肿瘤在单独施用时对用adc的抗体或抗原结合部分治疗具有抗性或难治性，和/或肿瘤在单独施用时对用艾日布林治疗具有抗性或难治性。
[0200]
此外，本披露的抗体可出于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型施用至表达间皮素的非人类哺乳动物。就后者而言，此类动物模型可用于评估所披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc的治疗功效(例如，测试剂量和施用时程)。
[0201]
本文进一步提供所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc的治疗性用途。还披露了示例性实施例为抗体、抗原结合片段和/或adc在治疗表达靶抗原的癌症(例如，表达间皮素的癌症)中的用途。用于鉴定患有表达靶抗原(例如间皮素)的癌症的受试者的方法在本领域中是已知的且可用于鉴定适于用所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc治疗的患者。
[0202]
另一示例性实施例为抗体、抗原结合片段和/或adc在制造用于治疗表达靶抗原的癌症(例如，表达间皮素的癌症)的药物的方法中的用途。
[0203]
用于实践前述方法的治疗性组合物可配制成包含适用于所需递送方法的药学上可接受的载剂的药物组合物。示例性实施例为包含本披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc以及药学上可接受的载剂的药物组合物。合适载剂包括在与治疗性组合物组合时保持治疗性组合物的抗肿瘤功能且一般不可与患者免疫系统反应的任何材料。
[0204]
药学上可接受的载剂包括生理上兼容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂的实例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸盐及其类似物以及其组合中的一种或多种。在许多情况下，组合物中包括例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠的等张剂。药学上可接受的载剂可进一步包含极少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这类辅助物质增强adc的保存期限或有效性。
[0205]
治疗性配制品可溶解且经由能够将治疗性组合物递送至肿瘤部位的任何途径施用。潜在有效的施用途径包括但不限于静脉内、非经肠、腹膜内、肌内、瘤内、皮内、器官内、正位及其类似途径。治疗性蛋白制剂可冻干且以无菌粉末形式储存在例如真空下，且随后在注射之前于抑菌水(含有例如苯甲醇防腐剂)或无菌水中重构。治疗性配制品可包含抗体、抗原结合片段、和/或adc，或其药学上可接受的盐(例如，甲磺酸盐)。
[0206]
本文所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc可以约0.2mg/kg至约10mg/kg范围内的剂量向有需要的患者施用。在一些实施例中，每天、每两个月或其间的任何时间段向患者施用抗体、抗原结合片段、和/或adc。使用前述方法治疗癌症的剂量及施用方案将随该方法及靶标癌症而变化，且一般将视此项技术中所了解的多种其他因素而定。
[0207]
各种递送系统是已知的且可用于施用一种或多种本披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc。施用抗体、抗原结合片段、和/或adc的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、瘤内施用和黏膜施用(例如，鼻内和经口途径)。另外，可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有气雾剂的配制品。参
见，例如，用于肺部施用的组合物和方法描述于美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及国际公开号wo 1992/019244、wo 1997/032572、wo 1997/044013、wo 1998/031346和wo 1999/066903中。可以通过任何方便的途径施用adc，例如通过输注或快速注射(bolus injection)，或通过经由上皮或皮肤黏膜内层(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收。施用可为全身或局部的。
[0208]
本文所披露的治疗性组合物可在制造及储存条件下无菌且稳定。在一些实施例中，一种或多种抗体、抗原结合片段和/或adc或药物组合物以干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物形式提供于气密密封式容器中且可复原(例如用水或生理盐水)成适当浓度以向受试者施用。在一些实施例中，预防剂或治疗剂或药物组合物中的一种或多种以至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg或其间任何量的单位剂量以干燥无菌冻干粉末形式供应于气密密封式容器中。在一些实施例中，经冻干的抗体、抗原结合片段、和/或adc或药物组合物在原始容器中在2℃与8℃之间储存。在一些实施例中，本文所述的抗体、抗原结合片段和/或adc或药物组合物中的一种或多种以液体形式供应于气密密封式容器，例如指示药剂的量和浓度的容器中。在一些实施例中，液体形式的所施用的组合物供应于具有至少0.25mg/ml、至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml adc的气密密封式容器中。液体形式可在原始容器中在2℃与8℃之间储存。
[0209]
在一些实施例中，所披露的抗体、抗原结合片段、和/或adc可掺入适用于肠胃外施用的药物组合物中。可注射溶液可由在弗林特(flint)或琥珀色小瓶、安瓿或预填充注射器或其他已知递送或储存装置中的液体或冻干剂型构成。
[0210]
本文所描述的组合物可呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射溶液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。形式取决于预期施用模式和治疗应用。
[0211]
在各种实施例中，治疗涉及经由可接受的施用途径单次推注或重复施用抗体、抗原结合片段和/或adc制剂。
[0212]
可针对给定样品中靶抗原的含量(例如表达靶抗原的细胞的含量)对患者进行评估以便帮助确定最有效的给药方案等。示例性实施例为确定患者是否对用本披露的抗体、抗原结合片段和/或adc治疗产生应答的方法，该方法包括提供来自患者的生物样品及使生物样品与抗体、抗原结合片段和/或adc接触。示例性生物样品包括组织或体液，如炎性渗出物、血液、血清、肠液、粪便样品或肿瘤活检(例如源自患有具有以下或处于以下风险下的患者的肿瘤活检：表达靶抗原的癌症，例如表达间皮素的癌症)。在一些实施例中，样品(例如组织和/或体液)可获自受试者，且适合的免疫方法可用于检测和/或测量靶抗原(例如间皮素)的蛋白表达。这类评估还在整个疗法中用于监测目的，且可与其他参数评估组合用于规测治疗成功性。
[0213]
在一些实施例中，可通过使来自受试者的肿瘤样品与抗体、抗原结合片段、和/或adc接触且评估肿瘤生长速率或体积来评估抗体、抗原结合片段、和/或adc的功效。在一些实施例中，当已确定抗体、抗原结合片段、和/或adc有效时，可将其施用至受试者。
[0214]
以上治疗方法可与多种额外手术、化学疗法或放射疗法方案中的任一种组合。在
一些实施例中，本文所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc或组合物与一种或多种其他治疗剂，例如一种或多种化学治疗剂共配制和/或共施用。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂，例如氮芥、乙撑亚胺化合物和烷基磺酸酯；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；抗有丝分裂剂，例如抗微管蛋白剂，如艾日布林(eribulin)或甲磺酸艾日布林(halaven
tm
)、长春花生物碱(vinca alkaloid)和奥瑞他汀(auristatin)；细胞毒性抗生素；损害或干扰dna表达或复制的化合物，例如dna小沟结合剂；以及生长因子受体拮抗剂。在一些实施例中，化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。细胞毒性剂的实例包括但不限于抗有丝分裂剂，如艾日布林或甲磺酸艾日布林(halaven
tm
)、奥瑞他汀(例如，单甲基奥瑞他汀e(mmae)、单甲基奥瑞他汀f(mmaf))、美登木素生物碱(例如，美登素)、尾海兔素、多斯他汀(duostatin)、念珠藻素、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱)、紫杉烷、紫杉醇和秋水仙碱；蒽环霉素(例如，道诺霉素、阿霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione))；细胞毒性抗生素(例如，丝裂霉素、放线菌素、倍癌霉素(例如，cc-1065)、金霉素(auromycin/duomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、内霉素、酚霉素)；烷基化剂(例如，顺铂)；嵌入剂(例如，溴化乙锭)；拓朴异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide))；放射性同位素，如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212或213、p32及镥的放射性同位素(例如lu177)；以及细菌、真菌、植物或动物起源的毒素(例如，蓖麻毒素(例如蓖麻毒素a链)、白喉毒素、假单胞菌外毒素a(例如pe40)、内毒素、有丝分裂素、康普瑞汀(combrestatin)、局限曲菌素、白树素(gelonin)、α-帚曲菌素、相思子毒素(例如，相思子毒素a链)、莫迪素(例如，莫迪素a链)、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素、肥皂草抑制剂(sapaonaria officinalis inhibitor)、糖皮质素)。
[0215]
本文还披露了所披露的抗体、抗原结合片段和/或adc中的一种或多种在制造用于例如根据上文所述的方法治疗癌症的药物中的用途。在一些实施例中，使用本文所披露的adc，例如根据上文所描述的方法治疗癌症。
[0216]
在各种实施例中，用于本文所描述的实验室及治疗性应用的试剂盒处于本披露的范畴内。这类试剂盒可包含经分隔以容纳如小瓶、套管及其类似物的一个或多个容器的载架、封装或容器，该一个或多个容器中的各者包含待用于本文所披露的方法中的独立元素中的一者以及包含如本文所描述的用途的使用说明书的标签或插页。试剂盒可包含含有药物部分的容器。本披露还提供了封装在指示药剂的量的气密密封式容器(如安瓿或药囊)中的抗体、抗原结合片段、和/或adc、或其药物组合物中的一种或多种。
[0217]
试剂盒可包含上文所描述的容器及与其相联的一个或多个其他容器，该一个或多个其他容器包含自商业及使用者观点看合乎需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤剂、针、注射器；列举内容物和/或使用说明书的载架、封装、容器、小瓶和/或套管标签；及具有使用说明书的药品说明书。
[0218]
标签可存在于容器上或容器中以指示组合物用于特定疗法或非治疗性应用，如预后、预防、诊断或实验室应用。标签还可指示关于体内或体外用途(如本文所述的用途)的指导。在包括在试剂盒中或试剂盒上的插页或标签上还可包括指导和/或其他信息。标签可处于容器上或与容器相联。当将形成卷标的字母、数字或其他字符模制或蚀刻至容器自身中时，标签可处于容器上。当标签存在于还固持容器的接受器或载架内时，标签可例如以包装插页形式与容器相联。卷标可指示组合物用于诊断或治疗如本文所描述的癌症的病况。
[0219]
对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本文披露的发明或实施例的范围的情况下，本文所述本发明的方法是明显的，并且可以使用适当的等价方案对其进行其他适当的修改和改编。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实例将更清楚地理解它们，这些实例仅出于说明的目的而被包括，并且不旨在具有限制性。实例实例1：针对人类间皮素的嵌合抗体产生
[0220]
含有兔子及人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体根据下文所述的程序产生。分析抗体与人类间皮素的结合及表位结合。在表达不同水平的间皮素的人类细胞系中评价重组嵌合抗间皮素抗体的初始adc细胞毒性。用于人源化及adc研发的主要抗体描述于实例2-3中。1.1试剂及材料1.1.1抗体
[0221]
用于以下研究中的抗体为兔子人类嵌合(-xi)形式的抗人类间皮素抗体且在轻链位置80处具有不成对半胱氨酸(lccys80)。如下文在章节1.5中所述纯化及去半胱氨酸化抗体。通过bca分析及sds-page评估最终蛋白质含量。1.1.2可缀合细胞毒素及lccys80 adc
[0222]
用于以下研究中的接头-细胞毒素化合物包括mal-peg
2-奥瑞他汀f。抗体与mal-peg
2-奥瑞他汀f以1:5(mab:有效负载)摩尔比缀合。在akta fplc上使用2x5ml hitrap脱盐柱(通用医疗集团(ge healthcare))的脱盐色谱法纯化缀合的lccys80抗体，使用1x dpbs作为操作缓冲液。通过bca分析测定最终蛋白质含量。1.1.3肿瘤细胞系
[0223]
用于分析兔子-人类嵌合adc的人类肿瘤细胞系包括a431-k5(经人类间皮素稳定转染的人类黑色素瘤细胞a431，msln
hi
)、a431(msln
lo
)及ovcar3(人类卵巢癌，msln
hi
)。a431-k5细胞获自美国国家癌症研究所(national cancer institute)。直接自美国菌种保藏中心(american type culture collection，atcc)获得所使用的细胞系。1.1.4其他试剂
[0224]
除非另外指明，否则所有所用试剂均以研究级别或更高级别购自商业供货商。1.2在针对人类间皮素的兔子中产生抗体
[0225]
将来自载体p0301的人类间皮素cdna克隆至aldevron表达载体(pb8-间皮素-hum)中。随后用免疫载体pb8-间皮素-人类免疫两只兔子。在四次遗传应用之后，在免疫接种方案的第52天获得免疫血清。兔子免疫血清在含有1％bsa的pbs中以1:1000或1:5000稀释，且通过流式细胞术使用以下来测试：克隆至aldevron表达载体(pb1-间皮素-hum)中的预先用人类间皮素cdna瞬时转染的哺乳动物细胞及克隆至相同载体中的用不相关cdna瞬时转染的哺乳动物细胞。接着用10μg/ml山羊抗兔子igg r-藻红素(sba公司(southern biotech)，#4030-09)检测来自免疫血清的抗体。免疫接种、流式细胞术及冷冻保存细胞通过aldevron(德莱堡，德国(dreiburg,germany))进行。1.3产生抗间皮素抗体的培养物的高通量筛选1.3.1细胞培养
[0226]
将冷冻保存的兔子淋巴结细胞(2.0
×
107个细胞)解冻，随后用2.5μg/ml来自美洲商陆(phytolacca americana)的凝集素活化且在37℃下在5％co2下用dna酶i回收一小时。
细胞以每孔5个细胞用饲养细胞(表达兔子cd154的cho)接种在384孔板上，且在含有10.5ng/ml人类il2及10.5ng/ml人类il21细胞介素(peprotech)的完整imdm(imdm补充有10％fbs、2mm l-谷氨酰胺、1x mem neaa、1mm丙酮酸钠、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素、55μm 2-me)中培养。1.3.2分离针对人类间皮素的兔子igg及多克隆抗体
[0227]
在第2周，通过使用铕穴合物的igg fret鉴定产生兔子igg抗体的孔。通过elisa针对涂布有1μg/ml cho-mt40间皮素的板筛选产生igg的孔的兔子igg fcγ抗体的存在。通过针对1μg/ml间皮素的elisa筛选及针对1μg/ml cd73-his的反筛选来证实产生间皮素特异性兔子igg的培养物。fret及elisa在fx机器系统(贝克曼公司(beckman))上进行。1.3.3针对人类间皮素的兔子抗体的mrna基因拯救
[0228]
使用rnaqueous
tm-96总rna分离试剂盒(ambion)自产生兔子igg抗间皮素抗体的孔分离总rna。合成cdna且通过pcr使用铂taq一步法rt-pcr试剂盒(invitrogen)使用内部引物扩增轻链及重链可变区(表11)。使用铂taq扩增试剂盒及热循环仪(40个循环，1分钟94℃，1分钟54℃，1.5分钟68℃)，用嵌套引物扩增轻链及重链可变区(表12)。通过凝胶电泳观测扩增的dna模板，通过qiaquick 96pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化，且通过genewiz(south plainfield，nj)，使用内部引物测定dna序列(表13)。针对v基因及j基因兔子家族(imgt/v-quest)且针对内部in-fusion引物数据库(blastn)分析dna序列。in-fusion引物(表14)经识别或设计为含有添加至用于v及j基因引物的5’端的人类fc接头。引物通过idt(coralville,ia)合成。表11.用于一步法rt-pcr的引物序列表12.用于pcr的引物序列表13.用于dna模板测序的引物序列基因3’引物重ttggtgttggtggctgggtg(seq id no:45)轻gttbtactgktmtygatgcc(seq id no:46)表14.用于样品345a12的in-fusion pcr的引物序列
1.3.4pcr片段
[0229]
pcr扩增可变域在与亚克隆载体内的克隆位点同源的5’及3’端包括15个碱基对。根据制造商的方案，使用in-fusion hd克隆试剂盒(clontech)将pcr片段亚克隆至含有人类γ(p1974pc 75iz-ldr-infusion-huγ)或κ恒定区(p1975pc 75ib-ldr-infusion-huκ)的表达质粒中。根据制造商的方案，将1μl in-fusion反应物转变成stellar感受态细胞(clontech)。在微量滴定板振荡器上在37℃下在1ml tb培养基(teknova)中使转化体生长过夜。第二天，根据制造商的方案使用epmotion 5075，培养物通过qiaprep 96turbo小规模纯化试剂盒(qiagen)来小规模纯化。1.3.5基因合成片段
[0230]
人源化重及轻可变域经密码子优化用于在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中表达且通过基因技术合成。可变域合成为有kozak转译起始序列及ig分泌前导序列，且在与亚克隆载体内的克隆位点同源的5’及3’端处包括15个碱基对。使用in-fusion hd克隆试剂盒(clontech)将通过基因技术合成的pcr片段亚克隆至含有人类γ(p1974 pc 75iz-ldr-infusion-huγ)或κ恒定区(p1975pc 75ib-ldr-infusion-huκ)的表达质粒中。对所有克隆测序以证实插入序列的存在及保真性。1.4瞬时mab产生1.4.1 hek细胞
[0231]
对于各毫升3
×
106个待经expifectamine(thermofisher)转染的细胞，将333.3ng hc质粒及333.3ng lc质粒于50μl opti-mem(thermofisher)中培育5-10min。同样，将2.67μl expifectamine于50μl opti-mem中培育。将expifectamine溶液添加至dna混合物且在室温下培育20-30min。在涡旋的同时将dna:expifectamine混合物添加至细胞且在37℃，8％co2，125rpm振荡下培育。第二天，添加5μl增强子1及50μl增强子2/ml细胞至转染，其中再继续培育7-10天。在48-72小时之后，以10g/l酵母提取物(bd biosciences)、5mm戊酸(sigma-aldrich)及1:100cd脂质浓缩物(thermofisher)的最终浓度饲喂细胞。1.4.2 cho细胞
[0232]
对于各毫升6
×
106个待经expifectamine cho(thermofisher)转染的细胞，将500ng hc质粒及500ng lc质粒混合于40μl总体积中的opti-pro(thermofisher)中。同样，在36.8μl opti-pro中混合3.2μl expifectamine cho。将expifectamine cho溶液添加至dna混合物且在室温下培育1-5min。在涡旋的同时将dna:expifectamine cho混合物添加至细胞且在37℃，8％co2，125rpm振荡下培育。第二天，添加6μl增强子及160μl进料/ml细胞至转染，且将细胞转移至32℃，5％co2。在第5天，添加额外160μl进料/ml细胞。在第12至14天，收集上清液。1.5 mab纯化及去半胱氨酸化
1.5.1抗体纯化
[0233]
用dpbs使prosep-va高容量蛋白a树脂(millipore)平衡，且将50μl添加至2ml样品中。在于室温下培育1小时之后，将培养基及树脂添加至过滤板且用1ml dpbs洗涤两次。通过添加400μl 0.1m甘氨酸，ph 2.9使样品自树脂洗脱，随后在15,000
×
g下进行离心30秒。用20μl 1m tris，ph 8.0中和样品。通过使用0.5ml amicon ultra，10k截止过滤器(millipore)在15,000
×
g下离心5min将样品浓缩至约100μl，且根据制造商的方案使用0.5ml zeba脱盐柱，7k mwco缓冲交换至dpbs中。mab浓度通过测量au280来测定且使用mab的消光系数转化成mg/ml。1.5.2半胱氨酸去封端
[0234]
使用akta xpress纯化平台(ge healthcare)进行纯化。将多达1l改良性培养基负载至在20mm磷酸钠、150mm nacl，ph 7.0中平衡的5ml mabselect柱(ge healthcare)上。在负载之后用平衡缓冲液充分洗涤柱直至观测到稳定基线。使用100mm甘氨酸，ph 2.9洗脱结合的物质。将洗脱的物质立即注射至在1x磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)中平衡的26/10hiprep脱盐柱(ge healthcare)上，且于相同缓冲液中洗脱。汇集峰级分。材料通过bca分析(thermofisher)及通过还原及非还原sds-page的电泳分析蛋白质含量。1.6用于adc研发的重组嵌合抗间皮素抗体的初始筛选及表征
[0235]
使用expi-293培养基瞬时表达抗间皮素抗体且在96深孔培养板中培养。如上文所述纯化及去半胱胺酰化来自上清液的抗体。使用1:5(mab:有效负载)摩尔比，抗体与使用mal-peg
2-奥瑞他汀f作为有效负载缀合。使用thermo zeba旋转脱盐板使缀合抗体脱盐以移除超游离有效负载。1.7结合表征1.7.1使用octet的抗间皮素表位聚类
[0236]
首先使用定制结合分析用链霉亲和素尖端使用octet表征将表位结合至间皮素的抗体。将结合抗间皮素抗体的表位相对于由已知抗间皮素抗体morab-009(阿麦妥单抗(amatuximab))结合的表位标准化。抗体基于其与作为morab-009的相同、邻近或不同表位的结合而分组。重复步骤直至所有抗体与不同表位聚类比对为止。基于octet结果，结合亲和力排列为高、中等及低。所有结合步骤在含有0.2％bsa的pbst缓冲液中进行。1.7.2表面等离子体共振(biacore)结合分析
[0237]
抗间皮素抗体对间皮素的结合亲和力通过biacore(biacore t-100,ge healthcare,#1426075)使用一系列s cm5芯片来测量。将抗体浓度在1x hbs-p 缓冲液(ge healthcare)中调节至1μg/ml且将间皮素(50μg)调节至100nm。根据制造商的方案使用具有固定向导的cm5芯片制备抗人类抗体捕捉芯片。在hbs-p 中，最终捕捉抗体水平为8000-9000ru。制备芯片用于分析，其中五个循环为300秒缓冲液注射，接着为30秒再生，所有循环均在30μl/min下跨越所有四个流动池。通过以10μl/min依序注射单个配体溶液90秒，在流动池2-4上捕获抗体。以单一循环动力学方式如下进行分析物注射：各自以30μl/min依序注射自低至高浓度的分析物溶液240秒。检测为2-1、3-1、4-1。通过相同配体捕捉注射的序列进行双重参考，随后各自进行5次仅缓冲液注射持续240秒，解离1800秒且如上所述再生。一式两份地分析所有配体与间皮素的结合。使用biaevaluations软件使用1:1langmuir拟合模型进行动力学分析。自重复操作平均化缔合速率、解离速率及亲和力常数。
1.8体外细胞毒性分析
[0238]
继代培养a431、a431-k5及ovcar3细胞且以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中的完全生长培养基中，且在37℃，5％co2下培育过夜(16小时)。以200nm起始，在2ml深孔稀释板中以1:3连续稀释测试试剂(总共10个稀释液)。将经稀释的样品(100μl)添加至细胞培养板中(以100nm的测试样品的起始浓度)。在37℃，5％co2下再培育培养板5天。接着丢弃培养基，且将板用200μl dpbs洗涤一次，在室温下用50μl的0.2％结晶紫溶液染色15min，且随后用自来水充分洗涤。将培养板风干，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取培养板。使用graphpad prism6分析数据。1.9结果1.9.1兔子免疫接种
[0239]
两个兔子用质粒pb8-间皮素-人类进行dna免疫以用于四个遗传应用。在免疫方案的第52天获得免疫血清，在含有1％bsa的pbs中以1:1000或1:5000稀释，且使用表达间皮素的细胞通过流式细胞术测试。来自两个经免疫兔子的血清结合表达间皮素的细胞，这些细胞为经pb1-中间皮素-hu转染的细胞(图1，下部曲线)。反之，来自经免疫兔子的血清不结合经不相关cdna转染的细胞(图1，上部曲线)。1.9.2产生针对人类间皮素的兔子多克隆抗体的培养物的高通量筛选
[0240]
收集兔子淋巴结细胞且低温保存。将来自解冻淋巴结的细胞(2
×
107个细胞)用饲养细胞以5个细胞/孔接种于384孔板上，且在含有10.5ng/ml人类il-2及10.5ng/ml人类il-21细胞介素的完整imdm中培养。在经由igg fret使用铕穴合物接种之后两周鉴定产生兔子igg抗体的孔，且18,715igg产生培养物通过elisa针对人类间皮素反应性筛选。针对间皮素的反应性重新确认第八十五个间皮素特异性培养物，且针对人类cd73的反应性进行反筛选。存在54个产生兔子fcγ抗体的培养物，该抗体结合超过0.2od
450
的间皮素，对cd73无交叉反应性(图2)。初级elisa结果显示为最右组条形图，二级elisa结果显示为最左组条形图，且人类cd73结合通过中间组条形图显示。1.9.3可变区的rt-pcr、测序及克隆
[0241]
自产生兔子igg抗间皮素抗体的54个确认培养物分离总rna，通过rt-pcr合成cdna，且对轻链及重链可变区进行pcr扩增。使用v基因及j基因兔子家族(imgt/v-quest)分析五十二个dna序列且用对克隆至恒定区表达载体中的in-fusion具有特异性的引物对51进行pcr扩增(图3)。将总共48种抗体克隆至人类恒定区表达载体中且随后转染至expi293f细胞中。在51个转染物的45个中检测到抗体(图4)，将兔子可变区经in-fusion克隆至人类恒定区表达载体中。1.9.4针对表达间皮素的细胞的adc的初始筛选
[0242]
根据章节1.5中所述的方法纯化嵌合兔子抗人类间皮素(rb-hu-xi抗-msln)抗体。测定经纯化抗体的蛋白质浓度(图5)。为了完成针对adc发展的抗间皮素抗体的筛选，进行抗间皮素抗体与mal-peg2奥瑞他汀f的微缀合，且adc的特征在于使用ovcar3、a431-k5及a431细胞系的基于体外细胞的效能分析，其中ovcar3及a431-k5表达高水平的间皮素，且将a431(msln-)用作用于评估adc的脱靶杀灭及特异性的对照细胞系(图6)。1.9.5抗间皮素抗体的表位结合
[0243]
48种抗间皮素抗体的间皮素的结合表位使用octet表征，如章节1.7.1中所指示。
针对抗体鉴别六种不同表位，且102a6在当前型式中通过octet未观测到结合(图7)。如章节1.7.2中所指示，通过biacore测量与间皮素的抗体结合亲和力。结合亲和力结果总结在表15中。表15.与间皮素的抗间皮素抗体结合亲和力表15.与间皮素的抗间皮素抗体结合亲和力
[0244]
基于以上结果，选择覆盖所有表位组的十五个抗体用于扩大缀合及表征，如表16中所指示。当与奥瑞他汀f缀合时，还基于有利的体外效能选择102a6a。表16.十五个经选择的抗间皮素抗体及其表位组
实例2：抗间皮素adc的人源化
[0245]
根据下文所述的程序产生人源化抗间皮素抗体。分析抗体及adc对人类间皮素的保留的结合活性及对表达间皮素的细胞的细胞杀灭效能。还针对药物负载、聚集、热稳定性及血清及基质稳定性对抗体进行生物物理学表征。如实例3中所述，体内评价主要人源化抗体及adc。2.1试剂及材料2.1.1抗体
[0246]
用于以下研究的抗体具有轻链位置80处的不成对半胱氨酸(lccys80)且包括兔子-人类嵌合(-xi)及人源化(-zu)形式的抗人类间皮素抗体33o11、201c15、111b10、324o5、178f16、264e24、237n18、383i18、393l14、346c6、62b10、55b4、morab009、120n18、345a12及102a6a2。使用prosep-va高容量蛋白a树脂及zeba脱盐柱分批纯化抗体。如章节1.5中所述，纯化及去半胱氨酸化改良性培养基(实例1)。经由bca分析及sds-page评估最终蛋白质含量。2.1.2可缀合细胞毒素及lccys80 adc
[0247]
以下研究中使用的接头-细胞毒素化合物包括马来酰亚胺-vcp-艾日布林、马来酰亚胺-vcp-念珠藻素及马来酰亚胺-vcp-艾日布林二聚体。用在1x dpbs中平衡的hitrap脱盐柱(ge healthcare)使用脱盐色谱法纯化缀合抗体。通过bca分析测定最终蛋白质含量。2.1.3肿瘤细胞系
[0248]
用于分析兔子-人类嵌合adc的人类肿瘤细胞系包括a431(人类黑色素瘤细胞，msln
neg
)、a3(用人类间皮素稳定转染的a431、msln
hi
)、ovcar3(人类卵巢癌细胞，msln
hi
)、hec-251(人类子宫内膜样，msln
med
)及h226(人类肺鳞状细胞间皮瘤，msln
lo
)。所使用的所有细胞系均直接获自美国菌种保藏中心(atcc)，除了a3外，其在morphotek处自a431亲本细胞系及hec-251产生，自jcrb获得。2.1.4其他试剂
[0249]
除非另外指明，否则所有所用试剂均以研究级别或更高级别购自商业供货商。2.2 adc的生物物理学表征2.2.1 sec-hplc聚集分析
[0250]
使用agilent 1200hplc系统进行sec-hplc分析。将advancebio sec 300a(2.7μm，
7.8
×
50mm，序列号0006344424-13，批次号0006344424)保护柱连接至advancebio sec 300a分析柱(2.7μm，7.8
×
300mm，序列号0006336837-4，批次号0006336837)，在0.1m磷酸钠、0.15m氯化钠、5％ipa，ph 7.4中以0.5ml/min的流动速率平衡。
[0251]
通过使用agilent 1200hplc进行尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法(sec-hplc)来分析lccys80 adc的聚集。抗体及adc在1x dpbs中以2mg/ml制备，注射8μl(16μg)的各样品且运作36min。使用agilent chemstation软件分析所有数据。报告聚集百分比、单体百分比及片段化百分比。2.2.2疏水相互作用色谱法(hic-hplc)dar分析
[0252]
在agilent hplc 1260系统上使用疏水相互作用色谱法(hic-hplc)分析dar。将样品注射至tskgel乙基-5pw柱(tosoh bioscience，7.5mm id
×
7.5cm，10μm，无孔尺寸)上，且通过100％移动相a的平衡3分钟、15分钟梯度(0-100％b)、在100％b中保持5分钟、改变1分钟至100％a及在100％移动相a中再平衡5分钟以0.7ml/min自柱洗脱。移动相a为25mm磷酸钠、1.5m硫酸铵，ph 7.0。移动相b为25mm磷酸钠、25％异丙醇，ph 7.0。在280nm(参考320nm)下进行检测。通过下式测定dar：[auc 1 2(auc 2) 3(auc 3)
…
n(auc n)]/σauctot]其中auc 1为对应于与一种细胞毒素缀合的adc的抗体峰的曲线下面积，且auc 2为对应于与两种细胞毒素缀合的adc的抗体峰的曲线下面积。σauctot为缀合及未缀合峰的组合的曲线下面积(dar＝0、1及2)。2.2.3液相色谱法/质谱(lc-ms)dar分析
[0253]
dar还使用具有sqd/pda检测的waters alliance hplc的lc-ms方法分析。将样品在65℃下注射至proteomix rp-1000柱(5μm，4.6mm
×
15cm，sepax)上，且通过25％b中的平衡3分钟、25％-55％b的27分钟线性梯度、在55％b中保持5分钟、改变1分钟至90％b、在90％b下保持5分钟、改变1分钟返回至25％b及以25％b的5分钟再平衡洗脱。移动相a为含0.1％tfa的水，且移动相b为含0.1％tfa的乙腈。洗脱液接着以10:1分到pda及sqd检测器中。sqd检测器设置为es正，3.5kv的毛细管电压，50v的锥体电压，5v的提取器，及0.3v的rf透镜，150℃的源温度，350℃的去溶剂化温度。在200-2000m/z下以连续模式获得质量数据40分钟，且扫描时间1秒。使用masslynx及maxent1分析数据且去卷积脱机。使用下式计算dar：2[[auclc 1 2(auclc 2) 3(auclc 3)
…
n(auclc n)]/σilctot] 2[[auchc 1 2(auchc 2) 3(auchc 3)
…
n(auchc n)]/σauchctot]其中auclc 1为与一种细胞毒素缀合的轻链峰的曲线下面积，auclc 2为与两种细胞毒素缀合的轻链峰的曲线下面积等。auchc为相应重链的曲线下面积，且σauclctot及σauchctot分别为所有未缀合及所缀合轻链及重链的曲线下的组合面积。2.3结合表征2.3.1使用octet的抗间皮素表位聚类
[0254]
首先使用定制结合分析用链霉亲和素尖端使用octet表征将表位结合至间皮素的抗体。将结合抗间皮素抗体的表位相对于由已知抗间皮素抗体morab-009结合的表位标准化。抗体基于其与作为morab-009的相同、邻近或不同表位的结合而分组。重复步骤直至所有抗体与不同表位聚类比对为止。基于octet结果，结合亲和力排列为高、中等及低。所有结
合步骤在含有0.2％bsa的pbst缓冲液中进行。2.3.2表面等离子体共振(biacore)结合分析
[0255]
抗间皮素抗体对间皮素的结合亲和力通过biacore(biacore t-100,ge healthcare,#1426075)使用一系列s cm5芯片来测量。将抗体浓度在1x hbs-p 缓冲液(ge healthcare)中调节至1μg/ml且将间皮素(50μg)调节至100nm。根据制造商的方案使用具有固定向导的cm5芯片制备抗人类抗体捕捉芯片。在hbs-p 中，最终捕捉抗体水平为8000-9000ru。制备芯片用于分析，其中五个循环为300秒缓冲液注射，接着为30秒再生，所有循环均在30μl/min下跨越所有四个流动池。通过以10μl/min依序注射单个配体溶液90秒，在流动池2-4上捕获抗体。以单一循环动力学方式如下进行分析物注射：各自以30μl/min依序注射自低至高浓度的分析物溶液240秒。检测为2-1、3-1、4-1。通过相同配体捕捉注射的序列进行双重参考，随后各自进行5次仅缓冲液注射持续240秒，解离1800秒且如上所述再生。一式两份地分析所有配体与间皮素的结合。使用biaevaluations软件使用1:1langmuir拟合模型进行动力学分析。自重复操作平均化缔合速率、解离速率及亲和力常数。2.4差示扫描量热法(dsc)热稳定性分析
[0256]
vp毛细管差示扫描量热计(vp-capdsc；microcal，vp-capdsc，#12-07-149与origin-7绘图及microcal vp毛细管dsc软件2.0版)用于解密及比较不同f(ab’)2片段及对照的较高阶结构及热稳定性。在96孔分析板(微升分析型(microliter analytical supply))上使用20％contrad溶液制备样品且在10℃下在自动进样器中分析。2.5毛细管等电聚焦(cief)分析
[0257]
根据cfr安装及启动程序填充自动取样器试剂。将血红素用作系统稳定性标准。使用用于分批数据分析的默认设置。以1,500v进行聚焦时段#1持续1min用于系统适用性标准及样品。以3,000v进行聚焦时段#2持续5min用于系统适用性标准且以3,000v持续11min用于tigc样品且符合缓冲器对照。复制tigc样品以4.5min使用聚集时段#2且将所有样品以系统适用性标准归类。使用0.1的峰宽度参数及5的阈值及pi 7.5与9.4之间的积分使样品自动整合。2.6制备dar2及dar6 morab-109 adc
[0258]
345a12-hc15-lc4 chozn细胞系在波袋(20l)中培养直至活力《30％且使用tff浓缩至2l。在预平衡于20mm磷酸钠、10mm edta，ph 7.2中的amosphere a3树脂上捕获抗体，在相同缓冲液中洗涤直至实现稳定基线(以移除未结合材料)，随后在低流速下使用20mm磷酸钠、10mm edta、10mm半胱氨酸，ph 7.2在柱上还原8小时，随后使用20mm tris，ph 7.5在柱上再氧化60小时。在0.1m甘氨酸，ph 3.0中洗脱结合的物质，随后在1x pbs、2mm edta，ph 7.4中渗滤并浓缩至》10mg/ml。最终回收率为100％。
[0259]
对于dar2 morab-109，在室温下以1:2.5(mab:有效负载)的摩尔比添加(于dmso中)马来酰亚胺-vcp-艾日布林1小时。在缀合之后，将材料稀释至2mg/ml，在1x pbs、2mm edta中渗滤以移除未缀合接头有效负载且浓缩至5mg/ml。通过制备型醚-5pw hic色谱法纯化dar2材料。最终材料通过sec-hplc、rp-hplc及hic-hplc表征。
[0260]
对于dar6 morab-109，纯化/去半胱氨酸化抗体在1x pbs、2mm edta中稀释至7.5mg/ml，且通过在相同缓冲液中添加相等体积的250μm tcep持续50分钟进一步降低，随后添加相等总体积的50％丙二醇于1x dpbs/1mm edta中，随后的最终马来酰亚胺-vcp-艾
日布林处于1:8(mab:有效负载)摩尔比下，在室温下培育1小时。adc通过g-25色谱法纯化以移除未缀合的有效负载且配制成1x pbs、2mm edta。最终材料通过sec-hplc、rp-hplc及hic-hplc表征。2.7体外血清稳定性
[0261]
在pbs或人类血清中以0.5mg/ml制备抗间皮素adc(马来酰亚胺-vcp-艾日布林作为有效负载)。样品在37℃下培育0、24、48、72、96或240小时，接着转移至-80℃以便储存。所有样品解冻至环境温度，且单一稀释为1:2,000用于测试。测试样品的总mab、总adc及基于细胞的效能。总mab分析作为逐步夹层型式在gyrolab xp上发展，用生物素化间皮素捕获，且用alexa fluor 647抗igg1 fc检测。总mab及完整adc分析的可定量范围分别为6.25-800ng/ml及6.25至800ng/ml。标准曲线及qc使用morab-109(345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林)制得。2.8 morab-109 adc的体外dar-敏感性基质稳定性
[0262]
在pbs或人类、猴、大鼠或小鼠血清中，一式三份地以0.1mg/ml制备morab-109(345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林)dar 2。在37℃下培育样品0、24、48、72、96或240小时。将自各时间点移出的样品转移至-80℃以便储存。使用不含标记的生物层干扰测量法分析进行分析。在含有0.05％tween-20及1％bsa的1x pbs(分析缓冲液)中将基质样品稀释至1:20。在匹配基质中将morab-109 dar 0、dar 1、dar 2及dar 6的对照样品稀释至0.1mg/ml。阴性对照样品为单独5％基质。在分析缓冲液中以5μg/ml将经生物素标记的间皮素捕捉于sa链霉亲和素生物传感器尖端上(300秒；pall-fortebio)，随后捕捉经稀释的稳定性样品及对照物(300秒)。随后通过兔子-人类嵌合抗艾日布林抗体5e4的结合以100mg/ml定量有效负载。监测缔合持续300秒，此时结合达到平衡。在缔合的295秒时测定各样品在解离阶段结束时的结合程度(r
eq
)。通过绘制相对于t0的r
eq
百分比来测定稳定性，其中：r
eq
＝r
eq
t
x
/r
eq
t0[100]及t
x
百分比＝0-240小时。2.9体外细胞毒性分析
[0263]
继代培养a431、a3、ovcar3、hec-251及h226细胞且以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中的完全生长培养基中，且在37℃，5％co2下培育过夜(16小时)。以200nm起始，在2ml深孔稀释板中以1:3连续稀释测试试剂(总共10个稀释液)。将经稀释的样品(100μl)添加至细胞培养板中(以100nm的测试样品的起始浓度)。在37℃，5％co2下再培育培养板5天。接着丢弃培养基，且将板用200μl dpbs洗涤一次，在室温下用50μl的0.2％结晶紫溶液染色15min，且随后用自来水充分洗涤。将培养板风干，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取培养板。使用graphpad prism 6分析数据。2.10结果2.10.1人源化抗间皮素艾日布林adc的初始筛选十五种抗间皮素抗体经亚克隆、经按比例扩大表达且经纯化，且在cys80位置处使用马来酰亚胺-vcp-艾日布林作为有效负载缀合。所有adc均使用sec-hplc纯化及表征以用于聚集分析，hic-hplc用于dar分析，且使用a431-a3(msln
hi
)、a431(msln
lo
)及ovcar3(msln
hi
)细胞系的基于细胞的分析。细胞用adc处理6小时，随后洗涤掉，或处理48小时(a431-a3及a431细胞)或72小时(ovcar3细胞)以便进行效能比较。表征数据总结在
[0264]
表17中。基于下文的表征数据，选择六个抗体(加粗)用于人源化。
表17.十五个抗间皮素艾日布林adc的表征
2.10.2 adc的hc1-lc1人源化及体外细胞毒性
[0265]
兔子102a6a2、11b10、201c15、345a12及346c6 fv区域的序列使用igblast(美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information(ncbi)))及imgt/domaingapalign(国际免疫遗传信息系统(international immunogenetics information system()))工具blast化，用于与人类种系可变域蛋白质序列最接近的同源。将兔子框架序列用最接近的同源人类种系序列置换以产生cdr移植的人源化变体(hc1及lc1)。保留kabat-限定的fwrh2的最后两个残基作为兔子残基。针对111b10保留最终kabat限定的fwrh3残基。保留所有克隆的vκ区域中的respect-l基序cys80及ala83。在产生人源化抗体之后，嵌合及人源化抗体均与三个不同的改变疏水性的有效负载(马来酰亚胺-vcp-艾日布林、马来酰亚胺-vcp-念珠藻素及马来酰亚胺-vcp-艾日布林二聚体)缀合。针对所有抗体，通过biacore测量与间皮素的结合亲和力，且如表18中所总结，针对聚集百
分比(％)、dar及体外效能表征adc。还测量人源化抗间皮素adc的效能有效负载且总结在表19中。在所测试的所有五个细胞系中，adc具有低纳摩尔的细胞杀灭ec50值。
表19.有效负载的基于体外细胞的效能
2.10.3人源化改进
[0266]
由于损失针对201c15、345a12及346c6克隆的间皮素结合，因此需要后续突变以保留与间皮素结合。兔子及cdr移植的fv序列用于产生可变域的计算机模拟模型。将兔子及人源化模型的理论结构叠加，且分析极接近cdr的残基对cdr环的整体结构的潜在结构影响。鉴别兔子与人源化序列之间不同的残基。大多数不同残基不位于二聚体界面或远离cdr。发现vh及vκ区域中的若干残基极接近cdr(在内)，且进一步分析。
[0267]
vh区中的两个人源化区域鉴定为可能干扰克隆201c15、345a12及346c6中的抗原结合。所有克隆的n末端比在兔子序列中的hc1长一个氨基酸。此外，各自在fwrh3中具有2-氨基酸缺失(残基72-73)。对于这些克隆中的每一者，将hc1的fwrh3缺失周围的前五个氨基酸及六个氨基酸(残基71-76)恢复为兔子序列。345a12的残基93也恢复为hc5中的兔子。关于lc1，201c15、345a12及346c6的n末端恢复为兔子序列。201c5(残基67)及345a12(残基70)的fwrl3中的一个残基鉴定为潜在地与cdr相互作用且同样鉴别346c6(残基36)的fwrl2中的一个残基。2.10.4超人源化345a12
[0268]
在鉴别vκ中的其他兔子残基对抗原结合而言至关重要的情况下，产生345a12的其他突变体以将增加数目的人类残基引入整个vh及vκ区域中。对计算机模拟模型的分析鉴别vh中的残基35、48、49、57、58、61、62、63及64及vκ中的残基1、3、24、55及70。2.10.5超人源化345a12抗体的生物物理学表征
[0269]
超人源化345a12抗体自350ml按比例扩大细胞培养物纯化且在1x dpbs中配制。浓缩抗体以用于物理-化学特性评估。如表20中所示，hc10-lc7与hc15-lc7的组合在浓缩步骤期间沉淀，潜在地归因于相对低pi或不良溶解度。通过biacore针对间皮素结合亲和力来分析纯化抗体，且数据总结在下表21中。表20.纯化人源化345a12抗体的总结
2.10.6 dsc及cief分析
[0270]
通过dsc分析f(ab’)2片段的热熔融曲线。hc15-lc4f(ab’)2及hc10-lc4 f(ab’)2
的曲线示于图8中。
[0271]
通过cief分析345a12-hc10-lc4及345a12-hc15-lc4mab的pi。pi在各mab之间的0.06ph单位内变化，对于345a12-hc10-lc4为8.19且对于345a12-hc15-lc4为8.25(表22)。表22.cief分析样品名称pi酸性峰％中性峰％碱性峰％345a12-hc10-lc48.1924.41257.17118.417345a12-hc15-lc48.2534.78750.79014.4242.10.7血清稳定性
[0272]
如章节2.7中所描述，测试345a12-hc10-lc4及345a12-hc15-lc4 adc的pbs/人类血清稳定性评估长达10天。数据总结在下表23中。
2.10.8使用dar-敏感性octet分析的各种基质中的345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林的基质稳定性
[0273]
分析345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林(dar2)在小鼠、大鼠、食蟹猴及人类血浆及血清中的体外稳定性。adc在基质中以0.1mg/ml培育1周，且在1、2、3、4及10天之后移除时间点。如章节2.3.1中所述，使用基于dar-敏感性octet(生物层干涉测量术)的分析进行分析。结果示于图9中。345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林(dar2)显示有效负载的时间依赖性释放，其中在37℃下培育10天之后平均20％的释放。2.10.9产生针对人类间皮素的兔子igg及多克隆抗体的培养物
[0274]
在第2周，通过使用铕穴合物的igg fret鉴定产生兔子igg抗体的孔。通过elisa针对涂布有1μg/ml cho-mt40间皮素的板筛选产生igg的孔的兔子igg fcγ抗体的存在。通过针对1μg/ml间皮素的elisa筛选及针对1μg/ml cd73-his的反筛选来证实产生间皮素特异性兔子igg的培养物。fret及elisa在fx机器系统(贝克曼公司(beckman))上进行。实例3：体内研究
[0275]
根据下文所述的方案，使用人类肺癌及胃癌异种移植模型及人类间皮瘤患者源异种移植(pdx)模型在小鼠中评估包含主要人源化抗间皮素抗体及艾日布林缀合物的adc。评估adc的不同dar种类的抗癌活性及脱靶毒性。3.1试剂及材料3.1.1抗体
[0276]
用于以下研究的抗体具有轻链位置80处的不成对半胱氨酸(lccys80)且包括兔子-人类嵌合(-xi)及人源化(-zu)形式的抗人类间皮素抗体xi345a12-hc1-lc2、xi102a6a2-hc1-lc2、zu345a12-hc1-lc2、zu345a12-hc10-lc4及zu345a12-hc15-lc4。3.1.2可缀合细胞毒素及lccys80 adc
[0277]
以下研究中使用的接头-细胞毒素化合物包括马来酰亚胺-vcp-艾日布林及马来酰亚胺-vcp-dioh艾日布林二聚体。3.1.3肿瘤细胞系
[0278]
将人类nsclc细胞系nci-h2110、人类胃癌细胞系nci-n87及人类间皮瘤癌细胞系hay用于以下研究。所使用的所有细胞系均直接获自美国菌种保藏中心(atcc)，除hay细胞以外，其获自nci。3.1.4其他试剂
[0279]
除非另外指明，否则所有所用试剂均以研究级别或更高级别购自商业供货商。3.2在人类癌症异种移植模型中的体内筛选及功效研究3.2.1研究动物
[0280]
将雌性cd-1igs小鼠(charles river，7-9周龄)用于最大耐受剂量(mtd)研究，雌性nod.cb17-scid小鼠(jackson实验室)用于nci-h2110及hay异种移植研究，且将雌性ncr裸鼠(taconic，5周龄)用于nci-n87异种移植研究。在到达之后，动物在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。3.2.2细胞培养
[0281]
来自冷冻储备液的冷冻保存的nci-h2110、nci-n87或hay细胞在含有必需补充剂的培养基中培养。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
3.2.3肿瘤植入、入选方法及处理
[0282]
细胞以1:1(体积:体积)悬浮于与冰冷matrigel混合的pbs中，达到对于nci-h2110及hay细胞1.0
×
108个细胞/ml或5.0
×
107个细胞/ml的最终浓度。向小鼠皮下注射100μl/小鼠的细胞混合物且监测体重及肿瘤生长。在植入后第3天开始，通过电子数显卡尺每周3次获取测量结果。3.2.4肿瘤测量及处理
[0283]
肿瘤体积使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/6。一旦肿瘤植入达到100mm3的平均体积，则将小鼠随机分成每组五只小鼠。以200μl的体积静脉内给予处理。测量最终体重且在各研究结束时记录。3.2.5统计分析
[0284]
通过重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。各实验组内的肿瘤生长的比较也使用相同统计分析进行。3.3在人类间皮瘤pdx模型中的体内功效研究3.3.1研究动物
[0285]
在接种之前在到达后时，使nmri nu/nu雌性小鼠(janvier实验室，5-6周)适应至少4天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。3.3.2异种移植
[0286]
在研究第0天，在无菌条件下自五只供体小鼠移除meso 7212肿瘤。将供体肿瘤组织切割成2
×
2mm片段且置放于覆盖有0.9％生理盐水的无菌皮氏培养皿中。同时，受体动物用止痛(2mg/kg)皮下处理，且随后通过单次静脉内注射(0.15ml/小鼠)用(12mg/kg)麻醉。在左侧腰窝上在皮肤中形成5-8mm的表面竖直切口。将外科剪刀的尖端直接在侧腹上插入至切口中，且用于在皮下空间中形成凹穴。使用手术镊子将每个小鼠一个肿瘤片段植入凹穴中。用金属夹子封闭切口且将动物放回干净笼子中。3.3.3实验程序
[0287]
在肿瘤繁殖期间，使用电子数显卡尺(mitutoyo)测量肿瘤直径。根据动物的肿瘤体积(肿瘤体积的纳入标准，0.1-0.3cm3)将动物随机分配至实验组中。每周两次记录肿瘤体积及体重。3.3.4处理
[0288]
在随机化当天，艾日布林以0.2、0.3及3.2mg/kg的剂量静脉内施用。在随机化当天以10.0mg/kg的剂量或在四个连续日以2.5mg/kg的剂量静脉内施用morab-109(dar 0、2及6)。对于在所有实验组中的静脉内注射，施用体积为10ml/kg。3.3.5统计分析
[0289]
对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，还用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。3.4结果-体内筛选及功效研究
3.4.1研究m109-004-2016：人类nsclc异种移植模型中345a12-hc1-lc2及102a6a2 hc1-lc2艾日布林二聚体adc的体内筛选
[0290]
在人类非小细胞肺癌(nsclc)nci-h2110异种移植模型中进行抗间皮素抗体的两个克隆(345a12-hc1-lc2及102a6a2-hc1-lc2)的比较体内筛选。小鼠用2.5mg/kg的345a12-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc或2.5mg/kg的102a6a2-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc处理。两种adc的抗肿瘤活性及体重变化分别示于图10a及图10b中。3.4.2研究m109-006-2017：cd-1小鼠中的345a12-hc1-lc2及345a12-hc15-lc4艾日布林二聚体adc的最大耐受剂量(mtd)的初步评估
[0291]
在施用5、10、15或20mg/kg的345a12-hc1-lc2-dioh艾日布林二聚体adc或5、10或20mg/kg的345a12-hc15-lc4-dioh艾日布林二聚体adc之后测量雌性cd-1小鼠的体重变化。各adc的体重变化示于图11a及图11b中。3.4.3研究m109-007-2017：人类nsclc异种移植模型中345a12-hc10-lc4及345a12-hc15-lc4艾日布林二聚体adc的体内筛选
[0292]
在人类nsclc nci-h2110异种移植模型中进行抗间皮素抗体的两个其他克隆(345a12-hc10-lc4及345a12-hc15-lc4)的比较体内筛选。小鼠用2.5mg/kg的345a12-hc10-lc4-dioh艾日布林二聚体adc或2.5mg/kg的345a12-hc15-lc4-dioh艾日布林二聚体adc处理。两种adc的抗肿瘤活性及体重变化分别示于图12a及图12b中。
[0293]
基于345a12-hc15-lc4克隆的抗肿瘤活性及毒性特征选择其作为morab-109 adc中所用的抗体的候选克隆。3.4.4研究m109-010-2018：人类胃癌异种移植模型中345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)的dar2及dar6种类的抗肿瘤作用
[0294]
在10mg/kg的剂量下，在人类胃癌nci-n87异种移植模型中比较345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)的两个dar种类(dar2及dar6)。dar2及dar6 adc种类均展现持久及类似抗肿瘤反应(图13a)，在施用任一dar种类后，观测到较少体重减轻至无体重减轻(图13b)。3.4.5研究m109-010-2018：人类间皮瘤异种移植模型中345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)的dar2及dar6种类的抗肿瘤作用
[0295]
在人类间皮瘤hay异种移植模型中比较345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)的两个dar种类(dar2及dar6)。dar2及dar6 adc种类证明，在用单次剂量(5mg/kg)的morab-109处理的小鼠中持久且类似抗肿瘤反应，而单独的艾日布林(以mtd(3.2mg/kg)或以等效摩尔量的艾日布林施用，如在morab-109(0.1mg/kg)中所发现)显示有限抗肿瘤作用(图14a)。在用艾日布林的mtd剂量处理的小鼠中观测到急性及暂时体重减轻，而在用任一adc处理的小鼠中未观测到体重减轻(图14b)。3.4.6 morab-109(dar6)在人类间皮瘤pdx模型中的抗肿瘤作用
[0296]
在人类间皮瘤pdx模型meso7212(mv15369)中研究345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)(dar6)的抗肿瘤作用。测试两种不同治疗方案：单次施用10mg/kg morab-109或四次连续每日施用2.5mg/kg。morab-109的两种治疗方案均证明持久及类似的抗肿瘤反应，而单独艾日布林(0.2mg/kg)的等效摩尔量显示有限的抗肿瘤作用(图15a)。与单独艾日布林的mtd剂量相比，morab-109 adc处理均显示显著增加的抗肿瘤活性(p《
0.05)。所有处理的体重变化示于图15b中。3.4.7 morab-109(dar2及dar6)在人类间皮瘤pdx模型中的抗肿瘤作用
[0297]
在人类间皮瘤pdx模型meso7212(mv16071)中在单次施用10mg/kg下研究345a12-hc15-lc4-vcp-艾日布林adc(morab-109)的两个dar种类(dar2及dar6)的抗肿瘤作用。morab-109的dar2及dar6种类均证明持久且可比较的抗肿瘤反应，而单独的艾日布林(0.3mg/kg)的等效摩尔量及与morab-109种类(dar0)缀合的无艾日布林显示有限的抗肿瘤作用或无抗肿瘤作用(图16a)。在任何群组中均未观测到体重减轻(图16b)。morab-109的dar2与dar6种类之间不存在抗肿瘤作用的统计学差异。实例4：间皮素(msln)表达及体外效能4.1方法
[0298]
细胞毒性：将细胞继代培养且以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中的完全生长培养基中，且在37℃，5％co2下培育过夜(16小时)。以200nm起始，在2ml深孔稀释板中以1:3连续稀释测试试剂(总共10个稀释液)。将经稀释的样品(100μl)添加至细胞培养板中(以100nm的测试样品的起始浓度)。在37℃，5％co2下再培育培养板5天。接着丢弃培养基，且将板用200μl dpbs洗涤一次，在室温下用50μl的0.2％结晶紫溶液染色15min，且随后用自来水充分洗涤。将培养板风干，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取培养板。使用graphpad prism 6分析ic
50
测定的数据。在graphpad prism中使用非参数spearman分析进行相关性分析。4.2结果
[0299]
观测所有细胞系的morab-109(dar6)效能与间皮素表达之间的相关性(图17；表24及25)。
[0300]
对于morab-109(dar2)，当来自分析中排除具有较低间皮素表达的细胞系(平均荧光强度的facs染色(mfi)《80)时，在效能与间皮素表达之间观测到显著相关性(图17；表24及25)。morab-109(dar2)的效能在较高间皮素表达水平下与间皮素表达相关。表24.间皮素表达及效能相关性分析(dar2及dar6)表25.间皮素表达及效能相关性分析中所用的细胞系
实例5：morab-109在人类胃癌(nci-n87)异种移植模型中的剂量反应5.1方法5.1.1体内功效
[0301]
动物：在到达时达5周龄的雌性ncr裸鼠(taconic)在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0302]
细胞培养：将经冷冻保存的nci-n87细胞解冻且在含有必需补充剂的培养基中生长。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
[0303]
肿瘤植入、入选方法及处理：将pbs中的细胞悬浮液与冰冷matrigel以1:1(体积：体积)混合至1.0
×
108个细胞/ml的最终浓度。皮下注射100μl/小鼠的混合物。自植入后第3天开始，监测小鼠的临床健康，其中体重及肿瘤通过电子数显卡尺每周3次测量。
[0304]
肿瘤测量及处理：肿瘤体积(tv)(mm3)使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/6。当肿瘤平均达到约100mm3时，将动物随机分组为5只/组。在200μl体积的测试物品中静脉内给予处理。在研究结束时，测量且记录最终体重。
[0305]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。5.1.2药代动力学(pk)
[0306]
使用完整adc分析及总抗体分析进行pk分析。总抗体是指所有种类的总和，包括缀合及未缀合的种类(即dar0 dar1 dar2
……
darn)，而完整adc是指所有缀合种类(即dar1 dar2
……
darn)。总抗体分析法使用生物素标记的间皮素进行捕获。完整adc分析使用生物素标记的抗艾日布林5e4 fab片段用于捕捉且alexafluor647标记的抗人类fc用于检测。用gyros分析仪进行样品分析。数据分析在watsonlims 7.4.1中进行且绘制于microsoft excel中。5.2结果
[0307]
在5mg/kg至25mg/kg的morab-109(dar2)的剂量范围下观测到剂量依赖型功效(图18a及18b)。在任何剂量组中未观测到体重减轻(图18c)。在经处理的动物中观测到adc的剂量依赖性暴露，如auc的剂量依赖性增加所指示(图19及表26)。表26.在nci-n87肿瘤携带小鼠中morab-109(剂量滴定)的pk实例6：morab-109在人类卵巢癌(ovcar-3-a1-t1)异种移植模型中的体内抗肿瘤功效6.1方法
[0308]
动物：在到达时5周龄的雌性nod.cb17-scid小鼠(jackson实验室)在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0309]
细胞培养：将经冷冻保存的ovcar-3-a1-t1细胞解冻且在含有必需补充剂的培养基中生长。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
[0310]
肿瘤植入、入选方法及处理：将pbs中的细胞悬浮液与冰冷matrigel以1:1(体积：体积)混合至5.0
×
107个细胞/ml的最终浓度。皮下注射100μl/小鼠的混合物。自植入后第3天开始，监测小鼠的临床健康，其中体重及肿瘤通过电子数显卡尺每周3次测量。
[0311]
肿瘤测量及处理：肿瘤体积(tv)(mm3)使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/6。当肿瘤平均达到约100mm3时，将动物随机分组为5只/组。在200μl体积的测试物品中静脉内给予处理。在研究结束时，测量且记录最终体重。
[0312]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双
向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。6.2结果
[0313]
morab-109(dar2)证明人类卵巢癌ovcar-3-a1-t1异种移植模型中的肿瘤生长延迟(图20a及图20b)。实例7：morab-109在人类nsclc pdx模型(lc-f-25)中的体内抗肿瘤功效7.1方法
[0314]
动物：在到达时达5周龄的远亲杂交无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(hsd:无胸腺裸露的-foxn1nu)在接种之前适应至少4天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0315]
异种移植：将lc-f-25建立为来自人类患者的原发性非小细胞肺腺癌的生长肿瘤(p9.1.1/0)。基于免疫组织化学(ihc)分析，相对于其他肿瘤类型(如lxfa-737(实例8))，lc-f-25在阳性百分比及整体强度方面具有较低msln表达。
[0316]
实验程序：当平均肿瘤体积及中值肿瘤体积分别达到153.5及126mm3时，分配具有108与288mm3之间的现有生长lc-f-25肿瘤(p9.1.1/0)的三十一只(31)小鼠进行处理。
[0317]
治疗：在4组中各7至8只小鼠中评估功效：
·
在第1组中，在第1天以5ml/kg静脉内(i.v.)单次剂量给药媒剂。
·
在第2组及第3组中，在第1天，分别以0.1mg/kg(5ml/kg)及3.2mg/kg(6.4ml/kg)静脉内单次剂量给药艾日布林。
·
在第4组中，在第1天以10mg/kg(5ml/kg)静脉内单次剂量给药morab-109。
[0318]
测量肿瘤且在实验时段期间一周两次称重小鼠。
[0319]
统计分析：针对通过曼-惠特尼非参数比较测试(mann-whitney non-parametric comparison test)的各测量进行统计分析。将各处理组与对照组进行比较。7.2结果
[0320]
通过静脉内途径以10mg/kg的单次剂量给与的morab-109(dar2)具有良好耐受性，而无携带lc-f-25肿瘤的小鼠的体重减轻(图21b)。morab-109(dar2)展现在lc-f-25nsclc pdx模型中在10mg/kg下的肿瘤生长延迟(图21a)。
[0321]
携带lc-f-25肿瘤的小鼠对通过静脉内途径以0.1mg/kg的单次剂量(以10mg/kg施用时，morab-109中有效负载的等效摩尔量)给予的艾日布林具有良好耐受性，但不诱导统计学上显著的肿瘤生长抑制(图21a及图21b)。
[0322]
携带lc-f-25肿瘤的小鼠对通过静脉内途径以3.2mg/kg的单次剂量(小鼠mtd剂量或当以10mg/kg施用时高于morab-109中艾日布林的摩尔量的32倍)给予的艾日布林具有良好耐受性，但在施用之后3至10天诱发轻微及瞬时体重减轻(图21b)。在此剂量下，艾日布林诱导统计学上显著的肿瘤生长抑制，其中8只小鼠中的6只有部分肿瘤消退(图21a)。实例8：morab-109在人类nsclc pdx模型(lxfa-737)中的体内抗肿瘤功效8.1方法
[0323]
动物：4至6周龄的雌性nmri nu/nu小鼠(crl:nmri-foxn1nu)。
[0324]
异种移植：将lxfa-737建立为来自人类患者的原发性非小细胞肺腺癌的生长肿瘤(p14n4)。基于ihc分析，相对于其他肿瘤类型(如lc-f-25(实例7))，lxfa-737在整体强度及
较高的阳性百分比方面具有中等msln表达。
[0325]
实验程序：监测动物直至肿瘤植入物在足够数目的动物中达到50-250mm3(例如80-200mm3)的研究体积标准。将小鼠分配至群组，以相当的组中值及平均肿瘤体积为目标。将随机化的当天表示为第0天。
[0326]
治疗：在4组中各6至7只小鼠中评估功效：
·
在第1组中，在第1天以5ml/kg静脉内(i.v.)单次剂量给药媒剂。
·
在第2组及第3组中，在第1天，分别以0.2mg/kg及3.2mg/kg静脉内单次剂量给药艾日布林。
·
在第4组中，在第1天以10mg/kg静脉内单次剂量给药morab-109。
[0327]
测量肿瘤且在实验时段期间一周两次称重小鼠。在随机化的一天(第0天)后，给药第一天为第1天。
[0328]
统计分析：肿瘤生长的抑制、测试/对照值以(min.t/c)％为单位的抑制：将在第x天测试组与对照组的中值残余肿瘤体积(rtv)值的比率乘以100来计算测试值相对于对照值(t/c％)。测试组及对照组的肿瘤体积加倍及四倍时间(td，tq)定义为达至200％或400％的中值rtv所需的时间间隔(天数)。8.2结果
[0329]
在lxfa-737nsclc pdx模型中，morab-109(dar2)证实在10mg/kg下稳定抗肿瘤功效(最小t/c，在第41天为2.3％)(图22a)且其tq在研究期间未达到。在单次剂量下给定的morab-109也具有良好耐受性，而无通过携带lxfa-737肿瘤的小鼠的体重减轻(图22b)。
[0330]
携带lxfa-737肿瘤的小鼠对通过静脉内途径以3.2mg/kg的单次剂量(小鼠mtd剂量或当以10mg/kg施用时高于morab-109中艾日布林的摩尔量的32倍)给予的艾日布林具有良好耐受性，显示抗肿瘤功效(最低t/c，在第27天为4.2％)且其tq为80.1％。然而，在施用之后，艾日布林诱发轻微及瞬时体重减轻(图22a及图22b)。为morab-109中以10mg/kg施用艾日布林的摩尔量的两倍的单次剂量0.2mg/kg显示出有限的抗肿瘤疗效(最小t/c，在第44天为51.1％)。实例9：morab-109在人类胃癌(nci-n87)异种移植模型中的剂量反应9.1方法9.1.1体内功效
[0331]
动物：在到达时达5周龄的雌性ncr裸鼠(taconic)在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0332]
细胞培养：将经冷冻保存的nci-n87细胞解冻且在含有必需补充剂的培养基中生长。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
[0333]
肿瘤植入、入选方法及处理：将pbs中的细胞悬浮液与冰冷matrigel以1:1(体积:体积)混合至1.0
×
108个细胞/ml的最终浓度。皮下注射100μl/小鼠的混合物。自植入后第3天开始，监测小鼠的临床健康，其中体重及肿瘤通过电子数显卡尺每周3次测量。
[0334]
肿瘤测量及处理：肿瘤体积(tv)(mm3)使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/6。当肿瘤平均达到约100mm3时，将动物随机分组为5只/组。在200μl体积的测试物品中静脉内给予处理。在研究结束时，测量且记录最终体重。
[0335]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。9.1.2药代动力学(pk)
[0336]
使用完整adc分析及总抗体分析进行pk分析。总抗体是指所有种类的总和，包括缀合及未缀合的种类(即dar0 dar1 dar2
……
darn)，而完整adc是指所有缀合种类(即dar1 dar2
……
darn)。总抗体分析使用生物素标记的间皮素用于捕捉且使用alexafluor647标记的抗人类fc用于检测。完整adc分析使用生物素标记的抗艾日布林5e4用于捕捉且alexafluor647标记的抗人类fc用于检测。用gyros分析仪进行样品分析。数据分析在watsonlims 7.4.1中进行且绘制于microsoft excel中。使用来自血浆、肿瘤及骨髓样品的lc-ms定量艾日布林。9.1.3 lc-ms
[0337]
将来自单个小鼠的20-50μl morab-109(dar2)血浆或50μl来自morab-109(dar6)给药小鼠的相同汇集血浆用于分析。将dynabeads m-280链霉亲和素(100μl)与3μg捕捉选择人类igg-fc pk生物素缀合物一起在室温下培育1小时，接着用hbs-ep缓冲液洗涤。在hbs-ep缓冲液中稀释的血浆样品接着与复合/洗涤的珠粒混合以捕获morab-109复合物，在室温下培育1小时，接着在hbs-ep缓冲液中洗涤两次。在37℃下用含rapid pngasef(1μl)的pngase缓冲液使含有复合物的经洗涤珠粒去糖基化1小时，随后在hbs-ep缓冲液中洗涤一次。用10％乙腈w/0.1％甲酸(30μl)洗脱所捕捉/去糖基化morab-109。用synapt g2/m类uplc分析来分析样品的完整或减少的质量。9.2结果
[0338]
图23a及图23b分别显示在用10mg/kg的morab-109(dar2或dar6)的单次给药处理的人类胃癌nci-n87异种移植模型中的抗肿瘤作用及体重变化。
[0339]
morab-109(dar2)、morab-109(dar6)及未缀合抗体的pk分析示于表27中。未缀合及morab-109(dar2)的总抗体类似，而morab-109(dar6)较低，表明morab-109(dar2)在循环中稳定。
[0340]
来自血浆样品的adc的dar分析指示，对于dar6种类而言，有效负载释放速率较高且引起艾日布林的血浆含量较高(表28及29)。表27.在nci-n87肿瘤携带小鼠中morab-109(dar2及dar6)的pk特性
表28.血浆中morab-109(dar2)的dar
表29.血浆中morab-109(dar6)的dar实例10：345a12 hc15 lc4与阿奈妥单抗结合亲和力的比较10.1方法
[0341]
抗体：345a12 hc15 lc4(morab-109中的抗间皮素抗体)及阿奈妥单抗。针对阿奈妥单抗的序列，人类抗间皮素抗体阐述于表30中。
[0342]
结合亲和力：在biacore t-100仪器上的hbs-p 缓冲液中进行结合测量。在hbs-p 中将抗体稀释至1μg/ml。在室温下将样品以14,000
×
g离心5分钟，且随后将上清液转移至新的1.5ml biacore管中且加盖。将间皮素(50μg)在1xhbs-p 缓冲液中稀释至100nm，接着在biacore管中以100、20、4、0.8及0.16nm连续稀释5倍且加盖。根据制造商的方案使用具有固定向导的cm5芯片制备抗人类抗体捕捉芯片。在hbs-p 中，最终捕捉抗体水平为8000-9000ru。制备芯片用于分析，其中五个循环为300秒缓冲液注射，接着为30秒再生，所有循环均在30μl/min下跨越所有四个流动池。
[0343]
通过以10μl/min依序注射单个配体溶液90秒，在流动池2-4上捕获抗体。以单一循环动力学方式如下进行分析物注射：各自以30μl/min依序注射自低至高浓度的分析物溶液240秒。检测为2-1、3-1、4-1。通过相同配体捕捉注射的序列进行双重参考，随后各自进行5次仅缓冲液注射持续240秒，解离1800秒且如上所述再生。一式两份地分析所有配体与间皮素的结合。使用biaevaluations软件使用1:1langmuir拟合模型进行动力学分析。自重复操作平均化缔合速率、解离速率及亲和力常数。10.2结果
[0344]
345a12 hc15 lc4呈现比阿奈妥单抗高40倍的亲和力(表31)。345a12 hc15 lc4保持与食蟹猴间皮素的结合亲和力，而阿奈妥单抗不与食蟹猴间皮素结合。两种抗体都不结合大鼠间皮素。表30.阿奈妥单抗序列
表31. 345a12 hc15 lc4及阿奈妥单抗与人类、食蟹猴及大鼠间皮素的结合实例11：morab-109与bay 94-9343体外效能的比较11.1方法
[0345]
adc：评估morab-109(dar2及dar6)及雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)(bay 94-9343)。也称作bay 94-9343的雷星-阿奈妥单抗为adc，其包含经由含二硫化物接头(可还原spdb接头[丁酸4-(2-吡啶基二硫基)n-丁二酰亚胺酯])与类美登素微管蛋白抑制剂dm4缀合的阿奈妥单抗。bay 94-9343如实例15中所述产生。
[0346]
细胞毒性：将细胞继代培养且以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中的完全生长培养基中，且在37℃，5％co2下培育过夜(16小时)。以200nm起始，在2ml深孔稀释板中以1:3连续稀释测试试剂(总共10个稀释液)。将经稀释的样品(100μl)添加至细胞培养板中(以100nm的测试样品的起始浓度)。在37℃，5％co2下再培育培养板5天。接着丢弃培养基，且将板用200μl dpbs洗涤一次，在室温下用50μl的0.2％结晶紫溶液染色15min，且随后用自来水充分洗涤。将培养板风干，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取培养板。使用graphpad prism 6分析ic
50
测定的数据。11.2结果
[0347]
morab-109(dar2及dar6)展示对msln-阳性细胞系的特异性细胞毒性(表32)。相比之下，bay 94-9343表明对msln阳性及msln阴性细胞系的杀灭。表32.msln

及msln-细胞系上体外活性的比较
实例12：morab-109与bay 94-9343特异性的比较12.1方法
[0348]
细胞毒性：将细胞继代培养且以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中的完全生长培养基中，且在37℃，5％co2下培育过夜(16小时)。以200nm起始，在2ml深孔稀释板中以1:3连续稀释测试试剂(总共10个稀释液)。将经稀释的样品(100μl)添加至细胞培养板中(以100nm的测试样品的起始浓度)。在37℃，5％co2下再培育培养板5天。接着丢弃培养基，且将板用200μl dpbs洗涤一次，在室温下用50μl的0.2％结晶紫溶液染色15min，且随后用自来水充分洗涤。将培养板风干，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取培养板。使用graphpad prism 6分析ic
50
测定的数据。12.2结果
[0349]
通过未缀合抗体的细胞毒性分析证实通过morab-109(dar2)(图25a)而非bay 94-9343(图25b)的表达间皮素的细胞的特异性杀灭。不受理论束缚，针对bay 94-9343观察到的未缀合抗体缺乏竞争表明有效负载的释放，即使当抗体结合被未缀合竞争剂阻断时，这也可能导致杀灭。这种有效负载释放与bay 94-9343在间皮素阴性细胞系上观察到的相对高水平的细胞毒性一致(表32)。在图27中也直接观察到有效负载释放(血浆稳定性比较)。实例13：morab-109与bay 94-9343adcc活性的比较13.1方法
[0350]
将表达msln的cho细胞解冻且在完全rpmi-4％ultralow igg fbs中在96孔组织培养板中以1,000个细胞/孔(25μl)接种。将测试试剂(345a12抗体、morab-109(dar2)及bay 94-9343)以20μg/ml为起始在完整的rpmi-4％ultra-low igg fbs中以1:2.5连续稀释，随后转移(25μl)至细胞培养板，且在37℃及5％co2下培育60分钟。将6,000jurkat效应细胞(promega)解冻且添加(25μl)至细胞培养板中，且培养板在37℃，5％co2下培育18-22小时。
[0351]
使荧光素酶分析试剂在暗处解冻。将75μl荧光素酶分析试剂添加至各孔中，培养板在培养板振荡器上振荡30秒。培育5分钟后，在亮度计上读取培养板。13.2结果
[0352]
morab-109(dar2)及345a12 hc15 lc4具有类似adcc活性(图26a及表33)，而与阿奈妥单抗相比，bay 94-9343具有较弱adcc活性(图26b及表34)。表33.adcc活性-morab-109及345a12 hc15 lc4345a12morab-109100％96.9％表34.adcc活性-bay 94-9343及阿奈妥单抗阿奈妥单抗bay 94-9343100％65.06％实例14：基质中morab-109及bay 94-9343的稳定性14.1方法
[0353]
在人类或小鼠血浆中以0.1mg/ml制备抗msln adc，样品在37℃下培育0、24、48、72、96及240小时，接着在达到时间点时转移至-80℃以储存。所有样品解冻至环境温度且以1∶100稀释用于测试。dar敏感性稳定性分析在gyrolab上以逐步夹层形式发展。在阻断及样品结合之后，分析使用生物素标记的间皮素用于捕获，且使用alexa fluor 647抗艾日布林5e4 fab或alexa fluor 647抗dm4(levena biopharma)用于检测。用morab-109及bay 94-9343制得标准曲线及质量对照。14.2结果
[0354]
在人类及小鼠血浆中，morab-109(dar2)比bay 94-9343更稳定(图27)。实例15：morab-109及bay 94-9343在人类胃癌(nci-n87)异种移植模型中的抗肿瘤功效15.1方法15.1.1产生bay 94-9343
[0355]
bay 94-9343为adc，其包含经由含二硫化物接头(可还原spdb接头[丁酸4-(2-吡啶基二硫基)n-丁二酰亚胺酯])与类美登素微管蛋白抑制剂dm4缀合的阿奈妥单抗。来自阿奈妥单抗的序列获自beacon数据库(hanson-wade)。由重叠寡核苷酸产生抗体序列(表30)，进行pcr扩增，克隆至表达质粒中，且进行序列确认。在293f细胞中产生稳定池且使细胞生长直至活力《30％。使用蛋白a亲和色谱法自改良性培养基纯化阿奈妥单抗。通过与spdb-dm4(levena biopharma)的赖氨酸反应性缀合产生bay 94-9343，以获得为3.7的dar。通过脱盐色谱法移除未缀合的有效负载。15.1.2体内功效
[0356]
动物：在到达时达5周龄的雌性ncr裸鼠(taconic)在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0357]
细胞培养：将经冷冻保存的nci-n87细胞解冻且在含有必需补充剂的培养基中生长。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
[0358]
肿瘤植入、入选方法及处理：将pbs中的细胞悬浮液与冰冷matrigel以1:1(体积：体积)混合至1.0
×
108个细胞/ml的最终浓度。皮下注射100μl/小鼠的混合物。自植入后第3天开始，监测小鼠的临床健康，其中体重及肿瘤通过电子数显卡尺每周3次测量。
[0359]
肿瘤测量及处理：肿瘤体积(tv)(mm3)使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/
6。当肿瘤平均达到约100mm3时，将动物随机分组为5只/组。在200μl体积的测试物品中静脉内给予处理。在研究结束时，测量且记录最终体重。
[0360]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。15.2结果
[0361]
morab-109(dar2)及bay 94-9343均展示在nci-n87肿瘤携带小鼠中的类似功效(图28a)。任一组中未观测到体重减轻(图28b)。实例16：morab-109及bay 94-9343在人类间皮瘤(hay)异种移植模型中的抗肿瘤功效16.1方法
[0362]
动物：在到达时5周龄的雌性nod.cb17-scid小鼠(jackson实验室)在接种之前适应5-7天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0363]
细胞培养：将经冷冻保存的hay细胞解冻且在含有必需补充剂的培养基中生长。细胞在用于体内接种之前在完全培养基中再培养2个继代。
[0364]
肿瘤植入、入选方法及处理：将pbs中的细胞悬浮液与冰冷matrigel以1:1(体积:体积)混合至5.0
×
107个细胞/ml的最终浓度。皮下注射100μl/小鼠的混合物。自植入后第3天开始，监测小鼠的临床健康，其中体重及肿瘤通过电子数显卡尺每周3次测量。
[0365]
肿瘤测量及处理：肿瘤体积(tv)(mm3)使用下式计算：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×
π/6。当肿瘤平均达到约100mm3时，将动物随机分组为5只/组。在200μl体积的测试物品中静脉内给予处理。在研究结束时，测量且记录最终体重。
[0366]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。16.2结果
[0367]
morab-109(dar2)及bay 94-9343均展示在hay肿瘤携带小鼠中的类似功效(图29a)。任一组中未观测到体重减轻(图29b)。实例17：morab-109及bay 94-9343在人类间皮瘤pdx模型(meso7212)中的抗肿瘤功效17.1方法
[0368]
动物：在到达时5至6周龄的nmri nu/nu雌性小鼠(janvier实验室)在接种之前适应至少4天。将动物关养在每个通风笼中3-5只小鼠，其中灭菌食品块及水瓶可供随意使用。在研究开始之前对动物进行标记且称重。
[0369]
异种移植：在第0天，在无菌条件下自五只供体小鼠移除meso 7212肿瘤。将肿瘤组织切割成2
×
2mm片段且置放于覆盖有0.9％生理盐水的无菌皮氏培养皿中。同时，受体动物用(2mg/kg)进行皮下止痛处理，且随后通过单次静脉内注射(0.15ml/小鼠)用(12mg/kg)麻醉。在左侧腰窝上在皮肤中形成5-8mm的表面竖直切
口。将外科剪刀的尖端直接在侧腹上插入至切口中，且用于在皮下空间中形成凹穴。使用手术镊子将每个小鼠一个肿瘤片段植入凹穴中。最后，用金属夹子封闭切口且将动物放回干净笼子中。
[0370]
实验程序：在异种移植之后，通过触诊控制小鼠中肿瘤的移植及扩散至少每周两次。当肿瘤可触知时，用电子数显卡尺(mitutoyo)进行肿瘤直径的测量。
[0371]
在处理开始前，根据动物的肿瘤体积(肿瘤体积的纳入标准，0.1-0.3cm3)将动物随机分配至实验组中。自第一次处理日开始，每周两次记录肿瘤体积及体重。每日两次控制动物福利。
[0372]
治疗：所有试剂在随机分组当天以单次剂量静脉内施用。对照组中的动物以相同方式用dpbs处理。
[0373]
统计分析：对肿瘤体积及体重的数据进行描述性统计数据。通过使用重复-测量双向方差分析(anova)，随后通过bonferroni事后检定，将来自各处理组的动物肿瘤体积与对照组进行比较。另外，还用相同统计分析进行各组内动物的肿瘤生长的比较。17.2结果
[0374]
morab-109(dar2)及bay 94-9343均展示在meso7212肿瘤携带小鼠中的肿瘤消退(图30a)。任一组中未观测到体重减轻(图30b)。实例18：morab-109及bay 94-9343在人类nsclc pdx模型(lxfa-586)中的抗肿瘤功效18.1方法
[0375]
动物：4至6周龄的雌性nmri nu/nu小鼠。
[0376]
异种移植：将lxfa-586建立为来自原发性非小细胞肺腺癌人类患者的生长肿瘤(t2n1m0)。
[0377]
实验程序：监测动物直至肿瘤植入物在足够数目的动物中达到50-250mm3(例如80-200mm3)的研究体积标准。将小鼠分配至群组，以相当的组中值及平均肿瘤体积为目标。分配至组的过程(入选、分层随机化)还可称作随机化。将随机化的当天表示为实验的第0天。
[0378]
治疗：在4组中各6至7只小鼠中评估功效：
·
在第1组中，在第1天以5ml/kg静脉内(i.v.)单次剂量给药媒剂。
·
在第2组中，在第1天以25mg/kg静脉内单次剂量给药bay 94-9343(dar约4)。
·
在第3组中，在第1天以25mg/kg静脉内单次剂量给药morab-109(dar2)。
·
在第4组中，在第1天以3.2mg/kg静脉内单次剂量给药艾日布林。
[0379]
测量肿瘤且在实验时段期间一周两次称重小鼠。在随机化的一天(第0天)后，给药第一天为第1天。18.2结果
[0380]
在lxfa-586nsclc pdx模型中，morab-109(dar2)证实在25mg/kg下稳定抗肿瘤功效(最小t/c，在第41天为1.8％)(图31a)且其tq在研究期间未达到。在单次剂量下给定的morab-109也具有良好耐受性，而无通过携带lxfa-586肿瘤的小鼠的体重减轻(图31b)。
[0381]
在lxfa-586nsclc pdx模型中，bay 94-9343(dar约4)证实在25mg/kg下类似于morab-109的稳定抗肿瘤功效(图31a)且其tq在研究期间未达到。然而，bay 94-9343中dm4
有效负载的摩尔量约为morab-109中艾日布林有效负载的量的两倍。
[0382]
携带lxfa-586肿瘤的小鼠对通过静脉内途径以3.2mg/kg的单次剂量(小鼠mtd剂量或当以10mg/kg施用时高于morab-109中艾日布林的摩尔量的32倍)给予的艾日布林具有良好耐受性，且显示抗肿瘤功效(最低t/c，在第21天为14.8％)。然而，在施用之后，艾日布林诱发轻微及瞬时体重减轻(图31a及图31b)。实例19：morab-109及bay 94-9343在人类nsclc pdx模型(lxfl-529)中的抗肿瘤功效19.1方法
[0383]
动物：4至6周龄的雌性nmri nu/nu小鼠。
[0384]
异种移植：将lxfl-529建立为来自原发性非小细胞肺腺癌人类患者的生长肿瘤(t3n1m0)。
[0385]
实验程序：监测动物直至肿瘤植入物在足够数目的动物中达到50-250mm3(例如80-200mm3)的研究体积标准。将小鼠分配至群组，以相当的组中值及平均肿瘤体积为目标。分配至组的过程(入选、分层随机化)还可称作随机化。将随机化的当天表示为实验的第0天。
[0386]
治疗：在6组中各6至7只小鼠中评估功效：
·
在第1组中，在第1天以5ml/kg静脉内(i.v.)单次剂量给药媒剂。
·
在第2组中，在第1天以12.5mg/kg静脉内单次剂量给药bay 94-9343(dar约4)。
·
在第3组中，在第1天以3.2mg/kg静脉内单次剂量给药艾日布林。
·
在第4组中，在第1天以25mg/kg静脉内单次剂量给药morab-109(dar2)。
·
在第5组中，在第1天以12.5mg/kg静脉内单次剂量给药morab-109(dar2)。
·
在第6组中，在第1、8及16天以12.5mg/kg静脉内剂量给药morab-109(dar2)。
[0387]
测量肿瘤且在实验时段期间一周两次称重小鼠。在随机化的一天(第0天)后，给药第一天为第1天。19.2结果
[0388]
morab-109(dar2)展现在lxfl-529nsclc pdx模型中在12.5及25mg/kg下的稳定抗肿瘤功效(图32a)。在单次剂量下给定的morab-109也具有良好耐受性，而无通过携带lxfl-529肿瘤的小鼠的体重减轻(图32b)。
[0389]
然而，以12.5mg/kg的bay 94-9343(dar约4)(dm4有效负载的等效摩尔量作为以25mg/kg的morab-109中艾日布林有效负载的量)证实无抗肿瘤功效(图32a)。
[0390]
携带lxfl-529肿瘤的小鼠对通过静脉内途径以3.2mg/kg的单次剂量(小鼠mtd剂量)给予的艾日布林具有良好耐受性且展示抗肿瘤功效。然而，在施用之后，艾日布林诱发轻微及瞬时体重减轻(图32a及图32b)。