人源化亲和力成熟的抗FcRn抗体的制作方法

人源化亲和力成熟的抗fcrn抗体
1.本技术为分案申请，原申请的申请日为2016年5月12日，申请号为201680040516.6(pct/us2016/032168)，发明名称为“人源化亲和力成熟的抗fcrn抗体”。
2.本技术要求2015年5月12日提交的美国申请号62/160,423和2015年9月11日提交的美国申请号62/217,490的优先权，所述美国申请两者均整体并入本文。
发明领域
3.本发明涉及结合至fcrn的抗体及其抗原结合部分和它们用于调节或抑制fcrn与抗体fc区的相互作用的用途。所述抗体可用作用于治疗自体免疫和其它病症的治疗剂。
4.序列表
5.本技术含有已通过efs网以ascii格式提交，并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述序列表于2015年8月7日创建，名为sequence listing.txt，并且大小是87,246字节。
6.发明背景
7.新生儿fc受体(fcrn)是igg的一种细胞内运输整合膜fc受体。fcrn最初被鉴定为在新生儿生命中起作用的受体。它首先以在12kda蛋白质与40-50kda蛋白质之间的异二聚体形式从啮齿动物肠道分离(rodewald和kraehenbuhl 1984,j.cell.biol.99(1pt2):159s-154s；simister和rees,1985,eur.j.immunol.15:733-738)，并且在1989年被克隆(simister和mostov,1989,nature 337:184-187)。对fcrn的克隆和随后结晶揭示它具有与12kdaβ2微球蛋白轻链非共价缔合的约50kda i类主要组织相容性复合物(mhc)样重链(raghavan等,1993,biochemistry 32:8654-8660；huber等,1993,j.mol.biol.230:1077-1083)。尽管最初被认定与胎儿和新生儿生命关联，但当今已知fcrn继续在整个成人生命中起作用。fcrn主要驻留在早期酸性内体中，在其中它以ph依赖性方式结合至igg的fc区，其中在ph6.5下具有微摩尔至纳摩尔级亲和力，而在生理ph下fcrn与fc的结合可忽略。在大多数细胞中，大部分fcrn存在于内体中，并且fcrn与它的igg fc配体之间的相互作用发生在那个酸性环境内。在诸如造血细胞的一些细胞中，除细胞内表达之外，也可在细胞表面上检测到显著水平的fcrn(zhu等,2001,j.immunol.166:3266-3276)。在这个情况下，当细胞外环境呈酸性时，如在赘生性或感染性病状的情况下，有可能的是fcrn可在这些细胞类型的细胞表面上结合至igg。fcrn通过以下方式来调控血清igg浓度：结合至经胞吞单体igg并保护所述经胞吞单体igg免遭在溶酶体区室中的降解，以及将igg转运至细胞表面以在中性细胞外ph下释放。通过这个机理，fcrn导致igg的血清半寿期较长，因为未由fcrn结合的igg进入溶酶体途径，并且被降解。
8.在生命的第一阶段期间，fcrn在出生之前和之后通过介导igg穿过母体胎盘或新生儿肠壁进行转移来对后代赋予被动免疫性。fcrn继续在整个成人生命中起作用，并且在各种组织例如肺和肝的上皮、血管内皮中，以及在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞中表达。
9.fcrn缺陷小鼠对由病原性igg自体抗体引起的自体免疫疾病更具抗性，因为它们不能维持高浓度的病原性血清igg(christianson等,1996,j.immunol.156:4932-4939；
ghetie等,1996,eur.j.immunol.26:690-696；israel等,1996,immunol.89:573-578)。发现在鼠关节炎模型中施用经工程化以具有以较高亲和力结合fcrn的经修饰fc区的抗体使疾病改善(patel等,2011,j.immunol.187:1015-1022)。在许多自体免疫疾病中高剂量施用igg具有可至少部分地由于以下原因而加以解释的缓和作用：使fcrn介导的对igg的保护作用饱和，从而缩短病原性igg的半寿期(jin和balthasar,2005,hum.immunol.66:403-410；akilesh等,2004,j.clin.invest.113:1328-1333；li等,2005,j.clin.invest.115:3440-3450)。因此，特异性阻断fcrn-igg相互作用可用于促进病原性igg抗体的降解，例如以治疗igg介导的自体免疫疾病以及以在施用之后从血清清除治疗性抗体。举例来说，在大鼠实验诱发性自体免疫重症肌无力模型中，用fcrn重链特异性单克隆抗体治疗导致血清igg浓度降低和疾病的严重性减轻(liu等,2007,j.immunol.178:5390-5398)。
10.造血细胞中不存在fcrn与含有igg的免疫复合物更快速从血流清除相关联(qiao等,2008,proc.natl.acad.sci.usa 105:9337
–
9342)。这指示特异性阻断fcrn-igg相互作用也将促进含有igg的免疫复合物从循环清除。
11.fcrn通过穿过极化细胞的胞吞转运来调控igg和任何结合运载物在身体的不同区室之间移动。这个过程例如在胃肠道中在粘膜保护免遭感染方面起重要作用。fcrn穿过肠的上皮细胞屏障转运igg，并且进入管腔中。在igg结合管腔中的抗原之后，igg/抗原复合物由fcrn穿过屏障转运回固有层中，从而允许由树突细胞加工igg/抗原复合物以及向区域性淋巴结中的cd4

t细胞呈递抗原。
12.fcrn也在ii类mhc抗原呈递和i类mhc交叉呈递igg复合抗原中起关键作用。当抗原以含有igg的免疫复合物(ic)形式呈递时，呈cd8-cd11b

cd11c

的树突细胞(炎症性树突细胞)以高度依赖于fcrn表达的途径在低抗原剂量下显示显著交叉呈递。这个途径涉及ic通过fcγ受体内化至酸性内体中。随后在抗原呈递细胞(apc)内由fcrn对ic的结合引发特定机理，所述特定机理导致携带抗原的ic运输至抗原被加工成可与装载于mhc上相容的肽表位所处的区室中(baker等,2011,proc.natl.acad.sci.usa 108:9927-9932；christianson等,2012,mabs第4卷,第208页,引言)。因此，dc中的fcrn使mhc ii抗原呈递增强，并且诱导抗原特异性cd4

t细胞的增殖以及在呈递抗原至cd8

t细胞(细胞毒性t细胞)方面展现基本作用。这个后述cd8

t细胞途径被称为交叉呈递，并且涉及细胞外抗原进入i类mhc依赖性途径中的交换。
13.阻断fcrn-ig ic相互作用会抑制ic的抗原呈递和由免疫相关的抗原呈递刺激的随后t细胞活化。在诸如dc的apc中与igg ic的相互作用也促进炎症性细胞因子诸如il-12、ifnγ和tnfα的分泌。因此，阻断fcrn-ig ic相互作用可用于抑制由先天性免疫细胞和抗原活化的t细胞产生炎症性细胞因子。
14.fcrn含有血清白蛋白结合位点，其不同于fcrn的igg fc结构域结合位点，此归因于fcrn与igg或白蛋白之间的离子相互作用在fcrn重链的对立面上(chaudhury等,2006,biochemistry 45:4983-4990)。如同它与igg的结合一样，fcrn与白蛋白的结合强烈依赖于ph，发生在酸性ph下(通常小于ph 6，并且最优在ph 5下)而非在中性ph下。与它在保护igg免遭降解方面的作用类似，fcrn结合白蛋白会保护白蛋白免遭降解，并且导致白蛋白的血清半寿期延长。
发明概要
15.本发明提供结合fcrn的抗体及其抗原结合部分。抗体结合至fcrn的重叠于igg的fc结构域的结合位点的表位，并且降低或抑制fcrn与igg和呈免疫复合物形式的igg的结合。
16.本文提供一种包含重链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，其中：
17.cdr1的序列是seq id no:2；
18.cdr2的序列是seq id no:4；并且
19.cdr3的序列是seq id no:78。
20.在一个实施方案中，cdr3的序列是seq id no:76。在另一实施方案中，cdr3的序列是seq id no:74。
21.在其它实施方案中，cdr3的序列选自由以下组成的组：seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49、seq id no:51、seq id no:53、seq id no:55、seq id no:57、seq id no:74、seq id no:76和seq id no:78。在一个实施方案中，cdr3的序列是seq id no:49或seq id no:55。
22.在抗体或抗原结合片段的一些实施方案中，重链可变区的在kabat位置103处的氨基酸是色氨酸。在一些实施方案中，重链可变区的在kabat位置103处的氨基酸是精氨酸。
23.本文也提供一种包含轻链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，其中：
24.cdr1的序列是seq id no:6；
25.cdr2的序列是seq id no:8；并且
26.cdr3的序列选自由以下组成的组：seq id no:59、seq id no:62、seq id no:65和seq id no:68。
27.本文也提供一种包含重链可变区和轻链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区各自包含cdr1、cdr2和cdr3，并且其中：
28.所述重链的cdr1的序列是seq id no:2；
29.所述重链的cdr2的序列是seq id no:4；并且
30.重链的cdr3的序列选自由以下组成的组：seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49、seq id no:51、seq id no:53、seq id no:55和seq id no:57；并且
31.所述轻链的cdr1的序列是seq id no:6；
32.所述轻链的cdr2的序列是seq id no:8；并且
33.所述轻链的cdr3的序列选自由以下组成的组：seq id no:10、seq id no:59、seq id no:62、seq id no:65和seq id no:68。
34.在一些实施方案中，重链的cdr3的序列是seq id no:49或seq id no:55；并且轻链的cdr3的序列是seq id no:10。在一些实施方案中，重链的cdr3的序列是seq id no:55；并且轻链的cdr3的序列是seq id no:10。
35.在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段是嵌合或人源化抗体或抗原结合片段。
36.本文也提供一种包含重链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列是seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56或seq id no:58，或所述重链可变区的序列与seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56或seq id no:58的重链可变区氨基酸序列至少95％同一。
37.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含轻链可变区，其中所述轻链可变区的序列是seq id no:20或seq id no:22。在一些实施方案中，重链可变区的序列是seq id no:50或seq id no:56。在一些实施方案中，重链可变区的序列是seq id no:56，并且轻链可变区的序列是seq id no:22。
38.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含轻链可变区，其中所述轻链可变区的序列是seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67或seq id no:70，或所述轻链可变区的序列与seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67或seq id no:70的轻链可变区氨基酸序列至少95％同一。
39.在一些实施方案中，重链可变区的序列是seq id no:50或seq id no:56，并且轻链可变区的序列是seq id no:20或seq id no:22。在一些实施方案中，重链可变区的序列是seq id no:56，并且轻链可变区包含seq id no:22的轻链可变区氨基酸序列的框架区。
40.也提供一种包含轻链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列是seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67或seq id no:70，或所述轻链可变区的序列与seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67或seq id no:70的轻链可变区氨基酸序列至少95％同一。在一些实施方案中，轻链可变区的序列是seq id no:67。在一些实施方案中，轻链可变区的序列是seq id no:67，并且抗体或抗原结合片段进一步包含重链可变区，其中所述重链可变区包含seq id no:12的框架区。在一些实施方案中，轻链可变区的序列是seq id no:67，并且抗体或抗原结合片段进一步包含重链可变区，其中所述重链可变区的序列是seq id no:12。
41.本文也提供一种包含重链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16或seq id no:18的重链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16或seq id no:18的框架区至少95％同一的框架区。在一些实施方案中，重链可变区包含seq id no:12的重链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:12的框架区至少95％同一的框架区。
42.也提供一种包含轻链可变区的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24或seq id no:26的轻链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24或seq id no:26的框架区至少95％同一的框架区。在一些实施方案中，轻链可变区包含seq id no:20或seq id no:22的轻链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:20或seq id no:22的框架区
至少95％同一的框架区。在一些实施方案中，轻链可变区包含seq id no:22的轻链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:22的框架区至少95％同一的框架区。
43.本文也提供一种结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中所述重链可变区包含seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16或seq id no:18的重链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16或seq id no:18的框架区至少95％同一的框架区，并且进一步包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24或seq id no:26的轻链可变区氨基酸序列的框架区、或与seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24或seq id no:26的框架区至少95％同一的框架区。
44.在本文所述的抗体的一些实施方案中，抗体具有同种型igg4。在一些实施方案中，抗体在重链中含有s241p修饰。在一些实施方案中，抗体在重链中缺乏c末端赖氨酸。在一些实施方案中，抗体在重链中含有s241p修饰，并且在重链中缺乏c末端赖氨酸。
45.在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段是scfv、fv、fab’、fab、f(ab’)2或双抗体。
46.本文也提供一种与本文所述的结合至fcrn的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉阻断所述抗体或其抗原结合片段的抗体。
47.本文也提供一种编码本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段的经分离的核酸。本文也提供一种包含编码本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段的经分离的核酸的核酸载体。本文也提供一种包含编码本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段的经分离的核酸的原核或真核宿主细胞。本文也提供一种包含本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的组合物。
48.本文也提供一种调节fcrn与iggfc之间的相互作用的方法，其包括使fcrn与本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
49.本文也提供一种促进抗体由细胞降解的方法，其包括使fcrn与本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
50.本文也提供一种促进抗体在受试者中降解的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，降解的抗体是自体抗体。在一些实施方案中，降解的抗体是治疗性抗体。
51.本文也提供一种改善受试者的igg介导的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效改善所述igg介导的疾病的量的本文所述的抗体或抗原结合片段。
52.本文也提供一种通过抑制fcrn-免疫复合物相互作用来抑制由fcrn达成的免疫复合物结合或减少循环免疫复合物的方法，其包括使fcrn与有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
53.本文也提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的呈递的方法，其包括使所述apc与有效抑制对所述抗原的呈递的量的本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
54.本文也提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的交叉呈递的方法，其包括使所述apc与有效抑制对所述抗原的交叉呈递的量的本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
55.本文也提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)分泌炎症性细胞因子的方法，其包括
使所述apc与有效抑制所述炎症性细胞因子的分泌的量的本文所述的抗体或抗原结合片段接触。在一些实施方案中，炎症性细胞因子是白介素(interleukin)-6(il-6)、白介素-12(il-12)或肿瘤坏死因子-α(tnfα)。
56.本文也提供一种抑制由抗原呈递细胞达成的t细胞活化的方法，其包括使所述抗原呈递细胞与本文所述的抗体或抗原结合片段接触。
57.本文也提供一种治疗、抑制有此需要的受试者的自体免疫疾病或减轻其严重性的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，自体免疫疾病选自由以下组成的组：寻常天疱疮、落叶状天疱疮、副赘生性天疱疮、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病(crohn’s disease)、特发性血小板减少性紫癜(itp)、肝素诱发的血小板减少症(hit)、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、自体免疫溶血性贫血(aiha)、重症肌无力(mg)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(cidp)、多灶性运动神经病变、视神经脊髓炎、自体免疫血小板减少症、免疫嗜中性白细胞减少症、抗血友病fviii抑制剂、抗磷脂综合征、川崎综合征(kawasaki syndrome)、anca相关疾病、多发性肌炎、皮肤肌炎、大疱性类天疱疮、多发性硬化症(ms)、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、慢性多发性神经病变、溃疡性结肠炎、糖尿病、自体免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏眼病变(graves’opthalmopathy)、自体免疫性荨麻疹、血管炎和拉斯穆森氏脑炎(rasmussen’s encephalitis)。
58.本文也提供一种鉴定在酸性ph与生理ph两者下均结合fcrn的抗体的方法，其包括两个或更多个在ph 5.8-6.4下进行的筛选步骤。在一些实施方案中，方法包括：
59.(a)使一批候选抗体与fcrn或其一部分在ph 5.8-6.4下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体；
60.(b)使步骤(a)的经分离抗体与fcrn或其一部分在ph 6.8-7.6下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体；和
61.(c)使步骤(b)的经分离抗体与fcrn或其一部分在ph 5.8-6.4下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体。
62.本文也提供一种阻断病原性抗体穿过胎盘进行传送的方法，其包括向有此需要的妊娠哺乳动物施用治疗有效量的fcrn抗体或其抗原结合片段。
63.本文也提供一种使ic从受试者的清除增加的方法，其包括向有此需要的受试者施用fcrn抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，受试者患有免疫复合物介导的血管炎。
64.本文也提供一种用于确定测试抗体或其抗原结合片段是否阻断或减弱fcrn与免疫复合物之间的相互作用的方法，其包括：
65.(a)从哺乳动物获得全血；
66.(b)将免疫复合物添加至所述全血的第一部分中；
67.(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
68.(d)将测试抗体或其抗原结合片段添加至所述全血的第二部分中；
69.(e)在添加所述测试抗体或其抗原结合片段之后或同时将所述免疫复合物添加至所述全血的所述第二部分中；和
70.(f)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血的所述第二部分中所述细胞因子的
量以获得所述细胞因子的第二量。
71.在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化、嵌合或非天然存在的完全人抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是igg、fab、f(ab’)2、双抗体、fv、scfv、阻断肽或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:56的重链可变区和具有seq id no:22的轻链可变区。
72.在一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-10(il-10)或白介素-12(il-12)。在一些实施方案中，免疫复合物是人工的，即不天然存在于哺乳动物中。在一些实施方案中，免疫复合物包括4-羟基-5-碘-3-硝基苯基乙酰基(nip)和鸡卵白蛋白(ova)和抗nip抗体的多聚复合物。
73.本文也提供一种用于测定患者对抗fcrn疗法的预期响应水平的方法，其包括：
74.(a)在开始所述抗fcrn疗法之前从所述患者获得全血；
75.(b)将免疫复合物添加至所述全血的第一部分中；
76.(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
77.(d)将已知会阻断或减弱fcrn与免疫复合物之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段添加至所述全血的第二部分中；
78.(e)在添加所述抗体或其抗原结合片段之后或同时将所述免疫复合物添加至所述全血的所述第二部分中；
79.(f)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血的所述第二部分中所述细胞因子的量以获得所述细胞因子的第二量；和
80.(g)测定所述细胞因子的所述第一量与所述细胞因子的所述第二量之间的差值。
81.在一些实施方案中，患者是人。
82.在一些实施方案中，抗fcrn疗法是施用包含seq id no:56的重链可变区氨基酸序列和seq id no:22的轻链可变区序列的抗体。
83.在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是igg、fab、f(ab’)2、双抗体、fv、scfv、阻断肽或其片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是f(ab’)2。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:56的重链可变区和具有seq id no:22的轻链可变区。
84.在一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-10(il-10)或白介素-12(il-12)。在一些实施方案中，免疫复合物是人工的，即不天然存在于哺乳动物中。在一些实施方案中，免疫复合物包括4-羟基-5-碘-3-硝基苯基乙酰基(nip)和鸡卵白蛋白(ova)和抗nip抗体的多聚复合物。在一些实施方案中，将在步骤(g)中测定的差值与对照值进行比较。在一些实施方案中，将在步骤(g)中测定的差值与在用包含在fc结构域中具有使与fcrn的结合消除的3个点突变(i253a/h310a/h435a)的抗体的免疫复合物执行方法时获得的差值进行比较。
85.本文也提供一种用于监测患者对抗fcrn疗法的响应的方法，其包括：
86.(a)在抗fcrn疗法开始之前从所述患者获得全血；
87.(b)将免疫复合物添加至所述全血中；
88.(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
89.(d)在抗fcrn疗法开始之后从所述患者获得全血；
90.(e)将所述免疫复合物添加至步骤(d)的所述全血中；
91.(f)在步骤(e)中添加所述免疫复合物之后测量所述全血中所述细胞因子的量以获得所述细胞因子的第二量；和
92.(g)测定所述细胞因子的所述第一量与所述细胞因子的所述第二量之间的差值。
93.在一些实施方案中，患者是人。
94.在一些实施方案中，抗fcrn疗法是施用包含seq id no:56的重链可变区氨基酸序列和seq id no:22的轻链可变区序列的抗体。
95.在一些实施方案中，抗体是igg、fab、f(ab’)2、双抗体、fv、scfv、阻断肽或其片段。在一些实施方案中，抗体是f(ab’)2。
96.在一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)、白介素-6(il-6)、白介素-10(il-10)或白介素-12(il-12)。在一些实施方案中，免疫复合物包括4-羟基-5-碘-3-硝基苯基乙酰基(nip)和鸡卵白蛋白(nip)和抗nip抗体的多聚复合物。在一些实施方案中，将在步骤(g)中测定的差值与对照值进行比较。在一些实施方案中，将在步骤(g)中测定的差值与在用包含在fc结构域中具有使与fcrn的结合消除的3个点突变(i253a/h310a/h435a)的抗体的免疫复合物执行方法时获得的差值进行比较。在一些实施方案中，基于在步骤(g)中测定的细胞因子的第一量与细胞因子的第二量之间的差值调整抗fcrn疗法。
97.本文也提供一种在施用治疗性抗体之前促进自身抗体降解的方法，其包括在施用所述治疗性抗体之前向需要用所述治疗性抗体治疗的受试者施用对fcrn的igg结合位点具有特异性的抗fcrn抗体或其片段。
98.本文也提供一种促进已向受试者施用的外源性治疗性抗体的降解的方法，其包括向所述受试者施用有效量的抗fcrn抗体或其片段。
99.在一些实施方案中，方法进一步包括向受试者施用治疗性抗体的步骤。在一些实施方案中，治疗性抗体的药物动力学或药效动力学得以增强。
100.本文也提供一种在施用抗fcrn抗体之后测量受试者中抗fcrn抗体的水平的方法，所述方法包括在已施用抗fcrn抗体之后从所述受试者获得全血，其中所述全血包含单核细胞；以及测量单核细胞细胞表面fcrn表达水平。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，哺乳动物是人。
101.附图简述
102.本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。连同彩色附图一起公布的本专利或专利申请的复本将在请求以及支付必要费用后由专利局提供。
103.图1显示人源化重链变体(vh1-vh4)的氨基酸序列。变体基于人重链可变结构域序列，并且被对准以显示并入在某些位置处以使潜在免疫原性最小化的氨基酸变化。对在人源化框架之间变化的氨基酸残基加下划线。对kabat cdr加框。
104.图2显示人源化轻链变体(vκ1-vκ3、vκ5)的氨基酸序列。变体基于人轻链可变结构域序列，并且被对准以显示并入在某些位置处以使潜在免疫原性最小化的氨基酸变化。对
在人源化框架之间变化的氨基酸残基加下划线。对kabat cdr加框。
105.图3显示将亲和力成熟的重链h1、h3和e7以及亲和力成熟的轻链e8与亲本鼠抗体进行比较的竞争性elisa。亲和力成熟的重链与人源化亲本vκ1轻链一起表达成scfv，并且亲和力成熟的轻链与人源化亲本vh1重链一起表达成scfv。使scfv抗体与生物素化亲本鼠抗体在ph 7.4(a)和ph 6.0(b)下竞争结合固定化fcrn，并且通过链霉亲和素-hrp来检测结合的生物素化亲本鼠抗体。
106.图4显示将包含人源化亲本(vh1vκ1)或亲和力成熟的(h1vh1_e8vκ1、h1vh1_e8vκ2、g7vh1_e8vκ1、g7vh1_e8vκ2)重链和轻链的igg4抗体和嵌合亲本鼠抗体进行比较的直接结合测定。使抗体与固定化fcrn在ph 7.4(a)和ph 6.0(b)下反应，并且用人κ-hrp抗体检测结合的抗体。
107.图5显示将包含人源化亲本(vh1vκ1)或亲和力成熟的(h1vh1_e8vκ1、h1vh1_e8vκ2、f7vh1_e8vκ1、f7vh1_e8vκ2)重链和轻链的igg4抗体和嵌合亲本鼠抗体进行比较的竞争性elisa。使测试抗体与生物素化亲本鼠抗体在ph 7.4(a)和ph 6.0(b)下竞争，并且通过链霉亲和素-hrp来检测结合的生物素化亲本鼠抗体。
108.图6显示将包含人源化亲本(vh1vκ1)或亲和力成熟的(h3vh1_e8vκ1)可变结构域的单价scfv和二价igg抗体进行比较的竞争性elisa。使测试抗体与生物素化亲本鼠抗体在ph 7.4(a)和ph 6.0(b)下竞争，并且通过链霉亲和素-hrp来检测结合的生物素化亲本鼠抗体。
109.图7显示在ph 7.4和6.0下mab与人fcrn的结合。使包含g9或h3亲和力成熟的重链与亲和力成熟的e8或人源化亲本vκ2轻链配对的igg抗体偶联于cm5传感器芯片。传感图显示在ph 7.4和ph 6.0下，历经固定化mab注射的滴定量的单体人fcrn的结合。(a)g9e8，(b)h3e8，(c)g9vκ2，(d)h3vκ2。
110.图8显示其中测量肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的释放的全血测定的结果。黑色棒条代表用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物，但无h3vκ2进行操作的测定；灰色棒条代表在h3vκ2存在下用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物进行操作的测定。从左至右读取的4个棒条图代表：在24小时时的动物1；在48小时时的动物1；在24小时时的动物2；在48小时时的动物2。动物1是非响应者，即在用nip-ova-igg复合物刺激后，产生的tnf-α的量可忽略。在24小时时由动物2达成的tnf-α产生实际上由h3vκ2抑制；这个抑制作用被掩蔽，因为产生了如此大量的tnf-α以致黑色棒条和灰色棒条超出这个图的标度。
111.图9显示其中测量白介素-6(il-6)的释放的全血测定的结果。黑色棒条代表用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物，但无h3vκ2进行操作的测定；灰色棒条代表在h3vκ2存在下用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物进行操作的测定。从左至右读取的4个棒条图代表：在24小时时的动物1；在48小时时的动物1；在24小时时的动物2；在48小时时的动物2。
112.图10显示其中测量白介素-10(il-10)的释放的全血测定的结果。黑色棒条代表用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物，但无h3vκ2进行操作的测定；灰色棒条代表在h3vκ2存在下用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物进行操作的测定。从左至右读取的4个棒条图代表：在24小时时的动物1；在48小时时的动物1；在24小时时的动物2；在48小时时的动物2。
113.图11显示另一全血测定的结果。最右侧棒条(以绿色、蓝色和红色显示)证明h3vκ2对产生的细胞因子的量具有剂量依赖性抑制作用。
114.图12显示在ph 7.4和ph 6.0下，人igg子类igg1和igg4以及抗人fcrn mab h3vk2
与人fcrn的结合。代表性传感图显示在ph 7.4和ph 6.0下，历经固定化(a)h3vk2、(b)higg1和(c)higg4注射的滴定量的hfcrn的结合。
115.图13显示在ph 7.4和ph 6.0下，h3vk2与人和食蟹猴fcrn的结合。代表性传感图显示滴定量的(a)hfcrn(历经固定化ab加以注射，在ph 7.4下)、(b)hfcrn(在ph 7.4和ph 6.0下)和(c)cfcrn(在ph 7.4和ph 6.0下)的结合。
116.图14显示其中测量白介素-1β(il-1β)的释放的全血测定的结果。黑色棒条代表用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物，但无h3vκ2进行操作的测定；灰色棒条代表在h3vκ2存在下用0.1μg/ml nip-ova-igg复合物进行操作的测定。从左至右读取的4个棒条图代表：在24小时时的动物1；在48小时时的动物1；在24小时时的动物2；在48小时时的动物2。
117.图15显示在hfcrn转基因小鼠中，h3vk2对higg分解代谢的影响。将数据绘制成基于在48小时血液抽取之后2小时注射20mg/kg h3vk2之前，在48小时时小鼠血浆中hulys11的量的剩余hulys11(人igg1)百分比(
±
标准误差)。在h3vk2处理之后收集的第一数据点是在第3天期间在给药后6小时。
118.图16显示在hfcrn转基因小鼠中，h3vk2对多聚免疫复合物(ic)分解代谢的影响。研究根据qiao sw,pnas 2008加以设计。将结果绘制成在指示的时间点基于24小时基线的剩余ic百分比(
±
标准误差)。
119.图17显示使用人血液的全血测定的结果，在所述测定中，测量在nip-ova-igg复合物或nip-ova-ihh复合物存在下，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)和白介素-12(il-12)的释放。
120.图18显示使用人血液的另一全血测定的结果，在所述测定中，相对于非相关igg4和igg1对照来测试h3e8和h3vk2的影响。
121.图19显示使用人血液的另一全血测定的结果，所述测定使用呈f(ab’)2形式的测试和对照抗体。
具体实施方式
122.在一个方面，本文提供结合至fcrn的抗体和结合蛋白。更特定来说，抗体结合fcrn的重叠于抗体fc的结合位点的表位。因此，抗体调节fcrn介导的功能，诸如fcrn与iggfc的结合、保护igg以及免疫复合物(ic)的抗原呈递。在另一方面，提供一种包含编码fcrn抗体或其抗原结合部分的序列的经分离的核酸。在另一方面，提供一种适于向受试者施用的组合物，其包含fcrn抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
123.在一些实施方案中，本文公开的抗体抑制人igg与人fcrn的结合，但不抑制人血清白蛋白与人fcrn的结合。在一些实施方案中，本文公开的抗体使人igg的血清半寿期降低，但不使人血清白蛋白的血清半寿期降低。
124.在另一方面，提供治疗的方法。举例来说，通过使igg fc与fcrn的结合降低，本文阐述的抗体或其抗原结合部分可用于使循环igg的半寿期降低以及治疗或预防抗体介导的自体免疫病症。类似地，本文阐述的抗体或其抗原结合部分可用于使治疗性igg和包含igg fc区以达成稳定性的其它治疗剂的半寿期降低。所述方法包括向需要降低fcrn介导的igg保护作用的个体施用足以抑制fcrn与人igg的结合的量的fcrn抗体。
125.fcrn，也称为新生儿fc受体，是igg的一种整合膜fc受体。fcrn是膜结合的α链
(genbank登录号nm004107)和可溶性β2微球蛋白(β2m)(genbank登录号nm004048)的异二聚体，并且在结构上与i类mhc分子相关。fcrn通过以下方式来调控血清igg浓度：结合至经胞吞的igg并保护所述经胞吞的igg免遭在溶酶体区室中的降解，以及将igg转运至细胞表面以在中性细胞外ph下释放。通过这个机理，fcrn导致igg的血清半寿期较长久。因此，特异性阻断fcrn-igg相互作用可用于促进病原性igg抗体的降解。在抗原呈递细胞(apc)诸如树突细胞(dc)内，fcrn也结合多价igg免疫复合物(ic)，从而引导结合的ic进入抗原加工途径中以向t细胞呈递以及使t细胞介导的免疫响应活化。因此，特异性阻断fcrn-ic相互作用可用于抑制t细胞介导的免疫响应，包括使炎症性细胞因子诸如il-6、il-12、ifnγ或tnfα的产生降低。
126.提供源于特异性结合至fcrn，并且阻断fcrn与iggfc的结合，但基本上不结合至fcrn的白蛋白结合位点的鼠抗体的抗体。抗体在ph 7.4和ph 6.0下在对fcrn的结合亲和力方面具有实质性改善，因此在生理和酸性条件下阻断igg fc与fcrn的结合。抗体可用于治疗自体免疫和炎症性疾病。抗体包含一个或多个亲和力成熟的cdr。亲和力成熟的程序提供历经关键ph范围6.0至7.4以高亲和力结合至fcrn的抗体。因此，一旦内化至内体的酸性环境中，抗体即有效阻断iggfc的结合。
127.根据某些实施方案，改善的抗体的特征也在于具有人源化框架以达成免疫原性降低。在某些实施方案中，fcrn特异性抗体的cdr位于从人抗体获得的框架中。在其它实施方案中，fcrn特异性抗体的cdr位于是两个或更多个人抗体的复合物的框架中。在其它实施方案中，用人抗体的框架残基替换fcrn特异性抗体的表面暴露框架残基。在一优选实施方案中，选择框架以使被预测历经广泛人口范围是t细胞表位的氨基酸序列的存在最小化。cdr也可位于与人恒定区连接的鼠框架中(即嵌合抗体)。
128.如本文进一步所述，对于亲和力成熟的，使重链和轻链可变结构域cdr3区突变，并且以scfv形式在ph 6.0和ph 7.4下筛选。使用寡核苷酸序列kncnncnncnncsvcnwcygg(seq id no:71)在氨基酸位置98-103(cdr3h的a.a.98-102和fw4的a.a.103)处将氨基酸序列变化引入重链cdr3h区中，所述寡核苷酸如下在各位置处提供所选氨基酸：a.a.98：a、c、d、f、g、s、v、y；a.a.99：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.100：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.100a：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.101：a、d、g、h、p、r；a.a.102：d、f、h、i、l、n、v、y；a.a.103：r、w。使用寡核苷酸序列tgtmrsvmgtvskrsrrcwmcyycbwcrycttc(seq id no:72)在氨基酸位置89-97处将氨基酸序列变化引入轻链cdr3l区中，所述寡核苷酸序列如下在各位置处提供所选氨基酸：a.a.88：c；a.a.89：h、k、n、q、r、s；a.a.90：a、e、k、p、q、t；a.a.91：c、s、w、y；a.a.92：c、d、e、g、w、y；a.a.93：d、g、n、s；a.a.94：n、s、t、y；a.a.95：f、l、p、s；a.a.96：d、f、h、l、v、y；a.a.97：a、i、t、v。
129.如以下实施例中所示，这导致赋予在fcrn结合亲和力方面的实质性改善的若干cdr3h变体。相较于引入cdr3h文库中的可变性对所得变体的检查指示氨基酸保持相对无变化所处的某些位置和可引入变化并导致结合改善所处的其它位置。因此，提供一种结合至fcrn的抗体或其结合部分，其中重链包含cdr3h，所述cdr3h包含可被改变的某些氨基酸。在一个所述实施方案中，cdr3h包含vx1ppx2x3，其中x1是a、r或s；x2是g或r；并且x3是i、l或v(seq id no:73)。在另一所述实施方案中，重链cdr3h是sttvx1ppx2x3，其中x1是a、r或s；x2是g或r；并且x3是i、l或v(seq id no:74)。在另一所述实施方案中，重链cdr3h包含vx1ppx2x3，
其中x1是a、r或s；x2是a、g、h、p或r；并且x3是h、i、l或v(seq id no:75)。在另一所述实施方案中，重链cdr3h是sttvx1ppx2x3，其中x1是a、r或s；x2是a、g、h、p或r；并且x3是h、i、l或v(seq id no:76)。在另一所述实施方案中，重链cdr3h包含vx1x2x3x4x5，其中x1是a、h、r或s；x2是a或p；x3是a、d或p；x4是a、d、g、h、p或r；x5是f、h、i、l、n或v；并且x2和x3中的至少一者是p(seq id no:77)。在另一所述实施方案中，重链cdr3h是sttvx1x2x3x4x5，其中x1是a、h、r或s；x2是a或p；x3是a、d或p；x4是a、d、g、h、p或r；x5是f、h、i、l、n或v；并且x2和x3中的至少一者是p(seq id no:78)。
130.在某些实施方案中，cdr3h是sttvspadf(seq id no:27)、sttvspppi(seq id no:29)、sttvsppah(seq id no:31)或sttvapprl(seq id no:33)。在某些实施方案中，cdr3h是sttvhpdrn(seq id no:35)、sttvsppal(seq id no:37)或sttvhpdhn(seq id no:39)、sttvspphl(seq id no:41)。在某些实施方案中，cdr3h是sttvapppl(seq id no:43)、sttvspphl(seq id no:45)、sttvappgh(seq id no:47)或sttvspprv(seq id no:49)。在某些实施方案中，cdr3h是sttvspppl(seq id no:51)、sttvappah(seq id no:53)、sttvrppgi(seq id no:55)或sttvsapgv(seq id no:57)。在这些实施方案中的某些中，重链可变结构域的在位置103处的氨基酸是色氨酸。在这些实施方案中的某些中，重链可变结构域的在位置103处的氨基酸是精氨酸。
131.在其中cdr3h如上阐述的某些实施方案中，cdr1h由seq id no:2阐述，并且cdr2h由seq id no:4阐述。
132.在鉴于已知抗体结构考虑鼠抗体的框架序列的情况下产生若干重链和轻链框架。人源化框架由人可变结构域序列装配，着眼于使免疫原性t细胞表位最小化。例示4种人源化重链框架和4种所述轻链人源化框架：vh1(seq id no:12)；vh2(seq id no:14)；vh3(seq id no:16)；vh4(seq id no:18)；vκ1(seq id no:20)；vκ2(seq id no:22)；vκ3(seq id no:24)；和vκ5(seq id no:26)。这些例示人源化框架的相应寡核苷酸序列由以下阐述：seq id no:11(vh1)；seq id no:13(vh2)；seq id no:15(vh3)；seq id no:17(vh4)；seq id no:19(vκ1)；seq id no:21(vκ2)；seq id no:23(vκ3)；和seq id no:25(vκ5)。在以seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16和seq id no:18提供的重链可变结构域序列中，cdr1h、cdr2h和cdr3h氨基酸表示为”xaa”。cdr1h和cdr2h的氨基酸序列分别如以seq id no:2和seq id no:4所阐述。cdr1h的相应寡核苷酸序列由seq id no:1阐述，并且cdr2h的相应寡核苷酸序列由seq id no:3阐述。在以seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24和seq id no:26提供的轻链可变结构域序列中，在所有位置处都指定特定氨基酸。cdr1l的氨基酸序列如以seq id no:6所阐述，cdr2l的氨基酸序列如以seq id no:8所阐述，并且cdr3l的氨基酸序列如以seq id no:10所阐述。相应寡核苷酸序列如由以下所阐述：seq id no:5(cdr1l)；seq id no:7(cdr2l)；和seq id no:9(cdr3l)。重链和轻链中fw和cdr的位置也将分别根据图1和图2显而易知。
133.表1提供亲和力成熟的人源化fcrn结合抗体重链和轻链可变结构域以及cdr的非限制性实例。如本文所述，可变结构域被选择以达成在ph 6.0和ph 7.4下结合改善，并且显示相对于亲本鼠抗体，结合得以实质上改善。
[0134][0135][0136]
可使亲和力成熟的重链cdr3与重链cdr1(例如具有seq id no:2的cdr1)和/或重链cdr2(例如具有seq id no:4的cdr2)组合。可使亲和力成熟的轻链cdr3与轻链cdr1(例如具有seq id no:6的cdr1)和/或轻链cdr2(例如具有seq id no:8的cdr2)组合。
[0137]
如以下实施例中所公开，本文例示的各种抗体可变结构域基于鼠抗体，并且含有亲和力成熟的cdr，并且某些实施方案的特征也在于具有人源化fw。将显而易知的是表1中公开的重链和轻链可变结构域被设计为是可相容的。因此，表1中公开的任何重链可变结构域都可与任何公开轻链共表达以产生功能性抗fcrn抗体。此外，亲和力成熟的重链可变结构域可与本文公开的人源化非亲和力成熟的轻链可变结构域配对，并且亲和力成熟的轻链可变结构域可与人源化非亲和力成熟的重链可变结构域配对。在一优选实施方案中，亲和力成熟的重链可变结构域可与人源化轻链可变结构域配对。此外，表1阐述vh1中的重链cdr以及vκ1和vκ2中的轻链cdr。重链cdr也可与例如本文公开的框架vh2、vh3和vh4相容(参见图
1)。轻链cdr也可与例如本文公开的框架vκ3和vκ5相容(参见图2)。如本文所用，标号vh1、vh2、vh3、vh4、vκ1、vκ2、vκ3、vκ5是指本文公开的示例性人源化框架，并且不是提及人种系基因家族。将显而易知的是本文公开的任何重链或轻链可变结构域都可与互补可变结构域的文库组合并筛选以鉴定具有改善或改变的结合特征的新抗体。
[0138]
本文提供与表1中公开的那些类似但不同一的抗体和抗原结合部分。抗体可具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加。在某些实施方案中，fcrn抗体包含与表1中阐述的重链可变结构域至少85％、至少90％或至少95％同一的重链可变结构域。在某些实施方案中，fcrn抗体包含与表1中阐述的轻链可变结构域至少85％、至少90％或至少95％同一的轻链可变结构域。在某些实施方案中，抗体包含表1中阐述的重链可变结构域或与表1中阐述的重链可变结构域至少85％、至少90％或至少95％同一的重链可变结构域，以及表1中阐述的轻链可变结构域或与表1中阐述的轻链可变结构域至少85％、至少90％或至少95％同一的轻链可变结构域。
[0139]
在一实施方案中，fcrn抗体含有重链可变结构域，其包含表1中阐述的cdr序列，即cdr1h、cdr2h和cdr3h，以及vh1、vh2、vh3或vh4的框架(即fw1、fw2，fw3和fw4)或与vh1、vh2、vh3或vh4的框架至少85％、90％或95％同一的框架。在一实施方案中，fcrn抗体含有重链可变结构域，其包含表1中阐述的cdr序列以及框架以致重链可变结构域序列与表1中阐述的可变结构域至少85％或至少90％或至少95％同一。
[0140]
在一实施方案中，fcrn抗体含有轻链可变结构域，其包含表1中阐述的cdr序列，即cdr1l、cdr2l和cdr3l，以及vκ1、vκ2、vκ3或vκ5的框架(即fw1、fw2，fw3和fw4)或与vκ1、vκ2、vκ3或vκ5的框架至少85％、90％或95％同一的框架。在一实施方案中，fcrn抗体含有轻链可变结构域，其包含表1中阐述的cdr序列以及框架以致轻链可变结构域序列与表1中阐述的轻链可变结构域至少85％或至少90％或至少95％同一。
[0141]
在一实施方案中，fcrn抗体含有重链可变结构域，其包含表1中阐述的cdr序列，即cdr1h、cdr2h和cdr3h，以及vh1、vh2、vh3或vh4的框架(即fw1、fw2，fw3和fw4)或与vh1、vh2、vh3或vh4的框架至少85％、90％或95％同一的框架，以及轻链可变结构域，其包含vκ1、vκ2、vκ3或vκ5或与vκ1、vκ2、vκ3或vκ5至少85％、90％或95％同一的序列。
[0142]“同一性”是指在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和各空位的长度的情况下由两个氨基酸或核酸序列共有的相同位置的数目或百分比。
[0143]
当氨基酸序列被描述为与另一氨基酸序列至少85％或至少90％或至少95％同一时，氨基酸序列的差异可在于保守性取代(包括其中所有取代都是保守性取代)。
[0144]
在一些情况下，氨基酸取代可通过选择在它们对维持(a)在取代的区域中肽骨架的结构，(b)在靶标位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的主体的作用方面不显著不同的取代来进行。举例来说，天然存在的残基可基于侧链性质被分成各组；(1)疏水性氨基酸(甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水性氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链定向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；和(6)芳族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。在这些组内进行的取代可被视为保守性取代。取代的实例包括不限于缬氨酸取代丙氨酸、赖氨酸取代精氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、谷氨酸取代天冬氨酸、丝氨酸取代半胱氨酸、天冬酰胺取代谷氨酰胺、天冬氨酸取代谷氨酸、脯氨酸取代甘氨
至10
12
升/摩尔、107至10
12
升/摩尔、108至10
12
升/摩尔、109至10
12
升/摩尔、10
10
至10
12
升/摩尔或10
11
至10
12
升/摩尔的kd结合至人fcrn的fc结合部分。在其它实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分以105至10
11
升/摩尔、106至10
11
升/摩尔、107至10
11
升/摩尔、108至10
11
升/摩尔、109至10
11
升/摩尔、或10
10
至10
11
升/摩尔的kd结合至人fcrn的fc结合部分。在其它实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分以105至10
10
升/摩尔、106至10
10
升/摩尔、107至10
10
升/摩尔、108至10
10
升/摩尔、或109至10
10
升/摩尔的kd结合至人fcrn的fc结合部分。在其它实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分以105至108升/摩尔、106至108升/摩尔、或107至108升/摩尔的kd结合至人fcrn的fc结合部分。
[0152]
为使在向人施用时的免疫原性最小化，本文阐述的抗体或其抗原结合部分优选包括人恒定结构域。因此，抗体可为任何同种型或亚型，包括但不限于igg1、igg
2a
、igg
2b
、igg3、igg4、igm、iga、igd或ige。可选择抗体类别以使效应物功能最优化(例如以增加或降低补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc))。在某些实施方案中，修饰恒定区(即ch1、ch2、ch3和/或铰链区)例如以增加或降低与fc受体的结合。在某些实施方案中，恒定结构域被修饰以促进或稳定化重链-重链结合。在某些实施方案中，抗体是igg4抗体，并且重链的铰链区通过使在位置241处的丝氨酸变为脯氨酸，从而导致血清半寿期延长来修饰(angal等,1993,mol.immunol.30:105-108)。在某些实施方案中，抗体是igg4抗体，并且重链的在位置478处的c末端赖氨酸被缺失。在一些实施方案中，igg4抗体具有s241p修饰，并且缺乏c末端赖氨酸。
[0153]
在某些实施方案中，提供fcrn结合抗体片段。fv是含有完全重链和轻链可变结构域的最小片段，包括全部6个高变环(cdr)。在缺乏恒定结构域下，可变结构域以非共价方式缔合。重链和轻链可使用允许vh结构域和v
l
结构域缔合以形成抗原结合位点的连接子连接成单一多肽链(“单链fv”或“scfv”)。参见例如bird等,1988,science242:423以及huston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879。在一实施方案中，连接子是(gly-gly-gly-gly-ser)3。因为scfv片段缺乏完整抗体的恒定结构域，所以它们显著小于完整抗体。scfv片段也无正常重链恒定结构域与可在某些实施方案中所需的其它生物分子的相互作用。
[0154]
如本文所用的“抗体”是指单体以及多聚体。可使用完整抗体(包括多聚体)或携带抗体的抗原结合区的抗体片段。抗原结合区包括不限于fv、scfv、fab、fab’和f(ab’)2片段。用于制备抗体片段的方法在本领域中是熟知的。举例来说，缺乏重链铰链区的单价fab片段可通过用木瓜蛋白酶进行蛋白水解消化来从完整免疫球蛋白制备。保留重链铰链区的二价f(ab’)2片段可通过用胃蛋白酶进行蛋白水解消化来制备。
[0155]
也可使用抗体的含有vh、v
l
以及任选c
l
、ch1或其它恒定结构域的片段。所述片段也可重组产生。许多其它适用抗原结合抗体片段在本领域中是已知的，并且包括不限于双抗体、三抗体、单结构域抗体以及其它单价和多价形式。
[0156]
进一步提供多价抗原结合蛋白，其可呈(不限于)抗体、其抗原结合片段、以及包含抗体的抗原结合部分的全部或一部分的蛋白质形式。多价抗原结合蛋白可为单特异性、双特异性或多特异性的。术语特异性是指特定分子可与其结合的不同类型的抗原决定簇的数目。如果免疫球蛋白分子仅结合至一种类型的抗原决定簇，那么所述免疫球蛋白分子是单特异性的。如果免疫球蛋白分子结合至不同类型的抗原决定簇，那么所述免疫球蛋白分子是多特异性的。
[0157]
在一个实施方案中，多价单链抗体包括可变轻链片段连接于可变重链片段(类似于scfv)，其由另一肽连接子进一步连接于至少一个其它抗原结合结构域。通常，肽连接子由约15个氨基酸残基组成。在一优选实施方案中，v
l
结构域和vh结构域的数目相等。举例来说，二价单链抗体可为如下表示：v
l-l
1-vh–
l
2-v
l-l
3-vh或v
l-l
1-v
h-l
2-vh–
l
3-v
l
或vh–
l
1-v
l-l
2-vh–
l
3-v
l
或v
h-l
l-v
l-l
2-vl
–
l
3-vh。三价或价数更大的多价单链抗体具有一个或多个抗体片段由额外肽连接子接合于二价单链抗体。三价单链抗体的一个实例是：v
l-l
1-v
h-l
2-v
l-l
i-v
h-l
2-v
l-l
i-vh。
[0158]
可使两个单链抗体组合以形成双抗体，也称为二价二聚体。参见例如欧洲专利申请0404097或hollinger等,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444。双抗体具有两条链。双抗体的各链包括vh结构域由具有约5-10个氨基酸残基的短连接子例如(gly-gly-gly-gly-ser)、(gly-gly-gly-gly-ser)2连接于v
l
结构域。所述连接子足够短以防止在同一链上的结构域之间的链内配对，由此驱动不同链上互补结构域之间的链间配对，并且重新产生两个抗原结合位点。双抗体结构是紧凑的，其中抗原结合位点在分子的对立端。
[0159]
可使vh和v
l
框架序列变体和亲和力成熟的抗体经受临床前离体测定以评估潜在免疫原性。一种所述测定是episcreen
tm
，其提供一种用于通过对针对蛋白质治疗剂的t细胞响应进行定量来预测t细胞免疫原性的有效技术。测定使用基于ii类mhc单倍型加以仔细选择的一组供血者以最佳代表在世界人口中表达的hla-dr同种异型的数目和频率。测定提供一种可采用其来在t细胞响应的幅度与频率两方面评估完整蛋白质的免疫原性的方法(jones等,j interferon cytokine res.200424(9):560-72；jones等,j thromb haemost.20053(5):991-1000)。
[0160]
与本文公开的抗体竞争或交叉阻断本文公开的抗体与fcrn的结合，或自身由本文公开的抗体交叉阻断而免于结合fcrn的抗体可用于阻断本文公开的fcrn活性的方法中。在一些情况下，这些竞争性抗体、交叉阻断性抗体或经交叉阻断的抗体结合至fcrn的与由本文所述的抗体结合的表位接界和/或重叠的表位。在一些情况下，这些竞争性抗体、交叉阻断性抗体或经交叉阻断的抗体是结合至fcrn的与由本文所述的抗体结合的表位相同的表位的嵌合抗体、完全人抗体或人源化抗体。
[0161]
竞争性抗体、交叉阻断性抗体和经交叉阻断的抗体可使用本领域中已知的任何适合方法来鉴定，包括竞争elisa或测定，其中竞争性或交叉阻断性抗体与人fcrn的结合阻止本文公开的抗体的结合，或反之亦然。
[0162]
在某些实施方案中，竞争性抗体或交叉阻断性抗体是阻断人igg与人fcrn的结合，以及与具有选自由seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56和seq id no:58组成的组的重链序列和选自由seq id no:20、seq id no:22、seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67和seq id no:70组成的组的轻链序列的抗体竞争或交叉阻断所述抗体的结合的抗体。在一些实施方案中，竞争或交叉阻断大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
[0163]
在某些实施方案中，竞争性抗体或交叉阻断性抗体是阻断人igg与人fcrn的结合，以及与具有seq id no:56的重链序列和seq id no:22的轻链序列的抗体竞争或交叉阻断所述抗体的结合的抗体。在一些实施方案中，竞争或交叉阻断大于80％、大于85％、大于
90％或大于95％。
[0164]
在某些实施方案中，竞争性抗体或经交叉阻断的抗体是阻断人igg与人fcrn的结合，以及其与fcrn的结合由具有选自由seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56和seq id no:58组成的组的重链序列和选自由seq id no:20、seq id no:22、seq id no:61、seq id no:64、seq id no:67和seq id no:70组成的组的轻链序列的抗体竞争或交叉阻断的抗体。在一些实施方案中，竞争性抗体或经交叉阻断的抗体被竞争或交叉阻断达到大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
[0165]
在某些实施方案中，竞争性抗体或经交叉阻断的抗体是阻断人igg与人fcrn的结合，以及其与fcrn的结合由具有seq id no:56的重链序列和seq id no:22的轻链序列的抗体竞争或交叉阻断的抗体。在一些实施方案中，竞争性抗体或经交叉阻断的抗体被竞争或交叉阻断达到大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
[0166]
在一些实施方案中，竞争性抗体、交叉阻断性抗体或经交叉阻断的抗体是嵌合的、完全人，或是人源化的。在一些实施方案中，竞争性抗体、交叉阻断性抗体或经交叉阻断的抗体以105至10
11
升/摩尔、106至10
11
升/摩尔、107至10
11
升/摩尔、108至10
11
升/摩尔、109至10
11
升/摩尔、或10
10
至10
11
升/摩尔的亲和力结合至人fcrn的fc结合位点。
[0167]
本文也提供编码抗fcrn抗体及其功能性片段的核酸、载体、宿主细胞和表达系统。编码抗fcrn抗体及其功能性片段的核酸可为例如包含单独或呈组合形式的任何那些多核苷酸的dna、cdna、rna、合成产生的dna或rna、或重组产生的嵌合核酸分子。举例来说，提供一种表达载体，其含有编码本文所述的抗fcrn抗体的多核苷酸序列可操作地连接于适于在真核和/或原核宿主细胞中的表达的表达控制序列。已开发多种表达载体以在原核细胞诸如细菌中高效合成抗体和片段，并且已开发真核系统，包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统。载体可包含染色体、非染色体和合成dna序列的区段。
[0168]
可使用任何适合表达载体。举例来说，原核克隆载体包括来自大肠杆菌(e.coli)的质粒，诸如cole1、pcr1、pbr322、pmb9、puc、pksm和rp4。原核载体也包括诸如m13和其它丝状单链dna噬菌体的噬菌体dna的衍生物。可用于酵母中的载体的一实例是2μ质粒。适于在哺乳动物细胞中表达的载体包括sv40、腺病毒、逆转录病毒源性dna序列的熟知衍生物和由功能性哺乳动物载体(诸如上述那些)和功能性质粒(例如plenti6.3/v5-pt-rex
tm-pgene/v5-hispgene/v5-(life technologies,norwalk,ct))的组合获得的穿梭载体。
[0169]
额外真核表达载体在本领域中是已知的(例如p.j.southern和p.berg,j.mol.appl.genet.,1,327-341(1982)；subramani等,mol.cell.biol.,1:854-864(1981)；kaufmann和sharp,"amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene,"j.mol.biol.159,601-621(1982)；kaufmann和sharp,mol.cell.biol.159,601-664(1982)；scahill等,"expression and characterization of the product of a human immune interferon dna gene in chinese hamster ovary cells,"proc.nat'l acad.sci.usa 80,4654-4659(1983)；urlaub和chasin,proc.nat'l acad.sci.usa 77,4216-4220,(1980))。
[0170]
表达载体可含有至少一个操作性地连接于待表达的dna序列或片段的表达控制序列。控制序列被插入载体中以控制和调控克隆的dna序列的表达。适用表达控制序列的实例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶例如pho5的启动子、酵母α交配因子的启动子、以及源于巨细胞病毒、多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子例如sv40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞和它们的病毒的基因的表达的其它序列或其组合。可使用的其它表达控制序列包括来自中国仓鼠延伸因子-1α(chef1)基因的dna调控序列(running deer和allison,2004,biotechnol.prog.20:880-889；美国专利号5,888,809)。
[0171]
也提供含有先前所述的表达载体的重组宿主细胞。本文阐述的抗体或其抗原结合部分可除在杂交瘤中以外而在细胞系中表达。包含编码如本文所述的多肽的序列的核酸可用于转化适合哺乳动物宿主细胞。
[0172]
基于高表达水平、组成性表达目标蛋白质以及受宿主蛋白质的污染最小来选择特别优选的细胞系。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是熟知的，并且包括许多永生化细胞系，诸如但不限于ns0细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、幼小仓鼠肾(bhk)细胞和许多其它细胞系。在一些实施方案中，细胞是骨髓瘤细胞例如sp2/0，其可被转染，并且培养生长或在小鼠的可从腹水液回收高浓度的igg所处的腹膜腔中生长。适合额外真核细胞包括酵母和其它真菌。适用原核宿主包括例如大肠杆菌诸如大肠杆菌sg-936、大肠杆菌hb 101、大肠杆菌w3110、大肠杆菌x1776、大肠杆菌x2282、大肠杆菌dhi和大肠杆菌mrcl，假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和链霉菌属(streptomyces)。
[0173]
通过在容许表达抗体或其片段的条件下培养细胞，以及从宿主细胞或包围宿主细胞的培养基纯化抗体或其片段，这些本发明重组宿主细胞可用于产生抗体或其抗原结合部分。因此，在一个实施方案中，提供一种用于产生能够结合fcrn的fc结合区的抗体的方法，所述方法包括：(a)培养如上所述的宿主细胞；和(b)从所述宿主细胞或所述宿主细胞的培养基分离所述抗体。
[0174]
可使经转化宿主在发酵罐中生长，并且根据本领域中已知的技术加以培养。一旦达到抗体的所需表达水平，即可根据本领域的标准程序使抗体纯化，所述程序包括硫酸铵沉淀、在亲和柱上纯化、柱色谱法、凝胶电泳等。对于在本文所述的治疗方法中使用，优选的是抗体被纯化达到至少90％、95％、98％或99％纯度。
[0175]
可通过在目标抗体编码基因的5'末端插入信号或分泌前导肽编码序列(参见shokri等,appl microbiol biotechnol.60(6):654-64(2003)，nielsen等,prot.eng.10:1-6(1997)以及von heinje等,nucl.acids res.14:4683-4690(1986))来有助于达成在重组宿主细胞中表达的抗体或片段进行分泌的目标。这些分泌前导肽元件可源于原核或真核序列。因此适合的是，使用分泌前导肽，其中接合于多肽的n末端的氨基酸引导所述多肽移动出宿主细胞胞质液，并且分泌至培养基中。
[0176]
可使抗体或其抗原结合部分融合于额外氨基酸残基。所述氨基酸残基可为肽标签，也许用以有助于分离。也涵盖用于使抗体向特定器官或组织归巢的其它氨基酸残基。
[0177]
在一些实施方案中，使抗体或其抗原结合部分缀合于一个或多个对抗体或其抗原
结合部分提供某一合乎需要的性质(例如增加的血清半寿期)的效应物分子。在一特定实施方案中，使抗体或其抗原结合部分缀合于聚乙二醇(peg)。可使peg连接于任何氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如游离氨基、亚氨基、硫醇基团、羟基或羧基。使peg连接于抗体的方法在本领域中是已知的，并且可加以采用。参见例如欧洲专利申请ep 0948544；欧洲专利申请ep1090037；“poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnical and biomedical applications,”1992,j.milton harris(编),plenum press,new york；“poly(ethyleneglycol)chemistry and biological applications,”1997,j.milton harris和s.zalipsky(编),american chemical society,washington dc；“bioconjugation protein coupling techniques for the biomedical sciences,”1998,m.aslam和a.dent,grove publishers,new york；或chapman,a.2002,advanced drug delivery reviews 2002,54:531-545。
[0178]
在另一实施方案中，通过在转基因动物中表达编码抗体的核酸，以使抗体被表达并可被回收来制备如本文阐述的抗体或其抗原结合部分。举例来说，可以有助于回收和纯化的组织特异性方式表达抗体。在一个所述实施方案中，抗体在乳腺中表达以在泌乳期间进行分泌。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。
[0179]
本文提供鉴定在酸性ph与生理ph两者下均结合fcrn的抗体的方法。方法包括两个或更多个在酸性ph(例如ph 5.0-6.6、ph 5.8-6.4、ph 6.0-6.2、或ph 6.0)下进行的筛选步骤。两个或更多个酸性筛选步骤与在生理ph(例如ph 6.8-8.2、ph 6.8-7.6、ph 7,2-7.4、或ph 7.4)下进行的筛选步骤交替。
[0180]
举例来说，所述方法的一个实施方案包括：
[0181]
(a)使一批候选抗体与fcrn或其一部分在ph 5.8-6.4下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体；
[0182]
(b)使步骤(a)的经分离抗体与fcrn或其一部分在ph 6.8-7.6下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体；
[0183]
(c)使步骤(b)的经分离抗体与fcrn或其一部分在ph 5.8-6.4下接触以及分离结合至fcrn或其一部分的抗体。
[0184]
另一实施方案包括：
[0185]
(a)提供一批候选fcrn结合抗体：
[0186]
(b)使所述一批候选fcrn结合抗体与fcrn或其一部分在ph 6.0下在使得在所述fcrn或其一部分与至少一些所述候选fcrn结合抗体之间形成复合物的条件下接触；
[0187]
(c)分离所述复合物；
[0188]
(d)从经分离复合物分离所述候选fcrn结合抗体；
[0189]
(e)使来自步骤(d)的经分离候选fcrn结合抗体与fcrn或其一部分在ph 7.4下在使得在所述fcrn或其一部分与至少一些所述候选fcrn结合抗体之间形成复合物的条件下接触；
[0190]
(f)分离在步骤(e)中形成的所述复合物；
[0191]
(g)从步骤(f)的经分离复合物分离所述候选fcrn结合抗体；
[0192]
(h)使来自步骤(g)的经分离候选fcrn结合抗体与fcrn或其一部分在ph 6.0下在使得在所述fcrn或其一部分与至少一些所述候选fcrn结合抗体之间形成复合物的条件下
接触；
[0193]
(i)分离在步骤(h)中形成的所述复合物；
[0194]
(j)从步骤(i)的经分离复合物分离所述候选fcrn结合抗体以获得在酸性ph与生理ph两者下均结合fcrn的抗体。
[0195]
在一些实施方案中，所述一批候选fcrn结合抗体可为抗体或其部分的文库(例如展示在噬菌体上的scfv的文库)。
[0196]
在一些实施方案中，在各接触步骤下，使fcrn或其一部分的浓度降低。举例来说，步骤(b)可在25nm的浓度下进行，步骤(e)可在2.5nm的浓度下进行，并且步骤(h)可在0.25nm的浓度下进行。
[0197]
在一些实施方案中，可使fcrn或其一部分连接于固体载体例如磁珠。在所述实施方案中，分离步骤可仅为使抗体与连接于固体载体的fcrn或其一部分结合，例如当固体载体是色谱柱时。在一些实施方案中，可使fcrn或其一部分连接于有助于分离fcrn或其一部分与抗体之间的复合物的部分。举例来说，可使fcrn或其一部分连接于生物素。
[0198]
如本文阐述的抗体或其抗原结合部分的物理和功能性质可通过常规程序来测定。举例来说，抗体阻断fcrn活性的能力可通过许多方法来评估。一种方式在于显示与已知结合至fcrn的fc结合区的抗体竞争结合。另一方式在于显示保护血清ig免遭分解代谢。参见例如akiles等,2007,j.immunol.179:4580-88。另一方式在于在测试剂存在下测量fcrn使抗体再循环或胞吞转运的能力。举例来说，claypool等,2002,j.biol.chem.277:28038-50使用经转染以表达人fcrn和β2m的马丁-达比(madin-darby)犬肾(mdck)细胞来显示对igg的胞吞转运。内源性表达fcrn的其它适合极化上皮细胞系包括人肠上皮细胞系t84和caco-2。在实施例中，提供一种用以测定如本文阐述的抗体或其抗原结合部分结合至fcrn，以及抑制由ii类mhc达成的抗原呈递和由i类mhc达成的交叉呈递的能力的测定方法。
[0199]
本文提供一种用以测定抗fcrn抗体调节对免疫复合物(ic)的加工的能力的基于全血的测定。fcrn起结合单体igg，并且使它从分解代谢转向，由此延长它的血清半寿期的作用。在另一方面，多聚igg或抗原-抗体ic与fcrn相互作用以使细胞因子产生活化，并且将ic引导至抗原呈递途径中。fcrn的主要作用是调控细胞介导的免疫功能，推测是通过摄取、加工和呈递含有igg的ic。与fcrn生物学的这个方面相关的细胞因子产生活化允许开发用以测定抗fcrn抗体调节(例如阻断或减弱)这个fcrn-ic相互作用的能力的基于全血的测定。
[0200]
在一个实施方案中，测定包括从哺乳动物(例如人或非人灵长类动物)获得全血，以及在存在或不存在测试抗体或其抗原结合片段下将预先形成的免疫复合物添加至所述全血中以刺激细胞因子的产生，并且测量适合细胞因子的产生。如果相较于在不存在测试抗体或其抗原结合片段下测量的量，测试抗体或其抗原结合片段能够阻断或减弱测量的细胞因子的量，那么测试抗体或其抗原结合片段被视为能够干扰fcrn与ic之间的相互作用。作为用以确保测量的细胞因子是fcrn与ic之间的相互作用的结果的对照，测定可用其中igg不能结合fcrn的ic进行操作。所述igg是已知的(参见例如qiao等,2008,proc.natl.acad.sci.usa 105:9337
–
9342)。用所述igg操作测定应不导致细胞因子产生，或导致极其少许细胞因子产生。
[0201]
在另一实施方案中，测定也可用于预测哪些患者可能受益于用抗fcrn抗体或其抗
原结合片段进行的疗法。在这个形式的测定中，测定用已知有效阻断或减弱fcrn与ic之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段进行操作。与在不存在已知抗fcrn抗体或其抗原结合片段下操作测定相对比，在用已知抗fcrn抗体或其抗原结合片段操作测定后显示细胞因子产生显著降低的那些患者将比显示细胞因子产生较小降低或不降低的那些患者更可能受益于用抗fcrn抗体或其抗原结合片段进行的疗法。
[0202]
上述测定的另一形式涉及在获得受试者或患者的血液以用于全血测定中之前向所述受试者或所述患者施用测试抗体或其抗原结合片段或已知抗fcrn抗体或其抗原结合片段。在这个形式的测定中，不将测试抗体或其抗原结合片段或已知抗fcrn抗体或其抗原结合片段添加至全血中，因为测试抗体或其抗原结合片段或已知抗fcrn抗体或其抗原结合片段将已存在于血液中。
[0203]
基于全血的测定的另一用途在于监测患者对抗fcrn疗法的响应。在这个实施方案中，用已持续预定时期接受抗fcrn抗体或其抗原结合片段的患者的血液操作测定。将预先形成的ic添加至血液中，并且测量产生的细胞因子的量。将那个量与已从同一患者的在开始用抗fcrn抗体或其抗原结合片段治疗之前获得的血液产生的量进行比较。如果当在开始治疗之后操作测定时在测定中产生的细胞因子的量较小，那么这指示患者对疗法起响应。如果相较于在已持续预定时期进行治疗之后获取的血液，对于来自患者的在开始治疗之前获取的血液观察到细胞因子产生量无差值或不显著差值，那么这指示患者不对疗法显著起响应。在其中有差值被观察到的那些情况下，差值的幅度是对响应的幅度的指示
–
差值越大，患者对抗fcrn疗法起响应的程度越大。这个形式的测定将不涉及将抗fcrn抗体或其抗原结合片段添加至血液中。
[0204]
本文提供一种用于确定测试抗体或其抗原结合片段是否阻断或减弱fcrn与免疫复合物之间的相互作用的方法，其包括：
[0205]
(a)从哺乳动物获得全血；
[0206]
(b)将免疫复合物添加至所述全血的第一部分中；
[0207]
(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
[0208]
(d)将测试抗体或其抗原结合片段添加至所述全血的第二部分中；
[0209]
(e)在添加所述测试抗体或其抗原结合片段之后或同时将所述免疫复合物添加至所述全血的所述第二部分中；
[0210]
(f)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血的所述第二部分中所述细胞因子的量以获得所述细胞因子的第二量；和
[0211]
(g)测定所述细胞因子的所述第一量与所述细胞因子的所述第二量之间的差值；
[0212]
其中如果所述细胞因子的所述第一量大于所述细胞因子的所述第二量，那么所述测试抗体或其抗原结合片段阻断或减弱fcrn与免疫复合物之间的相互作用。
[0213]
本文提供一种用于测定患者对抗fcrn疗法的预期响应水平的方法，其包括：
[0214]
(a)在开始所述抗fcrn疗法之前从所述患者获得全血；
[0215]
(b)将免疫复合物添加至所述全血的第一部分中；
[0216]
(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
[0217]
(d)将已知会阻断或减弱fcrn与免疫复合物之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段添加至所述全血的第二部分中；
[0218]
(e)在添加所述抗体或其抗原结合片段之后或同时将所述免疫复合物添加至所述全血的所述第二部分中；
[0219]
(f)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血的所述第二部分中所述细胞因子的量以获得所述细胞因子的第二量；和
[0220]
(g)测定所述细胞因子的所述第一量与所述细胞因子的所述第二量之间的差值。
[0221]
当第一量大于第二量时，细胞因子的第一量与细胞因子的第二量之间的差值的幅度指示预期患者对抗fcrn疗法起响应所处的程度。视这个预期响应程度而定，可选择患者以接受抗fcrn疗法。
[0222]
本文提供一种用于监测患者对抗fcrn疗法的响应的方法，其包括：
[0223]
(a)在开始所述抗fcrn疗法之前从所述患者获得全血；
[0224]
(b)将免疫复合物添加至所述全血中；
[0225]
(c)在添加所述免疫复合物之后测量所述全血中细胞因子的量以获得所述细胞因子的第一量；
[0226]
(d)在开始所述抗fcrn疗法之后从所述患者获得全血；
[0227]
(e)将所述免疫复合物添加至步骤(d)的所述全血中；
[0228]
(f)在步骤(e)中添加所述免疫复合物之后测量所述全血中所述细胞因子的量以获得所述细胞因子的第二量；和
[0229]
(g)测定所述细胞因子的所述第一量与所述细胞因子的所述第二量之间的差值。
[0230]
当第一量大于第二量时，细胞因子的第一量与细胞因子的第二量之间的差值的幅度指示患者对抗fcrn疗法起响应所处的程度。基于观察的响应程度，可调整抗fcrn疗法。举例来说，如果第一量仅略微大于第二量，那么可使抗fcrn疗法增强。如果抗fcrn疗法是本文所述的抗体，那么可使所述抗体的施用频率增加和/或可使施用剂量增加。在调整疗法之后，可再次操作测定。以这个方式，可进行测定、疗法调整、测定、疗法调整等的迭代过程，并且确定最优疗法水平。
[0231]
在上述方法的一些实施方案中，将细胞因子的第一量与细胞因子的第二量之间的差值与对照值进行比较。
[0232]
在上述方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，人正罹患自体免疫疾病。在一些实施方案中，人正罹患选自由以下组成的组的自体免疫疾病：寻常天疱疮、落叶状天疱疮、副赘生性天疱疮、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、特发性血小板减少性紫癜(itp)、肝素诱发的血小板减少症(hit)、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、自体免疫溶血性贫血(aiha)、重症肌无力(mg)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(cidp)、多灶性运动神经病变、视神经脊髓炎、自体免疫血小板减少症、免疫嗜中性白细胞减少症、抗血友病fviii抑制剂、抗磷脂综合征、川崎综合征、anca相关疾病、多发性肌炎、皮肤肌炎、大疱性类天疱疮、多发性硬化症(ms)、格林-巴利综合征、慢性多发性神经病变、溃疡性结肠炎、糖尿病、自体免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏眼病变、自体免疫性荨麻疹、血管炎和拉斯穆森氏脑炎。
[0233]
在一些实施方案中，免疫复合物是抗原 抗原特异性抗体的免疫复合物。在一些实
施方案中，免疫复合物是人工的，即不天然存在于哺乳动物中。举例来说，免疫复合物可为4-羟基-5-碘-3-硝基苯基乙酸(nip)、鸡卵白蛋白(ova)和抗nip抗体的多聚复合物。抗nip抗体的一种可能性是含有对4-羟基-5-碘-3-硝基苯基乙酸具有特异性的鼠可变区和来自野生型人igg1的fc结构域的嵌合igg抗体(claypool,2004,mol.biol.cell 15:1746-1759)。在另一实施方案中，抗nip抗体是在fc结构域中具有使与fcrn的结合消除的3个点突变(i253a/h310a/h435a)的igg抗体。在一些实施方案中，免疫复合物是包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个nip部分的nip-ova-抗体复合物。
[0234]
免疫复合物在本文所述的测定中的功能在于使fcrn多聚化。因此，测定可用能够执行这个功能的其它物质进行操作。举例来说，可使用具有适当间隔的fc结构域的物质。这种物质可为用具有能够由fcrn识别的fc结构域的抗体涂布，或用含有适当间隔的fc结构域的多肽涂布的苯乙烯珠粒。可使抗体直接结合于珠粒，或可使抗体识别的抗原直接结合于珠粒，并且抗体可借助于识别和结合所述抗原来连接于珠粒。
[0235]
因此，本文提供一种使fcrn多聚化的方法，其包括：
[0236]
(a)从哺乳动物获得全血；和
[0237]
(b)向所述全血中添加具有适当间隔的fc结构域的物质以使所述全血中的fcrn得以多聚化。
[0238]
在一些实施方案中，在物质之前或同时将抗fcrn抗体或其抗原结合片段添加至全血中。
[0239]
在一些实施方案中，方法包括(c)测量全血中细胞因子的量。在一些实施方案中，在不存在以及在存在抗fcrn抗体或抗原结合片段下测量细胞因子的量，并且测定测量的量的差值。
[0240]
在上述方法的一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-10(il-10)或白介素-12(il-12)。全血中细胞因子的量可通过本领域中已知的方法来测量。举例来说，细胞因子蛋白质的量可用对细胞因子具有特异性的抗体测量，或可测量全血中细胞因子的mrna转录物的量。
[0241]
在用于测定患者对抗fcrn疗法的预期响应水平的上述方法的一些实施方案中，产生指定预期响应水平和/或所述患者已被选择来接受抗fcrn疗法的报告，所述报告被传达给健康护理提供者，并且向所述患者施用抗fcrn疗法。在一些实施方案中，产生指定预期响应水平和/或患者已被选择来接受抗fcrn疗法的报告，所述报告被传达给医师，并且所述医师施用抗fcrn疗法，或指导另一健康护理提供者施用抗fcrn疗法。
[0242]
在上述测定方法的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是igg、fab、f(ab’)2、双抗体、fv、scfv、阻断肽或其片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是f(ab’)2。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:56的重链可变区和具有seq id no:22的轻链可变区。
[0243]
在用于监测患者对抗fcrn疗法的响应的上述方法的一些实施方案中，所述抗fcrn疗法是向所述患者施用结合至fcrn的fc结合区，并且阻断或减弱igg与fcrn的结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是h3vκ2、h3e8、g9vκ2或g9e8。在一些实施方案中，抗体包含具有序列seq id no:49或seq id no:55的重链cdr3。在一些实施方案中，抗体包含以seq id no:50或seq id no:56阐述的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，例如g9vκ2，抗体包
含以seq id no:50阐述的重链可变区氨基酸序列和以seq id no:22阐述的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，例如h3vκ2，抗体包含以seq id no:56阐述的重链可变区氨基酸序列和以seq id no:22阐述的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是igg、fab、f(ab’)2、双抗体、fv、scfv、阻断肽或其片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是f(ab’)2。
[0244]
在一些实施方案中，通过测试各种量以及建立剂量-响应曲线来测定添加至全血中的抗体的量。在一些实施方案中，添加的抗体的量足以使全血中抗体浓度达到在1nm与1μm之间，在10nm与750nm之间，或在100nm与500nm之间。
[0245]
在上述测定方法的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化、嵌合或非天然存在的完全人抗体或其抗原结合片段。
[0246]
人fcrn的为本文公开的抗体所结合的特定区域或表位可通过本领域中已知的任何适合表位定位方法来鉴定。所述方法包括筛选来自fcrn的具有不同长度的肽与抗体的结合以确定抗体结合至fcrn的哪些氨基酸。肽可通过熟知方法诸如蛋白水解消化fcrn或化学合成来产生。诸如质谱测定法的技术可用于鉴定结合抗体的肽。或者，可使用nmr波谱法或x射线晶体分析法。一旦鉴定，结合肽即可作为免疫原用于获得结合fcrn的同一表位的额外抗体。
[0247]
应了解当出于防治或治疗的目的用于哺乳动物中时，本文阐述的抗fcrn抗体或其抗原结合部分将以另外包含药学上可接受的载体的组合物形式施用。适合药学上可接受的载体包括例如以下中的一者或多者：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、组氨酸、谷氨酸、柠檬酸盐、甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、精氨酸、乙酸盐、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188(poloxamer 188)等以及其组合。药学上可接受的载体可进一步包括使抗体的储存期限或有效性增加的少量辅助物质诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
[0248]
在一些实施方案中，使包含抗体和药学上可接受的载体的组合物冻干。
[0249]
包含抗体和药学上可接受的载体的组合物可在各种浓度下包含本文阐述的抗fcrn抗体或其抗原结合部分。举例来说，组合物可在10mg/ml至200mg/ml、25mg/ml至130mg/ml、50mg/ml至125mg/ml、75mg/ml至110mg/ml、或80mg/ml至100mg/ml下包含抗体。组合物也可在约10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml或150mg/ml下包含抗体。
[0250]
在本文所述的方法中，向有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的本文阐述的抗体或其抗原结合部分。如本文所用的术语“施用”意指通过可实现所寻求的结果的任何方法来将本文阐述的抗体或其抗原结合部分递送至哺乳动物中。它们可例如皮下、静脉内或肌肉内施用。尽管本文阐述的抗体或其抗原结合部分特别可用于向人施用，但它们也可向其它哺乳动物施用。如本文所用的术语“哺乳动物”意图包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。“治疗有效量”意指本文阐述的抗体或其抗原结合部分的在向哺乳动物施用时有效产生所需治疗作用的量。举例来说，视疾病而定，对于抗体，这可需要0.1、1.0、3.0、6.0或10.0mg/kg。对于具有150,000g/mol的分子质量的igg(两个结合位点)，这些剂量对应于5l血液体积约18nm、180nm、540nm、1.08μm和1.8μm的结合位点。
[0251]
在某些实施方案中，通过静脉内输注来向哺乳动物施用抗体或其抗原结合部分，即历经某一时期将抗体或其抗原结合部分引入哺乳动物的静脉中。在某些实施方案中，时
期是约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时或约8小时。
[0252]
在某些实施方案中，通过皮下递送来向哺乳动物施用抗体或其抗原结合部分，即在哺乳动物的皮肤下，通常通过捏住皮肤并使皮肤提升离开下伏组织，以及将抗体或其抗原结合部分注射至在皮肤下由此形成的间隙中。
[0253]
在某些实施方案中，每天、每隔一天、每两天、每三天、一周一次、一周两次、一周三次或每两周一次向受试者施用一剂化合物或组合物。在其它实施方案中，每天、每两天、每三天、一周一次或每两周一次向受试者施用两剂、三剂或四剂化合物或组合物。在一些实施方案中，持续2天、3天、5天、7天、14天或21天施用一剂或多剂化合物或组合物。在某些实施方案中，持续1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久施用一剂化合物或组合物。
[0254]
施用方法包括但不限于胃肠外、真皮内、玻璃体内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经粘膜、经直肠、通过吸入、或经表面，特别是向耳、鼻、眼或皮肤。施用模式留给从业者判断。在大多数情况下，施用将导致化合物释放至血流中。
[0255]
在特定实施方案中，可合乎需要的是局部施用化合物。这可例如而非以限制方式通过局部输注、表面施加，通过注射，借助于导管，或借助于植入物来实现，所述植入物由多孔、非多孔或凝胶材料制成，包括膜诸如硅橡胶膜或纤维。在所述情况下，施用可选择性靶向局部组织，而不将化合物大量释放至血流中。
[0256]
也可采用经肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及与气雾化剂一起配制，或通过处于氟碳化合物或合成肺表面活性剂中进行灌注。在某些实施方案中，将化合物与传统粘合剂和媒介物诸如甘油三酯一起配制成栓剂。
[0257]
在另一实施方案中，将化合物于囊泡特别是脂质体中递送(参见langer,1990,science 249:1527-1533；treat等,liposomes in the therapy ofinfectious disease andbacterial infection,lopez-berestein和fidler(编),liss,new york,第353-365页(1989)；lopez berestein,同上,第317-327页；通常参见同上)。
[0258]
在另一实施方案中，将化合物于控制释放系统中递送(参见例如goodson,medical applications of controlled release,上文,第2卷,第115-138页(1984))。控制释放系统的实例由langer,1990,science 249:1527-1533在综述中讨论，可加以使用。在一个实施方案中，可使用泵(参见langer,上文；sefton,1987,crc crit.ref.biomed.eng.14:201；buchwald等,1980,surgery 88:507；saudek等,1989,n.engl.j.med.321:574)。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见medical applications of controlled release,langer和wise(编),crc pres.,boca raton,florida(1974)；controlled drug bioavailability,drug productdesign andperformance,smolen和ball(编),,wiley,new york(1984)；ranger和peppas,1983,j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61；也参见levy等,1985,science 228:190；during等,1989,ann.neurol.25:351；howard等,1989,j.neurosurg.71:105)。
[0259]
上述施用时程仅出于说明目的提供，并且不应被视为具有限制性。本领域普通技术人员将易于了解所有剂量都在本发明的范围内。
[0260]“自体免疫疾病”是指一类疾病，其中受试者的自身抗体与宿主组织反应，或其中
免疫效应t细胞与内源性自体肽具有自体反应性，并且导致组织破坏。因此，免疫响应针对受试者的自身抗原(称为自体抗原)而发动。如本文所用的“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括赘生性细胞。
[0261]
可向受试者施用结合至fcrn的抗体和抗原结合片段以调节免疫响应，或治疗、预防或诊断病症诸如免疫病症。术语“治疗”是指施用有效改善或改善病症或疾病或降低或预防病症或疾病的进展的疗法。有效量可视例如病状或病症、个别受试者而变化，并且可针对受试者加以调适。结合至fcrn的抗体和抗原结合片段也可在体外使用。
[0262]
在一个实施方案中，提供一种调节fcrn与iggfc之间的相互作用的方法，其包括使细胞中或受试者中的fcrn与本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段接触。在一实施方案中，调节抑制fcrn与igg fc之间的相互作用。因此，提供一种促进抗体由细胞或在受试者中降解的方法。在一个实施方案中，抗体是自体抗体。在另一实施方案中，抗体是治疗性抗体。
[0263]
在另一实施方案中，提供一种治疗或改善受试者的igg介导的疾病的方法，其包括以有效治疗或改善所述igg介导的疾病的量向所述受试者施用本文公开的fcrn抗体或抗原结合片段。所述igg介导的疾病可为涉及呈单体形式或呈含有igg的免疫复合物(ic)形式的病原性igg抗体的那些，并且包括凝血病变、血管炎、胶原病症、皮肤学疾病、神经疾病、炎症性肠病和器官特异性病症。
[0264]
在另一实施方案中，提供一种阻断病原性抗体穿过胎盘进行传送的方法，其包括向有此需要的妊娠哺乳动物施用治疗有效量的本文公开的fcrn抗体或抗原结合片段。
[0265]
在另一实施方案中，提供一种抑制由fcrn达成的免疫复合物(ic)结合的方法，其包括使细胞中或受试者中的fcrn与本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段接触。因此，也提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的呈递的方法，其包括使所述apc与一定量的fcrn抗体或其抗原结合片段接触。类似地，在另一实施方案中，提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的交叉呈递的方法，其包括使所述apc与一定量的fcrn抗体或其抗原结合片段接触。
[0266]
在另一实施方案中，提供一种使ic从受试者的清除增加的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段。所述方法可用于治疗ic介导的血管炎。
[0267]
在另一实施方案中，提供一种抑制由抗原呈递细胞(apc)分泌炎症性细胞因子的方法，其包括使所述apc与fcrn抗体或其抗原结合片段接触。炎症性细胞因子的非限制性实例包括例如白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)和干扰素γ(ifnγ)。
[0268]
在另一实施方案中，提供一种抑制由抗原呈递细胞达成的t细胞活化的方法，其包括使所述抗原呈递细胞与本文所述的fcrn抗体或抗原结合片段接触。
[0269]
本文提供一种治疗自体免疫疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的fcrn抗体或其抗原结合部分。可治疗的疾病的非限制性实例包括天疱疮(寻常天疱疮、落叶状天疱疮或副赘生性天疱疮)、克罗恩氏病、特发性血小板减少性紫癜(itp)、肝素诱发的血小板减少症(hit)、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、重症肌无力(mg)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(cidp)。额外非限制性自体免疫疾病包括自体免疫血小板减少症、免疫嗜中性白细胞减少症、抗血友病fviii抑制剂、抗磷脂综合征、川崎综合征、anca相关疾病、多发性肌炎、大疱性类天疱疮、多发性硬化症(ms)、格林-巴利综合征、慢性多发性神经病
变、溃疡性结肠炎、糖尿病、自体免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏眼病变、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、原发性硬化性胆管炎、全身性红斑狼疮(sle)、自体免疫脑脊髓炎、桥本氏甲状腺炎、古德帕斯彻氏综合征、自体免疫溶血性贫血、伴有抗胶原抗体的硬皮病、混合结缔组织疾病、恶性贫血、特发性阿狄森氏病、自体免疫相关不育症、肾小球性肾炎(例如新月体性肾小球性肾炎、增生性肾小球性肾炎)、胰岛素抗性和自体免疫糖尿病(1型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病)。自体免疫疾病也已被认定涵盖动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病。在另一实施方案中，自体免疫疾病包括肝炎、自体免疫血友病、自体免疫淋巴组织增生性综合征(alps)、自体免疫葡萄膜视网膜炎、肾小球性肾炎、无γ球蛋白血症、斑形脱发、淀粉样变性、僵直性脊椎炎、自体免疫血管性水肿、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫自主神经异常、自体免疫高脂质血症、自体免疫免疫缺陷、自体免疫内耳病(aied)、自体免疫心肌炎、自体免疫胰腺炎、自体免疫视网膜病变、自体免疫性荨麻疹、自体免疫性荨麻疹性神经病变、自体免疫轴突神经病变、巴洛病(balo disease)、贝塞特氏病(disease)、卡斯尔曼病(castleman disease)、乳糜泻、查加斯病(chagas disease)、慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)、车格-施特劳斯综合征(churg-strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、良性粘膜天疱疮、科根氏综合征(cogan’ssyndrome)、冷凝集素病、柯萨奇心肌炎(coxsackie myocarditis)、crest病、原发性混合冷球蛋白血症、疱疹样皮炎、皮肤肌炎、德维克氏病(devic’s disease)(视神经脊髓炎)、扩张心肌病变、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(dressler’s syndrome)、子宫内膜异位、嗜酸性粒细胞性血管中心纤维化、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、埃文斯综合征(evans syndrome)、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、桥本氏脑炎(hashimoto's encephalitis)、亨诺克-舍恩来因紫癜(henoch-schonlein purpura)、妊娠疱疹、特发性低补体血症性小管间质性肾炎、多发性骨髓瘤、多灶性运动神经病变、nmda受体抗体脑炎、igg4相关疾病、igg4相关硬化性疾病、炎症性主动脉瘤、炎症性假肿瘤、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、库特纳氏肿瘤(kuttner's tumour)、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、白细胞破裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性iga疾病(lad)、莱姆病(lyme disease)、慢性纵隔纤维化、美尼尔氏病(meniere’s disease)、显微性多血管炎、米库利奇氏综合征(mikulicz’s syndrome)、莫伦氏溃疡(mooren’s ulcer)、慕夏-哈伯曼病(mucha-habermann disease)、多灶性纤维硬化、嗜睡病、视神经炎、奥蒙德氏病(ormond’s disease)(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、pandas(与链球菌相关的儿科自体免疫神经精神病学病症)、副赘生性小脑变性、副蛋白血症性多发性神经病变、阵发性夜间血红蛋白尿(pnh)、帕里龙伯格综合征(parry romberg syndrome)、帕森尼奇-特纳综合征(parsonnage-turner syndrome)、主动脉周炎、动脉周炎、外周神经病变、静脉周脑脊髓炎、poems综合征、多发性结节性动脉炎、i、ii和iii型自体免疫多腺性综合征、风湿性多肌痛、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺氏现象、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征(reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、多动腿综合征、风湿热、里德氏甲状腺炎(riede’s thyroiditis)、类肉瘤病、施密特综合征(schmidt syndrome)、巩膜炎、休格连氏综合征(sjogren’s syndrome)、精子和睾丸自体免疫性、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克氏综合征(susac’s syndrome)、交感性眼炎、高安氏动脉炎(takayasu’s arteritis)、托洛萨-亨特综合征
(tolosa-hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、未分化结缔组织疾病(uctd)、水疱大疱性皮肤病、白癜风、拉斯穆森氏脑炎和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(waldenstrom’s macroglobulinaemia)。
[0270]
在其它实施方案中，提供治疗感染性疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的fcrn抗体或其抗原结合部分。
[0271]
在一些实施方案中，提供用于降低含有fc结构域的治疗性蛋白质例如包含fc结构域的治疗性抗体或非抗体蛋白质的血清半寿期的方法。如果所述治疗性蛋白质导致非所要生理作用，那么所述方法可使它们从血流的移除增强。可适用于这个方法的治疗性蛋白质的实例包括(那他珠单抗(natalizumab))和(贝伐单抗(bevacizumab))。在一些实施方案中，方法导致治疗性蛋白质的半寿期减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0272]
在一些实施方案中，提供用于移除igg连接的放射性示踪剂或其它抗体-药物缀合物的方法，其中有需要使这些从循环移除。在一些实施方案中，用igg降低剂阻断fcrn将有益于降低内源性igg水平以允许增强含有igg的治疗剂的药物动力学和药效动力学。在这个情况下，在施用这种治疗剂之前用对igg结合位点具有特异性的抗fcrn抗体预处理将使源于呈单体形式或呈含有igg的免疫复合物(ic)形式的内源性igg抗体的竞争降低，并且允许使对所施用的基于igg的治疗剂的保护作用增加。
[0273]
本文提供使用如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分的方法。因此，提供用于调节免疫响应或治疗、预防或诊断病症诸如免疫病症的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分。也提供用于调节fcrn与igg fc之间的相互作用以促进抗体由细胞或在受试者中降解的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗体可为自体抗体或治疗性抗体。也提供用于治疗或改善受试者的igg介导的疾病的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分，其中所述igg介导的疾病可为涉及病原性igg抗体的那些，并且包括凝血病变、血管炎、胶原病症、皮肤学疾病、神经疾病、炎症性肠病和器官特异性病症。
[0274]
本文提供用于抑制由fcrn达成的免疫复合物(ic)结合，抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的呈递，或抑制由抗原呈递细胞(apc)对免疫复合抗原的交叉呈递的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分。也提供用于抑制由抗原呈递细胞(apc)分泌炎症性细胞因子的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分，其中炎症性细胞因子包括例如白介素-12(il-12)、白介素-6(il-6)和干扰素γ(ifnγ)。也提供用于抑制t细胞活化的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分。
[0275]
本文提供用于治疗天疱疮(寻常天疱疮、落叶状天疱疮或副赘生性天疱疮)、克罗恩氏病、特发性血小板减少性紫癜(itp)、肝素诱发的血小板减少症(hit)、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、重症肌无力(mg)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(cidp)的如本文阐述的fcrn抗体或其抗原结合部分。额外非限制性自体免疫疾病包括自体免疫血小板减少症、免疫嗜中性白细胞减少症、抗血友病fviii抑制剂、抗磷脂综合征、川崎综合征、anca相关疾病、多发性肌炎、大疱性类天疱疮、多发性硬化症(ms)、格林-巴利综合征、慢性多发性神经病变、溃疡性结肠炎、糖尿病、自体免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏眼病变、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、原发性硬化性胆管炎、全身性红斑狼疮(sle)、自体免疫脑脊髓炎、桥本氏甲状腺炎、古德帕斯彻氏综合征、自体免疫溶血性贫血、伴有抗胶原抗体的硬皮病、混合
结缔组织疾病、恶性贫血、特发性阿狄森氏病、自体免疫相关不育症、肾小球性肾炎(例如新月体性肾小球性肾炎、增生性肾小球性肾炎)、胰岛素抗性和自体免疫糖尿病(1型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病)。自体免疫疾病也已被认定涵盖动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病。在另一实施方案中，自体免疫疾病包括肝炎、自体免疫血友病、自体免疫淋巴组织增生性综合征(alps)、自体免疫葡萄膜视网膜炎、肾小球性肾炎、无γ球蛋白血症、斑形脱发、淀粉样变性、僵直性脊椎炎、自体免疫血管性水肿、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫自主神经异常、自体免疫高脂质血症、自体免疫免疫缺陷、自体免疫内耳病(aied)、自体免疫心肌炎、自体免疫胰腺炎、自体免疫视网膜病变、自体免疫性荨麻疹、自体免疫性荨麻疹性神经病变、自体免疫轴突神经病变、巴洛病、贝塞特氏病、卡斯尔曼病、乳糜泻、查加斯病、慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)、车格-施特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮、良性粘膜天疱疮、科根氏综合征、冷凝集素病、柯萨奇心肌炎、crest病、原发性混合冷球蛋白血症、疱疹样皮炎、皮肤肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、扩张心肌病变、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征、子宫内膜异位、嗜酸性粒细胞性血管中心纤维化、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、埃文斯综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、桥本氏脑炎、亨诺克-舍恩来因紫癜、妊娠疱疹、特发性低补体血症性小管间质性肾炎、多发性骨髓瘤、多灶性运动神经病变、nmda受体抗体脑炎、igg4相关疾病、igg4相关硬化性疾病、炎症性主动脉瘤、炎症性假肿瘤、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、库特纳氏肿瘤、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性iga疾病(lad)、莱姆病、慢性纵隔纤维化、美尼尔氏病、显微性多血管炎、米库利奇氏综合征、莫伦氏溃疡、慕夏-哈伯曼病、多灶性纤维硬化、嗜睡病、视神经炎、奥蒙德氏病(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、pandas(与链球菌相关的儿科自体免疫神经精神病学病症)、副赘生性小脑变性、副蛋白血症性多发性神经病变、阵发性夜间血红蛋白尿(pnh)、帕里龙伯格综合征、帕森尼奇-特纳综合征、主动脉周炎、动脉周炎、外周神经病变、静脉周脑脊髓炎、poems综合征、多发性结节性动脉炎、i、ii和iii型自体免疫多腺性综合征、风湿性多肌痛、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺氏现象、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征、风湿热、里德氏甲状腺炎、类肉瘤病、施密特综合征、巩膜炎、休格连氏综合征、精子和睾丸自体免疫性、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克氏综合征、交感性眼炎、高安氏动脉炎、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、未分化结缔组织疾病(uctd)、水疱大疱性皮肤病、白癜风、拉斯穆森氏脑炎或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症。
[0276]
在本文所述的方法中，可与其它药剂、药物或激素组合(例如同时、依序或分开)施用治疗有效量的本文阐述的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，其它药剂、药物或激素可为小分子、肽或蛋白质，包括抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，其它药剂、药物或激素可于同一组合物中或于单独组合物中施用。在一些实施方案中，其它药剂、药物或激素是用于治疗本文所述的病症、疾病或病状的已知药剂、化合物或激素。举例来说，在一些实施方案中，其它药剂可为用于治疗免疫介导的疾病的单克隆抗体疗法。在其它实施方案中，其它药剂可为补体系统的抑制剂。举例来说，针对fcγ受体和fcrn的组合描述于以引用的方式整体并入本文的wo 2015/164605中。
[0277]
在一些实施方案中，其它药剂、药物或激素是免疫抑制剂、免疫刺激剂、免疫调节
剂或其组合。在一些实施方案中，其它药剂、药物或激素是静脉内ig疗法；非类固醇消炎药物(nsaid)；皮质类固醇(corticosteroid)；环孢菌素(cyclosporin)、雷帕霉素(rapamycin)、子囊霉素(ascomycin)或它们的免疫抑制性类似物，例如环孢菌素a、环孢菌素g、fk-506、雷帕霉素、40-0-(2-60羟基)乙基-雷帕霉素；环磷酰胺(cyclophosphamide)；硫唑嘌呤(azathioprene)；甲氨蝶呤(methotrexate)；microphenyolate；布喹那(brequinar)；fty 720；来氟米特(leflunomide)；咪唑立宾(mnizoribine)；霉酚酸(mycophenolic acid)；霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)；15-脱氧司加林(15-deoxyspergualine)；免疫抑制性单克隆抗体，例如针对白细胞受体(例如mhc、cd2、cd3、cd4、cd7、cd25、cd28、b7、cd45或cd 58)或它们的配体的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，例如ctla4ig；其它粘附分子抑制剂，例如mab或低分子量抑制剂，包括选择素(selectin)拮抗剂和vla-4拮抗剂；免疫调节细胞因子，例如α-干扰素、γ-干扰素或肿瘤坏死因子-α；或免疫刺激性细胞因子，例如白介素-2。
[0278]
本文提供在施用抗fcrn抗体之后测量受试者中抗fcrn抗体的水平的方法，所述方法包括在施用抗fcrn抗体之后从所述受试者获得全血，其中所述全血包含单核细胞，以及测量单核细胞细胞表面fcrn表达水平。在不限于任何特定理论下，已显示在单核细胞细胞表面fcrn水平与抗fcrn抗体的存在之间存在关联。单核细胞细胞表面fcrn表达水平可通过本领域中已知的任何方法来测量，并且可包括例如几何平均荧光强度。
[0279]
应了解和预期可由本领域技术人员作出符合本文公开的本发明的原理的变化，并且意图所述修改将被包括在本发明的范围内。
[0280]
在整篇本技术中，引用各种出版物。这些出版物据此以引用的方式整体并入本技术中以更充分描述本发明所属的技术的状态。以下实施例进一步说明本发明，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0281]
实施例
[0282]
实施例1
[0283]
可变结构域的人源化
[0284]
基于由于它能够结合至fcrn并且阻断fcrn和igg fc的结合而选择的小鼠单克隆抗体，设计适于人施用的重链和轻链可变区。小鼠抗体基本上不结合至人血清白蛋白。使用基于现有抗体结构的单克隆抗体的模型，从人v区的区段设计人抗体的可变区框架。为使潜在免疫原性最小化，设计若干变体，其在某些框架位置处具有被设计以移除人t细胞表位的所选氨基酸。
[0285]
重链和轻链v区基因由重叠寡核苷酸构建，所述重叠寡核苷酸使用连接酶链式反应(lcr)来装配成全长基因，随后扩增和添加适于克隆的限制位点。
[0286]
构建4种具有人igg4恒定区的重链变体。将变体指定为vh1、vh2、vh3和vh4。重链变体的可变结构域的氨基酸序列分别由seq id no:12、14、16和18表示。重链变体的可变结构域的寡核苷酸序列分别由seq id no:11、13、15和17表示。图1显示4种变体的比对。构建4种轻链变体，并且表达成人κ链。将变体指定为vκ1、vκ2、vκ3和vκ5。轻链变体的氨基酸序列分别由seq id no:20、22、24和26表示。轻链变体的可变结构域的寡核苷酸序列分别由seq id no:19、21、23和25表示。图2显示4种变体的比对。
[0287]
通过将v区基因克隆至具有上游巨细胞病毒立即/早期启动子/增强子、免疫球蛋
白信号序列和免疫球蛋白恒定区的哺乳动物表达载体中来将抗体表达成完整igg。将载体转染至hek ebna细胞中，对表达进行定量，并且在蛋白a柱上纯化抗体。
[0288]
4种重链变体和4种轻链变体的所有16种重链-轻链组合都通过瞬时转染至hekebna细胞中来表达。在蛋白a琼脂糖柱上纯化抗体，并且进行定量。如上所指示，fcrn主要驻留在早期酸性内体中，在其中它通过在低ph下结合至fc区来捕集经胞吞的igg。为阻断fcrn与经胞吞的igg的fc的结合，也可合乎需要的是fcrn抗体将在生理ph(例如ph 7.4)下结合至暴露于细胞间环境的fcrn。因此，在竞争elisa测定中在ph 6.0和ph 7.4下评估经纯化的抗体与fcrn的结合。
[0289]
对于elisa，在ph 7.4下用对不同于fc结合区的白蛋白-结合表位具有特异性的fcrn抗体将nunc immuno maxisorp 96孔平底微量滴定板预涂布过夜。次日，将于pbs(ph 7.4)中稀释的1μg/ml重组人fcrn(sino biological inc.目录号ct009-h08h)添加至孔中，并且在37℃下孵育1小时。使从25μg/ml至0.0015μg/ml的一系列4倍稀释的对照或测试igg4抗体与恒定浓度的生物素化亲本鼠抗体预混合，添加至板中，并且在37℃下孵育1小时。用链霉亲和素(streptavidin)-hrp和tmb底物检测生物素化mab的结合。在450nm下读取吸光度，并且绘制结合曲线。在ph 7.4与ph 6.0两者下测试16种组合的结合，并且通过与亲本鼠抗体比较来定量，如表2-相对亲和力2
[0290][0291][0292]
实施例2
[0293]
亲和力成熟
[0294]
为改善在酸性ph和生理ph下的结合亲和力，使重链和轻链可变结构域cdr3区突变，并且以scfv形式在ph 6.0和ph 7.4下筛选。为制备scfv，使用重叠pcr，用15个氨基酸的(g4s)3连接子装配编码vh和vκ的基因。将scfv序列以基因3融合蛋白形式克隆至噬菌粒载体中，并且将载体转化至大肠杆菌(tg1)中。使用vh1和vκ1变体进行亲和力成熟过程。对于筛选，使vh1中重链cdr3的文库与人源化亲本vκ1轻链组合，并且使vκ1中轻链cdr3的文库与人源化亲本vh1重链组合。
[0295]
使用寡核苷酸序列kncnncnncnncsvcnwcygg(seq id no:71)在氨基酸位置98-103(cdr3h的a.a.98-102和fw4的a.a.103)处将氨基酸序列变化引入重链cdr3h区中，所述寡核苷酸序列如下在各位置处提供所选氨基酸：a.a.98：a、c、d、f、g、s、v、y；a.a.99：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.100：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.100a：a、c、d、f、g、h、i、l、n、p、r、s、t、v、y；a.a.101：a、d、g、h、p、r；a.a.102：d、f、h、i、l、n、v、y；a.a.103：r、w。使用寡核苷酸序列tgtmrsvmgtvskrs rrcwmcyycbwcrycttc(seq id no:72)在氨基酸位置89-97处将氨基酸序列变化引入轻链cdr3l区中，所述寡核苷酸序列如下在各位置处提供所选氨基酸：a.a.88：c；a.a.89：h、k、n、q、r、s；a.a.90：a、e、k、p、q、t；a.a.91：c、s、w、y；a.a.92：c、d、e、g、w、y；a.a.93：d、g、n、s；a.a.94：n、s、t、y；a.a.95：f、l、p、s；a.a.96：d、f、h、l、v、y；a.a.97：a、i、t、v。
[0296]
对于各cdr，针对与可溶性抗原的结合来筛选含有大约3-6x106条dna序列的约5-10x107个噬菌体的文库(即代表各dna序列的约10-20个拷贝)。具体来说，使噬菌体文库与可溶性生物素化fcrn混合，随后在链霉亲和素涂布的珠粒上捕集fcrn-抗体噬菌体复合物。为获得在酸性内体中以及在生理ph下结合至fcrn的抗体，在交替ph下进行相继各轮文库筛选。此外，为使相继各轮筛选的严格性增加，使fcrn抗原的浓度降低。以25nm抗原的靶标浓度在ph 6.0下进行初始轮选择。在2.5nm抗原浓度下在ph 7.4下进行第二轮。在0.25nm抗原浓度下在ph 6.0下进行第三轮。
[0297]
选择来自v
h cdr3和v
l cdr3文库的总计约60种scfv抗体用于进一步研究。scfv抗体由细菌周质提取物制备，并且通过竞争elisa在ph 6.0和ph 7.4下来测试。在竞争elisa中，使scfv抗体片段与生物素化亲本鼠抗体竞争结合至固定化fcrn。如同用于测试人源化变体的elisa中一样，用1μg/ml的对不同于fc结合区的白蛋白结合表位具有特异性的fcrn抗体将96孔平底微量滴定板预涂布。在ph 7.4和ph 6.0下测定结合。图3显示在ph 6.0与ph 7.4两者下，对与人源化亲本vκ1轻链一起表达成scfv的3种亲和力成熟的重链(h1、h3、e7)以及与亲本vh1重链一起表达成scfv的1种亲和力成熟的轻链(e8)的结合亲和力增加。表3显示对于15条重链和2条轻链观察到的通过与亲本鼠抗体比较来定量的结合改善。
[0298]
[0299][0300]
测量到在vh1框架中含有亲和力成熟的重链cdr3的scfv在结合方面的显著改善。因此，推进这些重链与改善的轻链组合进行测试。如以上实施例1中所示，vκ1和vκ2轻链在与vh1(以及其它vh变体)配对时显示类似结合，并且预测vκ2框架比vκ1具有更小免疫原性。因此，推进含有亲和力成熟的cdr3的基于vκ1和vκ2的轻链与改善的重链组合进行测试。
[0301]
实施例3
[0302]
开发igg抗体
[0303]
选择8种亲和力成熟的重链(a8、c4、f7、g4、g7、g9、h1和h3)，并且与含有e8的cdr3的人源化轻链(vκ1或vκ2)一起表达。通过瞬时转染hek细胞来将16种组合表达成二价igg4抗体，随后对igg4抗体进行纯化。也使亲和力成熟的重链与人源化但非亲和力成熟的轻链组合表达，并且使某些亲和力成熟的轻链与人源化但非亲和力成熟的重链一起表达。
[0304]
实施例4
[0305]
igg4抗体的如由elisa测定的抗原结合和阻断特征
[0306]
通过直接结合elisa来将亲和力成熟的igg与人源化亲本vh1/vκ1igg进行比较。在ph 7.4下用对不同于fc结合区的白蛋白结合表位具有特异性的fcrn抗体将nunc immuno maxisorp 96孔平底微量滴定板预涂布过夜。次日，将于pbs(ph 7.4)中稀释的1μg/ml重组人fcrn(sino biological inc.目录号ct009-h08h)添加至孔中，并且在37℃下孵育1小时随后阻断与4％奶/pbs的非特异性结合。将经滴定的人源化亲本或亲和力成熟的igg添加至
孔中，随后使用人κ-hrp抗体检测结合的抗体。图4显示相较于人源化亲本vh1vκ1igg或嵌合亲本鼠抗体，h1vh1_e8vκ1、h1vh1_e8vκ2、g7vh1_e8vκ1和g7vh1_e8vκ2igg与固定化fcrn的结合增加。
[0307]
也在竞争elisa中在ph 6.0和ph 7.4下测试igg4抗体的抗原结合。在ph 7.4下用1μg/ml的对不同于fc结合区的白蛋白结合表位具有特异性的fcrn抗体将nunc immuno maxisorp 96孔平底微量滴定板(fisher，目录号dis-971-030j)预涂布过夜。次日，将于pbs(ph 7.4)中稀释的1μg/ml重组人fcrn(sino biological inc.目录号ct009-h08h)添加至孔中，并且在37℃下孵育1小时。在用pbst(ph 7.4)将板洗涤3次之后，在37℃下用pbsm(ph 7.4)将板阻断1小时。从这点开始，所有洗涤和孵育步骤都在所选测定ph(ph 6.0或7.4)下进行。在用pbst洗涤3次之后，使从25μg/ml至0.006μg/ml最终浓度的一系列4倍稀释的测试抗体与恒定浓度的生物素化亲本鼠抗体(0.4μg/ml，最终浓度)预混合，添加至fcrn涂布的板中，并且在37℃下孵育1小时。在3次pbst洗涤之后，用链霉亲和素-hrp(sigma，目录号s5512)和tmb底物(invitrogen，目录号00-2023)检测生物素化mab的结合。用3m hcl终止反应，在dynex technologies mrx tc ii读板仪上在450nm下读取吸光度，并且绘制结合曲线。
[0308]
如图5中对于4种抗体(h1vh1_e8vκ1、h1vh1_e8vκ2、f7vh1_e8vκ1、vh1_e8vκ2)所示，在竞争elisa中，亲和力成熟的igg的表现类似于嵌合亲本鼠抗体和人源化亲本vh1vκ1抗体。
[0309]
竞争elisa也用于将以单价(scfv)或二价(igg)形式表达的亲和力成熟的重链和轻链的某些组合与人源化亲本vh1vκ1进行比较。图6比较在ph 7.4与ph 6.0两者下，h3vh1_e8vκ1igg、h3vh1_vκ1scfv、vh1vκ1igg和vh1vκ1scfv的结合。在scfv形式下，亲和力成熟的h3vh1_vκ1scfv相较于vh1vκ1scfv亲本显示显著改善的结合。此外，相较于scfv形式，当表达成二价igg时，h3vh1_e8vκ1igg和vh1vκ1两者均显示结合改善。
[0310]
在竞争elisa中测试人源化亲和力成熟的重链和人源化亲和力成熟的轻链的额外组合。也测试人源化亲和力成熟的重链和人源化非亲和力成熟的轻链的组合。所得结果概述于表4和5中，所述表格显示在ph 7.4和ph 6.0下进行的实验的平均相对ic
50
值和实验的数目(n)。相对于在同一板上测试的嵌合亲本鼠抗体使组合的ic
50
值归一化。
[0311]
表4
[0312]
[0313][0314]
表5
[0315][0316]
n.d.＝未进行
[0317]
在ph 6.0下用完整人igg在竞争elisa测定中进一步评估人源化亲和力成熟的抗体与fcrn的结合。在ph 7.4下用1μg/ml的对不同于fcrn的fc结合区的白蛋白结合表位具有特异性的fcrn抗体将nunc immuno maxisorp 96孔平底微量滴定板(fisher，目录号dis-971-030j)预涂布过夜。次日，将于pbs(ph 7.4)中稀释的0.5μg/ml重组人fcrn(sino biological inc.目录号ct009-h08h)添加至孔中，并且在37℃下孵育1小时。在用pbst(ph 7.4)将板洗涤3次之后，在37℃下用pbsm(ph 7.4)将板阻断1小时。从这点开始，所有洗涤和孵育步骤都在测定ph 6.0下进行。在用pbst洗涤3次之后，使从25μg/ml至0.034μg/ml最终浓度的一系列3倍稀释的测试抗体与恒定浓度的生物素化人血清igg(sigma，目录号i4506，25μg/ml最终浓度)预混合，添加至板中，并且在37℃下孵育1小时。在3次pbst洗涤之后，用链霉亲和素-hrp(sigma，目录号s5512)和tmb底物(invitrogen，目录号00-2023)检测生物素化igg的结合。用3m hcl终止反应，在dynex technologies mrx tc ii读板仪上在450nm下读取吸光度，并且绘制结合曲线。
[0318]
将在人血清igg存在下在ph 6.0下人源化亲和力成熟的重链与人源化亲和力成熟的轻链的组合与fcrn的结合与嵌合亲本鼠抗体的结合进行比较。结果概述于表6中。相对于在同一板上测试的嵌合抗体使平均相对ic
50
值归一化。
[0319]
表6
[0320][0321]
将在人血清igg存在下在ph 6.0下人源化亲和力成熟的重链与人源化非亲和力成熟的轻链的组合与fcrn的结合与亲本鼠fcrn抗体的结合进行比较。结果概述于表7中。相对于在同一板上测试的亲本鼠抗体使平均相对ic
50
值归一化。
[0322]
表7
[0323][0324]
关于人源化亲和力成熟的重链和轻链的一些组合以及人源化亲和力成熟的重链与人源化非亲和力成熟的轻链配对的一些组合的额外数据显示于下表8中。
[0325]
表8
[0326]
[0327][0328]
实施例5
[0329]
使用表面等离子体共振测定mab结合动力学
[0330]
将抗体稀释于10mmnaac(ph 4.5)中，并且固定于cm5芯片上以达到约500-1000的ru水平。通过在ph 7.4或ph 6.0下注射于1xpbs-p中浓度是12-800nm的fcrn来进行分析。表9显示使用1:1朗缪尔模型(langmuirmodel)拟合的动力学数据。
[0331]
[0332][0333]
在另一研究中，通过来将包含亲和力成熟的重链和轻链的igg的亲和力与人源化亲本vh1/vκ1抗体进行比较。在用蛋白a涂布的cm5芯片上捕集抗体，并且使分析物(fcrn)流经表面。如以下在表10中所指示，包含亲和力成熟的重链和轻链的抗体显示的亲和力与人源化亲本vh1/vκ1抗体类似。
[0334][0335]
保持亲和力成熟的重链(即g9vh1、h3vh1或h1vh1)恒定，在具有vκ1的抗体与具有vκ2的抗体之间，以及保持vκ2恒定，在h3vh1与g9vh1之间进行成对比较。使用标准胺偶联化学，将蛋白a(sigma目录号p6031)涂布于s系列cm5传感器芯片(ge healthcare目录号br100530)表面的流动池(fc)1、2、3和4上。在于10mm乙酸盐缓冲液(ph 5.0)中的20μg/ml的蛋白质浓度下进行固定以达到500共振单位(ru)的靶标响应水平。在10μl/min下在f
c 2、3和4上捕集10nm抗体以产生约172的ru(50-150ru的分析物结合水平(r
max
))，并且使表面稳定。
[0336]
对于动力学分析，选择50-0.02nm fcrn的2倍稀释范围。在40μl/min下，对fcrn分析物的缔合期监测450秒，并且持续1500秒测量解离。fc1是参照通道，并且从其它流动池减去以修正非特异性结合。动力学值基于1:1结合模型(表11)。
[0337][0338]
在另一研究中，使用biacore 3000仪器(ge healthcare)，用如由制造商所述使用胺偶联化学与mab(约500-700个共振单位)偶联的cm5传感器芯片进行表面等离子体共振(spr)。使用胺偶联试剂盒(ge healthcare)，通过将3μg/ml的各蛋白质注射至10mm乙酸钠(ph 4.5)(ge healthcare)中来进行偶联。hbs-p缓冲液(ph 7.4)(0.01mhepes、0.15mnacl、0.005％表面活性剂p20)或磷酸盐缓冲液(ph 6.0)(67mm磷酸盐缓冲剂、0.15m nacl、0.005％吐温20)用作运行缓冲液和稀释缓冲液。通过在ph 7.4或ph 6.0下，注射滴定量的单体his标签化的hfcrn(400.0-12.5nm)到经固定化ab上方来测定结合动力学。所有spr实验都在25℃下以40μl/min的流速进行。将结合数据调零，并且减除参照槽数值。由biaevaluation软件(4.1版)提供的朗缪尔1:1配体结合模型用于测定结合动力学。拟合的接近度由统计值χ2描述。
[0339]
图7显示与变异轻链vκ2或亲和力成熟的轻链e8配对的亲和力成熟的重链g9或h3的由表面等离子体共振测定的结合缔合和解离的图。动力学速率常数提供于下表12中。动力学速率常数使用简单一级(1:1)朗缪尔双分子相互作用模型获得。动力学数值代表一式两份的平均值。χ2(卡方)值代表相对于所用结合模型的拟合度。
[0340][0341]
在另一研究中，使用biacore 3000仪器(ge healthcare)，用如由制造商所述使用胺偶联化学与抗体(约550个共振单位(ru))偶联的cm5传感器芯片进行表面等离子体共振(spr)。使用胺偶联试剂盒(ge healthcare)，通过将2.5μg/ml的各蛋白质注射至10mm乙酸钠(ph 4.5)(ge healthcare)中来进行偶联。hbs-p缓冲液(ph 7.4)(0.01m hepes、
0.15mnacl、0.005％表面活性剂p20)或磷酸盐缓冲液(ph 6.0)(67mm磷酸盐缓冲剂、0.15m nacl、0.005％吐温20)用作运行缓冲液和稀释缓冲液。通过在ph 7.4或ph 6.0下，注射滴定量(400.0-12.5nm)的单体his标签化人fcrn(hfcrn)(jta)到经固定化mab h3vk2来测定结合动力学。对于人igg1(higg1)和人igg4(higg4)，注射10.000-325.0nm。所有spr实验都在25℃下以40μl/min的流速进行。将结合数据调零，并且减除参照槽数值。由biaevaluation软件(4.1版)提供的朗缪尔1:1配体结合模型用于测定结合动力学。拟合的接近度由统计值χ2描述。
[0342]
图12显示higg1、higg4和h3vk2的结合缔合和解离的图。下
[0343]
表13以表列形式显示结果。
[0344][0345][0346]
如所预期，显示在ph 6.0下，higg1和higg4以严格ph依赖性方式以约1μm的kd进行结合，而在中性ph下仅获得极其微弱结合响应(在最高注射浓度10.000nm下)。
[0347]
在另一研究中，测试h3vk2与食蟹猴fcrn以及与从两个不同供应商获得的人fcrn的结合。
[0348]
使用biacore 3000仪器(ge healthcare)，用如由制造商所述使用胺偶联化学与mab h3vk2(约550个共振单位(ru))偶联的cm5传感器芯片进行表面等离子体共振(spr)。使用胺偶联试剂盒(ge healthcare)，通过将2.5μg/ml的h3vk2注射至10mm乙酸钠(ph 4.5)(ge healthcare)中来进行偶联。hbs-p缓冲液(ph 7.4)(0.01m hepes、0.15m nacl、0.005％表面活性剂p20)或磷酸盐缓冲液(ph 6.0)(67mm磷酸盐缓冲剂、0.15m nacl、0.005％吐温20)用作运行缓冲液和稀释缓冲液。通过在ph 7.4或ph 6.0下，注射滴定量(400.0-12.5nm)的受体到固定化ab上方来测定结合动力学(单体his标签化人fcrn(hfcrn)(jta)或从sino biological inc获得的人和食蟹猴fcrn(cfcrn))。所有spr实验都在25℃下以40μl/min的流速进行。将结合数据调零，并且减除参照槽数值。由biaevaluation软件(4.1版)提供的朗缪尔1:1配体结合模型用于测定结合动力学。拟合的接近度由统计值χ2描
述。
[0349]
图13显示结合缔合和解离的图。下表14以表列形式显示结果。
[0350][0351][0352]
在这个实验设置中，测定h3vk2对从sino biological inc.获得的人和食蟹猴fcrn的结合动力学。作为比较，在ph 7.4下包括内部产生并用于某些先前研究中的单体人fcrn(jta)。来自sino biological inc.的商业人形式给出的动力学常数极其类似于内部产生的人形式的动力学常数。显示食蟹猴fcrn在两种ph条件下均结合ab，但其中在ph 7.4下，亲和力稍微(约2倍)弱于人受体。
[0353]
实施例6
[0354]
抗原呈递测定
[0355]
制备骨髓树突细胞(bmdc)-从8只雌性b6.cg-fcgrt
tm1dcr tg(fcgrt)32dcr/dcrj小鼠(jackson laboratory库存编号014565)收集骨髓(bm)细胞。这些小鼠具有fcrnα链的敲出等位基因(fcgrt
tm1dcr
)，并且在人fcrn启动子的控制下表达人fcrnα链(fcgrt)转基因。将bm细胞以2x106/10cm2涂铺至约70个非tc处理的皮氏培养皿(petri dish)中的完全rpmi(c-rpmi)内。在第3和6天将bm细胞补充以gm-csf(20ng/ml)，并且收集(或冷冻)以在bmdc培养的第8
–
12天进行使用。
[0356]
在抗原呈递测定中，通过t细胞活化来评估fcrn介导的由bmdc对抗原的呈递。具体来说，使bmdc与抗原 抗原特异性抗体(nip-ova 抗nip igg)的免疫复合物一起孵育，随后测定抗原特异性t细胞的活化。通过测定t细胞活化来评估抗fcrn抗体(相较于匹配同种型
的非特异性对照抗体)抑制抗原呈递(通过阻断fcrn与ic的结合，由此阻断nip-ova加工和向t细胞呈递)的能力。使用elisa定量il2和ifn-γ产生来评估t细胞活化。非特异性抗原呈递的对照(即不由fcrn介导的抗原呈递的本底水平)通过使bmdc与测试抗体和未复合抗原(即不具有抗nip-igg的nip-ova)一起孵育来提供。
[0357]
首先使bmdc与测试抗体或同种型对照一起孵育。具体来说，将bmdc以5x104/100μl/孔接种至96孔板中，并且在37℃下孵育30
–
60分钟。向各孔中添加100μl各测试抗体(或同种型对照)以达到50、25、12.5、6.25或3.125nm的抗体浓度。在添加免疫复合物(ic)之前使bmdc
–
抗体混合物孵育30
–
60分钟。制备足够的孔以测试各系列的抗体稀释液对cd4

和cd8

t细胞活化的抑制，并且一式三份进行测量。
[0358]
免疫复合物(ic)形成
[0359]
使2.5ml各抗nip-igg(2x浓度＝200μg/ml)和nip-卵白蛋白(“nip-ova”)(2x浓度＝200μg/ml)混合，并且在37℃下孵育60分钟以形成200μg/ml免疫复合物(ic)。制备5ml未处理(即未复合)的100μg/ml nip-ova样品。
[0360]
制备各测试抗体(或同种型对照)和ic的混合物以向bmdc中添加。也使各测试抗体与nip-ova混合以提供本底对照。具体来说，制备测试抗体的连续稀释液(100、50、25、12.5、6.25nm)，并且将250μl各稀释液添加至250μl ic中，以及添加至250μl 100μg/ml nip-ova中，从而产生含有50、25、12.5、6.25和3.125nm浓度的测试抗体的测试抗体 ic或测试抗体 nip-ova溶液。
[0361]
使含有经测试抗体处理的bdmc的96孔板离心，将除25μl/孔之外的所有培养基都抽除，并且将100μl的测试抗体 ic或测试抗体 nip-ova溶液添加至孔中，随后在37℃下孵育2-3小时。
[0362]
t细胞制备
[0363]
为获得cd8

t细胞，从雌性oti c57bl/6-tg(tcratcrb)1100m jb/j小鼠(jackson laboratory库存编号003831)的脾和淋巴结收集单细胞混悬液。这些转基因小鼠表达被设计以识别在h2kb的情形下的卵白蛋白残基257-264的转基因t细胞受体，并且用于研究肽在正性选择和cd8

t细胞对抗原的响应中的作用。miltenyi试剂盒用于耗竭非-cd8

细胞。
[0364]
为获得cd4

细胞，从雌性otii b6.cg-tg(tcratcrb)425cbn/j小鼠(jackson laboratory库存编号004194)的脾和淋巴结收集单细胞混悬液。这些转基因小鼠表达与cd4共受体配对且对在i-ab的情形下的鸡卵白蛋白323-339具有特异性的小鼠α链和β链t细胞受体。miltenyi试剂盒用于耗竭非-cd4

细胞。
[0365]
使含有bdmc、测试抗体和ic(或未复合的nip-ova)的96孔板离心，将除25μl/孔之外的所有都移除，并且用预升温的c-rpmi将孔洗涤两次。
[0366]
在37℃下以1.5x105/200μl/孔的量使t细胞(cd4

或cd8

)孵育24小时。从各孔收集150μl以通过elisa来定量il2。将150μl/孔的c-rpmi添加回各孔中，随后在37℃下再孵育48小时(总计72小时)。在那个点时，从各孔收集150μl以通过elisa来定量ifn-γ。
[0367]
通过由elisa测量il2和ifn-γ向培养上清液中的分泌来评估oti(cd8

)和otii(cd4

)t细胞对各培养条件的响应。测量来自24小时的稀释1至3倍(对于oti)和稀释1至20倍(对于otii)的两种培养物的il2。测量来自24小时的稀释1至3倍的oti培养物和72小时的稀释1至20倍的otii培养物的ifn-γ。
[0368]
实施例7
[0369]
免疫原性测试
[0370]
使抗体经受临床前离体t细胞测定(antitope ltd.)。使用被选择来代表在全世界人口中表达的hla-dr同种异型的数目和频率的群组，(antitope ltd.)测定通过定量t细胞对蛋白质治疗剂的响应来有效预测t细胞免疫原性。
[0371]
实施例8
[0372]
全血测定
[0373]
开发使用来自食蟹猴的全血的测定以测试抗fcrn抗体在生理相关环境中阻断细胞因子的产生的能力。向全血中添加0.1μg/ml nip-ova或结合有抗nip人igg的0.1μg/ml nip-ova。nip-ova-igg在测定中充当替代免疫复合物，其结合至fcrn并引发fcrn的效应物功能诸如细胞因子产生。添加nip-ova-igg导致大量产生细胞因子肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-6(il-6)、白介素-10(il-10)和白介素-1β(il-1β)(分别参见图8、9、10和14中的黑色棒条)。相比之下，添加单独nip-ova不导致细胞因子释放。当nip-ova-igg中的igg用ihh(一种在fc结构域中具有使与fcrn的结合消除的3个点突变(i253a/h310a/h435a)的抗nip人igg1)(qiao等,2008,proc.natl.acad.sci.usa 105:9337
–
9342)替换时，未观察到细胞因子释放，从而证明测定中测量的作用是fcrn依赖性的。
[0374]
在抗fcrn抗体h3vκ2存在下添加nip-ova-igg导致产生的细胞因子的量显著减少(分别参见图8、9、10和14中的灰色棒条)。这证明本文所述的抗fcrn抗体阻断fcrn与ic之间的相互作用的作用之一的有效性。值得注意的是在这个测定中，并非所有猴都产生大量细胞因子。因此，并非所有猴都展现细胞因子产生由h3vκ2可测量抑制。不产生大量细胞因子的那些猴将不是接受用抗fcrn抗体进行的疗法的良好候选者。相反，展现产生大量细胞因子且在h3vκ2存在下显示细胞因子产生得以良好抑制的那些猴将为接受用抗fcrn抗体进行的疗法的良好候选者。
[0375]
图11显示基于全血的测定的另一轮的结果，其中添加递增量的h3vκ2。如图的最右侧3个棒条所指示，观察到h3vκ2对产生的细胞因子的量的剂量依赖性抑制作用。
[0376]
上述全血测定适合于与来自人的全血一起使用。向来自人受试者的肝素化全血中添加1.0μg/ml至100μg/ml的各种浓度的nip-ova与稳定浓度的抗nip人igg或经突变以不结合fcrn的抗nip ihh的预先形成的免疫复合物。在37℃下孵育全血样品，并且在24或36小时之后通过elisa或珠粒阵列来测量细胞因子水平。如图17中所示，nip-ova-igg免疫复合物刺激多种不同细胞因子的释放，而缺乏由nip-ova-ihh免疫复合物所致的响应证明测定中测量的作用是fcrn依赖性的。
[0377]
图18显示在呈igg4形式的抗fcrn抗体h3e8和h3vκ2存在下添加nip-ova-igg导致产生的细胞因子的量减少。用呈f(ab’)2形式的h3vκ2和对照抗体再进行测定。结果显示于图19中，所述图19证明本文所述的抗fcrn抗体阻断人全血中fcrn与ic之间的相互作用的作用之一的有效性。
[0378]
实施例9
[0379]
igg清除研究
[0380]
进行使用转基因小鼠的体内研究以检查抗fcrn抗体对人igg清除的作用。将二十(20)只14.9周
±
3日龄的人fcgrt转基因半合性hfcrn tg小鼠分成组1和2，各自含有5只雌
性和5只雄性。在第0天，所有小鼠都通过静脉内注射用人ivig以245mg/kg预给药，所述人ivig与5mg/kg的鸡卵溶菌酶特异性人源化igg1 mab hulys11掺混，以达成总计250mg/kg igg。在用人igg//hulys11静脉内注射后48、56、72、80、96、120和144小时从各小鼠收集血液样品。在48小时血液抽取之后1小时，静脉内施用20mg/kg h3vκ2或pbs。通过elisa来定量hulys 11的血浆浓度。相较于pbs对照组，用20mg/kg h3vκ2处理在hulys11的血浆浓度方面产生高度显著的3倍降低(p＝0.0001)。这个结果证明由h3vκ2导致的hfcrn阻断促进higg从循环清除。
[0381]
图15显示研究结果，其被绘制成基于在48小时血液抽取之后2小时注射20mg/kg synt001之前，在48小时时小鼠血浆中hulys11的量的剩余hulys11(人igg1)百分比(
±
标准误差)。
[0382]
实施例10
[0383]
免疫复合物清除研究
[0384]
根据qiao sw,pnas 2008进行使用转基因小鼠的体内研究以检查抗fcrn抗体对在体外形成并静脉内输注至hfcrn tg小鼠中的多聚免疫复合物的作用。将十六(16)只8.1周 /-3日龄的人fcgrt转基因半合性hfcrn tg小鼠随机分成2组，各组具有8只小鼠(4只雄性/4只雌性)。通过在室温下在pbs中使750μg/ml的
nip
higg抗-nip抗体与75μg/mlnip缀合的卵白蛋白(每个ova具有11个nip分子)一起孵育20分钟来形成多聚ic。在第0天，来自各组的8只小鼠通过静脉内注射分别7.5mg/kg和0.75mg/kg的
nip
higg/nip-ova ic预给药。这等效于150μg
nip
higg 15μg nip-ova用于20g体重的剂量。在用免疫复合物静脉内注射后24、32、48、56、72、96和120小时收集血液样品。在24小时血液抽取之后1小时，静脉内施用20mg/kg h3vκ2或pbs。通过elisa来定量
nip
higg的血浆浓度。这个体内实验的结果确认h3vκ2抑制由fcrn对在igg与抗原之间形成的免疫复合物的分解代谢提供的保护作用，此类似于在实施例9中对单体igg所见的结果。
[0385]
图16显示研究结果，其被绘制成在指示的时间点基于24小时基线的平均剩余ic％(
±
标准误差)。
[0386]
实施例11
[0387]
单核细胞fcrn表达
[0388]
食蟹猴全血样品的单核细胞fcrn表达用以表征在注射抗fcrn抗体之后的药物动力学性质和额外药效动力学标志物的响应。通过用媒介物(组1)、h3vκ2在10mg/kg/剂量下(组2)、h3vκ2在40mg/kg/剂量下(组3)或h3e8在40mg/kg/剂量下(组4)静脉内注射来每周一次持续4周对食蟹猴给药，继之以4周恢复时期。通过静脉穿刺来将全血样品收集至含有k2edta抗凝剂的管中，并且保持在室温下直至分析。在初始注射抗fcrn抗体之前，在首次注射之后2小时，接着在各次随后注射之前即刻，以及在各次随后注射之后2小时获取2个样品。血液的等分试样用于通过advia来测量白血细胞计数(总数、绝对数和百分比差值(percent differential))。将白血细胞计数和总淋巴细胞计数(tlc)报道为每μl全血的淋巴细胞数(细胞/μl)。将单核细胞计数报道为相对百分比(％)以及每μl全血的淋巴细胞数(细胞/μl)。
[0389]
使用具有facsdivatm软件的facscantotm ii流式细胞仪，通过流式细胞术来分析细胞外和细胞内单核细胞fcrn表达水平。对于单核细胞上的细胞外和细胞内fcrn受体表
达，报道cd45 cd14 fcrn 细胞中fcrn表达的几何平均荧光强度(geomfi)和来自cd14 单核细胞群体的表达fcrn的cd14 单核细胞的百分比值。此外，报道单核细胞(cd45 /cd14 )绝对计数和相对百分比。
[0390]
在大多数给药动物中，当相较于研究前时间点时，对于在各时间点在给药后2小时cd45 /cd14 fcrn 细胞上的细胞外fcrn表达的几何平均荧光强度(geomfi)获得降低倾向，如表15中所示。这些变化被视为是抗fcrn抗体与fcrn受体的结合增加的结果。通常，在各次预定给药之前，geomfi值恢复至研究前水平。在所有处理组中观察到这个样式，并且在接受10mg/kg/剂量的h3vκ2、40mg/kg/剂量的h3vκ2和40mg/kg/剂量的h3e8的各组之间，降低的幅度是类似的。对于cd14 单核细胞中的细胞外fcrn表达，未观察到cd45 /cd14 /fcrn 的相对百分比的变化。
[0391]
当考虑总体可变性和在各时间点时缺乏倾向时，在主要时期和恢复时期期间，在所有处理组中，对于cd14 单核细胞中的细胞内fcrn表达，在白血细胞计数方面、在cd45 /cd14 /fcrn 的相对百分比和几何平均值方面，不存在synt001-h3vk2或synt001-h3e8相关变化。
[0392]
这些数据表明细胞表面单核细胞fcrn表达可用作抗fcrn抗体药物水平的替代标志。
[0393][0394]