培养基用组合物

1.(相关申请)
2.本技术主张2019年11月25日向日本专利局申请的日本技术编号第2019-211991号的权益。出于所有目的，该日本技术以其申请文件(说明书、权利要求书、附图、说明书摘要)全部在本说明书中公开的方式作为参照而引入本说明书。
3.本发明属于再生医疗的技术领域。本发明涉及在该技术领域中能够在从体细胞向褐色脂肪细胞分化诱导时使用的培养基用组合物、以及用于保持被分化诱导的褐色脂肪细胞的培养基用组合物。


背景技术：

4.近年来，正在积极地研究在进行将基因导入体细胞的情况下利用低分子化合物将成纤维细胞这样的体细胞直接转变为其它细胞的方法(直接重编程：direct reprogramming)。例如，在专利文献1中，将alk5抑制剂、alk6抑制剂等若干低分子化合物进行组合，在其存在下对体细胞、特别是人成纤维细胞进行培养，并从其直接诱导为褐色脂肪细胞等。如专利文献1的发明那样，如果能够利用容易获得的低分子化合物从普通的成纤维细胞直接诱导成褐色脂肪细胞等细胞，将会是非常有益的。例如，由于能够从自体的成纤维细胞简便地制备自体的其它细胞，因此提高了在再生医疗上的应用。另外，可以容易地制备作为用于新药开发的实验材料的细胞。
5.非专利文献1也与专利文献1同样，在若干低分子化合物的组合的存在下培养人皮肤成纤维细胞，由所述成纤维细胞直接诱导为褐色脂肪细胞。具体而言，在非专利文献1的发明中，在sb431542(alk5抑制剂)、ldn193189(alk2/3抑制剂)、dorsomorphin(alk2/3/6抑制剂)、毛喉素(camp诱导剂)、以及罗格列酮(pparγ激动剂)这样的低分子化合物的存在下培养人皮肤成纤维细胞，从所述成纤维细胞直接诱导为褐色脂肪细胞。专利文献1中也公开了所述低分子化合物的组合。
6.从上述这样的体细胞向褐色脂肪细胞等的分化诱导必须通过在包含其它的化合物、营养素等的培养基中进行培养而进行。作为该培养基，可以列举例如：作为通常的培养基的mem(最低必需培养基)、dmem(dulbecco改良eagle培养基)、dmem/f12、或者对它们进行了改良而得到的培养基，它们是市售的。另外，通常考虑到待诱导的细胞而将适当的成分(血清、蛋白质、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等)适宜添加至这些培养基中进行细胞的分化诱导。其中，由于胎牛血清(fbs)这样的血清中包含激素、生长因子、粘附因子等细胞增殖所必需的成分，因此经常添加血清进行分化诱导。专利文献1、非专利文献1的发明也利用添加有fbs的培养基进行了分化诱导。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1：国际公开第2018/062269号
10.非专利文献
11.非专利文献1：takeda y.,harada y.,yoshikawa t.,and dai p.,sci.rep.,7,4304(2017)


技术实现要素：

12.发明要解决的课题
13.本发明以提供能够在从体细胞向褐色脂肪细胞进行分化诱导时所使用的新的培养基用组合物作为主要的课题。另外，本发明还在于提供用于保持被分化诱导而得到的褐色脂肪细胞的新的培养基用组合物。
14.解决课题的方法
15.本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过包含一定的低分子化合物的培养基用组合物，可以解决上述课题，从而完成了本发明。
16.作为本发明，例如，可以举出下述发明。
17.[1]一种分化诱导培养基用组合物，其是从体细胞向褐色脂肪细胞进行分化诱导时所使用的培养基用组合物，其包含以下的7种成分。
[0018]
·
甲状腺激素受体激动剂
[0019]
·
糖皮质激素受体激动剂
[0020]
·
磷酸二酯酶抑制剂
[0021]
·
胰岛素
[0022]
·
抗坏血酸衍生物
[0023]
·
白蛋白
[0024]
·
抗生素
[0025]
[2]根据上述[1]所述的分化诱导培养基用组合物，其中，上述分化诱导是在不向体细胞导入基因的情况下直接进行的。
[0026]
[3]根据上述[1]或[2]所述的分化诱导培养基用组合物，其中，甲状腺激素受体激动剂为三碘甲状腺原氨酸，糖皮质激素受体激动剂为地塞米松，磷酸二酯酶抑制剂为异丁基甲基黄嘌呤，抗坏血酸衍生物为l-抗坏血酸2-磷酸酯，白蛋白为结合有亚油酸和油酸的白蛋白或脂肪酸非结合白蛋白，或者抗生素为青霉素和/或链霉素。
[0027]
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的分化诱导培养基用组合物，其进一步包含选择性pparγ激动剂、或选择性pparγ激动剂及camp诱导剂和/或bmp7。
[0028]
[5]根据上述[4]所述的分化诱导培养基用组合物，其中，选择性pparγ激动剂为罗格列酮，或者camp诱导剂为毛喉素。
[0029]
[6]一种分化诱导培养基，其包含上述[1]～[5]中任一项所述的分化诱导培养基用组合物，且无血清。
[0030]
[7]根据上述[6]所述的分化诱导培养基，其是在dmem培养基中添加上述[1]～[5]中任一项所述的分化诱导培养基用组合物而成的。
[0031]
[8]根据上述[7]所述的分化诱导培养基，其中，上述dmem培养基为高葡萄糖dmem培养基。
[0032]
[9]根据上述[7]或[8]所述的分化诱导培养基，其中，上述dmem培养基含有l-谷氨酰胺。
[0033]
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的分化诱导培养基用组合物或分化诱导培养基，其中，上述体细胞为成纤维细胞。
[0034]
[11]一种褐色脂肪细胞，其是使用上述[1]～[10]中任一项所述的分化诱导培养基用组合物或分化诱导培养基制备的。
[0035]
[12]一种保持培养基用组合物，其是用于保持从体细胞分化诱导而制备的褐色脂肪细胞的培养基用组合物，其包含以下的5种成分。
[0036]
·
选择性pparγ激动剂
[0037]
·
糖皮质激素受体激动剂
[0038]
·
胰岛素
[0039]
·
白蛋白
[0040]
·
抗生素
[0041]
[13]根据上述[12]所述的保持培养基用组合物，其中，选择性pparγ激动剂为罗格列酮，糖皮质激素受体激动剂为地塞米松，白蛋白为结合有亚油酸和油酸的白蛋白或脂肪酸非结合白蛋白，或者抗生素为青霉素和/或链霉素。
[0042]
[14]一种保持培养基，其包含上述[12]或[13]所述的保持培养基用组合物，且无血清。
[0043]
[15]根据上述[14]所述的保持培养基，其是在dmem培养基中添加上述[12]或[13]所述的保持培养基用组合物而成的。
[0044]
[16]根据上述[15]所述的保持培养基，其中，上述dmem培养基为高葡萄糖dmem培养基。
[0045]
[17]根据上述[15]或[16]所述的保持培养基，其中，上述dmem培养基含有l-谷氨酰胺及丙酮酸盐。
[0046]
[18]根据上述[12]～[17]中任一项所述的保持培养基用组合物或保持培养基，其中，上述体细胞为成纤维细胞。
[0047]
发明的效果
[0048]
根据本发明，可以有效地进行从体细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导。另外，根据本发明，可以有效地保持从体细胞分化诱导得到的褐色脂肪细胞。
附图说明
[0049]
图1示出了ucp1基因的表达量。符号1示出了比较例6(对照)，符号2示出了实施例1，符号3示出了比较例1，符号4示出了比较例2，符号5示出了比较例3，符号6示出了比较例4，符号7示出了比较例5。纵轴示出了该mrna量相对于内标基因(tbp)的表达量的相对值。
[0050]
图2示出了fabp4基因的表达量。各符号及纵轴与图1相同。
[0051]
图3示出了ucp1基因的表达量。符号1示出了实施例2，符号2示出了实施例3，符号3示出了实施例4，符号4示出了比较例7，符号5示出了实施例5，符号6示出了比较例8，符号7示出了实施例6。纵轴示出了该mrna量相对于内标基因(tbp)的表达量的相对值。
[0052]
图4示出了fabp4基因的表达量。各符号及纵轴与图3相同。
[0053]
图5是用化合物的组合从成纤维细胞直接诱导而成的培养细胞(实施例7)及将该细胞在保持培养基中孵育后的细胞(实施例8)的照片、以及将这些细胞的线粒体(红)、ucp1
蛋白质(绿)及细胞核(蓝)进行免疫染色后的照片。由于图5是单色的，因此没有显示出红、绿及蓝等各种颜色，但图5的原始照片中显示出各种颜色。
[0054]
图6示出了基因的表达量。在各图中，纵轴示出了该mrna量相对于内标基因(tbp)的mrna量的相对值。横轴数值示出了时间(周)。
[0055]
图7示出了基因的表达量。在各图中，纵轴示出了该mrna量相对于内标基因(tbp)的mrna量的相对值。横轴数值示出了时间(周)。
[0056]
图8示出了ucp1基因的表达量。符号1示出了对照，符号2示出了实施例11，符号3示出了实施例12，符号4示出了比较例13，符号5示出了实施例14。纵轴示出了该mrna量相对于内标基因(tbp)的表达量的相对值。
[0057]
图9示出了ckmt1基因的表达量。各符号及纵轴与图8相同。
具体实施方式
[0058]
以下，对本发明详细地进行说明。
[0059]
1关于分化诱导培养基用组合物
[0060]
本发明的分化诱导培养基用组合物(以下称为“本发明诱导组合物”)是在从体细胞向褐色脂肪细胞分化诱导时使用的培养基用组合物，其包含以下的7种成分。
[0061]
·
甲状腺激素受体激动剂
[0062]
·
糖皮质激素受体激动剂
[0063]
·
磷酸二酯酶抑制剂
[0064]
·
胰岛素
[0065]
·
抗坏血酸衍生物
[0066]
·
白蛋白
[0067]
·
抗生素
[0068]
上述各成分分别可以使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0069]
从体细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导可以基于不向体细胞进行人工的基因导入而利用低分子化合物进行直接转变的所谓直接重编程，也可以基于向体细胞进行人工的基因导入的方法。其中，本发明诱导组合物优选用于不向体细胞导入基因而直接进行的分化诱导。
[0070]
另外，作为本发明，可以举出包含本发明诱导组合物且无血清的分化诱导培养基(以下称为“本发明诱导培养基”)。
[0071]
这里，“无血清”是指实质上不包含无调整或未纯化的血清，在本发明中，即使在分化诱导培养基或保持培养基中混入经纯化的血液来源的成分、动物组织来源的成分，只要实质上不包含无调整或未纯化的血清，也可称为无血清的分化诱导培养基或保持培养基。
[0072]
本发明中的“褐色脂肪细胞”是从体细胞人工分化诱导而得到的，具有大量的线粒体和大量的脂肪滴，并表达ucp1(uncoupling protein-1：解偶联蛋白)基因。另外，该褐色脂肪细胞也包括从白色脂肪细胞或其前体细胞诱导的所谓的人米色细胞、亮细胞(bright cell)。还包括通过不向体细胞进行人工的基因导入而利用低分子化合物进行直接转变的方法制备的所谓的低分子化合物诱导性褐色脂肪细胞(cibas：chemical compound-induced brown adipocytes)。此外，除了终末分化的褐色脂肪细胞以外，还包括注定要分
化成褐色脂肪细胞的前体细胞。
[0073]
本发明诱导组合物或本发明诱导培养基可以进一步包含选择性pparγ激动剂、或选择性pparγ激动剂及camp诱导剂和/或bmp7作为向褐色脂肪细胞分化诱导的有效成分。其中，优选进一步包含选择性pparγ激动剂，更优选进一步包含选择性pparγ激动剂和camp诱导剂这两种成分、或者选择性pparγ激动剂、camp诱导剂及bmp7这三种成分。
[0074]
1.1关于体细胞
[0075]
生物的细胞可以分类为体细胞和生殖细胞。本发明的制备方法可以使用任意的体细胞作为其起始材料。体细胞没有特别限定，可以是从生物体采集的原代细胞或确立细胞株中的任意细胞。在本发明的制备方法中，可以使用处于分化的各种阶段的体细胞，例如，终末分化的体细胞(例如，成纤维细胞、脐静脉内皮细胞(huvec)、肝细胞(hepatocytes)、胆管细胞(biliary cells)、胰腺α细胞(pancreaticαcells)、胰腺腺泡细胞(acinar cells)、胰腺导管细胞(ductal cells)、小肠隐窝细胞(intestinal crypt cells)等)、处于向终末分化的过程中的体细胞(例如，间充质干细胞、神经干细胞、内胚层祖细胞等)、或已经初始化而获得了多能性的ips细胞这样的体细胞及从ips细胞分化的或正在分化过程中的体细胞。作为能够用于本发明的制备方法的体细胞，可以列举任意的体细胞，例如，造血系统的细胞(各种淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、骨髓细胞等)、器官来源的细胞(肝细胞、脾细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞等)、肌肉组织系统的细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、心肌细胞等)、成纤维细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、间质细胞、脂肪细胞(白色脂肪细胞等)、胚胎干细胞(es细胞)等。另外，这些细胞的前体细胞、癌细胞也可以适用本发明的制备方法。优选可以使用成纤维细胞。
[0076]
作为本发明中可使用的成纤维细胞，没有特别限定，可以列举例如：皮肤成纤维细胞(dermal fibroblasts)、主动脉外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts)、心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts)、肺成纤维细胞(pulmonary fibroblasts)、子宫成纤维细胞(uterine fibroblasts)、绒毛膜间充质成纤维细胞(villous mesenchymal fibroblasts)等在各种组织、器官中构成结缔组织的主要细胞成分、且是进行胶原纤维生产的细胞。
[0077]
作为上述的体细胞的供给源，可以示例出人、除人以外的哺乳动物、以及除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等)，但并不限定于此。作为体细胞的供给源，优选为人、以及除人以外的哺乳动物，特别优选为人。在分化诱导以对人施用为目标的褐色脂肪细胞的情况下，优选可以使用从与受体的组织相容性抗原的类型一致或类似的供体采集到的体细胞。可以提供从受体本身采集到的体细胞。
[0078]
1.2关于各成分
[0079]
1.2.1甲状腺激素受体激动剂
[0080]
作为甲状腺激素受体激动剂，只要与甲状腺激素受体结合并具有该激素样作用即可，没有特别限定，例如，可以举出以下的化合物。优选可以举出：三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素。
[0081]
三碘甲状腺原氨酸(cas no.：6893-02-3)
[0082]
[化学式1]
[0083][0084]
3,5-二碘甲状腺原氨酸二水合物(cas no.：18835-59-1)
[0085]
替拉曲可(cas no.：51-24-1)
[0086]
碘塞罗宁钠(cas no.：55-06-1)
[0087]
l-甲状腺素(cas no.：51-48-9)
[0088]
甲状腺激素受体激动剂的浓度根据该激动剂的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，可以优选在1nmol/l～10μmol/l、优选在0.01μmol/l～1μmol/l的范围内使用。
[0089]
1.2.2糖皮质激素受体激动剂
[0090]
作为糖皮质激素受体激动剂，只要与糖皮质激素受体结合并具有糖皮质激素样作用即可，没有特别限定，例如，可以举出以下的化合物。优选可以列举：地塞米松、氢化可的松、皮质酮、可的松。
[0091]
地塞米松(cas no.：50-02-2)
[0092]
[化学式2]
[0093][0094]
地塞米松磷酸钠(cas no.：55203-24-2)
[0095]
醋酸地塞米松(cas no.：1177-87-3)
[0096]
甲泼尼龙(cas no.：1247-42-3)
[0097]
醋酸氟轻松(cas no.：67-73-2)
[0098]
布地奈德(cas no.：51333-22-3)
[0099]
去羟米松(cas no.：382-67-2)
[0100]
原人参三醇(cas no.：34080-08-5)
[0101]
曲安西龙(cas no.：124-94-7)
[0102]
丙酸倍氯米松(cas no.：5534-09-8)
[0103]
泼尼松龙(cas no.：50-24-8)
[0104]
氢化可的松(cas no.：50-23-7)
[0105]
地夫可特(cas no.：14484-47-0)
[0106]
曲安奈德(cas no.：76-25-5)
[0107]
氟轻松(cas no.：356-12-7)
[0108]
甲基泼尼松龙琥珀酸钠(cas no.：2921-57-5)
[0109]
环索奈德(cas no.：126544-47-6)
[0110]
氟米松(cas no.：2135-17-3)
[0111]
氟米龙(cas no.：426-13-1)
[0112]
倍他米松二丙酸酯(cas no.：5593-20-4)
[0113]
倍他米松戊酸酯(cas no.：2152-44-5)
[0114]
糠酸莫米松(cas no.：83919-23-7)
[0115]
氟替卡松丙酸酯(cas no.：80474-14-2)
[0116]
醋酸可的松(cas no.：50-04-4)
[0117]
可托多松(cas no.：152-58-9)
[0118]
氯替泼诺(cas no.：82034-46-6)
[0119]
倍他米松(cas no.：378-44-9)
[0120]
甲基泼尼松龙(cas no.：83-43-2)
[0121]
皮质酮(cas no.：50-22-6)
[0122]
可的松(cas no.：53-06-5)
[0123]
糖皮质激素受体激动剂的浓度根据该激动剂的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，优选可以在0.01μmol/l～30μmol/l、优选在0.1μmol/l～10μmol/l的范围内使用。
[0124]
1.2.3磷酸二酯酶抑制剂
[0125]
作为磷酸二酯酶抑制剂，只要能够通过抑制磷酸二酯酶(pde)、其中特别是pde3、pde4、pde5而使细胞内的camp浓度上升即可，没有特别限定，例如，可以举出以下的化合物。优选可以举出异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)、咯利普兰。
[0126]
异丁基甲基黄嘌呤(cas no.：28822-58-4)
[0127]
[化学式3]
[0128][0129]
罗氟司特(cas no.：162401-32-3)
[0130]
西地那非(cas no.：139755-83-2)
[0131]
他达那非(cas no.：171596-29-5)
[0132]
盐酸伐地那非水合物(cas no.：330808-88-3)
[0133]
匹莫苯丹(cas no.：74150-27-9)
[0134]
gsk256066(cas no.：801312-28-7)
[0135]
咯利普兰(cas no.：61413-54-5)
[0136]
阿普斯特(cas no.：608141-41-9)
[0137]
西洛他唑(cas no.：73963-72-1)
[0138]
米力农(cas no.：78415-72-2)
[0139]
阿伐那非(cas no.：330784-47-9)
[0140]
咯利普兰(cas no.：85416-73-5)
[0141]
芬司匹利(cas no.：5053-08-7)
[0142]
乌地那非(cas no.：268203-93-6)
[0143]
西洛他胺(cas no.：68550-75-4)
[0144]
异丁司特(cas no.：50847-11-5)
[0145]
木犀草素(cas no.：491-70-3)
[0146]
磷酸二酯酶抑制剂的浓度根据该抑制剂的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，优选可以在1μmol/l～1mmol/l、优选在10μmol/l～0.5mmol/l的范围内使用。
[0147]
1.2.4抗坏血酸衍生物
[0148]
作为抗坏血酸衍生物，只要是维生素c(l-抗坏血酸)、对其不稳定性进行了改进而得到的衍生物即可，没有特别限定。具体而言，例如，可以举出维生素c(l-抗坏血酸)、l-抗坏血酸2-磷酸酯(2paa)等以下的化合物。
[0149]
l-抗坏血酸-2-磷酸钠(cas no.：66170-10-3)
[0150]
[化学式4]
[0151][0152]
抗坏血酸棕榈酸酯(cas no.：137-66-6)
[0153]
抗坏血酸钠(cas no.：134-03-2)
[0154]
抗坏血酸衍生物的浓度根据该衍生物的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，优选可以在1μg/ml～1mg/ml、优选在10μg/ml～250μg/ml的范围内使用。
[0155]
1.2.5胰岛素、脂肪酸结合型白蛋白、以及抗生素
[0156]
胰岛素是由胰腺的β细胞分泌的肽激素，在本发明中，可以使用动物来源的胰岛素，也可以使用人来源的胰岛素。另外，可以是化学合成的胰岛素，也可以是由基因重组技术制造的重组胰岛素。
[0157]
在本发明中，优选使用人胰岛素。
[0158]
胰岛素的浓度根据该胰岛素的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，优选在100ng/ml～20μg/ml的范围内使用。
[0159]
白蛋白可以是结合了脂肪酸的脂肪酸结合型白蛋白，也可以是从白蛋白中去除了脂肪酸后的脂肪酸非结合型(无脂肪酸)白蛋白。作为该白蛋白，例如，可以举出从动物(例
如牛)的血清纯化而得到的白蛋白、使该纯化白蛋白与已知的脂肪酸结合而成的白蛋白、使用动物细胞或植物细胞表达得到的重组白蛋白。特别优选为已经确认了没有动物来源成分的重组白蛋白、纯化白蛋白与已知的脂肪酸结合而成的白蛋白。另外，优选为人来源的白蛋白。
[0160]
作为与白蛋白结合的脂肪酸，可以列举例如：亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)等代表性的饱和及不饱和脂肪酸。优选为亚油酸与油酸的混合脂肪酸。
[0161]
作为脂肪酸结合型白蛋白的具体例，可以举出从动物的血清纯化得到的白蛋白、亚油酸及油酸结合型白蛋白。在本发明中，可以使用市售的脂肪酸结合型的牛血清白蛋白(例如，l9655：sigma-aldrich公司制)。
[0162]
需要说明的是，在后述的实验结果中，使用脂肪酸非结合型的白蛋白诱导得到的褐色脂肪细胞的ucp1基因的表达量远高于使用脂肪酸结合型白蛋白诱导的那些(参照图8、图9)。另外，在从成纤维细胞向褐色脂肪细胞的诱导中，优选不添加脂肪酸。在脂肪生物合成活性高的间充质干细胞来源的脂肪细胞中并没有观察到这些。
[0163]
白蛋白的浓度可以根据该白蛋白的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，例如，可以在0.1mg/ml～10mg/ml、优选为在0.5mg/ml～4mg/ml的范围内使用。
[0164]
作为抗生素，只要能够用于动物的细胞培养即可，没有特别限定，可以列举例如：青霉素类、头孢类、单环内酰胺类等β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类、、大环内酯类、四环素类、肽类、核酸类、多烯类。具体而言，可以列举例如：放线菌素d、两性霉素b、氨苄青霉素、抗霉素a、巴弗洛霉素a1、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、刀豆霉素b、红霉素、g418、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素c、新霉素、寡霉素、青霉素、嘌呤霉素、雷帕霉素、链霉素、四环素、妥布霉素、缬氨霉素。其中，在本发明中，青霉素与链霉素的组合使用是适当的。
[0165]
抗生素的含量根据该抗生素的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，例如，可以在10units/ml～1000units/ml、优选在50units/ml～200units/ml的范围内使用。另外，根据抗生素的种类，可以在10μg/ml～1000μg/ml、优选在50μg/ml～200μg/ml的范围内使用。
[0166]
1.2.6关于选择性pparγ激动剂
[0167]
pparγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ)是属于核受体超级家族的蛋白质之一，是通过与视黄醇x受体(rxr)形成异二聚体并与靶基因的启动子区域结合而控制基因表达的转录因子。ppar中存在α、δ(β)、γ这3种亚型，在本发明中使用选择性地与其中的γ作用的激动剂。
[0168]
在本发明中，作为选择性pparγ激动剂，可以使用例如以下的化合物或其盐，但没有特别限定。优选可以举出噻唑烷类的选择性pparγ激动剂剂，具体可以列举：罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮。
[0169]
罗格列酮(cas no.：122320-73-4)
[0170]
[化学式5]
[0171][0172]
马来酸罗格列酮(cas no.：155141-29-0)
[0173]
环格列酮(cas no.：74772-77-3)
[0174]
依格列宗(cas no.：213411-83-7)
[0175]
gw1929盐酸盐(cas no.：1217466-21-1)
[0176]
ntzdpa(cas no.：118414-59-8)
[0177]
盐酸吡格列酮(cas no.：112529-15-4)
[0178]
s26948(cas no.：353280-43-0)
[0179]
曲格列酮(cas no.：97322-87-7)
[0180]
巴格列酮(cas no.：199113-98-9)
[0181]
利格列酮(cas no.：185428-18-6)
[0182]
选择性pparγ激动剂的浓度根据该激动剂的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，例如，可以在0.1μmol/l～20μmol/l、优选在0.5μmol/l～5μmol/l的范围内使用。
[0183]
1.2.7关于camp诱导剂
[0184]
camp(环磷酸腺苷)是作为第二信使参与各种细胞内信号转导的物质。camp在细胞内通过利用腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)将三磷酸腺苷(atp)环化而生成。
[0185]
在本发明中，例如，可以举出毛喉素(毛喉素：cas no.：66575-29-9)、以及毛喉素衍生物(例如，日本特开2002-348243号公报)、以下的化合物等作为camp诱导剂(腺苷酸环化酶激活剂)，但没有特别限定。可以优选使用毛喉素。
[0186]
毛喉素(cas no.：66428-89-5)
[0187]
[化学式6]
[0188][0189]
异丙肾上腺素(cas no.：7683-59-2)
[0190]
nkh477(cas no.：138605-00-2)
[0191]
pacap1-27(cas no.：127317-03-7)
[0192]
pacap1-38(cas no.：137061-48-4)
[0193]
camp诱导剂的浓度根据该衍生物的种类、所使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，例如，可以在0.1μmol/l～100μmol/l、优选在0.5μmol/l～30μmol/l的范围内使用。
[0194]
1.2.8关于bmp7
[0195]
bmp(bone morphogenetic protein：骨形成蛋白)7是bmp家族之一。人bmp7由117个残基的氨基酸组成，以同源二聚体的形式与细胞表面的受体结合，激活bmp信号通路。从bmp2至bmp7的6种被分类为tgfb超级家族，分别由不同的基因编码。在本发明中，可以是人来源的bmp7，也可以是动物来源的bmp7，还可以是它们的重组体。其中，优选使用人来源的bmp7。
[0196]
bmp7的浓度根据该bmp7的种类、使用的体细胞等而不同，没有特别限定，可以适当确定，例如，可以在0.1ng/ml～200ng/ml、优选为1ng/ml～50ng/ml的范围内使用。
[0197]
1.3体细胞的培养
[0198]
本发明诱导组合物可以作为用于从体细胞进行分化诱导而制备褐色脂肪细胞的组合物来使用。另外，本发明诱导组合物或本发明诱导培养基也可以作为用于从体细胞进行分化诱导而制备褐色脂肪细胞的培养基来使用。
[0199]
对于体细胞的培养而言，例如，可以将体细胞加入混合细胞的培养所需要的成分而制成的基础培养基、包含具有对分化诱导为褐色脂肪细胞有效的成分的本发明诱导组合物的培养基、或具有对分化诱导为褐色脂肪细胞有效的成分的本发明诱导培养基(无血清)中，根据所使用的体细胞的种类适当选择温度、其它条件，通过通常方法来进行。
[0200]
对分化诱导为褐色脂肪细胞有效的成分只要以对褐色脂肪细胞的制备有效的浓度而包含即可，本领域技术人员可以适当确定其浓度。上述的基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用作为通常的基本培养基的mem(eagle最低必需培养基)、gmem(glasgow’s最低必需培养基)、dmem(dulbecco改良eagle培养基)、ham’s f-12、dmem/f12、rpmi1640、imdm(iscov’s改良dulbecco培养基)或将它们改良而得到的培养基作为基础培养基。
[0201]
作为本发明诱导培养基的一个方式，可以举出在dmem培养基中添加本发明诱导组合物而成的分化诱导培养基。“dmem培养基”是在哺乳类细胞的培养中广泛使用的本领域技术人员公知的基础培养基，基本包含氨基酸、无机盐、d-葡萄糖、以及维生素。在本发明中，优选使用高葡萄糖dmem培养基、包含l-谷氨酰胺及丙酮酸盐的dmem培养基。
[0202]
有时可以使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基，通过一步培养从体细胞进行分化诱导而制备褐色脂肪细胞，另外，也可以通过选择容易培养的细胞作为待使用的体细胞等，将预先使细胞数增加而达到基本汇合的状态的体细胞进行分化诱导来制备褐色脂肪细胞。
[0203]
作为培养条件，可以选择通常的细胞培养的条件。可示例出37℃、5％co2的条件等。在培养中优选以适当的间隔(优选为1天～5天1次、更优选为2天～3天1次)更换培养基。
[0204]
体细胞的培养可以使用培养板、培养皿、细胞培养用烧瓶、细胞培养用袋等细胞培养容器。需要说明的是，作为细胞培养用袋，优选具有透气性。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。培养可以在开放体系或封闭体系中的任意一种中实施，在以得到的褐色脂肪细胞对人施用等作为目标的情况下，优选在封闭体系中进行培养。
[0205]
1.4褐色脂肪细胞的检测/确认等
[0206]
使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞例如可以利用细胞的形态的变化、褐色脂肪细胞的特征性质、特异性标记物进行检测、确认及分离。
[0207]
脂肪细胞将脂肪积蓄在细胞内。因此，可以通过使用了油红o的细胞内脂肪的染色来检测脂肪细胞。
[0208]
作为褐色脂肪细胞的特异性标记物，可以列举：ucp1、evol3(elongation of very long chain fatty acid protein 3)、pgc1a(ppar gamma coactivator1-alpha)、prdm16(prd1-bf1-riz1 homologous domain containing 16)、cited1(cbp/p300 interacting transactivator with glu/asp rich carboxy-terminal domain 1)等，但并不限定于此。ucp1是解偶联蛋白(uncoupling protein)的一种。
[0209]
特异性标记物的检测可以利用检疫的方法(基于抗体的检测)，关于蛋白质分子，也可以通过其mrna量的定量来实施检测。识别褐色脂肪细胞的特异性标记物的抗体在对使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基得到的褐色脂肪细胞进行分离及纯化方面是有用的。
[0210]
使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞例如可以用于外科治疗后的组织修复等。使用通过本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞，可以制造用于组织修复等的医药用组合物。另外，期待褐色脂肪细胞向生物体的移植、施用具有改善生物体的代谢、防止肥胖等效果。
[0211]
在将褐色脂肪细胞制成医药用组合物的情况下，可以通过通常方法将褐色脂肪细胞与医药上可接受的载体进行混合等而制成适合向个体给药的形式的制剂。作为载体，例如，可以举出加入生理盐水、葡萄糖、其它辅助剂(例如，d-山梨糖醇、d-甘露糖醇、氯化钠等)而等张的注射用蒸馏水。还可以进一步配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、无痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
[0212]
使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞也可以制成进一步与对发挥褐色脂肪细胞的功能、提高移植性有效的其它细胞或成分组合而成的组合物。
[0213]
另外，使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞也可以用于作用于褐色脂肪细胞的医药候选化合物的筛选、医药候选化合物的安全性评价。因此，使用利用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞，可以筛选增强褐色脂肪细胞的糖/脂质代谢及产热功能的药剂。用于该筛选的医药候选化合物例如包括所谓的生活习惯病治疗药、代谢疾病治疗药、其它的药库药物等现有药。食品成分例如包括维生素类、糖类、氨基酸、矿物质等广泛的食品的营养素、功能性食品的成分、中药、草药、其它食品中的低分子化合物及蛋白质、脂质等。
[0214]
上述筛选例如可以通过以下方式实施：向使用本发明诱导组合物或本发明诱导培养基制备的褐色脂肪细胞或其制备过程中的细胞添加受试物质，对由该受试物质所引起的该细胞的褐色化倾向的增强程度进行评价。在所述评价中，例如，可以利用例如实时pcr对ucp1基因及fabp4基因的表达量进行定量，使其比值作为褐色化倾向的指标。由此分析的增强褐色化倾向的医药候选化合物、食品成分可以成为能够在人体内增加褐色脂肪细胞(米色细胞)的有力的候选化合物。
[0215]
2关于保持培养基用组合物
[0216]
本发明的保持培养基用组合物(以下称为“本发明保持组合物”)是用于保持从体
细胞进行分化诱导而制造的褐色脂肪细胞的培养基用组合物，包含以下的5个成分。
[0217]
·
选择性pparγ激动剂
[0218]
·
糖皮质激素受体激动剂
[0219]
·
胰岛素
[0220]
·
白蛋白
[0221]
·
抗生素。
[0222]
上述各成分分别可以使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0223]
另外，作为本发明，可以举出包含本发明保持组合物且无血清的保持培养基(以下称为“本发明保持培养基”)。
[0224]
这里，与“体细胞”、“分化诱导”、“无血清”、“褐色脂肪细胞”、“选择性pparγ激动剂”、“糖皮质激素受体激动剂”、“胰岛素”、“白蛋白”、“抗生素”、以及其它他成分相关的事项等与上述含义相同。
[0225]
本发明保持组合物可以作为用于保持从体细胞进行分化诱导而制备的褐色脂肪细胞的组合物来使用。另外，本发明保持组合物或本发明保持培养基也可以作为用于保持从体细胞进行分化诱导而制备的褐色脂肪细胞的培养基来使用。
[0226]
对于该褐色脂肪细胞的保持而言，例如，可以将该褐色脂肪细胞加入在混合细胞的培养所需要的成分而制成的基础培养基中包含本发明保持组合物的培养基、或本发明保持培养基(无血清)中，根据所保持的该褐色脂肪细胞的种类适当选择温度、其它条件，利用通常方法进行培养，从而进行。
[0227]
上述的基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用作为通常的基本培养基的mem(eagle最低必需培养基)、gmem(glasgow’s最低必需培养基)、dmem(dulbecco改良eagle培养基)、ham’s f-12、dmem/f12、rpmi1640、imdm(iscov’s改良dulbecco培养基)或将它们改良而得到的培养基作为基础培养基。
[0228]
作为本发明保持培养基的一个方式，可以举出在dmem培养基中添加本发明保持组合物而成的保持培养基。在本发明中，优选使用高葡萄糖dmem培养基、包含l-谷氨酰胺及丙酮酸盐的dmem培养基。
[0229]
作为用于该保持的培养条件，可以选择通常的细胞培养的条件。可示例出37℃、5％co2的条件等。在培养中优选以适当的间隔(优选为1天～5天1次、更优选为2天～3天1次)更换培养基。
[0230]
该褐色脂肪细胞的保持培养可以使用培养板、培养皿、细胞培养用烧瓶、细胞培养用袋等细胞培养容器。需要说明的是，作为细胞培养用袋，优选具有透气性。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。培养可以在开放体系或封闭体系中的任意一种中实施，在以得到的褐色脂肪细胞对人施用等作为目标的情况下，优选在封闭体系中进行培养。
[0231]
实施例
[0232]
以下，通过实施例、比较例及试验例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于实施例等的范围。
[0233]
[试验例a]分化诱导培养基用组合物或分化诱导培养基的探讨
[0234]
(1)细胞培养
[0235]
作为材料的人成纤维细胞从ds pharma biomedical公司购入。是38岁的人皮肤来
源的成纤维细胞。
[0236]
将上述人成纤维细胞接种于用明胶(cat#：190-15805，和光纯药工业株式会社制)涂布后的35mm培养皿，每个培养皿接种5
×
104个成纤维细胞，在添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum；fbs)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem培养基(cat#：11965092；gibco公司制)中于37℃、5％co2条件下培养至达到80～90％汇合。
[0237]
(2)从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导
[0238]
向褐色脂肪细胞的分化诱导所使用的培养基是无血清培养基，以达到该最终浓度的方式，以表2所示的组合将表1的各成分添加于dmem培养基(cat#：11965092；gibco公司制、以下称为“dmem”)，从而制备(实施例1、比较例1～6)。
[0239]
[表1]
[0240][0241]
[表2]
[0242][0243]
表2中，“ ”表示在培养基中添加了该成分，“－”表示在培养基中未添加该成分。
[0244]
另外，以达到该最终浓度的方式将表3所示的各化合物添加于上述培养基。
[0245]
[表3]
[0246][0247]
然后，在人成纤维细胞达到80～90％汇合后，将培养皿的培养基更换为上述各无血清培养基，在该培养基中将人成纤维细胞培养3周。培养基每3天进行更换。
[0248]
(3)rna分离及qrt-pcr
[0249]
为了对基因表达进行定量，使用fastgene(注册商标)rna basic kit(nippon genetics公司制)从用各化合物进行处理后的成纤维细胞中提取出总rna。然后，在利用revertraace(注册商标)pcr rt master mix with gdna remover(东洋纺株式会社制)进行逆转录后，使用power sybr green pcr master mix(thermo fisher scientific)进行了实时pcr分析。反应在以下的条件下对每1个水平实施了3个反应。在95℃下10分钟后，在95℃下15秒钟及60℃下60秒钟，进行40个循环。结果全部以tbp mrna的量进行了标准化。qrt-pcr中使用的引物示于下述表4。
[0250]
[表4]
[0251][0252]
(4)结果
[0253]
将实验结果示于图1及图2。需要说明的是，在全部的附图中，数据表示平均值
±
sd(n＝3)，“***”、“**”及“*”表示通过student’s t检验分别在p＜0.001、p＜0.01及p＜0.05具有显著差异。
[0254]
实施例1中添加的培养基组合物是三碘甲状腺原氨酸、地塞米松、ibmx、胰岛素、2paa、亚油酸-油酸-白蛋白、以及青霉素/链霉素的组合。另外，比较例1～5是从该组合中排除了三碘甲状腺原氨酸、地塞米松、ibmx、胰岛素及2paa中的任一成分后的组合。此外，比较例6没有添加任何该成分(表1所示的全部成分)作为培养基组合物。
[0255]
如图1及2所示，在实施例1中，ucp1及fabp4均显著表达，相比之下，比较例中它们的表达不足。特别是在比较例1及2的组合物的组合中，ucp1基本上不表达。
[0256]
因此表明，作为从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导培养基的成分，实施例1的组合是优选的。
[0257]
[试验例b]保持培养基用组合物或保持培养基的探讨
[0258]
(1)细胞培养
[0259]
将与上述试验例a相同的人成纤维细胞在同样的条件下培养至达到80～90％汇合。
[0260]
(2)从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导
[0261]
向褐色脂肪细胞的分化诱导所使用的无血清培养基(无血清褐色脂肪诱导培养基)是在dmem培养基(cat#：11965092；gibco公司制)中添加与实施例1相同的各成分而制备的(以下称为“sfbam”)。进一步，添加了表3所示的各化合物。
[0262]
然后，在人成纤维细胞达到80～90％汇合之后，将培养皿的培养基更换为无血清诱导培养基的sfbam(包含表3所示的全部化合物)，将人成纤维细胞在该培养基中培养3周。培养基每3天进行更换。各诱导细胞在包含表5所示的全部成分的无血清保持培养基中(实施例2)、或至少包含罗格列酮的无血清保持培养基中(实施例3～6、比较例7及8)中进一步培养1周，使化学诱导的褐色脂肪细胞样细胞(cibas)成熟。该保持培养基是以达到该最终浓度的方式以表6所示的组合将下述表5所示的各成分添加于dmem培养基(cat#：11965092；gibco公司制)而制备的。
[0263]
[表5]
[0264][0265]
[表6]
[0266][0267]
表6中，“ ”表示在培养基中添加了该成分，“－”表示在培养基中未添加该成分。
[0268]
(3)rna分离及qrt-pcr
[0269]
与上述试验例a同样地进行了rna分离及pcr分析。
[0270]
(4)结果
[0271]
将实验结果示于图3及图4。
[0272]
实施例2及3中添加的培养基组合物是三碘甲状腺原氨酸、地塞米松、ibmx、胰岛素、2paa、亚油酸-油酸-白蛋白、以及青霉素/链霉素的组合。另外，实施例4～6以及比较例7及8是从该组合中排除了三碘甲状腺原氨酸、地塞米松、ibmx、胰岛素及2paa中的任一成分后的组合。
[0273]
如图3及4所示，在实施例2～6的无血清保持培养基中，对褐色脂肪细胞特异性的ucp1显著表达。在比较例7及8的无血清保持培养基中，分别排除了地塞米松及胰岛素，在这些比较例中，虽然对全部脂肪细胞特异性的fabp4有一定程度表达，但ucp1基本上没有表达。
[0274]
因此表明，作为对于褐色脂肪细胞的保持培养基的成分，除罗格列酮以外，地塞米松、胰岛素、亚油酸-油酸-白蛋白及青霉素/链霉素的组合是优选的。
[0275]
[试验例c]本发明的组合物或培养基的评价
[0276]
(1)细胞培养
[0277]
在同样的条件下培养了与上述试验例a同样的人成纤维细胞。
[0278]
(2)从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导
[0279]
在人成纤维细胞达到80～90％汇合之后，将培养皿的培养基更换为无血清诱导培养基sfbam(包含表3所示的全部化合物)，将人成纤维细胞在该sfbam中培养4周。培养基每3天进行更换。对于该阶段得到的褐色脂肪细胞，首先进行了免疫染色(后述)(实施例7)。
[0280]
接着，诱导细胞在将表7所示的各成分添加于dmem培养基(cat#：11965092；gibco公司制)而制备成的无血清褐色脂肪保持培养基(以下称为“sfbamam”)中进一步培养1周，使化学诱导的褐色脂肪细胞样细胞(cibas)成熟。对于成熟后的褐色脂肪细胞，也同样地进行了免疫染色(后述)(实施例8)。
[0281]
[表7]
[0282][0283]
(3)免疫染色
[0284]
免疫细胞如已经报道的那样进行(dai p,et al.j clin biochem nutr.2015；56(3):166-70)。首先，用4％多聚甲醛(nacalai tesque公司)固定了细胞。用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)清洗3次后，用含有0.1％triton x-100的pbs将细胞孵育10分钟。接下来，利用含有3％脱脂牛奶的pbs将细胞在室温下封闭1小时。用封闭溶液将ucp-1抗体(ab10983,abcam,cambridge,uk)稀释至1/500。将细胞和抗体在4℃下孵育过夜。用pbs清洗3次后，将细胞和alexa fluor 488donkey anti-rabbit igg(a-21206,thermo fisher scientific)在室温下孵育1小时。用dapi溶液(同仁化学研究所)对细胞核进行染色。图像全部使用荧光显微镜(axio vert.a1,carl zeiss,oberkochen,germany)获得。线粒体使用mitotracker(注册商标)red cmxros(thermo fisher scientific)进行了染色。
[0285]
(4)结果
[0286]
将实验结果示于图5。如图5所示，观察到了在无血清诱导培养基的sfbam中从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞进行了充分的直接分化诱导(直接转变)。另外，通过在sfbam中诱导4周后，在无血清保持培养基的sfbamam中孵育1周，观察到了具有更多的脂肪滴的褐色脂肪细胞。
[0287]
[试验例d]向褐色脂肪细胞的诱导期间的探讨
[0288]
与试验例c同样，在人成纤维细胞达到80～90％汇合之后，将培养皿的培养基更换为无血清诱导培养基sfbam(包含表3所示的全部化合物)，将人成纤维细胞在该sfbam中培养，将包含该表3所示的全部化合物的sfbam中的培养实验作为实施例9。培养基每3天进行更换。另外，利用qrt-pcr对与脂肪细胞及褐色脂肪组织特异性的下述表8所示的多个标记基因的表达量进行了定量。将其结果示于图6。在图中，“c”表示在不包含表3所示的化合物(向褐色脂肪细胞的诱导所需要的化合物)的情况下同样地培养5周的情况，“ro”表示在表3所示的化合物中仅包含罗格列酮并同样地培养5周的情况。需要说明的是，图6a所示的基因对于褐色脂肪细胞是特异性的，图6b所示的基因对于全部脂肪细胞是特异性的。
[0289]
[表8]
[0290][0291]
如图6所示，如果包含表3所示的全部化合物，则任意基因均在培养第1周之前开始表达，并且表达量在第3周或第4周为止持续增加。另外，考虑到该结果，根据本发明由成纤维细胞分化诱导的褐色脂肪细胞在第1周之前开始出现，并持续增加至第3周或第4周。
[0292]
接着，将培养基更换为本发明保持培养基、即sfbamam，使诱导细胞成熟1周。将该sfbamam中的保持培养实验作为实施例10。将该结果示于图7。图中的“c”及“ro”的含义与图6的情况相同，同样地将培养基更换为sfbamam，培养1周。另外，同样地，图7c所示的基因对于褐色脂肪细胞是特异性的，图7d所示的基因对于全部脂肪细胞是特异性的。
[0293]
如图7所示，在包含表3所示的全部化合物的sfbam中诱导得到的褐色脂肪细胞通过在sfbamam中成熟1周，没有诱导新的褐色脂肪细胞，利用最小限度的培养基组成进行了保持，而没有使对褐色脂肪细胞及脂肪细胞特异性的基因的表达量大幅减少。
[0294]
[试验例e]无血清培养基中脂肪酸有无的探讨
[0295]
在人成纤维细胞达到80～90％汇合之后，将培养皿的培养基更换为无血清诱导培养基sfbam、或者将白蛋白成分或脂肪酸成分变更为表9所示的化合物的表10所示的组合而得到的sfbam(均包含表3所示的全部化合物)，将人成纤维细胞在该各培养基中培养3周(实施例11～14)。培养基每3天进行更换。然后，利用qrt-pcr对与褐色脂肪组织特异性的标记基因ucp1及ckmt1的表达量进行了定量。将结果示于图8及9。图中的符号1(对照)表示向褐色脂肪细胞的诱导所需要的不包含表3所示的化合物的sfbam中的结果。
[0296]
[表9]
[0297][0298]
[表10]
[0299]
成分名实施例11实施例12实施例13实施例14l,o-alb －－－ff-bsa－ 油酸－－ －棕榈酸－－－
[0300]
表10中，“ ”表示在培养基中添加了该成分，“－”表示在培养基中未添加该成分。
[0301]
根据图8及9可知，通过无脂肪酸条件下的诱导，对褐色脂肪组织特异性的标记基因的表达量进一步增高。
[0302]
工业实用性
[0303]
本发明诱导培养基(例如，sfbam)作为从人成纤维细胞向褐色脂肪细胞的分化诱导培养基是有用的，另外，本发明保持培养基(例如，sfbamam)作为褐色脂肪细胞的保持培养基是有用的。