修饰的植物

1.本发明涉及生物技术领域和将所需性状改造到植物中。更具体而言，本发明涉及具有修饰的基因表达和/或修饰的蛋白质活性的植物细胞和植物及其产生方法。在无限制的情况下，本发明的修饰的植物的特征可以是，与野生型对应物相比以下中任何一项或多项增加：维管束鞘细胞数量、维管束鞘体积、维管束鞘面积、叶脉密度和/或侧脉的比例。


背景技术：

2.支撑地球上几乎所有生命的是光合作用过程，由此，植物、藻类和光合细菌利用光能将无机二氧化碳(co2)固定为有机糖。最常见的光合作用形式称为c3，因为co2被酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)固定为三碳化合物。然而，尽管c3无处不在，但由于rubisco不能准确区分co2和o2，c3光合成受到阻碍，从而导致竞争性羧化反应和氧合反应。在炎热干燥的环境中，氧合作用会升高，产生的磷酸乙醇酸酸必须在称为光呼吸的耗能过程中循环使用。因此，温度升高和干旱胁迫都会增加c3植物的光呼吸并降低光合效率。
3.在自然界中可以找到多种将co2集中在rubisco周围从而减少光呼吸的策略。这些包括许多蓝细菌和绿藻的碳浓缩机制，以及开花植物中的景天酸代谢(crassulacean acid metabolism,cam)和c4光合作用。在这些不同的策略中，c4光合作用在农艺学上最重要，因为玉米、高粱和甘蔗等生产性作物物种是c4，许多杂草也是如此。c4途径的最常见形式涉及在称为kranz的特征叶解剖结构内组织化的两种细胞类型之间代谢反应的空间分离。co2最初在叶外叶肉细胞中被o2不敏感羧化酶固定为四碳化合物(因此是c4途径)，然后c4化合物被转移到内维管鞘细胞，它在那里脱羧释放供rubisco重新固定的co2。这种细胞间c4穿梭将co2集中在rubisco位点，导致相对于c3植物，光呼吸水平较低和光合效率提高，特别是在炎热和/或干燥环境中。从c3途径演变而来的更有效的c4途径尽管仅被3％的物种使用，但仍占地球初级陆地生产力的约25％。
4.在单子叶植物和真双子叶植物的c3叶中，叶脉通常被维管鞘细胞层(气孔鞘(mestome sheath)和/或维管束鞘)包围，并且在大多数情况下，通过至少6个叶肉细胞与相邻叶脉分开。rubisco和因此c3碳固定主要发生在叶肉细胞中，而维管鞘细胞将代谢物加载到叶脉中，提供结构支持，并且至少在某些物种中被认为在干旱胁迫期间促进空化修复。尽管c4光合途径也可以在单细胞环境中运行，初始固定和随后的脱羧反应分割在不同的细胞内区室之间，但大多数c4物种在叶的两种不同细胞类型之间隔开反应。在具有kranz解剖结构的c4叶中，光合维管鞘和叶肉细胞的同心环围绕每条叶脉，相邻叶脉通常仅被两个叶肉细胞隔开。因此，c4kranz解剖结构与c3结构在叶的叶脉间距模式、叶脉周围的细胞类型规格和细胞特异性细胞器功能方面有所不同。
5.kranz解剖结构的物理特征和c4光合作用的机制已经得到了相对充分的表征。尽管如此，虽然30多年前就鉴定了编码c4途径的酶的基因，但多年来的正向遗传筛选未能提供对调节kranz解剖结构的基因的重要了解。
6.需要鉴定能够调节kranz解剖结构的基因。对这些基因的操作可以提供增强植物
叶中kranz样解剖结构的手段。


技术实现要素：

7.本发明人已经证明植物中某些转录因子的功能丧失提供了增加以下任何一项或多项的手段：维管束鞘细胞数量、维管束鞘体积、维管束鞘面积、叶脉密度和/或侧脉的比例。这反过来可以在某些环境中导致光合能力增加。
8.因此，本文所述的发明至少部分地涉及以下编号/列出的下述实施方案1-43：
9.实施方案1：植物细胞，经修饰抑制或阻止该细胞中seq id no:1定义的基因或其直系同源基因(orthologue)的表达和/或该基因编码的蛋白质的活性。
10.实施方案2：根据实施方案1所述的植物细胞，其中该植物细胞经基因修饰抑制或阻止该基因或其直系同源基因的所述表达。
11.实施方案3：根据实施方案1或实施方案2所述的植物细胞，其中该植物细胞通过敲除该基因或其直系同源基因的所述表达而得以基因修饰。
12.实施方案4：根据实施方案3所述的植物细胞，其中所述表达的敲除起因于该基因的全部或部分缺失。
13.实施方案5：根据实施方案3或实施方案4所述的植物细胞，其中所述表达的敲除起因于引入该基因中的移码突变、终止突变或其组合。
14.实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞经改造以表达能够敲低该基因在植物细胞中表达的抑制性rna分子。
15.实施方案7：根据实施方案6所述的植物细胞，其中该抑制性rna分子包括微rna或小干扰rna(sirna)。
16.实施方案8：根据实施方案6或实施方案7所述的植物细胞，其中该植物细胞包含用于表达抑制性rna分子的表达载体。
17.实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞经改造以表达能够抑制该基因编码的蛋白质的所述活性的拮抗剂。
18.实施方案10：根据实施方案9所述的植物细胞，其中该植物细胞包含用于表达上述拮抗剂的表达载体。
19.实施方案11：根据实施方案1-10中任一项所述的植物细胞，其中该基因包含或组成为与seq id no:1定义的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列。
20.实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的植物细胞，其中该蛋白质包含或组成为：
21.(i)seq id no:3定义的氨基酸序列；或者
22.(iii)与seq id no:3定义的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
23.实施方案13：根据实施方案1-12中任一项所述的植物细胞，其中该基因和/或蛋白质包含一个或多个乙烯响应元件结合因子相关两亲阻遏(ear)结构域，任选地，其中所述一个或多个ear结构域包含lxlxl(例如lllsl)、dlnxxp或lxlxl和dlnxxp的重叠定义的基序序列。
24.实施方案14：根据实施方案1-13中任一项所述的植物细胞，其中该基因的表达和/或该蛋白质的活性通过从所述基因或蛋白质中缺失一个或多个所述ear结构域的全部或一部分，或拮抗剂与ear结构域的结合而受到抑制或阻止。
25.实施方案15：根据实施方案13或实施方案14所述的植物细胞，其中该植物细胞是：禾本科(poaceae)/早熟禾科(gramineae)(禾本科植物)、亚麻科(linaceae)、大戟科(euphorbiaceae)或凤梨科(bromeliaceae)；科成员。
26.实施方案16：根据实施方案13-15中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞是以下中的任一种：水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、黍(common millet)、龙爪稷(finger millet)、画眉草(teff)、甘蔗或高粱；细胞。
27.实施方案17：根据实施方案13-16中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞是以下中的任一种：菠萝(ananas comosus)、木薯(manihot esculenta)、小米(setaria italica)、稻(oryza sativa)、日本型稻(oryza sativa japonica)、kitaake型稻(oryza sativa kitaake)、二穗短柄草(brachypodium distchyon)、玉蜀黍(zea mays)、高粱(sorghum bicolor)、菠萝(anasus comosus)、亚麻(linum usitatissimum)。
28.实施方案18：根据实施方案13-17中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞经基因修饰表达生长素或其类似物(例如4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、1-萘乙酸(1-naa)、吲哚-3-乙酸[iaa]、2,4-d、1-naa)，任选地包含编码所述生长素或其类似物的表达载体。
[0029]
实施方案19：根据实施方案1-18中任一项所述的植物细胞，其中该植物细胞是单子叶植物细胞。
[0030]
实施方案20：提供实施方案1-19中任一项所述植物细胞的方法，该方法包括：
[0031]
获得包含一条或多条序列的载体，该序列能够抑制或阻止该植物细胞中seq id no:1定义的基因或其直系同源基因的表达和/或该基因编码的蛋白质的活性；
[0032]
使用该载体对植物细胞群进行转化程序，从而提供由该载体转化的植物细胞亚群；和
[0033]
基于指示所述转化的选择标记的表达，从所述群中选择所述植物细胞亚群的成员，从而提供该植物细胞。
[0034]
实施方案21：根据实施方案20所述的方法，其中该一条或多条序列编码规则间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,crispr)指导rna和cas9核酸酶，其中该指导rna对该基因具有特异性，并且包含对cas9核酸酶具有特异性的原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,pam)。
[0035]
实施方案22：根据实施方案20所述的方法，其中该一条或多条序列包含能够与植物细胞基因同源重组从而去除该基因的全部或一部分并由此使该基因无功能的序列。
[0036]
实施方案23：根据实施方案20所述的方法，其中该一条或多条序列编码蛋白质的表达拮抗剂或活性拮抗剂。
[0037]
实施方案24：根据实施方案23所述的方法，其中该蛋白质的表达拮抗剂是抑制性rna分子。
[0038]
实施方案25：根据实施方案23所述的方法，其中该蛋白质的活性拮抗剂是能够与该蛋白质结合从而抑制或阻止所述蛋白质活性的蛋白质。
[0039]
实施方案26：根据实施方案20-25中任一项所述的方法，其中该基因和/或蛋白质
包含一个或多个ear结构域，并且所述抑制或阻止包括：从该基因和/或蛋白质中去除每个所述ear结构域的全部或一部分，或拮抗剂与每个所述ear结构域结合。
[0040]
实施方案27：根据实施方案26所述的方法，其中该植物细胞是：
[0041]
(i)禾本科/早熟禾科(禾本科植物)、亚麻科、大戟科或凤梨科；科成员；
[0042]
(ii)以下中的任何一种：水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、黍、龙爪稷、画眉草、甘蔗或高粱；细胞；
[0043]
(iii)以下中的任何一种：菠萝、木薯、粱、稻、日本型稻、kitaake型稻、二穗短柄草、玉蜀黍、高粱、菠萝(anasus comosus)、亚麻。
[0044]
实施方案28：根据实施方案20-27中任一项所述的方法，还包括对该植物细胞进行基因改造，以表达生长素或其类似物(例如4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、1-萘乙酸(1-naa)、吲哚-3-乙酸[iaa]、2,4-d、1-naa)。
[0045]
实施方案29：根据实施方案28所述的方法，包括用编码所述生长素或其类似物的表达载体转化该植物细胞。
[0046]
实施方案30：根据实施方案20-29中任一项所述的方法，其中该植物细胞是以下中的任一种：叶基本分生组织细胞、叶原形成层原始细胞(leaf procambial initial cell)、维管鞘细胞、维管束鞘细胞、内束鞘细胞、叶肉细胞。
[0047]
实施方案31：根据实施方案20-30中任一项所述的方法，其中该植物细胞是c3光合植物细胞。
[0048]
实施方案32：根据实施方案20-30中任一项所述的方法，其中该植物细胞是c4光合植物细胞。
[0049]
实施方案33：根据实施方案1-19中任一项所述的植物细胞，或根据实施方案20-32中任一项所述的方法，其中该植物细胞是稻属(oryza)植物细胞。
[0050]
实施方案34：根据实施方案1-19或33中任一项所述的植物细胞，或根据实施方案20-33中任一项所述的方法，其中该植物细胞是稻植物细胞。
[0051]
实施方案35：根据实施方案1-19、33或34中任一项所述的植物细胞，或根据实施方案20-34中任一项所述的方法，其中该植物细胞是：大豆(glycine max)、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum))、油菜/卡诺拉(cannola)(b.napus subsp.napus)、马铃薯(solanum tuberosum)、番茄(solanum lycopersicum)、木薯(manihot esculenta)、小麦(普通小麦(triticum aestivum))、大麦(hordeum vulgare)、木豆(cajanus cajan)、豇豆(vigna unguiculata)、豌豆(pisum sativum)、大麻(cannabis sativa)、甜菜(beta vulgaris)、燕麦(avena sativa)、黑麦secale cereal)、花生(arachis hypogaea)、向日葵(helianthus annuu))、亚麻(linum spp.)、菜豆(phaseolus vulgaris)、利马豆(phaseolus lunatus)、绿豆(phaseolus mung)、红小豆(adzuki bean)(phaseolus angularis)、鹰嘴豆(cicer arietinum)、烟草(nicotiana tabacum)、荞麦(fagopyrum esculentum))、油棕(elaeis guineensis)、籼稻(oryza sativa l ssp.indica)、粳稻(oryza sativa l ssp.japonica)、kitaake型稻(oryza sativa kitaake)、日本型稻(oryza sativa japonica)、橡胶(hevea brasiliensis)或单子叶植物；植物细胞。
[0052]
实施方案36：基因修饰的植物或其种子，包含实施方案1-19或33-35中任一项所述的植物细胞。
[0053]
实施方案37：实施方案1-19或33-35中任一项所述的植物细胞在生成基因修饰的植物中的用途。
[0054]
实施方案38：用于产生基因修饰的植物的方法，包括获得实施方案1-19或33-35中任一项所述的植物细胞并从所述植物细胞生成基因修饰的植物。
[0055]
实施方案39：根据实施方案37所述的用途，或根据实施方案38所述的方法，其中基因修饰的植物是c3光合植物。
[0056]
实施方案40：根据实施方案37所述的用途，或根据实施方案所述38的方法，其中基因修饰的植物是c4光合植物。
[0057]
实施方案41：根据实施方案37或39所述的用途，或根据实施方案38或39所述的方法，其中该基因修饰的植物是稻属植物。
[0058]
实施方案42：根据实施方案37、39或41中任一项所述的用途，或根据实施方案38、39或41中任一项所述的方法，其中该基因修饰的植物是稻或光稃稻(oryza glaberrima)植物。
[0059]
实施方案43：根据实施方案37或39-42中任一项所述的用途，或根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中该基因修饰的植物是：大豆(glycine max)、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum))、油菜/卡诺拉(cannola)(b.napus subsp.napus)、马铃薯(solanum tuberosum)、番茄(solanum lycopersicum)、木薯(manihot esculenta)、小麦(triticum aestivum)、大麦(hordeum vulgare)、木豆(cajanus cajan)、豇豆(vigna unguiculata)、豌豆(pisum sativum)、大麻(cannabis sativa)、甜菜(beta vulgaris)、燕麦(avena sativa)、黑麦(secale cereal)、花生(arachis hypogaea)、向日葵(helianthus annuus)、亚麻(linum spp.)、菜豆(phaseolus vulgaris)、利马豆(phaseolus lunatus)、绿豆(phaseolus mung)、赤小豆(phaseolus angularis)、鹰嘴豆(cicer arietinum)、烟草(nicotiana tabacum)、荞麦(fagopyrum esculentum)、油棕(elaeis guineensis)、籼稻(oryza sativa l ssp.indica)、粳稻(oryza sativa l ssp.japonica)、kitaake型稻(oryza sativa kitaake)、日本型稻(oryza sativa japonica)、橡胶(hevea brasiliensis)或单子叶植物；植物。
[0060]
定义
[0061]
除非上下文另有明确规定，否则本技术使用的单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。例如，除非另有说明，否则术语“细胞”还包括多个细胞。
[0062]
如本文所用，术语“包含/包括(comprising)”是指“包括(including)”。“包含/包括(comprising)”一词的变体，例如“包含/包括(comprise)”和“包含/包括(comprises)”，具有相应的不同含义。因此，例如，“包含”核苷酸序列'a'的多核苷酸可以仅由核苷酸序列'a'组成，或者可以包括一条或多条额外的核苷酸序列，例如核苷酸序列'b'和/或核苷酸序列'c'。
[0063]
如本文所用，“c3光合植物”应理解为包括所有或大部分光合作用限于c3光合作用的任何植物。“c3光合作用”是指仅使用卡尔文-本森循环(calvin-benson cycle)来固定空气中的二氧化碳，提供三碳化合物的光合途径。本文称为“c
3”的细胞类型应理解为来自“c3光合植物”。
[0064]
如本文所用，“c4光合植物”应理解为包括所有或大部分光合作用限于c4光合作用的任何植物。“c4光合作用”是指利用中间四碳化合物通过卡尔文-本森循环将co2转移到co2固定位点的光合途径。c4光合作用从叶肉细胞中的光依赖性反应和将二氧化碳初步固定到苹果酸开始。二氧化碳从苹果酸中释放，并通过rubisco和卡尔文-本森循环再次固定。本文称为“c
4”的细胞类型应理解为来自“c4光合植物”。c4光合作用可以发生在单个细胞中，也可以分布在植物叶中的多个细胞中。
[0065]
如本文所用，“核酸”是指单链、双链或三链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚体。该术语可以涵盖含有与参考核酸具有相似结合特性的天然核苷酸的已知类似物的核酸。具体核酸序列也可以隐含地包括其保守修饰变体(例如简并密码子取代)和互补序列。术语“核酸”、“核酸序列”或“多核苷酸”也可以与基因、cdna和基因编码的mrna互换使用。
[0066]
如本文所用，术语“直系同源基因”是指通过起源于共同祖先基因而与参考基因相关的基因。作为“直系同源基因”的基因应理解为物种形成造成的不同谱系中的相应基因。
[0067]
如本文所用，术语“osdot1直系同源基因组(orthogroup)”应理解为包括如本文所述的osdot1基因及其直系同源基因。
[0068]
在肽或蛋白质的语境中，本文所用术语“类似物”是指在功能上类似于肽或蛋白质的人工或天然物质。例如，蛋白质或肽类似物可以结合受体，从而产生与天然蛋白质/肽与受体结合一样的相同或相似结果。在实施方案中，此类类似物也可以在结构上类似于蛋白质/肽。本发明的实施方案考虑的类似物包括完全或部分拟肽化合物以及在活性上类似于主题肽但与主题肽或蛋白质相比包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代的肽或蛋白质。提及核苷酸序列时本文所用的术语“类似物”涵盖相对于主题核苷酸序列包含一个或多个碱基的添加、缺失或取代(包括保守氨基酸取代)的序列，其中编码的多肽在功能上类似于主题核酸分子编码的多肽。
[0069]
如本文所用，“序列同一性”百分比应理解为来自两条序列的比较，其中它们经比对给出序列之间的最大相关性。这可以包括在一条或两条序列中插入“缺口”以提高比对程度。然后可以在每条被比较的序列的长度上确定序列同一性百分比。例如，与另一条核苷酸序列(“查询序列”)具有至少95％“序列同一性”的核苷酸序列(“主题序列”)旨在表示，主题序列与查询序列相同，除了查询序列的每100个核苷酸，主题序列可以包括高达5个核苷酸改变。换言之，为了获得与查询序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，主题序列中高达5％(即100分之5)的核苷酸可以被插入，或被另一种核苷酸取代，或缺失。
[0070]
如本文所用，与另一序列“可操作地连接”的调节序列是指，两条序列之间存在功能关系，使得调节序列具有对与其连接的序列的表达和/或定位和/或活性施加影响的能力。例如，可操作地连接于编码序列的启动子能够调节编码序列的转录。可操作地连接于多肽的靶向肽能够将多肽引导至具体位置(例如细胞器或细胞质膜)。
[0071]
附图简要说明
[0072]
现在将参考附图仅以实例的方式描述本发明的优选实施方案，其中：
[0073]
图1涉及使用crispr/cas9介导的osdot1基因编辑的实验。(a)图概述了三个靶向osdot1基因的sgrna的位置(突出显示的紫色区域)和方向(紫色箭头)。所示的靶序列含有以紫色斜体标记的pam基序。(b)osdot1编码的蛋白质，突出显示了预测的ear基序(红色)和
c2h2锌指结构域(蓝色)。(c)在t1后代中分离和固定的等位基因的概述，等位基因m3从多个独立的转化事件中固定。(d)横截面描绘了携带osdot1-m3或osdot1-m4等位基因的wt和t1植物的旗叶1中的脉络式样，前者来自四个独立的转基因事件。
[0074]
图2描绘了t0 crispr系的dna印迹分析。hindiii消化的基因组与作为探针的digoxygenin标记的hyg基因片段的杂交。由同一转化事件产生的t0植物由事件编号(下划线《_》后的第一个数字)标识。小写字母表示具体系中的等位性，a标记系含有等位基因m3和m4，b标记系含有等位基因m3，c标记系含有等位基因m1和m2。标记有a或b的系中不同的条带模式表明，图1d所示的四个osdot1-m3突变体来自独立的转化事件。
[0075]
图3描述了本发明实施方案的植物的与osdot1敲除等位基因相关的表型变化。(a)箱型图显示，对叶宽没有影响与水稻内源性dot1功能的丧失有关。(b)与处于相似发育阶段的野生型植物相比，osdot1-m1和osdot1-m2突变等位基因对叶脉密度的影响。(c)比例尺，100μm。旗叶横截面突出显示了在osdot1-m1背景中发育的其他侧脉(用红色箭头标记)。(d)条形图说明了与突变植物相比，存在于野生型植物中的每种叶脉类别的平均比例。仅在osdot1突变体中发现了2级中脉。
[0076]
图4的图形显示了在野生型(wt)kitaake水稻和本发明实施方案的突变kitaake水稻品系(osdot1-m1-kitaake水稻osdot1基因突变等位基因1；osdot1-m2-kitaake水稻osdot1基因突变等位基因2)中，每毫米(mm)叶宽，与叶肉接触的维管束鞘(bs)细胞的数量。
[0077]
图5表明植物高度变化与osdot1敲除等位基因无关。(a，b)说明与野生型相比，植物高度降低与osdot1-m1和osdot1-m2等位基因相关。(c)在与野生型回交后，纯合osdot1-m2(f2)中恢复了植物生长。(d)条形图显示了在分离f2野生型、杂合和突变植物中测量为第一个成熟花序的高度的平均植物大小。比例尺，5cm。
[0078]
图6提供的图像显示，在本发明的基因编辑植物中明显的叶脉式样表型与植物高度降低无关。(a)显示与野生型相比植物高度降低与osdot1-m2等位基因相关。(b)从第二个crispr实验中分离出的t1纯合系中的植物生长(与图1d所示相同的系)。比例尺，5cm。
[0079]
图7显示了本发明实施方案的osdot1-m1和osdot1-m3突变植物。
[0080]
图8显示了野生型日本型稻dot1基因(a)、互补dna(cdna)(b)和蛋白质(c)序列。(b)中带下划线的序列＝ear结构域。
[0081]
图9显示了融合到tnos终止子的野生型日本型稻dot1启动子(a)和3'utr(b)序列用于互补尝试(complementation attempt)。golden gate融合位点以粗斜体表示。在(a)中，序列驯化位点以粗体小写字母显示，微卫星的变异以带下划线的小写字母显示，在(b)中，tnos终止子序列以小写字母表示。
[0082]
图10是vista图，显示了dot1基因座(水稻中的loc_os09g13680)的保守区。对来自玉蜀黍、狗尾草(s.viridis)和粗秆雀稗(p.virgatum)的相应基因组区域的分析确定了3'utr中的高度保守序列(蓝色箭头)。在上图中，序列被错误注释为非编码。vista plot软件用粉红色表示保守的非编码区，用深蓝色表示外显子，用浅蓝色表示utr。
[0083]
图11比较了外源生长素(0.1μm萘乙酸(naa))对野生型和osdot1突变体(osdot1-m2)植物表型的影响。左边六株幼苗——wt kitaake；中间6株幼苗——2个纯合osdot1-m2系——每个系3株；右侧6株幼苗
–
2个杂合osdot1-m2系
–
每个系3株幼苗。基因型由垂直虚线隔开，各系的后代由水平线隔开。
[0084]
图12显示了osdot1在水稻叶维管式样结构中的作用。从横截面拍摄的图像显示了在0.1μm萘乙酸(naa)上生长的第3片叶(leaf 3)中间叶片
–
osdot1-m2(f3)。
[0085]
图13显示了代表性植物物种中zmdot1基因的各种直系同源基因之间的系统发育关系。*表示存在ear结构域。
[0086]
图14显示了crispr/cas9介导的狗尾草(setaria virisis)dot1的基因编辑。(a)基因图显示了所用的两个sgrna的定位(突出显示的紫色区域)和方向(紫色箭头)。pam基序以紫色斜体标记。(b、c)横截面显示了svdot1-m1等位基因纯合(b)或杂合(c)的幼t1狗尾草植物的第2片叶(leaf2)中的叶脉式样。m-中脉，l-侧脉，红色箭头标记了纯合系中存在的新侧脉。以相同的比例拍摄图像。
具体实施方式
[0087]
以下详细描述充分详细地传达了本发明的示例性实施方案，以使本领域普通技术人员能够实践本发明。所述的各种实施方案的特征或限制并不一定限制本发明的其他实施方案或本发明的整体。因此，以下详细描述不限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
[0088]
本领域普通技术人员应当理解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案所公开的本发明进行各种改变和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应视为是说明性的而非限制性的。
[0089]
玉蜀黍disorganized tributaries 1(zmdot1)基因编码锌指c2h2型家族蛋白(参见，例如ncbi基因登录号grmzm2g150011；ncbi参考序列：nc_024465.2)(参见，例如，fouracre等人等人，2014,j exp bot.,65(13):3327-39)。对于代表性植物物种及其系统发育关系而言，zmdot1的直系同源基因存在于许多植物物种中，包括例如苔藓植物、真双子叶植物、基生单子叶植物和禾本科植物(参见图13)。禾本科植物(禾本科/禾本科)家族中的代表性直系同源基因是水稻基因osdot1(loc_os09g13680)(参见图8中的代表性序列)。为方便起见，zmdot1和osdot1基因及在其他植物中的其直系同源基因在本文中统称为“osdot1直系同源基因组”。可以使用本领域已知的常规方法不受限制地鉴定osdot1直系同源基因组的成员，包括例如emms&kelly,2019,“orthofinder:phylogenetic orthology inference for comparative genomics(比较基因组学的系统发育直系同源推理)”中描述的、可在github(https://github.com/davidemms/orthofinder)上获得的orthofinder软件。
[0090]
本发明人已经证明，osdot1直系同源基因组中基因的抑制或功能丧失提供了增加维管束鞘细胞数量、叶脉密度和/或侧脉比例中任何一项或多项的手段。在不受理论限制的情况下，本发明人假设，osdot1直系同源基因组的基因编码在叶脉发育中起作用以横向抑制邻近细胞中的原形成层起始的转录因子。因此，编码的蛋白质在每条叶脉中发挥作用的时间和程度可以决定叶脉间隔的紧密程度。由抑制或阻止植物(例如植物叶)中osdot1直系同源基因组内基因的表达和/或其编码蛋的白质的活性产生的表型特征，可以提供增加的光合效率。这可能至少部分起因于更多的“c4样”光合活动。
[0091]
因此，本发明提供了osdot1直系同源基因组中基因的表达和/或其编码的蛋白质的功能受到抑制或去除的基因修饰的植物细胞。本文所述的修饰的植物和植物细胞可以用
作能够引入经设计赋予c4光合性状的其他修饰的底架(chassis)。
[0092]
osdot1直系同源基因组
[0093]
技术人员应当能够容易地使用标准和非创造性方法在多种植物中鉴定osdot1直系同源基因组的基因及其相关互补dna(cdna)和蛋白质序列。如本领域技术人员所知，有许多公众可访问的在线工具可用，这些工具可用于使用输入参考序列(例如本文公开的osdot1直系同源基因组序列和/或诸如uniprot、genbank等公众可获得的数据库上的那些序列)来鉴定osdot1直系同源基因组基因及其蛋白质。
[0094]
用于评估序列之间同源性和同一性水平的方法是本领域众所周知的。例如，可以使用数学算法计算两条序列之间的序列同一性百分比。在karlin及其同事的出版物(1993,pnas usa,90:5873-5877)中描述了合适的数学算法的非限制性实例。该算法集成在blast(basic local alignment search tool)程序系列中(另请参见altschul等人(1990),j.mol.biol.215,403-410或altschul等人(1997),nucleic acids res,25:3389-3402)，可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)网站主页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)访问。blast程序可在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上免费访问。其他非限制性实例包括clustal(http://www.clustal.org/)和fasta(pearson(1990),methods enzymol.83,63-98；pearson and lipman(1988),proc.natl.acad.sci.us a 85,2444-2448.)程序。这些和其他程序可用于鉴定至少在某种程度上与给定输入序列相同的序列。另外或可选地，可在wisconsin sequence analysis package9.1版(devereux等人1984,nucleic acids res.,387-395)中获得的程序，例如程序gap和bestfit，可用于确定序列两条多肽序列之间的同一性百分比。bestfit使用smith和waterman(1981,j.mol.biol.147,195-197)的局部同源性算法，并确定两条序列之间的最佳单一相似性区域。在本文提及氨基酸序列与参考氨基酸序列共享指定百分比的序列同一性时，序列之间的差异可能部分或完全起因于保守氨基酸取代。在这种情况下，用保守氨基酸取代鉴定的序列可以基本上或完全保留参考序列的相同生物活性。
[0095]
如上所述，可以使用本领域已知的常规方法，包括例如emms&kelly,2019,“orthofinder:phylogenetic orthology inference for comparative genomics(比较基因组学的系统发育直系同源推理)”中描述的、可在github(https://github.com/davidemms/orthofinder)上获得的orthofinder软件，来鉴别osdot1直系同源基因组的成员。合适的技术还描述于例如vallender,2009,“bioinformatic approaches to identifying orthologs and assessing evolutionary relationships”,methods；49(1):50
–
55；altenhoff等人2016,“standardized benchmarking in the quest for orthologs”,nature methods,13(5)；425-433)。
[0096]
虽然osdot1直系同源基因组基因及其蛋白质的序列特征可能因不同植物类型而异，但使用本领域已知的标准方法(例如生物信息学方法)很容易鉴定它们。因此，对osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性可以根据本发明受到抑制或阻止的植物细胞和植物的类型，没有限制。
[0097]
osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性可以受到抑制或阻止的植物，包括但不限于以下科中的任何成员：槭树科(aceraceae)、漆树科
(anacardiaceae)、伞形科(apiaceae)、菊科(asteraceae)、桦木科(betulaceae)、十字花科(brassicaceae)、黄杨科(buxaceae)、藜科(chenopodiaceae)/苋科(amaranthaceae)、菊科(compositae)、葫芦科(cucurbitaceae)、豆科(fabaceae)、壳斗科(fagaceae)、禾本科(gramineae)、胡桃科(juglandaceae)、唇形科(lamiaceae)、月桂科(lauraceae)、豆科(leguminosae)、桑科(moraceae)、桃金娘科(myrtaceae)、木犀科(oleaceae)、悬铃木科(platanaceae)、禾本科(poaceae)、蓼科(polygonaceae)、蔷薇科(rosaceae)、芸香科(rutaceae)、杨柳科(salicaceae)、茄科(solanaceae)、榆科(ulmaceae)或葡萄科(vitaceae)。合适的裸子植物的非限制性实例包括柏科(cuppressaceae)、松科(pinaceae)、紫杉科(taxaceae)或杉科(taxodiaceae)的任何成员。
[0098]
如本文所述，osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性可以受到抑制或阻止的植物，可以是单子叶植物(monocotyledon)(单子叶植物(monocots))。
[0099]
或者，在一些实施方案中，植物可以是双子叶植物(dicotyledon)(双子叶植物(dicot))。
[0100]
在某些实施方案中，osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性可以受到抑制或阻止的植物包括任何类型的作物，例如谷类作物。植物可以是c3禾本科植物。植物可以是小麦、大麦、燕麦、黑麦或水稻植物。根据具体实施方案，植物可以是水稻植物，并且根据更具体的实施方案，植物可以是表达c4光合途径的一种或多种组分、任选地完整c4光合途径的所有必需组分的水稻植物。
[0101]
osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性受到抑制或阻止的植物的其他非限制性实例包括c3光合植物、c4光合植物、cam植物、稻属植物(例如稻、光稃稻、籼稻、粳稻、kitaake型稻)、大豆(glycine max)、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum))、油菜/卡诺拉(cannola)(b.napus subsp.napus)、马铃薯(solanum tuberosum))、番茄(solanum lycopersicum)、木薯(manihot esculenta))、小麦(triticum aestivum))、大麦(hordeum vulgare)、木豆(cajanus cajan)、豇豆(vigna unguiculata)、豌豆(pisum sativum)、大麻(cannabis sativa)、甜菜(beta vulgaris)、燕麦(avena sativa)、黑麦(secale cereal)、花生(arachis hypogaea)、向日葵(helianthus annuus)、亚麻(linum spp.)、菜豆(phaseolus vulgaris)、利马豆(phaseolus lunatus)、绿豆(phaseolus mung)、赤小豆(phaseolus angularis)、鹰嘴豆(cicer arietinum)、烟草(nicotiana tabacum)、荞麦(fagopyrum esculentum))、油棕(elaeis guineensis)和橡胶(hevea brasiliensis)。
[0102]
可以抑制或阻止植物细胞中osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性，包括但不限于来自任何上述植物类型的那些细胞。在一些实施方案中，植物细胞可以来自此类植物的叶。植物细胞可以是例如叶的基本分生组织细胞、叶的原形成层原始细胞、维管鞘细胞、维管束鞘细胞、内束鞘细胞或叶肉细胞。
[0103]
可以抑制或阻止在植物部分中osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白的活性，包括但不限于叶、茎、根、块茎、花、果实和种子、果实、胚或嫩枝，从这些植物获得的叶、茎、根、匍匐茎、块茎、芽、插条或其他非繁殖营养材料。
[0104]
在一些实施方案中，本发明的方法可用于抑制或阻止包含或组成为seq id no:1定义的序列的osdot1直系同源基因组基因的表达。在其他实施方案中，该方法可用于抑制
或阻止dot1基因的表达，所述dot1基因包含或组成为与seq id no:1定义的序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0105]
在其他实施方案中，本发明的方法可用于抑制或阻止蛋白质的活性，所述蛋白质由osdot1直系同源基因组基因编码，并且包含或组成为seq id no:3定义的序列。还在其他实施方案中，该方法可用于抑制或阻止蛋白质的活性，所述蛋白质由osdot1直系同源基因组基因编码，并且包含或组成为与seq id no:3定义的序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0106]
突变细胞和植物
[0107]
本发明提供了修饰的植物和植物细胞，其中osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性受到抑制或阻止。本领域技术人员已知的任何合适的方法都可以用于此目的。
[0108]
用于抑制或阻止osdot1直系同源基因组基因表达的合适且非限制性技术描述于：plant gene silencing(methods and protocols)(植物基因沉默(方法和方案)),mysore&senthil-kumar(eds),2015,humana press。
[0109]
在一些实施方案中，基因编辑技术可用于修饰给定植物或植物细胞基因组中的osdot1直系同源基因组基因，从而抑制或阻止其表达。例如，基因编辑可用于通过插入、缺失或置换osdot1直系同源基因组基因的一个或多个节段来修饰植物或植物细胞的基因组，从而抑制或阻止dot1表达。用于该目的的合适的基因编辑技术是本领域技术人员已知的，并且作为非限制性实例包括crispr(规则间隔成簇短回文重复序列)-cas9系统、talen(转录激活剂样效应核酸酶)和zfn(锌指核酸酶)。用于此目的的合适且非限制性基因编辑技术描述于例如：gene editing in plants,in“progress in molecular biology and translational science”,2017,vol 149,weeks and yang(eds),elsevier inc.；和song等人,genome engineering in human cells,in“methods in enzymology”,2014,chapter 5volume 546,93-118,elsevier inc.)。
[0110]
在其他实施方案中，可以通过使用同源重组置换或破坏给定植物或植物细胞的osdot1直系同源基因组基因来抑制或阻止osdot1直系同源基因组基因表达。例如，同源重组可用于用另一序列置换靶植物或植物细胞基因组内的完整osdot1直系同源基因组基因或其一部分，从而抑制或阻止osdot1直系同源基因组基因的表达。涉及同源重组的合适且非限制性技术包括homologous recombination and gene silencing in plants(植物同源重组和基因沉默),paszkowski(ed),1994,kluwer academic publishers中描述的那些技术。另外或可选地，先导编辑技术可以用于此目的(参见例如xu,等人,development of plant prime-editing systems for precise genome editing”,plant communications 1,100043,may 2020-https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s2590346220300262)。
[0111]
在某些实施方案中，抑制性rna可用于抑制或阻止给定植物或植物细胞基因组中osdot1直系同源基因组基因的表达。非限制性实例包括基于小/短干扰rna(sirna)和微rna(mirna)的技术，其描述于例如guo等人等人，2016,“rna silencing in plants:
transformation of arabidopsis thaliana”plant j.16,735-743；“methods in plant molecular biology(植物分子生物学方法)”(schuler&zielinski,eds.,1989)；“plant molecular biology manual(植物分子生物学手册)”(gelvin,schilperoort,verma,eds.,1993)；以及“methods in plant molecular biology-a laboratory manual(植物分子生物学方法-实验室手册)”(maliga,klessig,cashmore,gruissem&varner,eds.,1994)。另请参见sambrook,j.等人,molecular cloning(分子克隆),cold spring harbor laboratory(1989),sambrook,j.and russell,d.w.(2001),“molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆)”,3rd edition(第三版),cold spring harbor laboratory press，和其中引用的文献；以及ausubel等人(eds)current protocols in molecular biology(现代分子生物学实验技术),john wiley&sons(2000)。
[0118]
在某些实施方案中，用于生成本发明的修饰的植物和植物细胞的植物和植物细胞可以包含，含一个或多个乙烯响应元件结合因子相关两亲阻遏(ear)结构域的osdot1直系同源基因组基因。ear结构域可以具有例如lxlxl(例如lllsl)、dlnxxp或，lxlxl和dlnxxp的重叠定义的基序序列。考虑到ear结构域存在于其他生长素响应基因中，在不受理论限制的情况下，假设osdot1直系同源基因组基因的ear结构域及其编码的蛋白质，可以充当能够抑制对生长素的响应(例如血管化)的转录阻遏物。
[0119]
当生成修饰的植物和植物细胞时，可以从osdot1直系同源基因组基因或其组分中去除ear结构域，或将ear结构域与osdot1直系同源基因组基因或其组分一起去除，使得修饰的植物和植物细胞(i)不再包含osdot1直系同源基因组基因和其包括的任何ear结构域，或(ii)包含已被去除所有或至少一些ear结构域的osdot1直系同源基因组基因或其组分。作为非限制性实例，根据本发明的实施方案，可以在生成以下任何一种的过程中从osdot1直系同源基因组基因和/或其编码的蛋白质中去除ear结构域：修饰的禾本科植物(即禾本科/禾本科(poaceae/gramineae))或其他单子叶植物和植物细胞(例如水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、黍、龙爪稷、画眉草、甘蔗和高粱)、修饰的真双子叶植物和植物细胞、修饰的凤梨科植物和植物细胞。
[0120]
在某些实施方案中，修饰的植物和植物细胞可以另外包含能够促进生长素或其类似物(例如4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、1-萘乙酸(1-naa)、吲哚-3-乙酸[iaa]、2,4-d、1-naa)表达的重组构建体。已观察到，向本发明的修饰的植物和植物细胞中添加生长素可增强(例如叶组织)维管形成(例如叶组织)。在不受理论束缚的情况下，假设当植物和植物细胞中osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性受到抑制或阻止时，对增强维管形成的生长素的响应性会相应增加。因此，在修饰的植物和植物细胞中表达额外的生长素或其类似物可充当增加组织(例如叶)中维管形成程度的手段。经改造表达生长素或其类似物的修饰的植物和植物细胞在被修饰而抑制或阻止osdot1直系同源基因组基因的表达和/或其编码的蛋白质的活性之前，最初已包含含一个或多个乙烯响应元件结合因子相关两亲阻遏(ear)结构域的osdot1直系同源基因组基因。在此类修饰的植物和植物细胞中，可以从osdot1直系同源基因组基因或其编码的蛋白质中去除经改造表达生长素或其类似物的修饰的植物和植物细胞中的ear结构域。
[0121]
优选的转化方法可能取决于要转化的植物。农杆菌载体通常用于转化双子叶植物，尤其是茄科和十字花科的成员。然而，农杆菌介导的单子叶植物物种(包括稻米和小麦)
spring harbor laboratory(1989),sambrook,j.和russell,d.w.(2001),“molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆：实验室手册)”,3rd edition(第三版),cold spring harbor laboratory press，和其中引用的参考文献；以及ausubel等人等人(编辑)current protocols in molecular biology(现代分子生物学实验技术),john wiley&sons(2000)。
[0126]
也可以基于一种或多种插入基因的表达，筛选通过本发明的方法转化/突变的植物，例如通过检测引入的核苷酸序列的表达、通过使用特异性寡核苷酸探针进行分子分析和/或靶基因扩增。
[0127]
在一些实施方案中，可以使用常规植物育种方法，将通过本发明的方法转化/突变的植物与标准/野生型系回交，以便将标准/野生型植物和修饰的植物的性状组合到单一系中。在某些实施方案中，可以将后代反复杂交回标准/野生型植物系，以获得表现出感兴趣的突变表型的高产突变植物系(例如，诸如水稻等作物)。
[0128]
在某些实施方案中，通过本发明的方法转化/突变的植物可以是单子叶植物。在其他实施方案中，植物可以是双子叶植物。还在其他实施方案中，植物可以是c3光合植物、c4光合植物、cam植物、稻属植物(例如稻、光稃稻、籼稻、粳稻、kitaake型稻)、大豆(glycine max)、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum))、油菜/卡诺拉(cannola)(b.napus subsp.napus)、马铃薯(solanum tuberosum)、番茄(solanum lycopersicum)、木薯(manihot esculenta)、小麦(triticum aestivum)、大麦(hordeum vulgare)、木豆(cajanus cajan)、豇豆(vigna unguiculata)、豌豆(pisum sativum)、大麻(cannabis sativa)、甜菜(beta vulgaris)、燕麦(avena sativa)、黑麦(secale cereal)、花生(arachis hypogaea)、向日葵(helianthus annuus)、亚麻(linum spp.)、菜豆(phaseolus vulgaris)、利马豆(phaseolus lunatus)、绿豆(phaseolus mung)、赤小豆(phaseolus angularis)、鹰嘴豆(cicer arietinum)、烟草(nicotiana tabacum)、荞麦(fagopyrum esculentum)、油棕(elaeis guineensis)和橡胶(hevea brasiliensis)。
[0129]
还提供了从本发明的转化/突变的植物获得的种子。
[0130]
实施例
[0131]
现在参考具体实施例描述本发明，实施例不应解释为以任何方式进行限制。
[0132]
实施例1：突变osdot1等位基因
[0133]
材料和方法
[0134]-crispr靶标设计
[0135]
golden gate crispr载体用于靶向osdot1基因。使用表1列出的三个独立指导rna获得功能丧失转基因系。使用在线指导rna选择工具crispor(concordet和haeussler，2018)设计指导rna。靶序列sgrna1和sgrna3是从osdot1的第一个外显子设计的，而sgrna4经设计命中终止密码子之后的基因组基因座。将指导rna克隆到golden gate(weber等人2011)level1 grna表达盒中在osu3启动子的控制下。将tggc和aaac突出端添加到互补寡核苷酸的5'末端。在玉米泛素启动子的控制下表达cas9p基因(ma等人等人,2015)，选择组件含有由水稻肌动蛋白1启动子驱动的潮霉素抗性基因。在第一个crispr实验中，表达了单个指导rna(sgrna1)，而第二个crispr实验中表达了所有三种指导rna。
[0136]
表1.用于生成功能丧失osdot1植物的指导rna的序列和位置
[0137][0138]-植物转化
[0139]
使用从toki等人等人,2006改良的方案，在32℃下进行kitaake型水稻(粳稻(o.sativa ssp.japonica))愈伤组织转化和幼苗再生，toki等人等人,2006可以在以下位置下载：
[0140]
https://langdalelab.files.wordpress.com/2015/07/kitaake_transformation_2015.pdf。
[0141]
通过聚合酶链式反应(pcr)测试对潮霉素具有抗性的再生t0小植株，以验证是否存在选择基因hyg(正向引物：5
’‑
caaccaagctctgatagagt-3’；反向引物：5
’‑
gaagaatctcgtgctttca-3’)。将转基因植物转移到土壤(john innes compost no.2)，并检查指导rna靶位点周围是否存在诱导突变。
[0142]-水稻发芽和生长条件
[0143]
用cruisermaxx(cm)杀真菌剂(50μl cruisermaxx，1ml水)处理每系20粒种子。将种子干燥，放在培养皿中水饱和的纸巾上，并在16h/8h光周期、30℃白天/25℃夜间温度下发芽。发芽后，将幼苗转移到含有1/2ms培养基的falcon管中。将两周龄幼苗转移到土壤(john innes compost no.2)并使其在上述相同条件下生长。
[0144]-外源性生长素处理
[0145]
对于生长素处理，使灭菌种子在补充有0.1μm naa的半浓度murashige和skoog培养基(1/2ms培养基)上发芽并生长。在dmso中制备naa原液(100μm)。将等量dmso添加到对照板中。
[0146]-水稻叶样品的固定和包埋
[0147]
对于所分析的每个t2植物，从完全展开的
–
第1旗叶的最宽部分切下跨越整个叶宽的叶段(2-3mm)。将叶段在室温下在3:1的乙醇:乙酸中固定30分钟，然后转移到70％乙醇中。将固定的叶切片转移到组织包埋盒中，然后在tissue tek vacuum infiltration processor(vip)中脱水和蜡浸润。然后将切片从它们的盒中取出，放入石蜡块中，并使其在4℃下凝固过夜。修整蜡块，并使用leica rm2135旋转切片机获得10μm的横截面。将切片在37℃下干燥过夜在显微镜载玻片上。
[0148]-叶新鲜切片成像
[0149]
为了分析外源生长素对突变植物的影响，穿过缺乏叶绿素的第三片叶中间的限制区域的中心，加上紧邻其上方和下方的区域，用羽毛刀片制作薄徒手切片。在uv照射下使切片成像。
[0150]-叶切片染色
[0151]
在用番红o(在50％乙醇(etoh)中1％)染色30分钟之前，将叶切片脱蜡并部分再水化。然后将载玻片用fast green(在95％etoh中0.5％)染色1秒，脱水，排水，并使用dpx封固。
[0152]-成像和数据收集
[0153]
用光学显微镜(leica dmrb显微镜)观察叶切片，并以x20放大倍数成像。图像用于估计叶片宽、叶脉密度、总维管束鞘细胞数和每种叶脉类型(侧向、1级中脉(rank1 intermediate)和2级中脉(rank 2intermediate))的量化。
[0154]-系统发育分析
[0155]
使用orthofinder软件(emms and kelly,2015)从phytozome v12.1(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中检索了来自52个物种的379个zmdot1直系同源基因的蛋白质序列。从这个列表中，选择了代表一系列开花植物分类群的19个物种的子集，并选择了两个苔藓植物物种作为最早的趋异陆地植物的代表。使用mergealign(collingridge and kelly,2012)，对来自21个物种的总计147条序列进行了比对。使用mega(kumar等人,2018)对所得的比对结果进行修整，以仅包括ear结构域和四个锌指结构域。估计了最佳拟合模型参数(jttdcmut i g4)，并使用最大似然法，由1000个自举复制品(nguyen等人,2015)，运行一致性系统发育树。使用itol(interactive tree of life)(letunic and bork,2016)网络界面从该树中提取osdot1进化枝。
[0156]-osdot1突变体的叶光合性状
[0157]
植物生长条件
[0158]
在美国华盛顿州普尔曼市华盛顿州立大学生物科学学院(school of biological sciences of washington state university,pullman,wa(usa))，在当前环境co2水平下，使植物在受控环境生长室中生长。所有植物均单独种植在4-l无排水盆中；土壤、灌溉和施肥同giuliani等人(2013)。
[0159]
每日光周期为14h，光以钟形型态供应10h，入射到植物冠层上的最大光合光子通量密度(ppfd)为每平方米每秒600mol光子。在暗期，空气温度设定在22℃；打开灯后，空气温度跟踪ppfd模式，最大为26℃，持续10h。空气相对湿度保持在约70％，对应于约1.6kpa的最大空气蒸汽压差(vapor pressure deficit,vpd)。
[0160]
叶生理分析
[0161]
在华盛顿州普尔曼市(pullman,wa)，对4-5周龄的水稻进行了叶-大气co2和h2o以及稳定的碳同位素交换进行了测量。测量装置由li-6800设备(li-cor biosciences,ne,usa)组成，其作为开放系统运行，并与可调谐二极管激光吸收光谱仪耦合，该光谱仪可检测
12
co2和
13
co2同位素体(tdlas型号tga200a,campbell scientific,inc.,logan,ut,usa)。li-6800设备配备了容纳6cm2叶表面积的圆形叶室(6800-01a)。
[0162]
对于每个基因型的五株水稻，在同一茎上选择两片完全展开的叶(不包括冠层底部的前六片叶)，并将中到远端叶片部分用于叶片光合分析(n＝5)。在20mmol mol-1
空气(2％o2)的大气o2摩尔分数和400mol mol-1
空气的co2(ca)摩尔分数下进行测量；将ppfd设定为每平方米每秒1500μmol光子，叶片温度为30℃，将叶片与空气的vpd保持在1.2-1.3kpa。
[0163]
使叶部分在叶室中适应约30min，并记录数据约30-40分钟。测定每单位(一侧)叶
表面积的净co2同化和蒸腾速率(分别为a，μmol co
2 m-2
s-1
和e，mmol m-2
s-1
)、细胞间co2摩尔分数(ci，μmol mol-1
空气)以及气孔对水蒸气和co2的扩散传导(分别为g
s_h2o
和g
s_co2
；mol m-2
s-1
)。基于对叶-大气co2和
13
co2交换数据的分析，根据evans and von caemmerer,2013，估算了叶肉对co2的扩散传导(gm,mol co
2 m-2
s-1
)。计算ci/ca、a/e、a/g
s_h2o
和gm/g
s_co2
的比值。
[0164]
为了计算每个基因型的单位面积叶质量(leaf mass per area,lma)，从用于测量的叶片部分获取已知表面积的叶片样品(n＝4)。将组织样品在55℃的通风烘箱中干燥至恒重，然后计算单位面积叶质量(lma,g m-2
)。
[0165]
结果
[0166]-osdot1敲除等位基因
[0167]
在kitaake水稻背景下，使用crispr生成编码推断的锌指蛋白(c2h2家族，iiia型，a1d亚类)的水稻基因osdot1即loc_os09g13680的两个隐性敲除等位基因(图1)。在第一个等位基因(m1)中，2bp的插入导致过早的终止密码子和缺少整个c2h2锌指结构域的截短蛋白质。第二个等位基因(m2)的特征是5bp缺失导致阅读框发生移码和蛋白质发生改变。两个等位基因均分离自相同的异等位基因t0系。
[0168]
从第二个crispr实验中分离出四个新的携带等位基因m3和m4的独立敲除系(图1)。从4个独立的转化事件中反复分离m3等位基因(图2)。两个crispr实验所用的短指导rna(sgrna)如图1a所示。与仅使用sgrna1的第一个实验相比，新的crispr构建体使用了所有三种sgrna，旨在在ear结构域周围的位置(图1b)生成一系列影响dot1基因的突变，包括大的基因组缺失。图1c总结了两个实验中获得的四种不同的等位基因。除了保留完整ear结构域的等位基因m1(截短)外，引入的突变导致ear结构域发生改变或缺失。
[0169]-osdot1突变体的叶脉形态
[0170]
与野生型相比，携带等位基因m1和m2的纯合状态幼苗的特点是，叶脉密度更高，侧脉的比例增加(图3a-c)。更高数量的侧脉有助于更大的维管束鞘细胞与叶肉细胞的比例(图4)。有趣的是，突变系还发育了一些通常在水稻中未发现的2级*中脉(图3d)。
[0171]
虽然没有详细地进行表型分析，但携带等位基因m3和m4的系与野生型相比也始终显示出较高数量的侧脉(图1d)。具体结果总结如下：
[0172]
·
osdot1突变体中叶宽不受影响
[0173]
·
突变等位基因可导致叶脉密度增加
[0174]
·
突变背景中存在数量增加的侧脉
[0175]
·
在突变植物的叶子中发现明显更多的维管束鞘细胞(与叶肉接触)
[0176]
·
在osdot1背景中发育出新型叶脉，即2级中脉(在c4而非c3禾本科植物中发现)。
[0177][0178]-osdot1突变植物生长
[0179]
m1和m2等位基因的纯合突变植物与t2代从幼苗期(图5a)到成熟(图5b)的植物高度表型降低有关。然而，由m2等位基因回交到野生型kitaake背景产生的纯合f2后代的植物高度表现出植物高度恢复(图5c-d)。
[0180]
从第二个crispr实验中分离出的携带等位基因m3和m4的四个独立敲除系显示出预期的叶脉式样表型(图1)，但未表现出植物高度降低(图6)。此外，m2和m3突变植物的行为在代谢方式上似乎类似于野生型植物，如叶净co2同化和蒸腾速率所示(参见表2和表3，图7)。
[0181]
表2显示了净光合速率(a)、蒸腾速率(e)、气孔对水蒸气(g
s_h2o
)和co2(g
s_co2
)的扩散传导以及叶肉对co2的扩散传导(gm)。ci是细胞间co2摩尔分数。值是平均值
±
se(n＝5)。表3显示了wt与突变植物的单位面积叶质量(lma)。值是平均se(n＝4)。f3-10.2和f3-9.3系起源于等位基因m2回交到野生型kitaake背景中，如图3所示。osdot1-m3(697-1.1d-1)系是t1系17697_1.1d姐妹系至17697_1.1a和17697_1.1b的后代，如图4所示。
[0182]
表2
[0183][0184]
表3
[0185]
植物类型lma(g m-2
)osdot1-m2(f3-10.2)67.6
±
4.7分离的wt(f3-9.3)61.1
±
2.4
ꢀꢀ
osdot1-m3(697-1.1-d1)69.6
±
6.6wt53.1
±
5.7
[0186]
综上所述，这些结果表明，osdot1突变体中没有叶脉式样变化引起的生长缺陷或代谢缺陷。
[0187]-osdot1突变体对生长素的响应
[0188]
进行了实验以测试外源生长素对功能丧失osdot1突变体，特别是osdot1-m2表型的影响。
[0189]
将种子铺在含有0.1μm naa的1/2ms培养基上，在生长室中生长7天，然后拍照。没有观察到野生型幼苗和突变型幼苗在嫩枝高度、根结构等方面的总体形态差异(图11)。
[0190]
然而，与野生型相比，突变植物在第3片叶的中间显示出受限区域。从该区域以及紧邻其上方和下方的区域制备徒手切片。
[0191]
在osdot1-m2背景而非野生型中，生长素浓度的增加触发了维管组织和泡状细胞的增殖。在位于第3片叶叶片中间并且跨越整个叶宽的狭窄区域中观察到在多个纯合幼苗上观察到的效果(图12)。
[0192]
实施例2：用于抑制osdot1表达的mirna构建体
[0193]-人工mirna(amirna)
[0194]
使用wmd中的寡核苷酸设计器(ossowski等人,2008)设计人工微rna构建体。将bsai位点和golden gate 4bp特异性突出端添加到pnw55_osamir528茎环上已经存在的bamhi和kpni位点的侧翼，随后允许在golden gate系统中克隆人工微rna。
[0195]
设计以下三种微rna，以靶向loc_os09g13680的第一个外显子：
[0196]
ttatgctcacgttaggctcat(seq id no:7)
[0197]
ttatgctcacgttaggctcgt(seq id no:8)
[0198]
tacaagaacccacatccgcat(seq id no:9)
[0199]
这三种微rna用作设计下文所列amirna寡核苷酸的基础，用于在pcr协助下将人工mirna克隆到golden gate系统中：amirna"ttatgctcacgttaggctcat"的寡核苷酸
[0200][0201]
amirna"ttatgctcacgttaggctcgt"的寡核苷酸
[0202][0203]
amirna"tacaagaacccacatccgcat"的寡核苷酸
[0204][0205]
预测：
[0206]
根据(warthmann等人,2008)描述的方法，使用骨架载体pnw55的golden gate兼容版本，克隆人工微rna构建体并在水稻中使用。该技术使用水稻内源性mirna机制在植物中从整合的转基因中生成特定的21mer小沉默rna(srna)。预计会在t0代中观察到osdot1基因的沉默和随后的表型变化。为了使成功机会最大化，克隆和转化三种不同的amirna，以概括在基因编辑系中观察到的表型。
[0207]
amirna前体在水稻中得到有效加工，并且至少对于一些建议的amirna而言，预计在具有高水平转基因表达的t0系中靶转录物的丰度会大大降低。预计水平非常低的osdot1表达会将正常脉络式样转向osdot1突变体表型。
[0208]
实施例3：具有完整和改变的ear结构域的植物的脉络式样
[0209]
如以上实施例所述，在携带具有完整ear结构域的m1等位基因的植物与携带具有改变的ear结构域的等位基因m2、m3和m4的植物之间，没有观察到脉络式样的明显差异。
[0210]
在不受限理论限制的情况下，发明人假设，单子叶植物中充分保守的ear结构域(uniprot数据显示，保守的mlllslwppg结构域-预测的ear结构域以粗体突出显示)对于dot1的功能准确性可能是必不可少的，并且缺乏ear结构域的蛋白质可能缺乏正常的调节反馈。
[0211]
为了检验该假设，本发明人已尝试表达osdot1的在其内源性表达结构域中缺乏ear结构域的版本。
[0212]
在经设计补充突变表型的实验中，atg上游2952bp片段(包括5'utr)(图9a)被证明不足以驱动osdot1 cdna序列的表达(图8b)。图9a显示了启动子序列，其经修饰与golden gate克隆系统相容(通过在每种情况下引入1bp变化来“驯化”4个bpii和bsai限制酶位点)。
[0213]
为了检测其他潜在的调节序列，使用vista plot软件将osdot1基因座与来自玉蜀黍、狗尾草和粗秆雀稗的相应区域进行比对。比对揭示了含有潜在的调节元件的高度保守的3'utr区域(图10)。然而，将保守的3'utr区域添加到互补构建体中不足以驱动从图9a所示osdot1启动子的基因表达。
[0214]
植物内含子通常参与转录因子的募集，导致发育基因的抑制或激活，染色质标签h3k27me和h3k4me存在于osdot1内含子中。
[0215]
预测：
[0216]
本发明人会(在未来)进行额外的补充尝试，以在基因组克隆背景下测试a)添加存在于dot1基因中的单个内含子的效果，和b)添加内含子加上更大的(约5kb)上游调节区的效果。
[0217]
预计在成功鉴定内源性osdot1表达结构域中驱动转基因表达的调节序列后，在突变osdot1背景中使用这些调节序列驱动转基因表达，会决定ear结构域的相关性。具体而言，预计全长osdot1cdna序列的表达会导致突变表型的补充，而ear结构域缺失的cdna序列的表达无法补充突变表型。
[0218]
实施例4：生成狗尾草(me034v)crispr系
[0219]
材料和方法
[0220]
crispr靶标设计
[0221]
为了生成svdot1突变等位基因，使用crispor设计了两条靶向该基因的第一个外显子的短指导rna(表2)。使用针对水稻描述的goldengate strategy策略，将从osu启动子表达的两个指导rna组装在单个构建体c402006中。
[0222]
表4.用于生成功能丧失svdot1植物的指导rna的序列和位置。原间隔序列邻近基序(pam)以粗斜体显示
[0223][0224]
植物转化
[0225]
使用van eck等人,2017描述的农杆菌介导的愈伤组织转化方法获得转基因狗尾草me034v植物。将具有健康根的再生t0幼苗转移到土壤中，并使其在温室中在16h/8h(白天/夜间)光周期和28℃/22℃(白天/夜晚)的温度下生长。
[0226]
使用靶向选择基因hyg的正向引物：5
’‑
caaccaagctctgatagagt-3’(seq id no:23)和反向引物：5
’‑
gaagaatctcgtgctttca-3’(seq id no:24)对恢复的幼苗进行基因分型，以确定是否存在转基因，并使用商业sanger测序检查编辑。
[0227]
种植狗尾草
[0228]
使非休眠种子在置于培养箱中的密封培养皿中的湿纸巾上发芽，同时30℃光照16小时，24℃黑暗8小时。当幼苗大到足以处理时，将它们转移到土壤中，并使其在光周期为16h/8h(白天/夜间)，温度为28℃/22℃(白天/夜间)的温室条件下生长。
[0229]
基因分型
[0230]
使用kasajima等人,2004开发的一步提取方法分离适合pcr扩增的dna。用引物svdot1_sg65-f 5
’‑
cacttgtttctcccctccct-3’(seq id no:25)和svdot1_sg153-r 5
’‑
tgtagtgactctggtggtgg-3’(seq id no:26)获得375bp扩增子，并通过sanger测序分析其最终突变。
[0231]
表型分析
[0232]
(i)水稻叶样品的固定和包埋
[0233]
在发芽后5天收获第二片新叶的尖端(4-5mm)，并在室温下在3:1的乙醇:乙酸中固定30分钟，然后转移到70％乙醇中。将固定的叶切片转移到组织包埋盒中，然后在tissue tek vacuum infiltration processor(vip)中脱水和蜡浸润。然后将切片置于石蜡块中，设定在4摄氏度，使用leica rm2135旋转切片机进行修整和切片。将10μm横截面干燥到显微镜载玻片上。
[0234]
(ii)叶切片染色
[0235]
在用番红o(50％etoh中1％)染色30分钟并用fast green(95％etoh中0.5％)染色1秒之前，对叶切片进行脱蜡和部分再水化，然后脱水并使用dpx封固。
[0236]
(iii)成像和数据收集
[0237]
用光学显微镜(leica dmrb显微镜)观察叶切片，并以x20放大倍数成像。图像用于估算叶宽、叶脉密度、总维管束鞘细胞数和每种叶脉类型(侧向、1级中脉和2级中脉)的量化。
[0238]
结果
[0239]
svdot1敲除等位基因
[0240]
两个独立的指导rna用于靶向狗尾草dot1基因的位于保守ear结构域两侧的第一个外显子(图14a)。使用下面概述的golden gate构建体成功转化了狗尾草me034v：
[0241]
pl2v-posact1-hyg_pzmubi-cas9p_sgrna-osu3-svdot1-g153_sgrna-osu3-svdot1-g74
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:27)
[0242]
用于狗尾草转化的golden gate构建体的概述
[0243]
同时表达两个指导rna。在两个转化实验中，从11个独立的再生愈伤组织中分离出总共11个基因分型为潮霉素基因存在阳性的t0系。
[0244]
在第一个转化实验中鉴定的第一个突变等位基因(m1)在sgrna153(表4)处具有1bp插入，导致移码并导致从氨基酸54开始发生部分改变的蛋白质，该蛋白质保留了完整的ear结构域，但缺少整个c2h2锌指结构域(如下面的蛋白质比对所示)：
[0245][0246]
野生型(svdot1)和突变型(svdot1-m1)蛋白的比对显示了1bp插入引入的移码变化。
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[0267]
通过交叉引用并入
[0268]
本技术要求澳大利亚临时专利申请号2019902678和2019903883的优先权，每个文件的全部内容均通过交叉引用并入本文。