永生化干细胞株的制备方法及其用途与流程

1.本发明涉及如下的永生化干细胞株的制备方法及其用途：在抑制增殖的同时保持引入基因的表达能力，以便能够用作细胞治疗剂。


背景技术：

2.在世界范围内正在开发利用细胞的治疗方法，尤其，正在进行大量的利用成体干细胞的细胞治疗剂的研究。作为成体干细胞的间充质干细胞(mesenchymal stem cell；msc)为可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、成纤维细胞等的多能(multipotent)细胞。上述msc较容易从骨髓、脐带血、脂肪等各种成体组织中获得。msc具有迁移到炎症或损伤部位的特异性，还具有作为用于传递治疗药物的载体的巨大优势。并且，可通过抑制或激活如t细胞、b细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞的免疫细胞的功能来调节人体的免疫功能。而且，msc具有可在试验管内(in vitro)较容易培养的优点。由于这种特性，正在积极进行将msc用作细胞治疗剂的研究。
3.但是，即使msc具有如上所述的优点，但生产临床级msc作为细胞治疗剂时具有如下的问题。第一，msc的增殖受限，因此难以大量生产其。第二，所获得的msc混合有各种细胞，当生产时，难以保持相同的效果。第三，在仅利用msc的情况下，治疗效果不佳。最后，还具有注入人体的msc在体内成为癌细胞的可能性。
4.另外，在韩国授权专利第1585032号中公开了包含在水凝胶中培养的间充质干细胞的细胞治疗剂。在上述文献中，提供了在分离用作细胞治疗剂的间充质干细胞的工序中，缩短预处理过程来提供能够直接给药的组合物，但完全没有提及如上所述的间充质干细胞的问题及用于解决其的方案。因此，需要研究可用作细胞治疗剂的安全且有效的间充质干细胞。


技术实现要素：

5.技术问题
6.由此，本发明人为了研发可大量生产且长期培养中也可保持相同效果的干细胞治疗剂而进行研究的结果，确认了如下的事实，即，在向本发明的引入永生化基因及外源基因的干细胞照射特定范围的放射线的情况下，稳定地保持引入的外源基因的蛋白质表达，但抑制了干细胞的增殖，从而完成了本发明。
7.即，本发明的目的在于，提供包括向引入永生化基因及外源基因的永生化干细胞株照射放射线的步骤的永生化干细胞株的制备方法及制备的永生化干细胞株。
8.本发明的另一目的在于，提供利用制备的上述永生化干细胞的药剂学组合物。
9.技术方案
10.为了实现上述目的，本发明提供永生化干细胞株的制备方法，其包括如下的步骤：制备引入永生化基因的干细胞株；向上述干细胞株引入编码外源蛋白的基因；冷冻保存上述干细胞株；以及向冷冻状态的上述干细胞株照射放射线。
11.并且，本发明提供药剂学组合物，其包含通过上述方法制备的永生化干细胞株作为细胞治疗剂。
12.以下，详细说明本发明。
13.在一方面，本发明提供永生化干细胞株的制备方法，其包括如下的步骤：制备引入永生化基因的干细胞株；向上述干细胞株引入编码外源蛋白的基因；冷冻保存上述干细胞株；以及向冷冻状态的上述干细胞株照射放射线。
14.本发明的永生化干细胞株的特征在于，引入永生化基因，由此，在长期传代培养中也可保持干细胞的特性，在大量生产中也能够保持相同的品质，从而可稳定地大量生产。
15.尤其，在上述制备过程中，引入向冷冻保存的干细胞株照射放射线的步骤，由此，不使引入永生化基因的干细胞增殖，同时，可长时间稳定地表达引入的蛋白质，从而可安全地用作细胞治疗剂。
16.本发明的永生化干细胞株可通过下述方法制备。
17.步骤1)，向宿主细胞引入如htert和/或c-myc基因的永生化基因；以及步骤2)，向引入上述永生化基因的宿主细胞引入外源基因。
18.在上述步骤1)及步骤2)中，基因的引入方法可使用质粒、逆转录病毒、慢病毒、aav等的各种方法，在利用慢病毒的情况下，当制备包含外源基因的慢病毒时，还可使用包含用于调节外源基因的表达的特定启动子的载体，此时，可包括还引入包含上述启动子的基因的步骤。
19.虽然不限于此，但在本发明的一实施例中，通过使用慢病毒载体向细胞内引入基因，此时利用了使用多西环素或四环素调节表达的tre启动子(tre promoter)，为此，向细胞还感染了包含tta基因的慢病毒。
20.本发明的干细胞通过引入永生化基因来永生化。如上述步骤1)，在本发明中，“永生化基因”可以为htert和/或c-myc基因，但可不受限地使用能够作为永生化基因引入的其他基因。
21.在本发明中使用的术语“c-myc”是指编码位于人类8号染色体的转录因子的基因。用于调节细胞内基因约15％的表达的在c-myc编码的蛋白质为转录调节因子(transcription factor)，在上述转录调节因子过表达的情况下，促进细胞活性及增殖。在本发明中，“htert”是指端粒酶逆转录酶。上述端粒酶逆转录酶将端粒酶的rna模板与互补dna合成来形成rna-dna杂交形式后，变成双环dna并插入于宿主细胞的染色体中。之后，在上述宿主细胞中，端粒酶代替端粒附着在染色体尾部并持续产生端粒，从而可制备永生化细胞。
22.并且，在上述步骤中可追加包含的tta为能够调节靶蛋白的表达的基因，是指四环素反式激活因子。在本发明中使用的tet-off系统可通过如上所述的方法并根据四环素或多西环素的有无来调节靶蛋白的表达。
23.在本说明书中，上述“外源基因”是指可引入至干细胞内来编码外源蛋白的基因。本发明的上述永生化干细胞株的特征在于，保持被引入的外源基因编码的蛋白质的表达能力。并且，上述外源蛋白的种类并不受限，可不受限地包含引入至干细胞内来表达的外源蛋白。优选地，上述外源蛋白可以为对于疾病具有治疗效果的蛋白质。
24.更具体地，上述外源蛋白不仅包括如肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子
(vegf)、神经生长因子(ngf)、脑源性神经生长因子(bdnf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、血小板源性生长因子(pdgf)、骨成型蛋白质(bmp)、集落刺激因子(csf)、表皮生长因子(egf)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)的生长因子；如il-2、il-4、tnf、if-γ、g-csf、gm-csf的细胞因子；如tnf-相关细胞凋亡-诱导配体蛋白(trail)和/或胞嘧啶脱氨酶(cd)的癌症治疗基因；或者识别能够靶向癌组织的特定抗原的抗体、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)型抗体(mono or bi，tri-specific)，还可不受限地包括促进细胞迁移的趋化因子受体等。在本发明的一实施例中，制备了引入bdnf、trail和/或cd的永生化干细胞株，并不局限于此。
25.本发明的永生化干细胞株能够表达bdnf。“脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)”蛋白为大脑中分布最丰富的神经营养因子(neurotrophin)。其以促进神经元(neuron)的生长、神经递质的合成、代谢、游离及调节神经元的活性而周知。并且，bdnf蛋白以在忧郁症患者的前额皮质或海马体中减少且可通过增加其浓度来治疗忧郁症而周知。
26.本发明的bdnf蛋白可以为人源蛋白质。上述蛋白质可以为具有seq id no:1的氨基酸序列的多肽。上述bdnf蛋白可以与seq id no:1的氨基酸序列具有约80％、90％、95％或99％以上的同源性。另外，编码上述bdnf蛋白的基因可以为seq id no:2的碱基序列。并且，编码上述bdnf蛋白的碱基序列可以与seq id no:2的碱基序列具有约80％、90％、95％或99％以上的同源性。
27.并且，本发明的永生化干细胞株能够表达trail及cd。“tnf-相关细胞凋亡-诱导配体(tnf-related apoptosis-inducing ligand，以下称为“trail”)”蛋白属于tnf家族中的2型跨膜细胞因子。上述trail为自杀基因之一，选择性诱导转化细胞的细胞凋亡。具体地，trail与存在于细胞表面死亡受体-4(dr-4)、dr-5、诱骗(decoy)受体或诱骗受体-2结合来激活细胞凋亡信号传递系统。trail对正常细胞无毒性，仅在癌细胞中特异性诱导细胞凋亡而周知。
28.本发明的trail蛋白可以为人源蛋白。上述trail蛋白以能够与三个受体结合的同源三聚体(homotrimer)形式存在。本发明的trail蛋白可以为具有seq id no:3的氨基酸序列的多肽。上述trail蛋白可以与seq id no:3的氨基酸序列具有约70％、80％、90％或95％以上的同源性。另外，编码上述trail蛋白的基因可以为具有seq id no:4的碱基序列的多核苷酸。并且，编码上述trail蛋白的碱基序列可以与seq id no:4的碱基序列具有约70％、80％、90％或95％以上的同源性。
29.在本说明书中使用的“cd蛋白”为胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)蛋白，可以为“cd与尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyltransferase；uprt)结合的融合蛋白”的形式，在本说明书中，“cd蛋白”可以与“cd::uprt”混合使用。本发明的编码cd蛋白的基因的序列为将编码酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的cdase的fcy1基因与从编码n-末端缺失35个氨基酸的uprtase的fur1
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105基因融合而成的密码子优化(codon-optimization)序列。上述序列记载于美国专利第5338678号、国际专利公开第wo 96/16183号及国际专利公开第wo 99/54481号中。根据一实施例，上述cd蛋白可以为具有seq id no:5的氨基酸序列的多肽。并且，上述cd蛋白可以与seq id no:5的氨基酸序列具有约70％、
80％、90％或95％以上的同源性。另外，编码上述cd蛋白的基因可以为具有seq id no:6的碱基序列的多核苷酸。并且，编码上述cd蛋白的碱基序列可以与seq id no:6的碱基序列具有约70％、80％、90％或95％以上的同源性。
30.在本说明书中使用的术语“慢病毒载体”为逆转录病毒之一。上述载体也可混用称为慢病毒转移载体。上述慢病毒载体插入于作为感染对象的细胞的基因组dna来稳定地表达基因。并且，上述载体可向分裂细胞及非分裂细胞传递基因。上述载体并不诱导人体的免疫反应，因此持续表达。并且，相比于以往使用的作为病毒载体的腺病毒载体，具有还可以递送大尺寸的基因的优点。
31.在本发明中使用的重组慢病毒载体可通过启动子调节加载于其的基因的表达。上述启动子可以为巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、人延伸因子-1α(human elongation factor-1alpha，ef-1α)或四环素反应元件(tetracycline response elements，tre)启动子。根据一实施例，重组慢病毒载体可通过一个或两个以上的启动子调节bdnf、trail及cd蛋白的表达。上述启动子可操作地连接在编码所要表达的蛋白质的基因。
32.根据本发明的一实施例，优选地，上述bdnf、trail和/或cd蛋白可与tre启动子连接。当并不使用tre启动子而使用其他种类的启动子时，确认倍增时间(doubling time)随着传代次数的增加而增加，外源蛋白的表达量随着传代次数的增加而显著减少，且细胞形态发生改变。
33.上述tre启动子可通过四环素反式激活因子(tetracycline transactivator，tta)蛋白激活与启动子连接的基因的转录。具体地，当不存在四环素(tetracycline)或多西环素(doxycycline)时，tta蛋白通过与tre启动子结合来激活转录。相反，在其存在的情况下，tta蛋白无法与tre启动子结合而无法激活转录。因此，可根据四环素或多西环素的存在与否调节bdnf、trail和/或cd蛋白的表达。
34.上述术语“可操作地连接”是指特定多核苷酸与其他多核苷酸连接，以使其能够发挥其功能。即，编码特定蛋白质的基因与启动子可操作地连接是指基因被相应启动子转录成mrna并翻译成蛋白质。
35.上述“重组慢病毒”可通过如下的步骤获取：利用本发明的慢病毒载体、包装(packaging)质粒及包膜(envelope)质粒转化宿主细胞；以及从转化的宿主细胞分离慢病毒。
36.上述术语“包装质粒(packaging plasmid)”及“包膜质粒(envelope plasmid)”为载入有编码蛋白质的基因的质粒。除慢病毒载体之外，这些质粒可提供生产慢病毒所需的辅助构建体(例如，质粒或分离的核酸)。这种构建体在宿主细胞中制备慢病毒载体，并包含包装其时有用的元件。上述元件可包括如gag前体的结构蛋白；如pol前体的加工蛋白质；蛋白酶、外皮蛋白及宿主细胞中制备蛋白质且生产慢病毒粒子所需的表达及调节信号等。
37.当生产重组慢病毒时，可使用clontech laboratories公司的lenti-x lentiviral expression system或者addgene公司提供的包装质粒(例如，prsv-rev、pspax、pcl-vsvg、pnhp等)或包膜质粒(例如，pmd2.g、pltr-g、phef-vsvg等)。
38.上述术语“转导(transduction)”是指将通过病毒感染载入至重组慢病毒载体的基因传递至宿主细胞。
39.上述宿主细胞可以为人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hes)、骨髓干细胞(bone marrow stem cell，bmsc)、间充质干细胞(mesenchymal stemcell，msc)、人神经干细胞(human neural stem cell，hnsc)、角膜干细胞(limbal stem cell)或口腔粘膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cell)。根据本发明的一实施例，上述宿主细胞可以为间充质干细胞。
40.上述术语“间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)”是指可分化为包括骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞在内的各种细胞的多能基质细胞。间充质干细胞可分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、神经组织、成纤维细胞及肌肉细胞等具体器官的细胞。这些细胞可从脂肪组织、骨髓、外周神经血、脐带血、骨膜、真皮、中胚层衍生组织等分离或纯化。
41.在本发明的一实施例中，上述永生化间充质干细胞株可以为如下的细胞株：在离体(ex vivo)的情况下，通过多西环素处理抑制外源基因的表达，通过去除多西环素来表达外源基因。
42.在本发明的一实施例中，上述永生化间充质干细胞株可以为如下的细胞株，即，当在多西环素去除培养基(dmem-低葡萄糖(low glucose)，10ng/ml的fgf，10％的fbs)以37℃、5％co2的条件下培养48小时时，与1
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105细胞(cells)的多西环素处理培养基相比，以增加4000倍以上、3000倍以上、1000倍以上、500倍以上、100倍以上、10倍以上、3倍以上的水平表达bdnf蛋白，优选地，以增加3倍至6000倍、3倍至5000倍、3倍至4000倍、3倍至3000倍、3倍至2000倍、3倍至1000倍、3倍至500倍、3倍至300倍、3倍至100倍、30倍至6000倍、30倍至4000倍、30倍至3000倍、30倍至1000倍、300倍至6000倍、300倍至3000倍或300倍至1000倍以上的水平表达bdnf蛋白。
43.在本发明的一实施例中，本发明的表达bdnf的永生化间充质干细胞株通过如下的方式筛选，即，在配制单克隆后，若在12孔板(well plate)中去除多西环素并培养48小时，则先筛选通过tre启动子表达1.5ng/ml以上的bdnf的克隆，若在12孔板中向1
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105细胞处理多西环素并培养48小时，则二次筛选bdnf表达小于0.5ng/ml的克隆，并再次配制单克隆后筛选最终克隆候选。
44.在本发明的一实施例中，本发明的永生化间充质干细胞株可以为如下的细胞株，即，在进行长期传代培养时，也表达作为表面抗原蛋白的cd44及cd105蛋白，由此保持间充质干细胞所具备的固有特性。并且，在本发明的一实施例中，本发明的永生化间充质干细胞株可以为如下的细胞株，即，在进行100天为止的长期传代培养时，也不会改变间充质干细胞的形态，由此，在形态学上保持间充质干细胞的特性。
45.本发明的永生化间充质干细胞株为如下的细胞株(cell line)，即，在长期传代培养时，也可稳定地增殖，倍增时间可短至5小时至25小时、5小时至20小时、5小时至15小时、10小时至25小时、10小时至20小时或10小时至15小时，由此可在短时间内大量生产。在本发明的一实施例中，确认了本发明的永生化间充质干细胞株在进行100天以上的长期传代培养时也可稳定地增殖，倍增时间可短至14小时至25小时，平均时间可短至16小时。
46.本发明的永生化间充质干细胞株在制备后冷冻保存。上述冷冻保存可通过本领域公知的方法执行，并不特别局限于其方式。冷冻保存的温度可以在-70℃至-200℃的范围内，但并不特别局限于此。在本发明的一实施例中，在液氮罐中保存了上述细胞株，在之后的步骤中，也保持了冷冻保存的状态。
47.为了抑制引入用于大量生产的永生化基因时发生的细胞增殖，本发明的永生化间充质干细胞株还包括如下步骤来制备，即，在用作给药至人体的细胞治疗剂前，照射放射线。
48.在本说明书中，术语“照射放射线”的特征在于，利用从放射线源释放的放射线作用于间充质干细胞中的电离能敏感性高的dna来直接引起有效电离并切割dna链的原理，使得照射放射线的间充质干细胞失去增殖能力，但保持存活期间引入的治疗基因的表达。
49.在本发明中，只要可抑制间充质干细胞的增殖，放射线可不受限地使用γ射线、β射线、中子射线、x射线、电子束等。
50.在本发明中，上述放射线的“照射剂量”是指任意场所中的x射线或γ射线等放射线在空气中移动的同时产生的阳离子或电子能量的多少。因此，上述照射剂量表示根据放射线照射仪器的种类、照射的环境及接触时间等被实际对象体吸收的剂量之差。因此，在本发明中照射的放射线的剂量以在对象体表示放射线的能量被介质吸收的程度的单位“吸收剂量”为基准测定。即，在本发明中，以永生化干细胞株所吸收的放射线能量的量测定其范围。
51.在本发明的一实施例中，将引入bdnf的bm102细胞株、bm01a细胞株和引入trail及cd的bm03细胞株作为永生化干细胞株进行放射线照射试验，结果，确认到在吸收特定吸收剂量以上的放射线的细胞株中，未实现集落生成及细胞数的增加，从而测定了可将上述永生化干细胞株用作细胞治疗剂的最小吸收剂量。
52.即，在本发明中，以吸收放射线的干细胞株为基准，吸收剂量可以为大于80gy的范围，优选为大于81gy、大于82gy、大于83gy、大于84gy、大于85gy、大于86gy、大于87gy、大于88gy、大于89gy、大于90gy的范围，更优选为80gy至400gy的吸收剂量的范围。但是，在照射超出上述范围的吸收剂量时，确认了不发生干细胞的增殖且保持外源蛋白的表达。确认的上述吸收剂量的上限仅为实验测定的范围，并不意味着其上限特别受限。从本发明的一实施例确认，在照射剂量的层面上，即使照射500gy以上的放射线，本发明的细胞株也可适合用作临床试样。
53.并且，在本发明的一实施例中，干细胞株所吸收的吸收剂量的范围满足下述范围。
54.当照射剂量为0gy至100gy时，吸收照射剂量的90％至110％；当照射剂量为100gy至200gy时，吸收照射剂量的85％至115％；以及当照射剂量为200gy以上时，吸收照射剂量的60％至110％。
55.在满足上述范围的情况下，在本发明的永生化干细胞株中，未实现集落形成及细胞数增加，可使引入的外源基因的表达量保持规定水平以上。这为确认以通过引入永生化基因来能够大量生产的方式制备的干细胞株的稳定性的结果。
56.在本发明的一实施例中，通过上述制备过程制备的间充质干细胞株为利用包括编码四环素反应元件(tetracycline response elements，tre)启动子基因及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)蛋白的基因的重组慢病毒转染的永生化间充质干细胞株，上述细胞株提供如下的永生化间充质干细胞株，即，与离体(ex vivo)处理多西环素来培养的间充质干细胞株相比，在去除多西环素来培养的间充质干细胞株中，示出下述基因的表达模式：过表达bdnf；增加angptl4、angpt1、cend1、nfasc、grap2或trim6基因的表达量；以及减少il2rb、il6、il1b或ptgs2的表达量。
57.上述永生化间充质干细胞株为在离体(ex vivo)的情况下通过多西环素处理抑制bdnf表达且通过去除多西环素表达bdnf的永生化间充质干细胞株，可根据是否存在bdnf表达来改变转录组(transcriptome)。
58.在本说明书中，术语“转录组(transcriptome)”是指所有表达的rna的总合。与多西环素处理前后相比，本发明的永生化间充质干细胞株可包括如下的rna的变化。
59.在本发明的一实施例中，当在添加有多西环素的培养基中增殖永生化间充质干细胞株后去除多西环素时，确认了过表达bdnf，选自由angptl4、angpt1、cend1、nfasc、grap2及trim6组成的组中的一种以上的基因的表达增加，il2rb、il6、il1b或ptgs2基因的表达减少(图10a)。
60.本发明的血管生成素样蛋白4(angiopoietin like 4，angplt4)及血管生成素蛋白1(angiopoiein 1，angpt1)以参与血管生成过程而周知，白细胞介素2受体β亚基(interleukin 2receptor subunit beta，il2rb)、白细胞介素6(interleukin6，il6)、白细胞介素1β(interleukin 1beta，il1b)及前列腺素内过氧化物酶合酶2(prostaglndin-endoperoxidase synthase 2，ptgs2)与炎症相关，细胞周期和神经元分化1(cell cycle and neuronal differentiation 1，cend1)及神经束蛋白(neurofascin，nfasc)与神经生成过程相关，grb2相关接头蛋白2(grb2-related adaptor protein 2，grap2)及三重基序6(tripartite motif containg 6，trim6)与免疫系统相关而周知。
61.在本发明的一实施例中，当在添加有多西环素的培养基中增殖上述永生化间充质干细胞株并去除多西环素时，还确认了hlf、ror2或icam1基因的表达量减少，cebpb、egr2、bmp8a、bex2、klf4、tnfsf15、ptbp3或igfbp2基因的表达量减少(图10b)。
62.本发明的hlf(hlf、par bzip转录因子(par bzip transcription factor))、受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2，ror2)及细胞间黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，icam1)基因以作为调节细胞分化、迁移及增殖的基因而周知。
63.并且，ccaat/增强子结合蛋白β(ccaat/enhancer binding protein beta，cebpb)、早期生长受体2(early growth receptor 2，egr2)、骨形态生成蛋白8a(bone morphogenetic protein 8a，bmp8a)、脑表达x染色体连锁蛋白2(brain expressed x-linked 2，bex2)、kruppel样因子4(kruppel like factor 4，klf4)、tnf超家族成员15(tnf superfamily member 15，tnfsf15)、多聚嘧啶串结合蛋白3(polypyrimidine tract binding protein 3，ptbp3)及胰岛素生长因子结合蛋白2(insulin growth factor binding protein 2，igfbp2)以作为调节细胞凋亡的基因而周知。
64.在本发明的一实施例中，当在添加有多西环素的培养基中增殖上述永生化间充质干细胞株并去除多西环素时，还确认了mir4444-1、mir4444-2、mir1244-1的表达增加，mir1244-4、mir319i、mirlet7d的表达减少(图10c)。
65.在再一实施方式中，本发明提供包含通过如上所述的方法制备的永生化间充质干细胞株的药剂学组合物。上述药剂学组合物可包含由向永生化间充质干细胞株引入的外源基因表达的蛋白质作为有效成分。
66.上述药物组合物还可包含药学上可接受的载体。上述载体通常用于制备药物，可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅
酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。
67.并且，本发明的药物组合物还可包含选自由润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂及其它们的组合组成的组中的药学上可接受的添加剂。
68.以本发明的药物组合物的总重量为基准，可包含约1重量百分比至约99.99重量百分比的上述载体，优选地，可包含约90重量百分比至约99.99重量百分比的上述载体，可包含约0.1重量百分比至约20重量百分比的上述药学上可接受的添加剂。
69.上述药物组合物可根据常规方法利用药学上可接受的载体及赋形剂来制剂化，由此，能够以单位容量形态制备或者装入多容量容器内来制备。此时，剂型还可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态或者提取剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。
70.在本发明的一实施例中，经确认，当将以通过bdnf良好生长而周知的神经胶质细胞c6与bm102细胞株共培养时，c6细胞的增殖率与bm102细胞株的数量成正比地增加，由此，可稳定地大量生产bdnf，以便将bm102细胞株用作细胞治疗剂，可将稳定表达bdnf的bm102细胞株用作保护或治疗神经细胞的细胞治疗剂(图22)。
71.并且，在本发明的一实施例中，确认了bm102细胞株在细胞培养的过程中没有转化能力，且没有试验管内(in vitro)致肿瘤性(图21)。
72.由此，虽然本发明的永生化间充质干细胞株为引入bdnf及永生化基因的转化的细胞，但它不具备致肿瘤性，通过表达bdnf来示出神经保护效果，因此，可安全地用于治疗各种中枢神经系统紊乱。
73.上述神经疾病可选自由阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)、帕金森病(parkinson's disease，pd)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)、脑梗塞、慢性脑损伤(chronic brain injury)、缺血性脑病、脊髓损伤、亨廷顿病(huntington's disease，hd)、雷特病(rett's disease，rd)、脑卒中、多发性硬化症、外伤性脑损伤(traumatic brain injury)、新生儿缺氧缺血性脑病(neonatal hypoxic ischemic encephalopathy)及勃起功能障碍组成的组中。
74.并且，本发明提供通过如上所述的神经疾病的预防或治疗方法，其包括向个体给药本发明的药物组合物的步骤。
75.上述个体可以为哺乳动物，具体地，可以为人类。上述药物组合物的给药途径及剂量可根据患者的状态及是否具有副作用来以各种方法及量向对象给药，普通技术人员可在适当范围内选择给药方法及剂量。并且，上述药物组合物可与对于所要治疗的疾病公知治疗效果的其他药物或生理学活性物质联合给药，或者可剂型化为与其他药物的组合制剂形态。
76.在肠胃外给药上述药物组合物的情况下，作为其例，具有皮下、眼部、腹腔内、肌肉内、口腔、直肠、眼眶内、脑内、颅内(intracranial)、脊椎及鞘内、脑室内、鞘膜内、鼻内、静脉内、包括颈动脉的动脉给药。
77.针对上述给药，可给药1次以上、2次以上、3次以上、4次以上、1次至4次以上，具体地，可分为2次给药。在重复给药其的情况下，能够以12小时至48小时、24小时至36小时间隔、1周、2周至4周间隔给药，具体地，能够以24小时或1周以上的间隔给药。针对上述给药，
在慢病毒的情况下，以成人为基准，能够以1天1.0
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106tu至1.0
×
10
12
tu的量给药，具体地，以一天1.0
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108tu至1.0
×
10
10
tu的量给药。另外，在细胞的情况下，以成人为基准，能够以1天1.0
×
105细胞至1.0
×
10
11
细胞的量给药，具体地，能够以1天1.0
×
107细胞至1.0
×
109细胞的量给药。在剂量多的情况下，可一天分多次给药。
78.发明的效果
79.本发明的永生化干细胞株的制备方法还包括向引入永生化基因及外源基因的干细胞株照射放射线的步骤，由此，可制备如下的永生化干细胞株：由于异常分化及增殖可能性低，安全性高，同时，长时间保持能够用作治疗成分的外源蛋白的表达量。并且，根据上述制备方法制备的永生化干细胞株可有用地用作用于预防或治疗各种疾病的药剂学组合物。
附图说明
80.图1为比较由c-myc永生化的msc(stem24)与非永生化msc(bm-msc)的细胞增殖率的图表，其中，x轴：培养时间，y轴：群体倍增水平(population doubling level，pdl)。
81.图2为比较通过引入c-myc及htert来永生化的msc与非永生化msc的细胞增殖率的图表，其中，immsc：永生化msc，msc：非永生化msc，x轴：培养时间，y轴：群体倍增水平。
82.图3为示出在根据bdnf蛋白表达量得以确认的克隆中是否存在多西环素的bdnf蛋白表达量的图表，图3a示出用于筛选本发明的bm102的克隆的表达量，图3b示出用于筛选bm01a的克隆的表达量。
83.图4为比较示出bm102单克隆细胞株的基因操作之后的msc所具有的固有特性的表面抗原蛋白cd44和cd105等的表达与源自骨髓的msc的表面抗原蛋白的表达的图表。
84.图5为在长期培养由包含bdnf基因的慢病毒转导的永生化msc的细胞的同时确认增殖率的图表，其中，x轴：培养时间，y轴：群体倍增水平(population doubling level，pdl)。
85.图6为在长期培养的同时确认根据是否处理多西环素的bm102的细胞增殖率的图表，其中，x轴：培养时间，y轴：群体倍增水平(population doubling level，pdl)。
86.图7为确认根据是否处理多西环素的bm102细胞株保持各个传代的形态学细胞特性的图。
87.图8为示出根据是否处理多西环素的bm102细胞株的bdnf蛋白表达量的图表。
88.图9为确认向bm102细胞株引入基因的图。
89.图10为比较根据是否处理多西环素的bm102细胞株的转录组并示出变化的基因。
90.图10a为示出随着去除多西环素，以在bm102细胞株中与血管生成、炎症、神经生成及免疫系统过程相关而周知的基因的转录组变化的图。增加的转录组的数值由正值表示，减少的转录组的数值由负值表示。
91.图10b为示出随着去除多西环素，以在bm102细胞株中与细胞分化、迁移、增殖及细胞凋亡相关而周知的基因的转录组变化的图。增加的转录组的数值由正值表示，减少的转录组的数值由负值表示。
92.图10c为示出随着去除多西环素，在bm102细胞株中的微小核糖核酸(micro rna)基因的转录组变化的图，增加的转录组的数由正值表示，减少的转录组的数由负值表示。
93.图11示出向bdnf表达永生化干细胞株(bm102)照射γ射线后测量细胞数的结果。
94.图12示出向bdnf表达永生化干细胞株(bm102)照射x射线后测量细胞数的结果。
95.图13为向bdnf表达永生化干细胞株(bm102)照射γ射线后通过bdnf表达量确认细胞滴度变化的结果。
96.图14为向bdnf表达永生化干细胞株(bm102)照射x射线后通过bdnf表达量确认细胞滴度变化的结果(一次)。
97.图15为向bdnf表达永生化干细胞株(bm102)照射x射线后通过bdnf表达量确认细胞滴度变化的结果(二次)。
98.图16为示出向bdnf表达永生化干细胞株(bm01a)照射γ射线后测量细胞数的结果。
99.图17为向bdnf表达永生化干细胞株(bm01a)照射γ射线后通过bdnf表达量确认细胞滴度变化的结果。
100.图18为向表达trail及cd的永生化干细胞株(bm03)照射低水平γ射线后测量细胞数的结果。
101.图19为向表达trail及cd的永生化干细胞株(bm03)照射高水平γ射线后测量细胞数的结果。
102.图20为向表达trail及cd的永生化干细胞株(bm03)照射低水平γ射线后通过上述trail及cd基因表达量确认细胞滴度变化的结果。
103.图21为在操作bm102细胞株的基因后确认不存在致肿瘤性的图表。
104.图22为在共培养bm102细胞株和c6细胞时确认c6细胞的增殖率的图表，其中，x轴：bm102细胞数，y轴：c6细胞的增殖率。
具体实施方式
105.在一方面，本发明涉及永生化干细胞株的制备方法，其包括如下步骤：制备引入永生化基因的干细胞株；向上述干细胞株引入编码外源蛋白的基因；冷冻保存上述干细胞株；以及向冷冻状态的上述干细胞株照射放射线。
106.作为本发明的一实施方式，上述永生化基因为c-myc和/或htert。
107.作为本发明的一实施方式，上述外源蛋白选自生长因子、细胞因子或癌症治疗蛋白、抗体及趋化因子受体中。
108.作为本发明的一实施方式，上述永生化干细胞株为人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hes)、骨髓干细胞(bone marrow stem cell，bmsc)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)、人神经干细胞(human neural stem cell，hnsc)、角膜干细胞(limbal stem cell)或口腔粘膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cell)。
109.作为本发明的一实施方式，照射上述放射线以使对于干细胞株的吸收剂量至少成为80gy，更具体地，当照射剂量为0gy至100gy时，上述吸收剂量满足照射剂量的80％至140％的范围，当照射剂量为100gy至200gy时，上述吸收剂量满足照射剂量的80％至140％，当照射剂量为200gy以上时，上述吸收剂量满足照射剂量的60％至140％的范围。
110.作为本发明的一实施方式，上述放射线选自包括γ射线、β射线、中子射线、x射线及电子束的组中。
111.在再一方面，本发明涉及包含通过上述方法制备的永生化干细胞株的药剂学组合
物。
112.作为本发明的一实施方式，上述药剂学组合物包含表达脑源性神经营养因子(bdnf)的永生化干细胞株。
113.作为本发明的一实施方式，上述药剂学组合物具有神经疾病的预防或治疗效果，上述神经疾病选自由阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)、帕金森病(parkinson's disease，pd)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)、脑梗塞、慢性脑损伤(chronic brain injury)、脊髓损伤、亨廷顿病(huntington's disease，hd)、雷特病(rett's disease，rd)、缺血性脑病、脑卒中、外伤性脑损伤(traumatic brain injury)、新生儿缺氧缺血性脑病(neonatal hypoxic ischemic encephalopathy)及多发性硬化症组成的组中。
114.在另一方面，本发明涉及通过上述方法制备的永生化干细胞株作为细胞治疗剂的用途。
115.在还有一方面，本发明涉及向个体给药治疗有效量的通过上述方法制备的永生化干细胞株来治疗疾病的方法。
116.发明实施方式
117.以下，通过下述实施例详细说明本发明。但，下述实施例仅用于例示本发明，本发明并不局限于此。
118.实施例1.制备永生化间充质干细胞(msc)
119.实施例1.1.制备包含永生化基因的慢病毒载体
120.为了使msc永生化，制备了包含永生化基因c-myc和/或htert的慢病毒载体。此时，为了使用tet-off系统，一同插入表达tta蛋白的基因构建体。
121.首先，在pwpt载体(bioneer合成)的表达盒内，将ef启动子取代为cmv启动子来制备了pbd慢病毒载体。向上述pbd慢病毒载体插入c-myc基因(seq id no:7)，以通过cmv启动子调节表达。将制备的上述载体命名为pbd-1。
122.另外，向pbd慢病毒载体插入htert基因(seq id no:8)，以通过cmv启动子调节表达。其中，插入对zeomycin具有抗性的基因(zeor；seq id no:12)，以通过rsv启动子调节表达。将制备的上述载体命名为pbd-2。
123.并且，向pbd慢病毒载体插入四环素反式激活因子(tetracycline transactivator，tta)基因(seq id no:9)，以通过cmv启动子调节表达，将制备的载体命名为pbd-3。
124.实施例1.2.生产包含永生化基因的慢病毒
125.利用在上述实施例1.1.中制备的慢病毒载体，通过如下的方法生产了包含永生化基因的慢病毒。
126.首先，使用包含10％的胎牛血清的dmem培养基，在150mm的培养皿(dish)培养lenti-x细胞(clontech laboratories，美国)。另外，通过使用endofree plasmin maxi kit(qiagen，美国)从dh5α大肠杆菌细胞提取并定量慢病毒载体。
127.利用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤培养的上述lenti-x细胞后，添加3ml的tryple
tm select cts
tm
(gibco，美国)。在37℃的温度下，将细胞放置约5分钟后，确认细胞被剥离。通过添加7ml的包含10％的胎牛血清的dmem培养基来中和剥离的细胞。将中和的细胞收集在
50ml的管中，并在1500rpm的速度离心分离5分钟。去除上清液，并添加10ml的包含10％的胎牛血清的dmem培养基来将细胞再次悬浮。
128.利用血细胞计数器测量悬浮的细胞数后，向150mm的培养皿接种以成为1.2
×
107个的细胞。当培养接种的上述细胞以使细胞饱和度成为约90％程度时，将12μg的慢病毒载体、12μg的pspax(addgene；gag-pol表达、包装质粒)及2.4μg的pmd.g质粒(addgene；vsvg表达，包膜质粒)混合物转导至上述细胞。为了帮助转导，使用了脂质体(invitrogen，美国)和plus reagent(invitrogen，美国)。转导6小时后，将培养基更换为包含10％的胎牛血清的dmem。将其追加培养48小时后，收集上清液。
129.混合获取的上述上清液与慢病毒浓缩试剂盒(lenti-x concentrator，clontech laboratories，美国)后，在4℃的温度下，培养一夜。并在4℃、4000rpm的条件下，离心分离2小时来获取病毒，并在未包含胎牛血清(fbs)的0.5ml的dmem再次悬浮其。
130.实施例1.3.制备永生化间充质干细胞
131.通过使用包含在上述实施例1.2.中生产的永生化基因的慢病毒来制备了永生化msc。
132.首先，通过如下的方法准备了源自骨髓的msc。具体地，从健康供体(donor)的髂嵴(iliac crest)中获得骨髓穿刺液(bone marrow aspirate)。在无菌容器中将其与20iu/ml的肝素混合来抑制凝固。在4℃、739g的条件下，将上述骨髓混合液离心分离7分钟后，去除上清液，并与10倍体积的无菌水混合。在相同条件下，对其再次进行离心分离来获得了细胞的颗粒。在包含20％的胎牛血清及5ng/ml的b-fgf(100-18b，peprotech，美国)的dmem-低葡萄糖(low glucose)(11885-084，gibco，美国)培养基悬浮所获得的颗粒并接种在培养瓶中。在37℃、5％co2条件下，将其培养24小时至48小时后，更换为新的培养基。以3天至4天的间隔，在更换新的培养基的同时将其传代培养，培养2周后，通过使用荧光细胞分析仪确认是否存在msc。
133.通过使用纤维连接蛋白(retronectin，clontech laboratories，美国)并利用在上述实施例1.2.中生产的pbd-1慢病毒以100moi感染所准备的上述msc。结果，在图1示出包含c-myc的msc及不含c-myc的msc的细胞增殖率。如图1所示，在由包含永生化基因c-myc的慢病毒感染的msc细胞中，随着通过永生化基因进行永生化，以感染后培养30天为基准，增殖率增加，且高增殖率保持至50天为止。相反，在培养20天后，正常msc细胞的细胞增殖率快速减少。
134.并且，利用包含htert的pbd-2慢病毒载体以100moi感染被包含上述c-myc的慢病毒感染的细胞。感染后，通过向稳定的细胞的培养液添加500μg/ml的zeomycin来筛选了感染pbd-2慢病毒的细胞。
135.对此，如图2所示，在培养120天后，被包含永生化基因c-myc及htert两者的慢病毒感染的msc细胞保持高细胞增殖率。相反，在培养40天后，正常msc细胞的细胞增殖率快速减少。
136.并且，向感染上述pbd-1和/或pbd-2的细胞以100moi感染包含tta的pbd-3慢病毒载体。感染后，向稳定的细胞的培养液添加1μg/ml的嘌呤霉素，由此筛选感染pbd-3慢病毒的细胞。
137.实施例2.制备包含外源基因的慢病毒
138.实施例2.1.制备包含bdnf基因的慢病毒
139.向在上述实施例1.1.中制备的pbd慢病毒载体插入bdnf基因(seq id no:2)。
140.首先，为了确认启动子对于bdnf表达的影响，分别使用cmv启动子及tre启动子制备慢病毒载体以表达bdnf基因，并利用其来制备表达bdnf基因的msc。结果确认了，在应用cmv启动子的细胞株的情况下，当长期传代培养时，表达bdnf的msc发生形态变化，随着传代培养的进行，bndf的表达率减少。
141.由此，将bndf基因插入至各个pbd载体，以通过tre启动子调节表达。tre启动子可根据是否添加多西环素而调节与上述启动子相连的基因的表达。
142.并且，利用包含制备的上述bdnf基因的慢病毒载体(pbd-4及pbd-5)，通过与在上述实施例1.2.中的记载相同的方法生产了慢病毒。以4.7
×
106copies/ml(pbd-4)、1.4
×
10
12
copies/ml(pbd-5)的浓度分别准备生产的慢病毒。
143.实施例2.2.制备包含trail及cd基因的慢病毒
144.根据在韩国授权专利第10-1985271号中记载的内容制备包含trail及cd基因的慢病毒。向在上述实施例1.1中制备的pbd慢病毒载体插入trail基因(seq id no:4)及cd基因(seq id no:6)。此时，插入的trail及cd基因与内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，ires)相连，并通过tre启动子调节表达。ires为核糖体结合位点，即使没有5
’‑
帽结构，也可开始翻译(translation)，从而可在一个mrna表达两个蛋白质。另外，tre启动子可根据是否添加多西环素来调节与上述启动子相连的基因的表达。
145.将插入trail及cd的上述载体命名为pbd-6，通过与上述实施例1的记载相同的方法，利用其来生产了慢病毒。以7.6
×
108tu/ml的浓度准备了所生产的慢病毒。
146.实施例3.制备利用包含外源基因的慢病毒转染的永生化干细胞
147.实施例3.1.制备由包含bdnf基因的慢病毒转染的msc
148.3.1.1.制备bm102细胞株
149.向在上述实施例1.3.中制备的永生化msc，以100moi感染包含在上述实施例2.1.中生产的bdnf基因的慢病毒，从而制备了表达bdnf基因的细胞。其中，上述慢病毒使用通过引入永生化基因中的c-myc的pbd-1载体生产而成的。在添加有2μg/ml的多西环素(doxycycline，631311，clontech，美国)的培养基中培养转导的细胞，从而在培养过程中抑制了bdnf蛋白的表达。
150.利用克隆选择成像仪(clone select imager)培养上述细胞以形成集落。对在96孔板中接种的细胞，按照孔赋予编号后，利用人bdnf duoset elisa试剂盒(r&d systems，dy248，美国)确认了，在确认集落形成的200多个克隆中是否存在bdnf蛋白表达。
151.在上述细胞中，在由引入pbd-4的慢病毒制备的永生化msc中，在去除多西环素后，筛选了表达1.5ng/ml以上的bdnf蛋白的#10、#22、#28、#65、#110、#116、#126、#596、#669及#741克隆。之后，当处理多西环素时，筛选了表达0.5ng/ml以下的bdnf蛋白的#28和#110克隆(图3a)。
152.确认筛选的上述克隆的细胞增殖能力的结果，将示出稳定的增殖模式且bdnf蛋白表达量最优秀的#28克隆命名为bm102细胞株，并作为专利菌株保藏(韩国生命工程研究院，kctc13876bp)。
153.3.1.2.制备bm01a细胞株
154.并且，与上述3.1.1相同地，制备了由引入pbd-1和pbd-2的慢病毒感染的永生化msc。上述细胞株的制备方法根据韩国授权专利第10-2074336号中记载的方法制备。病毒感染后，稳定细胞后，向培养液添加500μg/ml的g418，由此筛选了由引入c-myc及htert基因的pbd-5慢病毒感染的细胞。在添加有1μg/ml的多西环素(doxycycline，631311，clontech，美国)的培养基中培养筛选的细胞，由此抑制了培养过程中的bdnf蛋白的表达。
155.培养筛选的上述细胞以形成集落。利用人bdnf duoset elisa试剂盒(r&d systems，dy248，美国)确认是否存在bdnf蛋白表达，由此筛选所形成的#1至#50的克隆中的表达bdnf蛋白的#10、#12、#14、#18、#20、#22、#23、#26、#29及#41克隆，当处理多西环素时，再次筛选不表达bdnf蛋白的#14、#22、#23及#41克隆(图3b)。通过相同的方法确认细胞增殖能力，并将示出稳定的增殖模式且表达量最优秀的#41克隆命名为bm-01a细胞株。
156.实施例3.2.制备由包含trail及cd基因的慢病毒转染的msc
157.根据在韩国授权专利第10-1985271号中记载的方法，对在上述实施例1-3中制备的永生化msc感染在上述实施例2-2中生产的包含trail及cd基因的慢病毒，由此制备了表达trail及cd基因的细胞。与在实施例1-3中记载的相同方法执行感染。感染后，向稳定的细胞的培养液添加1μg/ml的多西环素(doxycycline，631311，clontech，美国)，来在抑制trail及cd的表达的状态下进行培养。将细胞稳定后，在去除多西环素的培养基中培养72小时，由此诱导trail及cd的表达，利用上述细胞执行流式细胞术(facs)来筛选了在细胞表面表达trail的细胞。
158.具体地，接种由包含trail及cd基因的慢病毒感染的细胞，以使每facs管成为5
×
105个，在4℃、1500rpm的条件下，对其离心分离5分钟来去除了上清液。对其添加1ml的facs缓冲液(包含2％的胎牛血清的pbs)来再次悬浮细胞，并以相同条件离心分离来去除了上清液。再次执行上述洗涤过程后，在1ml的facs缓冲液中再次悬浮细胞。向再次悬浮的细胞添加混合物，上述混合物向200μl的facs缓冲液添加0.3μl的fixable near-ir dead cell stain(life technologies-molecular probes，美国)及5μl的作为抗-trail抗体的apc抗人cd253抗体(biolegend，cat#.308210，美国)而成，并在4℃的温度下反应30分钟。反应后，通过如上所述的方法将细胞洗涤2次，并去除上清液。向洗涤的细胞添加300μl的固定缓冲液(fixing buffer)(包含2％的甲醛及1％的胎牛血清的pbs)，并在4℃的温度下至少放置15分钟。利用facs(lsrfortessa，bd biosciences，美国)仪器分析上述细胞来筛选表达trail的细胞，培养细胞以形成集落。
159.利用形成的集落培养单克隆细胞来确认细胞株，并将其命名为bm-03。
160.实施例4.对于永生化干细胞株的放射线照射试验
161.为了将在上述实施例3中制备的各个永生化msc细胞株用作临床试样，还执行了在不使细胞增殖的同时保持治疗蛋白的表达量的放射线照射步骤，由此确认了适当的放射线照射(吸收)剂量。
162.首先，利用为了照射放射线而制造的移动盒运输永生化msc细胞株，上述永生化msc细胞株通过剂型化来冷冻保存在液氮罐中。此时，利用干冰保持冷冻状态。
163.向冷冻状态的上述永生化msc细胞株照射放射线。放射线照射使用公知的方法及设备，在γ射线的情况下，使用低水平γ射线照射设备或高水平γ射线照射设备(mds nordion，加拿大)，在x射线的情况下，使用x-rad 320x-ray irradiator(首尔大学融合科
学技术院)或rs1800q(rad source technologies,inc)。在照射放射线的过程中，通过干冰将移动盒内部的温度保持为能够持续冷冻状态的温度，将完成放射线照射的msc细胞株再次保存在液氮罐中。
164.为了确认放射线照射剂量，利用单独的丙氨酸剂量测定按照照射量测量放射线吸收剂量，可通过上述结果值计算永生化msc细胞株的吸收剂量。
165.针对放射线照射完成的上述永生化msc细胞株，每个标本以3个小瓶在37℃的恒温水箱中解冻约2分钟后，添加9ml的pbs，并在4℃、1500rpm的条件下，离心分离5分钟后，去除上清液，并在包含10％的fbs(16000-044，gibco，美国)、10ng/ml的b-fgf(100-18b，peprotech，美国)的dmem-低葡萄糖(11885-084，gibco，美国)培养基中悬浮。利用血细胞计数器测量所悬浮的细胞数后，进行之后的实验。
166.实验例1.确认bm102细胞株中的表面抗原蛋白表达
167.利用人msc分析试剂盒(stemflow
tm
，cat no562245，bd)分析插入基因之前的源自骨髓的msc和插入bdnf基因的bm102细胞株的表面抗原蛋白表达。根据各个试剂盒中所包括的说明书执行实验，在图4示出实验结果。
168.结果证明，如图4所示，bm102细胞株即使进行用于表达bdnf的基因操作，作为msc所具有的固有特性的表面抗原蛋白cd44和cd105的表达也与源自骨髓的msc相似。
169.实验例2.确认照射放射线前的bm102细胞株的增殖率
170.确认了在上述实施例3.1.中确认的bm102细胞株的增殖率。向t175烧瓶中接种0.2
×
106个至0.8
×
106个的bm102细胞株后，添加或不添加多西环素来培养3天或4天，并测定增殖倍增水平(proliferation doubling level，pdl)和细胞存活率。通过“pdl＝x 3.222(logy-logi)”公式计算pdl，x示出初始pdl，i示出接种在烧瓶的初始细胞数，y示出最终细胞数。在图5及图6示出确认的细胞株的增殖率。
171.结果，如图5所示，bm102细胞株稳定增殖超过100天。并且，如图6所示，可确认，与添加多西环素并培养的bm102细胞株相比，未添加多西环素并培养80天为止的bm102细胞株的细胞增殖率逐渐减少。
172.实验例3.根据传代培养的bm102细胞株的形态学确认
173.为了确认在上述实施例3.1.中确认的bm102细胞株随着传代培养的形态学变形，在实验例2.中确认bm102细胞株的增殖率，并通过显微镜拍摄细胞的照片，在图7示出bm102细胞的形态。
174.结果确认，如图7所示，即使将bm102细胞株长期培养至100天为止，也没有形态学变化，由此，未观察到长期培养引起的如细胞老化的现象。但是，在未添加多西环素来培养的情况下，确认了由于bdnf的表达，bm102细胞株发生形态学变化。这意味着，由于表达bdnf蛋白，影响bm102细胞，从而使细胞特性变化。
175.实验例4.确认照射放射线之前的bm102细胞株中的bdnf蛋白的表达
176.通过elisa分析方法确认了在上述实施例3.1.中建立的bm102细胞中的bdnf蛋白的表达。具体地，利用人bdnf duoset elisa试剂盒确认bdnf蛋白的表达水平。根据各个试剂盒中包括的说明书执行实验。在下述图8示出在去除多西环素的培养基和未去除多西环素的培养基中从约1
×
105个细胞诱导表达48小时的bdnf蛋白的表达水平。
177.结果，如图8所示，在具有多西环素的培养基中，检测到约0.2ng的bdnf，相反，在去
除多西环素的培养基中，检测到约740ng的bdnf。
178.表1
179.靶蛋白表达水平bdnf740ng/105细胞
180.结果确认，如上述表1所示，在照射放射线之前的bm102细胞株中，表达约740ng/105细胞的bdnf蛋白。
181.实验例5.确认bm102细胞株中的bdnf引入基因
182.为了确认是否向在上述实施例3.1.中制备的bm102细胞株引入基因，执行聚合酶链式反应(pcr)。具体地，将上述bm102细胞株移至包含9ml的pbs的15ml管后，以1500rpm的速度进行细胞下降(cell down)5分钟。完全去除pbs后，在1.5ml的管中，利用200μl的pbs悬浮颗粒后转移。之后，利用tissue(mn，740952.250)准备gdna，如下述表2，制备混合物后，以下述表3的步骤执行pcr。此时，添加100ng的bm102质粒dna作为阳性对照组，添加1μl的纯化水作为阴对照组。可根据在韩国公开专利第2017-0093748号中记载的方法分离纯化上述bm102质粒dna。
183.表2
[0184][0185][0186]
表3
[0187][0188]
向电泳试剂盒添加1％(v/v)琼脂糖凝胶。向第一个孔加载10μl的dna尺寸标志物(dna size marker)，从下一孔开始，依次分别加载10μl的阴性对照组、阳性对照组、3个bm102标本。之后，以100v实施电泳20分钟，拍摄凝胶照片，并在图9示出其结果。结果确认，如图9所示，在3个bm102细胞株中均确认与阳性对照组相同尺寸(0.6kb)的pcr产物。
[0189]
实验例6.确认bm102细胞株中的转录组变化
[0190]
为了确认随着多西环素处理与否的bdnf表达引起的基因的表达变化，对在上述实施例3.1.中制备的bm102细胞株执行转录组碱基序列分析(transcriptome sequencing)。
[0191]
向macrogen委托碱基序列分析并确保结果。利用novaseq 6000s4 reagent kit(illumina)并根据novaseq 6000system user guide document#1000000019358v02(illumina)执行了试验，通过novaseq sequencer及1000000019358v02software
(illumina)实施分析。在图10a、图10b及图10c列出随着在bm102细胞株中去除多西环素而变化的转录组。
[0192]
结果确认，如图10a所示，随着去除多西环素，bm102细胞株中的与血管生成、炎症、神经生成及免疫系统过程相关而周知的angptl4、angpt1、cend1、nfasc、grap2及trim6基因的表达增加，il2rb、il6、il1b及ptgs2的表达减少。
[0193]
并且，如图10b所示，确认了随着去除多西环素，bm102细胞株中的以与细胞分化、迁移及增殖相关而周知的hlf、ror2、icam1基因的表达减少，以与细胞凋亡相关而周知的cebpb、egr2、bmp8a、bex2、klf4、tnfsf15、ptbp3及igfbp2基因的表达减少。
[0194]
追加地，还确认了随着去除多西环素，bm102细胞株中的微小rna基因的转录组发生变化，具体地，确认了mir4444-1、mir4444-2、mir1244-1的表达增加，mir1244-4、mir319i、mirlet7d的表达减少(图10c)。
[0195]
实验例7.对于bm102细胞株的放射线照射试验
[0196]
对于bm102细胞株，利用γ射线及x射线，通过如实施例4的方法进行放射线照射试验，所照射的放射线的种类使用γ射线及x射线。
[0197]
首先，以80gy、100gy、120gy、140gy的照射剂量一次照射γ射线后，确认bm102细胞株的吸收剂量、是否形成集落、细胞数及滴度，以200gy、300gy的照射剂量二次照射γ射线后，以相同的方法分别确认吸收剂量、是否形成集落、细胞数及滴度。
[0198]
在下述表4示出其结果。
[0199]
表4
[0200][0201]
并且，利用x射线，以100gy、200gy、300gy、400gy、500gy的照射剂量分别一次照射，由此确认吸收剂量、是否形成集落及滴度并在表5及图11示出其结果，以0gy、50gy、100gy、200gy、300gy、400gy、500gy的照射剂量分别二次照射，并在下述表6及图12示出其结果。
[0202]
表5
[0203][0204]
表6
[0205][0206]
实验例7.1.照射放射线的bm102细胞株是否形成集落
[0207]
对于bm102细胞株，为了确认以上述范围分别照射γ射线及x射线后是否形成集落，每小瓶接种12个孔，以使在6孔板中，成为每孔5
×
105个的细胞，接种共2个6孔板。摇晃培养板来使细胞分布均匀，在37℃、5％co2培养箱中，每3天或4天更换培养基，利用显微镜以肉眼观察是否形成集落。
[0208]
结果确认，如上述表4所示，在照射γ射线的情况下，当照射剂量为80gy时，形成集落，在其以上的范围中，未形成集落。在形成集落的情况下，确认了细胞株的放射线吸收剂量为79.5gy，实验确认的最大吸收剂量约为322gy。
[0209]
并且，在是否形成集落中也同样确认了照射x射线的结果。如上述表5及表6所示，在一次实验中确认了，在照射剂量为100gy的情况下，形成集落，因此并不适合用作临床试样，在其以上的范围中，未形成集落。在形成集落的情况下，细胞株的吸收剂量为62.5gy。
[0210]
相反，在二次x射线照射实验中确认，在以100gy照射的情况下，所测量的吸收剂量为83.1gy。此时确认了，未形成集落。即，即使以相同的照射剂量照射，吸收剂量也具有差异，在细胞吸收的剂量为62.5gy的情况下，并不适合用作临床试样，但在细胞吸收的剂量为83.1gy的情况下，能够使用。因此，以吸收剂量为基准，在吸收大于约80gy范围的放射线的情况下，可预测能够将本发明的细胞株用作临床试样。
[0211]
实验例7.2.照射放射线的bm102细胞株的细胞数测量结果
[0212]
利用为了试验是否形成上述集落而接种的细胞，实施细胞数测量试验。对于在上述实验例7中照射γ射线的bm102细胞株，以细胞解冻日为基准，在第7天、第14天、第28天、第35天、第49天、第63天分别利用胰蛋白酶分离所附着的细胞后，进行台盼蓝(trypan blue)染色，在血细胞计数器(hematocytomer)中计数总细胞数和存活细胞数的数量。
[0213]
结果确认，如下述表7及图11所示，在利用γ射线的一次照射试验及二次照射试验中观察到63天为止时，在照射放射线的情况下，细胞未增殖。
[0214]
表7
[0215][0216][0217]
并且，对于通过使用x射线进行照射实验的细胞株，解冻细胞株之后，在第14天、第28天、第42天、第56天、第70天分别测量细胞数的结果，如下述表8、图12所示，确认了在300gy、400gy、500gy各个照射组中观察的所有时间内，没有追加增殖的细胞。
[0218]
表8
[0219][0220]
实验例7.3.确认照射放射线的bm102细胞株的bdnf表达
[0221]
对于一部分在上述实验例7中照射放射线的bm102细胞，为了滴度试验，每小瓶接种共1个孔，以使在12孔板中，成为每孔1
×
105或5
×
105个的细胞，摇晃培养板来使细胞分布均匀，在37℃、5％co2培养箱中，培养48小时或60小时。
[0222]
为了测量bdnf的表达量，从上述培养液获取上清液，在4℃、5000rpm的条件下，离心分离5分钟后，将上清液以200μl分在4个e-管(tube)，并在-80℃的温度下冷冻保存。利用bdnf分析试剂盒(dbd00，r&d systems，美国)分析bdnf蛋白的表达量。
[0223]
如表4及图13所示，在照射γ射线的bm102细胞株的情况下，当照射放射线时，确认了bdnf的表达量保持适当水平(500ng/5
×
105/48小时)以上，如表5及图14、图15中所确认，在照射x射线的情况下，在高照射剂量中，也保持bdnf的表达量(100ng/105/48小时以上或400ng/105/60小时以上)。
[0224]
实验例8.对于bm01a细胞株的放射线照射试验
[0225]
以与实验例7相同的方式执行了对于bm01a细胞株的放射线照射试验。照射的放射线种类使用γ射线，在以90gy、100gy、110gy、120gy的照射剂量一次照射γ射线后，确认吸收剂量、是否形成集落、细胞数及滴度，在以140gy、160gy、180gy的照射剂量二次照射γ射线后，通过相同的方法确认吸收剂量、是否形成集落、细胞数及滴度。在下述表9记载其结果。
[0226]
表9
[0227][0228]
实验例2.1.照射放射线的bm01a细胞株是否形成集落
[0229]
以3
×
105细胞/孔的数量向6孔板接种bm01a细胞株，通过与上述实验例7.1.相同的方法培养后，在培养基中确认是否形成集落。
[0230]
结果确认，如上述表9所示，在90gy至120gy及140gy至180gy的照射剂量范围内，均未形成集落，由此确认了，未形成集落的最小吸收剂量为95.6gy且最大吸收剂量为191.4gy。
[0231]
实验例8.2.照射放射线的bm01a细胞株的细胞数测量结果
[0232]
通过与上述实验例7.2.相同的方法，实施照射γ射线的bm01a细胞株的细胞数测量实验。
[0233]
以细胞解冻日为基准，在第7天、第14天、第28天、第35天、第42天，利用胰蛋白酶分离附着的细胞后，利用台盼蓝进行染色，并在血细胞计数器中计数总细胞数和存活细胞数的数量。
[0234]
结果确认，如下述表10及图16所示，在对bm01a细胞株照射γ射线的情况下，当观察至42天为止时，细胞数未增殖。
[0235]
表10
[0236][0237]
实验例8.3.确认照射放射线的bm01a细胞株的bdnf表达量
[0238]
为了在上述实验例8中照射放射线的bm01a细胞株的滴度试验，通过与实验例7.3.相同的方法培养并冷冻保存细胞。使用bdnf分析试剂盒(dy248，r&d systems，美国)分析bm01a的bdnf表达量。
[0239]
结果确认，如表9及图17所示，当照射γ射线时，与未照射的情况相比，bdnf的表达量保持高水平。
[0240]
实验例9.对于bm03细胞株的放射线照射试验
[0241]
对于表达trail及cd的作为永生化干细胞的bm03细胞株，通过与实验例7相同的方式实施放射线照射试验。bm03菌株的放射线照射试验利用了γ射线，分别照射低水平及高水平γ射线来确认了其结果。
[0242]
在照射低水平γ射线时，利用核先进辐射研究所的低水平照射器来对填充至小瓶后冷冻的bm03(bm03-p005，1
×
107细胞/ml/小瓶)照射放射线，以0gy、10gy、20gy、30gy、
40gy、50gy、60gy、70gy的照射剂量分别照射，来确认了如下述表11的吸收剂量、是否形成集落、细胞数及滴度。
[0243]
表11
[0244][0245]
并且，通过相同的方法实施高水平γ射线的照射试验，高水平γ射线以0gy、30gy、40gy、60gy、70gy进行一次试验后，以0gy、100gy、110gy、120gy、130gy的剂量进行二次试验，由此测定吸收剂量、是否形成集落。利用核先进辐射研究所的高水平照射器对填充至小瓶后冷冻的bm03(1
×
107细胞/ml/小瓶)实施高水平γ射线的照射试验，在各个试验中，使用丙氨酸剂量计(alanine doxymeter)测定吸收剂量。其结果如下述表12所示。
[0246]
表12
[0247][0248]
实验例9.1.照射放射线的bm03细胞株是否形成集落
[0249]
为了确认上述实验例9的bm03细胞是否形成集落，通过与上述实验例7.1.相同的方式确认细胞株是否形成集落。在上述实验例9中，确认照射低水平γ射线的bm03及照射高水平γ射线的bm03是否形成集落的结果，如上述表11及表12所示，当照射低水平γ射线时，尤其，在50gy以下的照射剂量中形成集落，当照射高水平γ射线时，在60gy以下的照射剂量中形成集落，从而确认不适合用作临床试样。但是，在70gy以上的低水平γ射线的情况以及100gy以上的高水平γ射线的情况下，确认未形成集落。
[0250]
实验例9.2.测量照射放射线的bm03细胞株的细胞数
[0251]
对于在实验例9.1.中培养的细胞，在照射低水平γ射线的bm03细胞株的情况下，在距细胞解冻日的第2天、第7天、第14天、第28天、第35天、第42天、第49天，计数附着的细胞数，从而确认培养的细胞数的增加。
[0252]
结果，如下述表13及图18所示，在10gy照射组中，从第7天开始，确认了多于接种数的细胞数，在20gy照射组中，在第14天确认多于接种数的细胞数，在30gy及40gy照射组中，在第21天确认多于接种数的细胞数，在50gy照射组中，在第35天确认多于接种数的细胞数。并且，在60gy照射组中，保持了少于接种数的细胞，从第42天开始，细胞数增加，在70gy中，存活细胞数持续减少。这表示，在低水平γ射线的照射剂量及吸收剂量为60gy以下的情况下，具有细胞能够增殖的可能性。
[0253]
表13
[0254]
[0255][0256]
并且，在通过相同的方法照射高水平γ射线的bm03细胞株的情况下，距细胞解冻日的第7天、第14天、第21天、第28天(一次)以及第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天、第63天(二次)，计数附着的细胞数。
[0257]
结果，如下述表14及图19所示，在一次实验的30gy、40gy照射组中，从第14天开始，确认了多于接种数的细胞数，在50gy照射组中，在第21天确认了多于接种数的细胞数，在60gy照射组中，在第28天确认了多于接种数的细胞数，但是，二次试验结果，在100gy、110gy、120gy、130gy照射组中，当观察至63天为止时，确认了没有增殖的细胞。
[0258]
从如上所述的结果可知，在bm03细胞株的情况下，最小吸收剂量需为60gy以上。
[0259]
表14
[0260]
[0261][0262]
实验例9.3.确认照射放射线的bm03细胞株的因表达量
[0263]
为了测定照射放射线后的细胞的滴度变化，选定可确认插入的治疗基因trail和cd::uprt的引物后，通过qrt-pcr反应定量测定插入的基因的表达。
[0264]
解冻后，分别获取培养2天、7天、14天的细胞后，利用trizol提取rna，利用5x prime script rt master mix(takara)在1ug的rna下合成cdna，利用可分别与trail和cd特异性结合的引物执行rt-qpcr。
[0265]
结果，如图20所示，在照射低水平γ射线的bm03细胞株中表达的治疗基因trail及cd的表达量未发现显著差异。当照射高水平γ射线时，若存在存活细胞，则确认了几乎没有根据放射线照射剂量的滴度变化。
[0266]
实验例10.确认试验管内(in vitro)bm102细胞株的致肿瘤性
[0267]
利用cytoselect
tm 96-well cell transformation assay，在软琼脂凝胶(soft agar gels)中确认了源自骨髓的msc、bm102细胞株、阳性对照组(hela)及阴性对照组(nih3t3)中是否通过非附着增殖(anchorage-independent growth)形成集落，利用mts溶液染色来测定吸光度，从而定量由细胞转化引起的肿瘤形成与否。
[0268]
结果，如图21所示，在阳性对照组中，未形成细胞转化引起的集落，从阴性对照组、源自骨髓的msc及bm102细胞株未形成集落的结果可确认，bm102细胞株在细胞培养时没有转化能力，并没有试验管内(in vitro)致肿瘤性。
[0269]
实验例11.确认试验管内(in vitro)bm102细胞株的神经细胞保护及治疗效果
[0270]
为了确认bm102细胞株的神经细胞保护及治疗效果，将以通过bdnf很好地生长而周知的神经胶质细胞c6与bm102细胞株共培养后，确认了c6细胞的增殖率以细胞数依赖性地增加。
[0271]
具体地，利用侵袭实验(trans-well)共培养c6细胞和bm102细胞株。与c6细胞相同
地，以2
×
103个接种在96孔板后，bm102细胞株以从1
×
104个以1/2稀释来接种在侵袭实验的方式，改变共培养的细胞数。共培养24小时后，在培养中的c6细胞培养基处理mts溶液来测定吸光度，由此定量在bm102细胞株中表达的bdnf蛋白引起的c6细胞的增殖率。
[0272]
结果，如图22所示，通过与bm102细胞株的数量成正比来增加的bdnf分泌量，即使没有直接接触，也可确认c6细胞的增殖率增加。
[0273]
从上述结果可确认，可稳定地大量生产bdnf，由此可将bm102细胞株用作细胞治疗剂，可将稳定表达bdnf的bm102细胞株用作保护或治疗神经细胞的细胞治疗剂。
[0274]
保藏机构名：韩国生命工程研究院
[0275]
保藏编号：kctc13876bp
[0276]
保藏日期：2019年07月02日
[0277]