Kv1.3阻断剂的制作方法

kv1.3阻断剂
技术领域
1.本发明提供了新的钾通道kv1.3阻断剂、编码其的多核苷酸、以及制备和使用其的方法。


背景技术：

2.离子通道是在生物膜中形成孔以允许(和调节)离子流动通过相关膜的膜蛋白。有许多不同类型的离子通道，其可以按多种方式分类，例如按它们为其提供通道的离子种类、调节或“门控”离子通道的方式(例如“配体门控”或“电压门控”)，以及它们的细胞或亚细胞定位。
3.钾通道分为四大类，即电压门控钾通道、钙激活钾通道、内向整流钾通道和串联孔结构域钾通道。
4.电压门控钾通道与其他电压门控通道一样，响应于跨膜电压而打开或关闭。它们代表了具有多种生物学功能的复杂家族，所述生物学功能包括调节神经递质释放、心率、胰岛素分泌、神经元兴奋性、上皮电解质传递、平滑肌收缩和细胞体积。
5.kv1.3(电压门控钾通道亚家族a成员3)通道在t细胞上表达并在调节t细胞活化中起作用。已显示kv1.3的阻断剂抑制活化的t细胞在体外的增殖(综述于cahalan and chandy,immunol.rev.231:59-87,2009中)，并抑制自身免疫病(包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)、实验性关节炎、迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，dth)、变应性接触性皮炎和肾小球肾炎)的多种实验模型中t细胞依赖性疾病进展。参见，例如，rangaraju et al.(expert opin.ther.targets 13:909-24,2009)；beeton et al.(proc.natl.acad.sci.u s a.103:17414-9,2006)；koo et al.(j.immunol.158:5120-8,1997)；hyodo et al.(am.j.physiol.renal physiol.299:f1258-69,2010)。wo 2016/112208描述了表面应用kv1.3阻断剂以用于治疗皮肤和黏膜炎症。
6.因此，kv1.3阻断剂具有相当大的潜力用于治疗炎性疾病，包括自身免疫病。
7.wo 2015/013330提出使用kv1.3阻断剂肽以治疗眼病症，例如目涩和葡萄膜炎，包括当由自身免疫病(例如舍格伦综合征(sjogren’ssyndrome))引起时。
8.kv1.3的阻断剂也可具有有益的代谢作用，例如与能量稳态、体重调节和葡萄糖控制有关。与对照同窝小鼠相比，kv1.3敲除(kv1.3(-/-))小鼠响应于高脂肪饮食表现出降低的体重增加、较高的胰岛素敏感性和降低的血浆葡萄糖水平(xu et al.,hum.mol.genet.12:551-9,2003)。此外，还已显示kv1.3阻断剂提高葡萄糖转运体4(glucose transporter 4，glut4)在骨骼肌和脂肪组织中的表达，提高正常和ob/ob肥胖小鼠的胰岛素敏感性，并提高原代脂肪细胞的体外葡萄糖摄取(xu et al.,proc.natl.acad.sci.usa 101:3112-7,2004)。在人中，kv1.3基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)也与胰岛素敏感性降低和糖耐量降低相关(tschritter,clin endocrinol metab 91:654-8,2006)。
9.kv1.3也在增殖的人和小鼠平滑肌细胞中表达。kv1.3的阻断剂可对平滑肌增生性疾病如再狭窄有效，例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中。已显示kv1.3阻断剂在离体人静脉样品中抑制钙进入、降低平滑肌细胞迁移并抑制新生内膜增生(cheong et al.,cardiovasc.res.89:282-9,2011)。
10.另外的证据表明，kv1.3通道参与多种类型细胞(包括肿瘤细胞(bielanska et al.,curr.cancer drug targets 9:904-14,2009)、小胶质细胞(khanna et al.,am.j.physiol.cell physiol.280:c796-806,2001))的活化和/或增殖和神经元祖细胞的分化(wang et al.,j.neurosci.30:5020-7,2010)。因此，kv1.3阻断剂可有益于治疗神经炎性和神经退行性疾病以及癌症。
11.kv1.3是密切相关的钾通道亚家族(称为kv1.1至kv1.8)的一部分。在处理大同源家族时，总是期望阻断剂对所期望靶标尽可能具有选择性和特异性，以提高效力和安全性，并避免不期望的脱靶效应。迄今为止确定的最具特异性的kv1.3阻断剂是来源于多种类型的有毒生物体(例如蛇、蛛形动物(如蝎子和蜘蛛)、海葵等)的毒肽(venom peptide)。这样的kv1.3阻断剂包括肽shk、oskl、玛格毒素(margatoxin)和卡利蝎毒素(kaliotoxin)(由chandy et al.,trends in pharmacol.sci.25:280-9,2004综述)。另参见abdel-mottaleb et al.,toxicon 51:1424-30,2008和mouhat et al.,biochem.j.385(pt 1):95-104,2005。
12.已经描述了针对特定特性(包括特异性或效力)对毒素肽进行工程化的多种尝试，例如在wo2006/002850、wo2006/042151、wo2008/088422、wo2006/116156、wo2010/105184和wo2014/116937中。
13.然而，仍然需要替代的kv1.3阻断剂。与已知阻断剂相比具有改善的特异性的阻断剂可以是特别期望的，尽管其他特性如稳定性和效力的改善也可以是有用的。
14.发明概述
15.本发明涉及来自黑粗尾蝎(scorpion parabuthus transvaalicus)的离子通道阻断剂，所述离子通道阻断剂具有以下氨基酸序列：
[0016][0017]
及其变体。
[0018]
除其他期望特性之外，已发现这些分子相比对其他电压门控钾通道对kv1.3是极具选择性的阻断剂，并且通常还在kv1.3通道上具有高效力。
[0019]
因此，本发明提供了包含kv1.3抑制剂组分的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述kv1.3抑制剂组分包含：
[0020]
pat1的序列：
[0021][0022]
或其变体，所述变体与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中任何替换或缺失位于选自第1至5、7至11、13至15、17至23、25、28至31、33和35至37位的氨基酸位置处；以及
[0023]
其中所述kv1.3抑制剂组分具有kv1.3抑制剂活性并且对kv1.3具有选择性。
[0024]
因此，离子通道阻断剂的kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比可以含有最多9个氨基酸变化。除非另有说明，否则这9个变化中的每一个都可以独立地选自单个氨基酸插入、缺失或替换。在一个实施方案中，离子通道阻断剂的kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比可以含有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化。在一个实施方案中，离子通道阻断剂的kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比含有6个氨基酸变化。
[0025]
pat1的氨基酸残基按照n端到c端的常规方向从1到33编号。在整个说明书中，pat1变体中的氨基酸位置根据当与pat1最佳对齐时pat1中的相应位置编号。因此，特别是对于与pat1相比含有一个或更多个插入或缺失的抑制剂，任何给定残基的编号反映了pat1中的相应残基，而不一定反映其在相关序列中的线性位置。
[0026]
存在于特定位置的残基可以由相关位置的编号与所存在的残基的单字母代码或三字母代码一起表示。因此，1q或q1(两种形式可互换)表示第1位的谷氨酰胺(q)残基，而2nle、2[nle]、nle2或[nle]2表示第2位的正亮氨酸残基。
[0027]
星号可用于表示相对于pat1序列的缺失位置。例如，“1*”表示与pat1相比，第1位的残基缺失。
[0028]
插入可以由单个位置处的一串连续残基来表示，例如“1qa”表示在第1位的谷氨酰胺(q)残基之后插入了一个丙氨酸(a)残基。
[0029]
在一些实施方案中，可以期望第28、31、34、35、36或37位中的一个或更多个与pat1中的相应位置相同，即存在于相关位置的残基与存在于pat1的相应位置处的残基相同。例如，第28、31、34和35位中的一个或更多个可以与pat1中的相应位置相同。在一些实施方案中，第28、31、34和35位全部都与pat1中的相应位置相同，例如第28、31、34、35、36和37位全部都与pat1中的相应位置相同。
[0030]
可以期望相比于pat1的任何替换都是保守替换。然而，下面提供的任何通式中列出的任何替换都可以在相应位置引入。
[0031]
分子的kv1.3抑制剂组分可包含pat1的序列：
[0032][0033]
或可与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0034]
第1位的残基选自n、p、i、v、h、y和s或缺失；
[0035]
第2位的残基选自nle、i、v、l、t、q和e或缺失；
[0036]
第3位的残基选自e、s和n或缺失；
[0037]
第4位的残基选自nle、i、v、l、a、e和s或缺失；
[0038]
第5位的残基选自k、q、a、l、e和d或缺失；
[0039]
第7位的残基选自k、r、q、e、f和a；
[0040]
第8位的残基选自i、h、s、l、y和g；
[0041]
第9位的残基选自a、abu、p、f、v和l；
[0042]
第10位的残基选自r、k、p、a、q和l；
[0043]
第11位的残基选自q和d；
[0044]
第13位的残基选自l、a、e、q、i、k、h、d、v和g；
[0045]
第14位的残基选自v、k、e、l、d和2-氨基-5-羧基戊酰基；
[0046]
第15位的残基选自s、l和p；
[0047]
第17位的残基选自k、y、r、q、d、v和e或缺失；
[0048]
第18位的残基选自d、a、y、g、v、q、hq和l或缺失；
[0049]
第19位的残基选自r、y和q或缺失；
[0050]
第20位的残基选自y、e和r或缺失；
[0051]
第21位的残基选自r、h、e和d；
[0052]
第22位的残基选自r、m、d、l和c；
[0053]
第23位的残基选自r、k、hk、p、g和h；
[0054]
第26位的残基是高赖氨酸；
[0055]
第28位的残基选自nle、a和l；
[0056]
第29位的残基是v；
[0057]
第30位的残基选自g和d；
[0058]
第31位的残基选自d、q、e和h；
[0059]
第33位的残基选自h、v、d、q和r；
[0060]
第35位的残基选自t、f(4-nh2)、f(4-f)、f(4-no2)和f(4-ch3)；
[0061]
第36位的残基选自q、s和g或缺失；
[0062]
第37位的残基选自k、e、s和c或缺失。
[0063]
分子的kv1.3抑制剂组分可包含pat1的序列：
[0064][0065]
或可与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0066]
第1位的残基选自n、p、i、v、h、y和s或缺失；
[0067]
第2位的残基选自nle、i、v、l、t、q和e或缺失；
[0068]
第3位的残基选自e、s和n或缺失；
[0069]
第4位的残基选自nle、i、v、l、a、e和s或缺失；
[0070]
第5位的残基选自k、q、a、l、e和d或缺失；
[0071]
第7位的残基选自k、r、q和a；
[0072]
第8位的残基选自i、h和g；
[0073]
第9位的残基选自a、abu和l；
[0074]
第10位的残基选自r、k、p、a和l；
[0075]
第11位的残基选自q和d；
[0076]
第13位的残基选自l、a、e、q、i、k、h、d、v和g；
[0077]
第4位的残基选自v、k、e、l、d和2-氨基-5-羧基戊酰基；
[0078]
第15位的残基选自s、l和p；
[0079]
第17位的残基选自k、y、r、q、d、v和e或缺失；
[0080]
第18位的残基选自d、a、y、g、v、q、hq和l或缺失；
[0081]
第19位的残基选自r、y和q或缺失；
[0082]
第20位的残基选自y、e和r或缺失；
[0083]
第21位的残基选自r、h、e和d；
[0084]
第22位的残基选自r、m、d、l和c；
[0085]
第23位的残基选自r、k、hk、p、g和h；
[0086]
第28位的残基选自nle、a和l；
[0087]
第29位的残基是v；
[0088]
第30位的残基选自g和d；
[0089]
第31位的残基选自d、q、e和h；
[0090]
第33位的残基选自h、v、d、q和r；
[0091]
第35位的残基选自t、f(4-nh2)、f(4-f)、f(4-no2)和f(4-ch3)；
[0092]
第36位的残基选自q、s和g或缺失；
[0093]
第37位的残基选自k、e、s和c或缺失。
[0094]
在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分可与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0095]
第1位的残基选自n、p、i、v、h、y和s或缺失；
[0096]
第2位的残基选自nle、i、v、l、t、q和e或缺失；
[0097]
第3位的残基选自e、s和n或缺失；
[0098]
第4位的残基选自nle、i、v、l、a、e和s或缺失；
[0099]
第5位的残基选自k、q、a和l或缺失；
[0100]
第7位的残基选自k、r和q；
[0101]
第8位的残基选自i、h、s、l、y和g；
[0102]
第9位的残基选自a、abu、p、f、v和l；
[0103]
第10位的残基选自r、k和p；
[0104]
第11位的残基是q；
[0105]
第13位的残基选自l、a、e、q、i、k、h和g；
[0106]
第14位的残基选自v、k、e、l和2-氨基-5-羧基戊酰基；
[0107]
第15位的残基选自s和l；
[0108]
第17位的残基选自k、y、r、q和d或缺失；
[0109]
第18位的残基选自d、a、y、g、v、q、hq和l或缺失；
[0110]
第19位的残基选自r、y和q或缺失；
[0111]
第20位的残基选自y、e和r或缺失；
[0112]
第21位的残基选自r、h和e；
[0113]
第22位的残基选自r、m、d、l和c；
[0114]
第23位的残基选自r、k、hk、p和g；
[0115]
第28位的残基是nle；
[0116]
第30位的残基选自g和d；
[0117]
第31位的残基选自d、q、e和h；
[0118]
第33位的残基选自h、v、d、q和r；
[0119]
第35位的残基选自t、f(4-nh2)、f(4-f)、f(4-no2)和f(4-ch3)；
[0120]
第36位的残基选自q、s和g或缺失；
[0121]
第37位的残基选自k、s和c或缺失。
[0122]
在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分可与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0123]
第1位的残基选自n、p、i、v、h、y和s或缺失；
[0124]
第2位的残基选自nle、i、v、l、t、q和e或缺失；
[0125]
第3位的残基选自e、s和n或缺失；
[0126]
第4位的残基选自nle、i、v、l、a、e和s或缺失；
[0127]
第5位的残基选自k、q、a和l或缺失；
[0128]
第7位的残基选自k、r和q；
[0129]
第8位的残基选自i、h和g；
[0130]
第9位的残基选自a、abu和l；
[0131]
第10位的残基选自r、k和p；
[0132]
第11位的残基是q；
[0133]
第13位的残基选自l、a、e、q、i、k、h和g；
[0134]
第14位的残基选自v、k、e、l和2-氨基-5-羧基戊酰基；
[0135]
第15位的残基选自s和l；
[0136]
第17位的残基选自k、y、r、q和d或缺失；
[0137]
第18位的残基选自d、a、y、g、v、q、hq和l或缺失；
[0138]
第19位的残基选自r、y和q或缺失；
[0139]
第20位的残基选自y、e和r或缺失；
[0140]
第21位的残基选自r、h和e；
[0141]
第22位的残基选自r、m、d、l和c；
[0142]
第23位的残基选自r、k、hk、p和g；
[0143]
第28位的残基是nle；
[0144]
第30位的残基选自g和d；
[0145]
第31位的残基选自d、q、e和h；
[0146]
第33位的残基选自h、v、d、q和r；
[0147]
第35位的残基选自t、f(4-nh2)、f(4-f)、f(4-no2)和f(4-ch3)；
[0148]
第36位的残基选自q、s和g或缺失；
[0149]
第37位的残基选自k、s和c或缺失。
[0150]
分子的kv1.3抑制剂组分可包含pat1的序列：
[0151][0152]
或可与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0153]
第1位的残基选自n、p、v、h、y和s或缺失；
[0154]
第2位的残基选自nle、i、v和l或缺失；
[0155]
第3位的残基选自e和s或缺失；
[0156]
第4位的残基选自nle、i、v、l、e和s或缺失；
[0157]
第5位的残基是k或缺失；
[0158]
第7位的残基选自k和r；
[0159]
第8位的残基选自i和h；
[0160]
第9位的残基选自abu和l；
[0161]
第10位的残基选自r和k；
[0162]
第11位的残基是q；
[0163]
第13位的残基选自l、a、e、q、v和g；
[0164]
第14位的残基选自v、k、e、l和2-氨基-5-羧基戊酰基；
[0165]
第15位的残基选自s和l；
[0166]
第17位的残基选自k、y和r或缺失；
[0167]
第18位的残基选自d、a、y、g、v、q、hq和l或缺失；
[0168]
第19位的残基选自r和y或缺失；
[0169]
第20位的残基选自y、e和r或缺失；
[0170]
第21位的残基选自r、h和e；
[0171]
第22位的残基选自r和c；
[0172]
第23位的残基选自r、k、hk、p和g；
[0173]
第28位的残基是nle；
[0174]
第30位的残基是g；
[0175]
第33位的残基选自h、v和r；
[0176]
第35位的残基选自f(4-nh2)、f(4-f)、f(4-no2)和f(4-ch3)；
[0177]
第36位的残基选自q、s和g或缺失；
[0178]
第37位的残基选自s和c或缺失。
[0179]
在一些实施方案中，分子的kv1.3抑制剂组分包含pat1的序列：
[0180][0181]
或与pat1的不同之处在于最多9个替换、插入或缺失，其中如果不同于pat1的话，则任何替换或缺失仅在以下位置处进行，其中：
[0182]
第1位的残基选自n和p或缺失；
[0183]
第2位的残基是nle、i、v和l；
[0184]
第3位的残基选自e和s；
[0185]
第4位的残基是nle、i、v和l；
[0186]
第8位的残基是i；
[0187]
第10位的残基是r；
[0188]
第11位的残基是q；
[0189]
第13位的残基是a；
[0190]
第14位的残基是v；
[0191]
第18位的残基选自d、y和a；
[0192]
第19位的残基是r；
[0193]
第20位的残基是y；
[0194]
第21位的残基是r；
[0195]
第22位的残基选自r和c；
[0196]
第23位的残基选自r和g；
[0197]
第28位的残基是nle；
[0198]
第30位的残基是g；
[0199]
第33位的残基是h；
[0200]
第37位的残基是c。
[0201]
在一些实施方案中，本发明提供了包含kv1.3抑制剂组分的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述kv1.3抑制剂组分包含：
[0202]
pat1的序列：
[0203][0204]
或与patl的序列具有至少75％同一性的序列，其中与patl序列的任何差异位于选自第1至5、7至11、13至15、17至23、25、28至31、33和35至37位的氨基酸位置处；以及
[0205]
其中所述kv1.3抑制剂组分具有kv1.3抑制剂活性并且对kv1.3具有选择性。
[0206]
在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少75％的同一性。在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少85％的同一性。在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1的序列具有至少97％的同一性。
[0207]
kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比可以含有一个或更多个插入或缺失。
[0208]
通常，kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比含有最多三个插入，例如准确地3次插入、准确地2次插入或准确地1次插入。
[0209]
通常，在任何给定位点插入仅一个氨基酸，尽管可以容许多个氨基酸的插入。为避免疑义，在同一位点插入两个氨基酸被认为是两个插入，并因此是与pat1序列的两个允许的差异。
[0210]
通常，kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比含有不超过7个缺失，例如不超过6个、不超过5个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个缺失、不超过1个缺失，或者根本没有缺失。
[0211]
为了保持半胱氨酸残基的间距，并因此保持二硫键的模式，可以期望任何插入和缺失都不位于第6位的半胱氨酸残基(6c)和第34位的半胱氨酸残基(34c)之间。因此，任何插入或缺失可优选位于6c的n端或34c的c端。
[0212]
然而，如果kv1.3抑制剂组分在6c和34c之间含有一个或更多个插入或缺失，则可以期望在该区域内并入相同数量的插入和缺失。例如以恢复半胱氨酸残基的相对间距。
[0213]
在许多实施方案中，kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比不含有插入。
[0214]
如果在6c和34c之间存在缺失，则可以期望仅存在一个这样的缺失。例如，它可以在第17、18、19或20位，特别是如果分子不含有相应的插入以维持半胱氨酸残基的间距的话。
[0215]
不希望受理论束缚，认为在n端序列(残基1至5)和c端序列(残基36至37)中可以更好地容许多个缺失。在这些区域中可以容许多个缺失。对于n端序列(第1至5位)中的缺失，如果第x位的残基缺失，则可以期望该残基n端的所有残基也缺失。因此，例如，可以缺失残基1、1和2、1至3、1至4或1至5。对于c端(第36至37位)的缺失，如果第36位的残基缺失，则可
以期望第37位的残基也缺失。因此，例如，可以缺失残基37或者36和37。
[0216]
为避免疑义，两个连续氨基酸的缺失被认为是两个氨基酸缺失，并因此是与pat1序列的两个允许的差异。
[0217]
谷氨酰胺(q)残基在体内或体外(例如在于水溶液中储存期间)都可能不稳定。当谷氨酰胺残基位于分子的n端时，这可能特别相关，因为侧链可能在空间上能够与游离的α氨基相互作用，导致脱水成焦谷氨酸。因此，可以期望第1位的残基不是q，特别是如果离子通道阻断剂不含有kv1.3抑制剂n端的任何另外的序列的话。例如，第1位的残基可以是n或p，或者可以缺失；即，kv1.3抑制剂可以包含1n、1p或1*。
[0218]
另外地或替代地，可以期望第2、4和28位处的残基中的一个、两个或所有三个不是m，因为甲硫氨酸(m)残基易于氧化。优选地，一个、两个或所有三个甲硫氨酸残基独立地被具有不可氧化的侧链的残基替换，或者缺失。可以使用具有不可氧化的残基的任何合适的残基，其中nle、i、v和l是特别合适的。
[0219]
在第2、4和28位中的一些或所有位置处的残基的合适组合包括：
[0220]2＊
4nle，4i，4v或4l；
[0221]
2nle 4nle，4i，4v或4l；
[0222]
2i 4nle，4i，4v或4l；
[0223]
2v 4nle，4i，4v或4l；
[0224]
2l 4nle，4i，4v或4l。
[0225]
以上任何一种都可以与28nle组合。
[0226]
2nle 4nle 28nle可以是特别优选的。
[0227]
在一些实施方案中，kv1.3抑制剂组分含有残基22s 23i或22r 23g。
[0228]
除了第1、2、4和28位处的任何差异之外，可以期望kv1.3抑制剂组分含有与pat1序列的仅4个另外的差异、仅3个另外的差异、仅2个另外的差异或仅1个另外的差异。
[0229]
kv1.3抑制剂组分可以在除了第1、2、4和28位之外的所有位置处与pat1或pat2相同。
[0230]
另外地或替代地，kv1.3抑制剂组分可以包含残基13a和/或18a。
[0231]
例如，它可以包含：
[0232]
2nle 13a；
[0233]
2nle 18a，或
[0234]
2nle 13a 18a。
[0235]
例如，它可以包含：
[0236]
2nle 4nle 13a 28nle；
[0237]
2nle 4nle 18a 28nle；或
[0238]
2nle 4nle 13a 18a 28nle。
[0239]
以上任何一项都可以与1*组合。
[0240]
kv1.3抑制剂组分可以在除了第2、3和4位之外的所有位置处与pat1或pat2相同。
[0241]
另外地或替代地，kv1.3抑制剂组分可以包含残基1p和/或18a。
[0242]
例如它可以包含：
[0243]
2nle 4nle 28nle；
[0244]
2nle 3e 4nle 28nle；
[0245]
2nle 3e 4nle 18a 28nle；
[0246]
1p 2nle 4nle 28nle；
[0247]
1p 2nle 3e 4nle 28nle；或
[0248]
1p 2nle 3e 4nle 18a 28nle。
[0249]
另外地或替代地，上述任何一种都可以与22c 37c组合，即第22和37位的残基能够形成二硫键。
[0250]
离子通道阻断剂可包含kv1.3抑制剂组分的n端和/或c端的另外的氨基酸序列。例如，离子通道阻断剂可以是包含kv1.3抑制剂和一种或更多种可称为异源组分的异源肽或多肽序列的融合蛋白。异源组分可用于例如在体内延长半衰期、提高溶解度或促进重组表达。合适的异源组分包括人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)、抗体fc结构域等。
[0251]
其他异源组分包括标签，例如多组氨酸标签、flag标签或myc标签。
[0252]
离子通道阻断剂可以包含位于kv1.3抑制剂和异源组分之间的接头肽。
[0253]
多种组分可以处于任何适当的取向。例如，kv1.3抑制剂可以位于异源组分的n端，或者异源组分可以位于kv1.3抑制剂的n端，而接头(如果存在的话)在它们之间。
[0254]
肽接头的长度通常在3至30个氨基酸之间，具有高比例的亲水性小氨基酸残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，以提供所需的柔性而不影响分子的水溶性。例如，其可以包含至少50％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少60％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少70％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少80％的甘氨酸和丝氨酸残基、或至少90％的甘氨酸和丝氨酸残基。它还可以含有蛋白酶切割位点，以使kv1.3抑制剂和异源组分能够隔开。
[0255]
kv1.3抑制剂也可以插入异源多肽中，所述异源多肽可被视为kv1.3抑制剂的“支架”。在这样的情况下，离子通道阻断剂可以被认为包含kv1.3抑制剂的n端和c端的异源组分，其中异源组分来源于相同分子并且彼此相互作用，例如以折叠成支架，其中在其表面展示kv1.3抑制剂。因此，可以将kv1.3抑制剂插入异源蛋白的表面环内，例如插入抗体或其含有抗原结合结构域的片段的cdr序列中。已经证明，当将kv1.3抑制剂插入命名为“syn”的人源化免疫球蛋白的cdr(例如cdr3l)中时，kv1.3抑制剂针对呼吸道合胞病毒保持活性。(wang et al.,proc.natl.acad.sci.usa 113(41),11501-11506,2016.)。因此，syn抗体或其含有抗原结合结构域的片段可以用作支架。如果抗体支架含有fc结构域，则可以期望它在功能上是“fc无效的(fc-null)”，即它不能够与fc受体结合。wang et al.,op cit.描述了这样的突变。
[0256]
在一些实施方案中，离子通道阻断剂的最大长度可以为200个氨基酸，例如150个氨基酸、125个氨基酸、100个氨基酸、75个氨基酸或50个氨基酸，例如49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38或37个氨基酸，或者甚至更短，其中kv1.3抑制剂组分与pat1序列相比含有一个或更多个缺失。
[0257]
离子通道阻断剂还可在n端处包含多至10个另外的残基，例如在n端处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的残基。另外地或替代地，在分子长度不超过50个氨基酸的限制下，离子通道阻断剂还可以在c端处包含多至10个残基，例如在c端处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的残基。
[0258]
例如，n端处的另外的序列可以包含序列gg或sg或者由序列gg或sg组成。另外地或
替代地，c端处的另外的序列可以包含以下序列或由以下序列组成：
[0259][0260]
已显示当添加到odk2类似物的c端时，所有这些序列与kv1.3抑制剂活性和选择性相容(参见wo12014/116937)。
[0261]
因此，本发明还提供了具有下式的离子通道阻断剂或其可药用盐：
[0262]r1-z
1-x-z
2-r2[0263]
其中
[0264]
r1是氢、c
1-4
烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
[0265]
r2是oh、nh2或ch2oh，
[0266]
x是具有上述pat1序列或其变体的kv1.3抑制剂，并且
[0267]
z1和z2独立地是多至10个氨基酸残基的序列；
[0268]
前提是离子通道阻断剂的最大长度为50个氨基酸。
[0269]
如上所述，z1可以包含序列gg或sg或者由序列gg或sg组成。
[0270]
另外地或替代地，z2可以包含以下序列或者由以下序列组成：
[0271][0272]
另外地或替代地，r2可以是ch2oh并且可以包含在(4-氨基-5-羟基戊基)胍或4-氨基-5-羟基戊酰胺中。
[0273]
分子的kv1.3抑制剂组分含有6个半胱氨酸(c)残基，它们一起形成在残基6c与27c、残基12c与32c以及残基16c与34c之间的三个二硫键。认为这些键对于kv1.3抑制剂的构象和活性很重要。
[0274]
通过参考pat1，二硫键可以如下形象地表示：
[0275][0276]
其中一对一起参与二硫键的半胱氨酸残基用括号中的同一数字表示。类似的符号可以应用于本技术中的任何其他序列。除非上下文另有要求，否则应理解活性抑制剂化合物包含适当的二硫键。
[0277]
可以期望没有其他半胱氨酸残基通过替换引入kv1.3抑制剂组分中。另外地或替代地，可以期望在n端或c端的任何另外的序列中不存在半胱氨酸残基。因此，在一些实施方案中，除了pat1的第6、12、16、27、32和34位的半胱氨酸残基之外，分子不含有其他半胱氨酸残基。
[0278]
然而，在一些实施方案中，抑制剂组分包含8个半胱氨酸残基，它们一起形成在残基6c与27c、残基12c与32c、残基16c与34c以及对应于pat1的第22和37位的位置处的半胱氨酸残基之间的四个二硫键。化合物87是这样的分子的一个实例，并且二硫键可以如下形象
地表示：
[0279][0280]
类似的符号可以应用于具有四对二硫键的其他化合物。
[0281]
因此，抑制剂通常在第22位和第37位具有半胱氨酸残基，或者第22位和第37位中没有一个是半胱氨酸残基(即，第22位和第37位都不是半胱氨酸)。
[0282]
kv1.3抑制剂组分可以包含以下序列之一：
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287][0288]
离子通道阻断剂可以包含以下任一序列或由以下任一序列组成：
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293][0294]
在一些实施方案中，离子通道阻断剂不具有以下序列：
[0295][0296]
在一些实施方案中，r1是h并且r2是nh2或oh。在一些实施方案中，可以期望r2是oh。
[0297]
离子通道阻断剂包括以下：
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303][0304]
在一个实施方案中，本发明的离子通道阻断剂是：
[0305]
[0306]
在一些实施方案中，离子通道阻断剂不是：
[0307][0308]
本发明还提供了编码如所述的离子通道阻断剂、kv1.3抑制剂或肽z
1-x-z2的核酸。
[0309]
本发明还提供了包含本发明核酸的表达载体。
[0310]
本发明还包含宿主细胞，其包含本发明的核酸或表达载体，并且能够表达如所述的离子通道阻断剂、kv1.3抑制剂或肽z
1-x-z2。宿主细胞可以能够分泌如所述的离子通道阻断剂、kv1.3抑制剂或肽z
1-x-z2。
[0311]
本发明还提供了合成本发明离子通道阻断剂的方法，所述方法包括：
[0312]
(a)通过固相或液相肽合成方法合成所述离子通道阻断剂并回收由此获得的肽；
[0313]
(b)由编码所述离子通道阻断剂的核酸构建体表达所述离子通道阻断剂并回收表达产物；或者
[0314]
(c)由编码前体肽序列的核酸构建体表达前体肽，回收表达产物，并修饰所述前体肽以产生所述离子通道阻断剂。
[0315]
本发明还提供了药物组合物，其包含与可药用载体混合的本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0316]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于医学治疗方法中。
[0317]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于抑制或减轻炎症的方法中，尤其用于治疗炎性病症或疾病，包括自身免疫病。
[0318]
炎性病症或疾病可以是其中期望减轻炎症的任何病症或疾病，例如其中炎症促成症状或发病机制的情况。
[0319]
这样的病症包括自身免疫病、变态反应和超敏反应、同种移植物排斥和移植物抗宿主病。
[0320]
具体病症包括花粉症、哮喘、过敏反应、变应性鼻炎、荨麻疹、湿疹、斑秃、皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎、强直性脊柱炎、血管炎、关节炎(包括类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle，或简称“狼疮”)、和葡萄膜炎、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化、肝硬化)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，copd)、肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、炎性肠病、结肠炎(包括克罗恩病(crohn’s disease)和溃疡性结肠炎)、红斑、甲状腺炎、银屑病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、硬皮病、肾小球肾炎、炎性骨吸收、多发性硬化、1型糖尿病、移植排斥和移植物抗宿主病。
[0321]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于抑制体重增长、促进体重降低、减少超重体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)的方法中，或用于治疗肥胖症相关的炎症、肥胖症相关的胆囊疾病或肥胖症引起的睡眠呼吸暂停。
[0322]
对体重的作用可以是治疗性的或美容性的。
[0323]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于治疗由葡萄糖控制受损引起或与葡萄糖控制受损相关的病症，例如代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高或2型糖尿病。
[0324]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于治疗平滑肌增生性疾病，例如再狭窄，例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中。
[0325]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于治疗神经炎性疾病或神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病(alzheimer's disease)、多发性硬化(multiple sclerosis，ms)、帕金森病(parkinson's disease)或肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)(例如在病毒感染之后)。
[0326]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐，所述离子通道阻断剂或其可药用盐用于治疗癌症，例如乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，nhl)。nhl包括t细胞nhl和b细胞nhl。
[0327]
b细胞nhl的形式包括弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。t细胞nhl的形式包括蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤、前体t淋巴母细胞性淋巴瘤和塞扎里综合征(s
é
zary syndrome)。
[0328]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：抑制或减轻炎症，特别是治疗炎性病症或疾病(包括自身免疫病)。这样的病症的另外细节在上文陈述。
[0329]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：抑制体重增长、促进体重降低、减少超重体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)，或治疗肥胖症相关的炎症、肥胖症相关的胆囊疾病或肥胖症引起的睡眠呼吸暂停。
[0330]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：治疗由葡萄糖控制受损引起或与葡萄糖控制受损相关的病症，例如代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高或2型糖尿病。
[0331]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：治疗平滑肌增生性疾病，例如再狭窄，例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中。
[0332]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：治疗神经炎性疾病或神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、多发性硬化(ms)、帕金森病或肌萎缩侧索硬化(als)(例如病毒感染之后)。
[0333]
本发明还提供了本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐在制备用于以下的药物中的用途：治疗癌症，例如乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(nhl)。
[0334]
本发明还提供了抑制或减轻炎症(特别是在治疗炎性病症或疾病(包括自身免疫病)中)的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。这样的病症的另外细节在上文陈述。
[0335]
本发明还提供了抑制体重增长、促进体重降低、减少超重体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)，或治疗肥胖症相关的炎症、肥胖症相关的胆囊疾病或肥胖症引起的睡眠呼吸暂停的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0336]
本发明还提供了治疗由葡萄糖控制受损引起或与葡萄糖控制受损相关的病症(例如代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高或2型糖尿病)的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0337]
本发明还提供了治疗平滑肌增生性疾病例如再狭窄(例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中)的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0338]
本发明还提供了治疗神经炎性疾病或神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病、多发性硬化(ms)、帕金森病或肌萎缩侧索硬化(als)(例如病毒感染之后))的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0339]
本发明还提供了治疗癌症(例如乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤)的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的离子通道阻断剂或其可药用盐。
[0340]
发明详述
[0341]
除非本文中另有定义，否则本技术中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常来说，与本文中所述的化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名及其技术是本领域中公知并且通常使用的那些。
[0342]
本技术中提及的所有专利、已公开的专利申请和非专利出版物具体地通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括其具体定义)为准。
[0343]
本文中描述的本发明的每个实施方案可单独或与本发明的一个或更多个另外的实施方案组合使用。
[0344]
除非另有指明，否则为在本书面描述中使用的具体术语提供以下定义。
[0345]
在本说明书通篇，词语“包含/包括(comprise)”及其语法变体(例如“comprises”或“comprising”)应理解为意指包括/包含指定的整体或组分或者整体或组分的组，但不排除任何其他整体或组分或者整体或组分的组。
[0346]
除非上下文另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
[0347]
术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
[0348]
术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用。对象可以是哺乳动物，包括人或非人哺乳动物，例如非人灵长类(例如猿、旧大陆猴(old world monkey)或新大陆猴(new world monkey))、家畜动物(例如牛或猪)、伴侣动物(例如犬或猫)或实验动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。
[0349]
在本说明书和权利要求书通篇，使用了用于天然存在的氨基酸的常规三字母和单字母代码，即
[0350]
a(ala)，g(gly)，l(leu)，i(ile)，v(val)，f(phe)，w(trp)，s(ser)，t(thr)，y(tyr)，n(asn)，q(gln)，d(asp)，e(glu)，k(lys)，r(arg)，h(his)，m(met)，c(cys)和p(pro)；
[0351]
以及公认的用于其他α-氨基酸的代码，例如正亮氨酸(nle)、肌氨酸(sar)、α-氨基异丁酸(aib)、2,3-二氨基丙酸(dap)、2,4-二氨基丁酸(dab)、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸；orn)、α-氨基丁酸(abu，也称为高-丙氨酸)、hk、hlys或高-lys(高-赖氨酸)、hq、hgln或高-gln(高-谷氨酰胺，也称为6-氧代赖氨酸、l-5-氨基甲酰基正缬氨酸、6-氨基-6-氧代正亮氨酸或5-(氨基羰基)正缬氨酸)、f(4-f)(4-氟-苯丙氨酸)、f(4-nh2)(4-氨基-苯丙氨酸)、f(4-no2)(4-硝基-苯丙氨酸)、f(4-ch3)(4-甲基-苯丙氨酸)。
[0352]
名称[2-氨基-5-羧基戊酰基]表示2-氨基-5-羧基戊酸的肽残基：
[0353][0354]
因此，其具有类似于谷氨酸的侧链，但带有另外的亚甲基。
[0355]
当用于本说明书中的通式或序列中时，尤其是当式或序列的其余部分使用单字母代码示出时，这样的另外的α氨基酸可以在中括号“[]”中示出(例如“[nle]”)。上面列出的20种“天然存在的”氨基酸是由标准遗传密码编码的氨基酸，并且也可以称为“蛋白原性”氨基酸。
[0356]
除非另有说明，否则本发明的肽中的氨基酸残基是l-构型。然而，可以并入d-构型氨基酸。在本文中，用小写字母书写的氨基酸代码代表所述氨基酸的d-构型，例如“k”代表赖氨酸(k)的d-构型。
[0357]
所涉及序列的n端处的“h”(或“hy
‑”
)部分表示氢原子[即r1＝氢]，对应于在n端存在游离伯氨基或仲氨基，而在序列的c端的
“‑
oh”或
“‑
nh
2”部分[即r2＝oh或nh2]表示在分子的c端存在羧基(cooh)基团或酰胺基(conh2)基团。c端的“ch2oh”部分[即r2＝ch2oh]表示在分子的c端存在与烷基连接的羟基。ch2oh部分可以包含在(4-氨基-5-羟基戊基)胍或4-氨基-5-羟基戊酰胺中。其他r1和r2基团的名称应相应理解。
[0358]
kv1.3阻断剂
[0359]
术语kv1.3用于指电压门控钾通道亚家族a成员3，也称为kcna3、hpcn3、hgk5、hukiii和hlk3。“亚家族a”也可以称为“振荡器相关亚家族”。人氨基酸序列以uniprot登录号p22001，版本p22001.3(q5vwn2)提供。
[0360]
kv1.3通道在t和b淋巴细胞上表达，并与t细胞活化有关。许多研究组正在开发用于抑制免疫应答以及用于多种其他适应证的kv1.3阻断剂。然而，kv1.3通道是相关离子通道的复杂家族的一部分，所述家族还包括具有不同生理作用的kv1.1、kv1.2和kv1.6通道。因此，期望kv1.3抑制剂优先于其他离子通道尽可能对kv1.3具有选择性，所述其他离子通道尤其是其他电压门控钾通道，例如kv1.1、kv1.2、kv1.4、kv1.5、kv1.6、kv1.7和kv1.8。
[0361]
术语“离子通道阻断剂”简单地用于表示对离子通道具有抑制剂(或阻断)活性，即能够抑制或消除通过相应离子通道的离子流(通常通过与离子通道结合)的化合物。类似地，术语“kv1.3抑制剂”和“kv1.3抑制剂组分”是指能够抑制或消除通过kv1.3离子通道的离子流(通常通过与kv1.3通道结合)的肽。然而，术语“阻断剂”和“抑制剂”不应被理解为暗示任何特定的作用机制，或任何特定的与离子通道本身相互作用的模式。
[0362]
本发明的离子通道阻断剂(以及单独的kv1.3抑制剂组分)在kv1.3离子通道处具有抑制剂或阻断剂活性，即它能够抑制通过kv1.3通道的离子流。
[0363]
ic
50
值可用作抑制剂(或阻断剂)活性或效力的量度。ic
50
值是在给定测定中实现该化合物对离子通道活性的最大抑制的一半所需的抑制剂浓度的量度。在特定离子通道下具有比参考化合物更低的ic
50
的化合物可以被认为是比参考化合物更有活性的抑制剂或更强效的抑制剂。术语“活性”和“效力”可互换使用。
[0364]
ic
50
值可以使用任何适当的测定法来确定，例如测量离子通量(例如铊离子通量)的基于荧光的测定法和膜片钳测定法。它们可以如以下实施例中所述进行。膜片钳测定法可能是优选的，例如使用系统。
[0365]
本发明的离子通道阻断剂(或kv1.3抑制剂)的ic
50
可以低于10nm，但理想地ic
50
低于5nm、低于2nm或低于1nm。在一些情况下，它可以低至0.5nm、0.1nm或甚至更低。
[0366]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1至5、7、11至42、44至48、50至53、55至60、62至68、70至73、75至81、83至88、90至98、101、104至108、116、122、129、131、132、134和137。这些化合物在本文的实施例2中显示为ic
50
为0.3nm或更小。
[0367]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物7、14至35、37、39、40至48、50至53、55至60、62至68、70至73、75至80、83至97、90、91、93至98、101、104至108、116、129和131。这些化合物在本文的实施例2中显示为ic
50
为0.2nm或更小。
[0368]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物7、15至17、19至28、30至35、37、39至42、44、46至48、51至53、55至60、62至67、70、71、73、75至80、83至85、87、91、93、96至98、104、106、107、108和129。这些化合物在本文的实施例2中显示为ic
50
为0.15nm或更小。
[0369]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1、3、17、19、21、23、26至33、37、41至43、46至49、52、62、63、66至68、70至73、75、76、78、82至84、87、91、94、97至102、105至108、115和116。这些化合物在本文的实施例5中显示为对于抑制大鼠全血中t细胞活化，ic
50
为1nm或更小。
[0370]
本发明的离子通道阻断剂对kv1.3具有选择性。在一个实施方案中，本发明的离子通道阻断剂对kv1.1、kv1.2、kv1.4、kv1.5、kv1.6、kv1.7和kv1.8具有选择性。特别地，本发明的离子通道阻断剂对kv1.3的选择性优先于对kv1.1、kv1.2和kv1.6中的一种或更多种的选择性。
[0371]
例如，其可以是：
[0372]
对kv1.3的选择性优先于kv1.1；
[0373]
对kv1.3的选择性优先于kv1.2；
[0374]
对kv1.3的选择性优先于kv1.6；
[0375]
对kv1.3的选择性优先于kv1.1和kv1.2；
[0376]
对kv1.3的选择性优先于kv1.1和kv1.6；
[0377]
对kv1.3的选择性优先于kv1.2和kv1.6；或者
[0378]
对kv1.3的选择性优先于kv1.1、kv1.2和kv1.6。
[0379]
通常，离子通道阻断剂对kv1.3的选择性优先于kv1.1。
[0380]
另外地，其对kv1.3的选择性可优先于kv1.2和/或kv1.6。
[0381]
本文中的“选择性”意指离子通道阻断剂对kv1.3的抑制剂活性高于对kv1.1、kv1.2和kv1.6各自的抑制剂活性。因此，离子通道阻断剂对kv1.3的ic
50
通常低于对相应的其他一种或更多种离子通道的ic
50
。
[0382]
因此，对kv1.3的选择性优先于对另一个离子通道x的选择性可以表示为相应的ic
50
值的比率，例如如ic
50
[x]/ic
50
[kv1.3]。
[0383]
因此，本发明的离子通道阻断剂对kv1.3的选择性可优先于kv1.1至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，其对kv1.3的选择性优先于kv1.1至少100、或至少1000。
[0384]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1至3、5、8、12、16至23、25至31、34至37、40至42、45至49、52至54、56、58、62、63、70、71、76、79、83、94至98、101、103至108和117。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.1至少1000。
[0385]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物3、12、16、18至22、25至28、30、31、35、37、40至42、52、53、62、70、71、76、79、94、95、98和105。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.1至少10000。
[0386]
因此，本发明的离子通道阻断剂对kv1.3的选择性可优先于kv1.2至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，其对kv1.3的选择性优先于kv1.2至少10，并且优选地至少50或至少100或至少1000。
[0387]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1至3、5、8、16至23、25至31、34至37、40至42、45至49、52至54、56、58、62、63、70、71、76、79、83、94至98、101、103至108和117。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.2至少50。
[0388]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1、3、5、8、12、18、25、29、30、36、37、41、46至48、52、62、70、71、79、83、94至98、101、103至106和117。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.2至少700。
[0389]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1、3、12、18、29、30、36、37、41、47、48、62、70、71、79、94至98、101和103至105。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.2至少1000。
[0390]
因此，本发明的离子通道阻断剂对kv1.3的选择性可优先于kv1.6至少10、至少100、至少1000或至少10000，并且可以多至100000或甚至更高。通常，其对kv1.3的选择性优先于kv1.6至少100、或至少400、或至少1000。
[0391]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物1、2、3、5、8、12、16至23、25至31、34至37、40至42、45至49、52至54、56、58、62、63、70、71、76、79、83、94至98、101、103至108和117。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.6至少400。
[0392]
本发明的离子通道阻断剂可以包括如本文所述的化合物3、12、16、18、20、22、26、30、31、37、41、52、53、70、71、76、79、94、95、98和105。这些化合物在本文的实施例3中显示为对kv1.3的选择性优先于kv1.6至少10000。
[0393]
本发明的离子通道阻断剂可以比已知的离子通道阻断剂如shk、莫卡毒素(mokatoxin)(moka1)、vm24、odk2或osk1具有更高的选择性。因此，本发明的离子通道阻断剂可优先于离子通道x对kv1.3具有更高的选择性，
[0394]
即ic
50
[x]/ic
50
[kv1.3]，
[0395]
其大于对比分子的选择性。两种离子通道阻断剂的选择性将在相同条件下对每个离子通道进行确定，以便进行直接比较。如上所述，可以使用任何合适的测定法，例如基于荧光的离子通量测定法和膜片钳测定法。
[0396]
在kv1.1、kv1.2和/或kv1.6中的任一者或全部的情况下，本发明的离子通道阻断剂可能具有比已知离子通道阻断剂(例如odk2或osk1)更低的绝对抑制剂活性(即更高的ic
50
)。然而，以下是可以接受的：只要本发明的离子通道阻断剂对kv1.3的选择性高于对比化合物的选择性，则在这些离子通道中的任一者或全部的情况下，本发明的离子通道阻断剂具有较高的绝对抑制剂活性。然而，通常本发明的化合物结合了对kv1.3的高特异性和高效力。
[0397]
合成与重组表达
[0398]
本文所述的离子通道阻断剂可以通过固相或液相肽合成方法来合成。在这种情况下，可以参考wo 98/11125以及其他许多文献fields,g.b.et al.,2002,“principles and practice of solid-phase peptide synthesis”.in:synthetic peptides(第2版)和本文的实施例。
[0399]
或者，本文所述的离子通道阻断剂可通过重组技术或通过重组技术与肽化学的组合来合成。
[0400]
例如，离子通道阻断剂肽可以通过包括以下的方法来合成：
[0401]
(a)通过固相或液相肽合成方法合成肽并回收由此获得的肽；
[0402]
(b)由编码肽的核酸构建体表达肽并回收表达产物；或者
[0403]
(c)由编码前体肽序列的核酸构建体表达前体肽，回收表达产物，并修饰所述前体肽以产生本发明的离子通道阻断剂。
[0404]
前体肽可以通过引入一个或更多个非蛋白原性氨基酸(例如nle)、引入合适的末端基团r1和r2等来修饰。
[0405]
由编码肽或前体肽的核酸来表达肽或前体肽可以在包含这样的核酸的无细胞表达系统或细胞中进行。这样的表达通常需要肽或前体肽完全由蛋白原性氨基酸(即由标准遗传密码编码的20个氨基酸)构成。
[0406]
对于重组表达，通常将编码前体肽的核酸片段插入到合适的载体中以形成克隆或表达载体。根据应用目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒的形式，但是仅在某些细胞中瞬时表达的裸dna也是重要的载体。优选的克隆和表达载体(质粒载体)能够自主复制，从而使得能够产生高拷贝数以用于高水平表达或高水平复制以进行后续克隆。
[0407]
总体上，表达载体包含5
’→3’
方向上的且可操作地连接的以下特征：用于驱动核酸片段表达的启动子；任选地，编码能够分泌(分泌到胞外相或适当时分泌到周质(periplasma)中)的前导肽的核酸序列；编码前体肽的核酸片段；以及任选地，编码终止子的核酸序列。表达载体可包含另外的特征，例如可选择标志物和复制起点。当对生产菌株或细胞系中的表达载体进行操作时，优选的是所述载体能够整合到宿主细胞基因组中。技术人员对合适的载体非常熟悉，并且能够根据其特定要求来设计载体。
[0408]
本发明的载体用于转化宿主细胞以产生肽或前体肽。这样的经转化细胞可以是用
于扩增核酸片段和载体和/或用于重组产生所述前体肽的培养的细胞或细胞系。
[0409]
优选的经转化细胞是微生物，例如细菌(例如以下物种：埃希菌属(escherichia)(例如大肠杆菌(e.coli))、芽孢杆菌属(bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis))、沙门菌属(salmonella)或分支杆菌属(mycobacterium)(优选非致病性的，例如牛分枝杆菌(m.bovis)bcg))、酵母菌(yeast)(例如，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(pichia pastoris))和原生动物。或者，经转化细胞可来源于多细胞生物，即，其可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。为了克隆和/或优化表达的目的，优选的是经转化细胞能够复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
[0410]
当通过经转化细胞来产生肽或前体肽时，将表达产物分泌到培养基中是方便的，尽管远不是必须的。
[0411]
治疗性适应证
[0412]
如上所述，已显示kv1.3的阻断剂抑制活化的t细胞的增殖，并在多种疾病实验模型中具有有益效果。不希望受理论束缚，认为需要细胞的通过kv1.3通道的钾外向通量来维持t细胞活化所需的钙内向通量。
[0413]
kv1.3在以下中过表达：来自患有新发1型糖尿病的患者的gad5/胰岛素特异性t细胞、来自ms患者的髓磷脂特异性t细胞和来自类风湿性关节炎患者的滑膜的t细胞(beeton et al.,proc natl acad sci usa 103:17414-9,2006)、乳腺癌样本(abdul et al.,anticancer res 23:3347,2003)和前列腺癌细胞系(fraser et al.,pflugers arch 446:559,2003)。
[0414]
已在以下模型中描述了用kv1.3阻断剂在动物模型中的积极结果：对卵清蛋白和破伤风类毒素的超敏反应模型(beeton et al.,mol pharmacol 67:1369,2005；koo et al.,clin immunol 197:99,1999)、用于多发性硬化的模型例如大鼠过继转移实验性自身免疫性脑脊髓炎(adoptive-transfer experimental autoimmune encephalomyelitis，at-eae)模型(beeton et al.,proc natl acad sci usa 103:17414-9,2006)、炎性骨吸收模型(valverde et al.,j bone mineral res 19:155,2004)、关节炎模型(beeton et al.,proc natl acad sci 103:17414,2006；tarcha et al.,j.pharmacol.exp.ther.342:642,2012)以及肥胖症、糖尿病和代谢紊乱(xu et al.,hum mol genet 12:551,2003；xu et al.,proc natl acad sci 101:3112,2004)。
[0415]
已提议表面应用kv1.3阻断剂来治疗皮肤和黏膜炎症。
[0416]
因此，本说明书中描述的离子通道阻断剂具有相当大的潜力用于抑制或减轻炎症，特别是用于治疗炎性病症或疾病，包括自身免疫病。
[0417]
炎性病症或疾病可以是其中期望减轻炎症的任何病症或疾病，例如其中炎症促成症状或发病机制的情况。
[0418]
这样的病症包括自身免疫病、变态反应和超敏反应、同种移植物排斥和移植物抗宿主病。
[0419]
更具体地，病症包括花粉症、哮喘、过敏反应、变应性鼻炎、荨麻疹、湿疹、斑秃、皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎、强直性脊柱炎、血管炎、关节炎(包括类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮(sle，或简称“狼疮”)、和葡萄膜炎、炎
性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化、肝硬化)、慢性阻塞性肺疾病(copd)、肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、炎性肠病、结肠炎(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、红斑、甲状腺炎、银屑病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、硬皮病、肾小球肾炎、炎性骨吸收、多发性硬化、1型糖尿病、移植排斥和移植物抗宿主病。
[0420]
kv1.3的阻断剂也可以具有有益的代谢作用，例如与能量稳态、体重调节和葡萄糖控制相关。
[0421]
因此，此处描述的离子通道阻断剂可以用于抑制体重增长、促进体重降低、减少超重体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)，以及用于治疗相关病症和健康病症，包括肥胖症相关的炎症、肥胖症相关的胆囊疾病和肥胖症引起的睡眠呼吸暂停。
[0422]
对体重的作用可以是治疗性的或美容性的。
[0423]
离子通道阻断剂也可以用于治疗由葡萄糖控制受损引起或与葡萄糖控制受损相关的病症，包括代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高或2型糖尿病。这些病症中的一些可能与肥胖症有关。离子通道阻断剂对这些病症的作用可能全部或部分通过对体重的作用来介导，或者可能与对体重的作用无关。
[0424]
kv1.3也在增殖的人和小鼠平滑肌细胞中表达。kv1.3的阻断剂可以对平滑肌增生性疾病如再狭窄(例如在经历血管手术(例如血管成形术)之后的患者中)有效。
[0425]
另外的证据表明，kv1.3通道参与多种类型细胞(包括肿瘤细胞(bielanska et al.,curr.cancer drug targets 9:904-14,2009)、小胶质细胞(khanna et al.,am.j.physiol.cell physiol.280:c796-806,2001))的活化和/或增殖和神经元祖细胞的分化(wang et al.,j.neurosci.30:5020-7,2010)。因此，kv1.3阻断剂可以有益于治疗神经炎性疾病和神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病、多发性硬化(ms)、帕金森病和肌萎缩侧索硬化(als)(例如病毒感染之后))，以及癌症(包括乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(nhl))。非霍奇金淋巴瘤包括t细胞nhl和b细胞nhl。b细胞nhl的形式包括弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。t细胞nhl的形式包括蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤、前体t淋巴母细胞性淋巴瘤和塞扎里综合征。
[0426]
药物组合物和施用
[0427]
本发明的一个方面涉及包含本发明的离子通道阻断剂或其盐以及载体、赋形剂或载剂的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物组合物，任何盐是可药用盐，并且载体是可药用载体、赋形剂或载剂。
[0428]
因此，本发明的化合物或其盐，尤其是其可药用盐，可以配制成制备用于储存或施用的组合物或药物组合物，并且其包含治疗有效量的本发明化合物或其盐。
[0429]
与碱形成的合适的盐包括金属盐，例如碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或镁盐；铵盐和有机胺盐，例如与以下形成的那些：吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、低级单-烷基胺、二-烷基胺或三-烷基胺(例如，乙基-叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基丙基胺)、或低级单-(羟基烷基)胺、二-(羟基烷基)胺或三-(羟基烷基)胺(例如，单-乙醇胺、二-乙醇胺或三乙醇胺)。还可形成内盐。类似地，当本发明的化合物含有碱性部分时，可以使用有机酸或无机酸形成盐。例如，可由以下酸形成盐：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊
酸、己酸、草酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、苦杏仁酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、苯甲酸、碳酸、尿酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、对甲苯磺酸(即4-甲基苯磺酸)、樟脑磺酸、2-氨基乙磺酸、氨基甲基膦酸和三氟甲磺酸(trifluoromethanesulphonic acid)(后者也称为三氟甲磺酸(triflic acid))，以及其他已知的可药用酸。还可以与氨基酸(例如赖氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸)形成氨基酸加成盐。
[0430]
在一些实施方案中，本发明的药物组合物是其中化合物是可药用酸加成盐形式的药物组合物。
[0431]
如对于医学领域的技术人员将明显的是，本发明的化合物或药物组合物的“治疗有效量”将尤其根据待治疗对象(患者)的年龄、体重和/或性别而变化。可能相关的其他因素包括所考虑的具体患者的身体特征、患者的饮食、任何并用药物的性质、所使用的具体化合物、具体施用方式、所期望的药理学作用以及具体的治疗性适应证。因为这些因素及其在确定治疗有效量中的关系在医学领域中是众所周知的，所以确定用于实现所期望的治疗作用的治疗有效剂量水平将在技术人员的范围内。
[0432]
本文中使用的术语“治疗有效量”是指减轻给定病症或病理状况之症状，并且优选使患有该病症或病理状况的个体中的生理响应正常化的量。症状的减轻或生理响应的正常化可使用本领域中常规的方法来确定，并且可随给定的病症或病理状况而变化。在一个方面中，本发明化合物或药物组合物的治疗有效量是将可测量的生理参数恢复至未患所涉及病症或病理状况的个体中的参数的基本上相同的值(优选在该值的30％以内，更优选在该值的20％以内，并且更优选在该值的10％以内)。
[0433]
在本发明的一个实施方案中，本发明化合物或药物组合物的施用以较低剂量水平开始，并且提高剂量水平直至实现预防/治疗相关医学适应证的期望作用。这将限定治疗有效量。对于本发明的化合物(单独或作为药物组合物的一部分)，活性化合物的这样的人剂量可以为约0.01pmol/kg至500μmol/kg体重、约0.01pmol/kg至300μmol/kg体重、0.01pmol/kg至100μmol/kg体重、0.1pmol/kg至50μmol/kg体重、1pmol/kg至10μmol/kg体重、5pmol/kg至5μmol/kg体重、10pmol/kg至1μmol/kg体重、50pmol/kg至0.1μmol/kg体重、100pmol/kg至0.01μmol/kg体重、0.001μmol/kg至0.5μmol/kg体重、0.05μmol/kg至0.1μmol/kg体重。
[0434]
可通过常规手段来确定有效剂量和治疗方案，其在实验动物中以低剂量开始，并且随后在监测效果的同时提高剂量，并且还系统地改变剂量方案。当确定用于给定对象的最优剂量时，临床医师可能考虑若干因素。这样的考虑是本领域技术人员已知的。
实施例
[0435]
实施例1：通用肽合成
[0436]
下表提供了缩写和供应商列表
[0437][0438]
[0439]
装置和合成策略
[0440]
根据固相肽合成操作，使用9-芴基甲基氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，fmoc)作为n-α-氨基保护基和使用用于侧链官能团的合适的普通保护基，在肽合成仪(例如cem liberty肽合成仪或symphony x合成仪)上分批合成肽。
[0441]
使用了作为基于聚合物支持物的树脂，例如tentagel
tm
。向合成仪装载在使用之前在dmf中溶胀的树脂。
[0442]
偶联
[0443]
cem liberty肽合成仪
[0444]
将fmoc保护的氨基酸溶液(4当量)与偶联试剂溶液(4当量)和碱溶液(8当量)一起添加至树脂。将该混合物通过微波单元加热至70至75℃并偶联5分钟或者在不加热的情况下偶联60分钟。在偶联期间，使氮鼓泡通过混合物。
[0445]
symphony x合成仪
[0446]
将偶联溶液按以下顺序转移至反应容器：氨基酸(4当量)、hatu(4当量)和dipea(8当量)。除非另有说明，否则偶联时间为在室温(room temperature，rt)下10分钟。用dmf洗涤树脂(5
×
0.5分钟)。在重复偶联的情况下，偶联时间在所有情况下为在室温下45分钟。
[0447]
去保护
[0448]
cem liberty肽合成仪
[0449]
使用在dmf或其他合适的溶剂中的哌啶将fmoc基团去保护。将去保护溶液添加至反应容器并将混合物加热30秒，达到约40℃。排空反应容器，并添加新的去保护溶液，并随后加热至70℃至75℃，持续3分钟。在排空反应容器之后，用dmf或其他合适的溶剂洗涤树脂。
[0450]
symphony x合成仪
[0451]
使用在dmf中的40％哌啶进行fmoc去保护，持续2.5分钟，并使用相同条件进行重复。用dmf洗涤树脂(5
×
0.5分钟)。
[0452]
切割
[0453]
将经干燥的肽树脂用tfa和合适的清除剂处理约2小时。降低滤液的体积，并在添加乙醚之后使粗制肽沉淀。将粗制肽沉淀物用乙醚洗涤数次并最终干燥。
[0454]
粗制肽的hplc纯化
[0455]
通过制备型反相hplc纯化粗制肽：使用常规hplc装置，例如gilson gx-281，具有用于二元梯度应用的331/332泵组合，配备有柱(例如5
×
25cm gemini nx 5u c18 110a柱)和级分收集器，使用缓冲液a(0.1％甲酸，水溶液)或a(0.1％tfa，水溶液)和缓冲液b(0.1％甲酸，90％mecn，水溶液)或b(0.1％tfa，90％mecn，水溶液)的适当梯度的20至40ml/分钟的流量。通过分析型hplc和ms对级分进行分析，并合并所选择的级分并进行冻干。将最终产物通过hplc和ms来表征。
[0456]
二硫化物形成
[0457]
将具有六个半胱氨酸的粗制或部分纯化的线性肽溶解在缓冲液(例如碳酸氢钠(nahco3)或乙酸铵(nh4ac))中，以得到最终浓度约为0.1mg/ml或25μm。将缓冲液的ph调节至ph 8.0并在室温下在磁力搅拌下搅拌溶液并打开通向大气的通道。反应进程由hplc确定，
并通常被评价为过夜完成。通过用有机酸(例如乙酸或三氟乙酸(ph《4))降低溶液的ph来淬灭溶液。将溶液过滤并直接加载到制备型hplc柱上用于纯化。
[0458]
分析hplc
[0459]
通过配备有自动进样器、脱气装置(degasser)、20μl流动池(flow cell)和chromeleon软件的分析型hplc(agilent 1100/1200系列)确定最终纯度。使用分析柱(例如kinetex 2.6μm xb-c18 100a 100
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4,6mm柱)在40℃下以1.2ml/分钟的流量操作hplc。在215nm处对化合物进行检测和定量。缓冲液a(0.1％tfa，水溶液)和缓冲液b(0.1％tfa，90％mecn，水溶液)。
[0460]
质谱
[0461]
在配备有具有锁定质量校准的电喷雾检测器和masslynx软件的常规质谱仪(例如waters xevo g2 tof)上进行最终ms分析。使用直接进样和如色谱图中指定的15v(1tof)、30v(2tof)或45v(3tof)的锥孔电压(cone voltage)在正模式下操作。精度为5ppm，而典型分辨率为15,000至20,000。
[0462]
合成的化合物见表1。
[0463]
表1
[0464]
[0465]
[0466]
[0467][0468]
还合成了以下化合物用作对照：
[0469][0470]
实施例2：flipr铊测定中的kv1.3阻断剂活性
[0471]
人kv1.3电压门控k 通道细胞系购自perkin elmer(tds-ax-010-c-1)。该细胞系基于用人kv1.3电压门控k 通道稳定转染的cho-dukx细胞。
[0472]
将细胞系在具有核苷酸、glutamax(gibco cat#32571028)、10％胎牛血清(foetal bovine serum，fbs)、0.4mg/ml遗传霉素、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的memα中培养，并以10.000个细胞/孔接种到黑色聚-d-赖氨酸涂覆的96孔板中。
[0473]
将fluxor
tm
钾离子通道测定(invitrogen cat#f10016)用于定量作为对kv1.3激活的响应的铊离子进入细胞的通量，所述kv1.3激活用刺激缓冲液进行，从而导致细胞膜去极化，产生与通道活性成比例的荧光信号。该测定按照测定试剂盒制造商的描述进行。使用tetra高通量筛选系统(molecular devices，inc.)记录和定量荧光响应。
[0474]
将来自引起抑制进入细胞的铊通量的受试化合物的数据相对于阳性(shk)和阴性对照(载剂)进行归一化，以从浓度响应曲线计算ic
50
。结果示于表2中。ic
50
可被视为对相应化合物的抑制效力的量度。ic
50
值是在给定测定中实现该化合物对离子通道活性的最大抑制的一半所需的抑制剂浓度的量度。在特定离子通道下具有比参考化合物更低的ic
50
的化合物可以被认为是比参考化合物更有活性的抑制剂或更强效的抑制剂。
[0475]
表2
[0476]
[0477]
[0478]
[0479][0480]
实施例3：膜片钳测定中的kv1.3选择性
[0481]
将稳定表达每个钾离子通道的外源人α-亚基的中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，cho)细胞系在标准培养条件下培养和传代。
[0482]
使用自动化的基于芯片的平面膜片钳设备来定量离子电流。在建立千兆欧的密封之后，在传统的全细胞配置中进行所有记录。含有外部记录溶液(150mm nacl、10mm kcl、10mm hepes、1mm mgcl2、3mm cacl2、10mm葡萄糖，用naoh将ph调节至7.4)和内部记录溶液(20mm kcl、120mm kf、10mm hepes、10mm egta、5mm naatp，用koh将ph调节至7.2)。在实验期间，将0.1％(v/v)bsa作为载剂包含在所有外部记录溶液中。使用电压协议，从-80mv的保持电位引出电流，该协议每15秒将电压转换为30mv，持续500毫秒。
[0483]
浓度-响应关系是通过累积将七次递增浓度的受试样品应用于单独细胞来建立的，而每次化合物应用的记录期为2分钟。
[0484]
效力被确定为在每个浓度应用期结束时从光标(cursor)位置开始的最后三个扫描的平均电荷。每个测试剂量应用期的百分比抑制计算为平均光标值(电荷)相对于载剂期结束时测量的光标值的减少，并用于从浓度响应曲线计算ic
50
。
[0485]
结果如表3所示。
[0486]
表3
[0487]
[0488]
[0489][0490]
比较实施例2和3中的数据表明，在两种测定中测量的ic
50
值之间存在良好的相关性。
[0491]
实施例4a：kv1.3阻断剂对人pbmc的抑制活性
[0492]
使用人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)来评估kv1.3阻断剂对t细胞活化的作用，这通过在用抗cd3刺激之后的il-2(细胞因子)释放来确定。
[0493]
人pbmc获自precision for medicine(frederick，md)。使用来自5个供体的细胞。将板结合的抗cd3用于在pbmc制剂中刺激大量t细胞。简而言之，在37℃下使用50μl的在1
×
pbs中稀释的0.5μg/ml抗cd3溶液用抗cd3抗体包被96孔板2小时。此后将板洗涤两次。
[0494]
将表4a中所示的kv1.3阻断剂在培养基(rpmi 1640，其具有glutamax-i，含有10％v/v胎牛血清，1％v/v青霉素-链霉素溶液)中稀释并以100μl的体积以0.01pm至100nm(十倍稀释)的浓度添加。将环孢素a(1ug/ml)和vm24肽(100nm)用作阳性对照。最后，以100μl的体积将1
×
105pbmc添加至每个孔，使每个孔的最终体积为200μl。将板在37℃/5％co2培养箱中孵育20至24小时。将板离心之后，将25μl上清液转移至il-2检测板(msd人il-2组织培养试剂盒，cat#k151ahb-2)，并按照制造商(meso scale discovery，rockville，rockville，maryland，usa)的描述测量il-2。
[0495]
结果在表4a中作为从经抗cd3刺激的人pbmc测定中获得的ic50值的几何平均值示出。所有值都来自至少4次重复。
[0496]
表4a
[0497][0498]
在经抗cd3抗体活化的hpbmc并添加kv1.3阻断剂的情况下孵育导致il-2分泌的剂量依赖性降低。平均而言，受试化合物的ic
50
值(根据il-2释放计算)在0.05nm至0.4nm的范围内。这与使用shk186观察到的ic
50
相当(ic
50
为0.07nm)，并且是moka1(其抑制il-2分泌的效力更低)的ic
50
的约1/10至1/100。
[0499]
受试化合物与shk186之间没有显著差异。shk186和受试化合物均显著低于moka1。
[0500]
在所有实验中，环孢素完全阻断了cd3诱导的il-2释放。
[0501]
实施例4b：kv1.3阻断剂对人pbmc的抑制活性
[0502]
使用人外周血单个核细胞(pbmc)来评估kv1.3阻断剂对t细胞活化的作用，这通过在用抗cd3刺激之后的il-2释放来确定。
[0503]
人pbmc获自precision for medicine(frederick，md)。使用来自5个供体的细胞。将板结合的抗cd3用于在pbmc制剂中刺激大量t细胞。简而言之，在5℃下使用50μl的在pbs中稀释的1μg/ml抗cd3溶液用抗cd3抗体包被96孔板约16小时。此后将板洗涤两次。
[0504]
随后将kv1.3阻断剂在培养基(rpmi 1640，其具有glutamax-i，含有10％v/v胎牛血清，1％v/v青霉素-链霉素溶液)中稀释并以50μl体积添加。将表4b中所示化合物以0.3pm至1000nm(半对数稀释，起始浓度不同)的浓度使用。将环孢素a(1μg/ml)和vm24肽(100nm)用作阳性对照。
[0505]
最后，将在相同培养基中的50.000个pbmc以50μl的体积添加至每个孔，使每个孔的最终体积为100μl。将板在37℃/5％co2培养箱中孵育20至24小时。将板离心之后，将25μl上清液转移至il-2检测板(msd人il-2组织培养试剂盒，cat#k151ahb-2)，并按照制造商(meso scale discovery，rockville，maryland，usa)的描述测量il-2。
[0506]
结果在表4b中作为从经抗cd3刺激的人pbmc测定中获得的ic50值的几何平均值示出。所有值均来自至少6次重复。
[0507]
表4b
[0508][0509]
在经抗cd3抗体活化的hpbmc并添加本发明的化合物的情况下孵育导致il-2分泌的剂量依赖性降低。
[0510]
如表4b所示，受试化合物的平均ic
50
值(根据il-2释放计算)在0.01nm至0.09nm的范围内。这与使用shk186观察到的ic
50
相当(ic
50
为0.05nm)。该测定使用与用于实施例4a的供体不同的供体进行，因此预计两组实验中shk-186的值不会相同。
[0511]
在所有实验中，环孢素完全阻断了抗cd3诱导的il-2释放。
[0512]
实施例5：kv1.3阻断剂在大鼠全血中的抑制活性
[0513]
使用大鼠全血来评估kv1.3阻断剂对t细胞活化的效力，如通过在用毒胡萝卜素刺激之后的il-17a释放来确定。添加毒胡萝卜素导致信号传导级联激活，最终激活t细胞增殖和细胞因子产生，其中kv1.3离子通道起关键作用，使得可以在该实验系统中测量原代细胞中kv1.3阻断剂的活性。
[0514]
大鼠全血获自健康的、未经处理的lewis或sprague-dawley大鼠，将这些大鼠使用
肝素钠采血管从心脏中进行终末采血以进行收集。将受试化合物在测定缓冲液(dmem glutamax)中稀释至4
×
最终测试浓度(glutamax是包含3.97mm l-丙氨酸-l-谷氨酰胺(gibco cat#61965026)并补充有25mm hepes缓冲液、1mm丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.05％来自牛乳的酪蛋白(sigma-aldrich)的培养基)并将25μl添加至96孔板的孔。然后添加50μl大鼠全血并在室温下孵育至少5分钟以允许化合物结合。然后将在测定缓冲液中稀释的25μl 40μm毒胡萝卜素添加至测定板的所有孔中以活化细胞，然后在湿润的箱中在37℃/5％co2下孵育24小时。将测定板在4℃下以300g离心10分钟，并将上清液转移到新板中。使用大鼠il-17aelisa试剂盒(abcam cat#ab214028)按照制造商的推荐测量释放到上清液中的il-17a浓度。通过将20μl上清液转移到来自检测试剂盒的含有30μl缓冲液75bs的elisa板上的孔中来将样品稀释2.5倍。
[0515]
将来自引起对il-17a的抑制的受试化合物的数据相对于完全毒胡萝卜素激活(未添加阻断剂)和未激活对照(添加测定缓冲液而不是毒胡萝卜素)进行归一化，以从浓度响应曲线计算ic
50
。
[0516]
结果如表5所示，以ic
50
表示，带有标准差(ic
50
_sd)。所有值均来源于至少2次重复。离体生物作用显示出与化合物效力的相关性。
[0517]
表5
[0518]
[0519][0520]
实施例6：药代动力学表征
[0521]
方法
[0522]
对sprague dawley或wistar大鼠(体重为约250g至350g的雄性)给予每种待测试肽的单次皮下(s.c.)注射。
[0523]
s.c.施用选定的化合物(剂量70nmol/kg，给药体积2或5ml/kg)之后，在给药之后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时时抽取血液样品。在每个采样时间点，通过舌下出血或通过切尾从大鼠中抽取样品。在最后一次采样之后，将大鼠通过o2/co2麻醉处死。给药载剂是10mm磷酸盐、0.8％nacl、0.05％聚山梨酯20(ph6.0)。
[0524]
将血浆样品在固相萃取(solid phase extraction，spe)之后通过液相色谱质谱
(lc-ms/ms)进行分析。在phoenix winnonlin 6.4或更高版本中，使用非房室方法使用平均血浆浓度来计算药代动力学参数。血浆终末消除半衰期(t1/2)被确定为ln(2)/λz，其中λz是终末期期间对数浓度相对于时间曲线的对数线性回归的斜率的大小。auc
inf
是外推至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(auc
inf
＝auc
last
c
last
/λz，其中c
last
是最后观察到的血浆浓度)。c
max
是观察到的最大浓度，发生在tmax处。选定的化合物的结果示出在表6中。
[0525]
表6
[0526][0527]
实施例7：kv1.3阻断剂处理对大鼠匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)耳炎症模型的作用
[0528]
在大鼠的一只耳中引发了经典的迟发型超敏反应(dth)。简而言之，将8至10周龄的雄性lewis大鼠在第-7天用200μl在完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant，cfa)(difco，目录号263810)中乳化的匙孔戚血蓝蛋白(klh)(来自sigma，目录号h7017)(4mg/ml)在尾巴根部皮下(sc)免疫接种。在第0天，将大鼠在左耳中用40μl klh/nacl0.9％(2mg/ml)进行皮内攻击。在耳攻击之后，大鼠在klh攻击的左耳中发展出t细胞依赖性炎症。右耳保持未发炎并用作对照。
[0529]
通过比较用载剂处理的大鼠(n＝8至10/gr)与用kv1.3阻断剂处理的大鼠中的响应来研究kv1.3阻断剂处理降低dth耳肿胀响应的能力。在klh耳攻击之前24小时，sc施用载剂或溶解在载剂中的kv1.3阻断剂(2ml/kg)。kv1.3阻断剂的试验剂量为50、70或100nmol/kg。测试载剂是10mm磷酸盐、0.8％w/v nacl、0.05％w/v聚山梨酯20，ph 6。将环孢素(csa)作为阳性研究对照包含在所有实验中。在klh耳攻击之前一小时经口施用环孢素(sandimmune100mg/ml经口溶液，novartis)(10mg/kg)并在klh耳攻击之后6小时再次施用。
[0530]
作为效力的主要读出，计算了每只动物在耳dth反应诱导之后0至48小时的δ耳厚
度(mm)的曲线下面积(area under curve，auc)，其中变化(d)计算如下：左耳厚度-右耳厚度。然后将这些结果用于计算kv1.3阻断剂处理对耳厚度的％抑制：％抑制：((1-(个体δauc kv1.3阻断剂/平均δauc载剂组))
×
100。结果计算为％抑制 /-标准差(standard deviation，sd)，并示出在表7和表8中。
[0531]
表7
[0532]
exp剂量(nmol/kg)cpd.3cpd.41cpd.52csa
＊
#17038.8( /-9.7)46.9( /-10.9) 71.4( /-4.8)#27025.0( /-12.5)27.7( /-11.5) 76.8( /-13.4)#35037.3( /-13.8)22.2( /-11.1) 65.1( /-4.5)#4100 41.9( /-12.5)25.1( /-6.3)63.4( /-5.9)
[0533]
表8
[0534][0535]
***
[0536]
本说明书中描述的工作已在基金协议venomics_ca_20111021下获得了欧洲共同体第七框架计划(european communities seventh framework program)fp7/2007-2013的资助。