用于获得健康肠类器官的方法与流程

用于获得健康肠类器官的方法
1.本发明涉及再生医学和精准医学领域，并且具体地涉及制备患者来源的健康肠类器官(pdo)的方法。
2.全球受炎症性肠病(ibd)影响的人口数目持续增加。粘膜愈合和肠屏障功能的重建是与显著更良好的预后、较低的复发和住院率以及手术和结肠直肠癌风险降低有关的重要治疗目标。然而，当前的医疗在全部ibd患者中不太有效，其中约16-47％的患者在诊断后10年需要手术(frolkis等人,risk of surgery for inflammatory bowel diseases has decreased over time:a systematic review and meta-analysis of population-based studies；gastroen-terology 2013；145:996-1006)。这清楚地突显了对于新型疗法未满足的需要，其中干细胞富集的肠类器官作为移植和肠屏障功能重建的再生材料来源具有巨大前景。
3.类器官，包括细胞球体或团是从干细胞发育并且以类似于体内情况的方式通过细胞分选和空间受限的谱系提交自组织(或自模式化)的干细胞或器官特异性细胞类型的三维结构。因此，类器官代表细胞的天然生理学并且具有模拟天然情况的细胞组成(包括在不同分化阶段的剩余干细胞和/或特化细胞类型)和解剖学。干细胞可以分离自组织或类器官片段。由此产生类器官的细胞可以分化以形成器官样组织，从而显示出自组织以形成非常类似于体内器官的结构的多细胞类型(即细胞分化)。因此，类器官是在非常类似于体内发育的系统中研究人器官和人器官发育的优良模型。类器官还用于生长和扩增用于临床应用的细胞。在本领域中，从分离的肠隐窝或干细胞生长的类器官还可以被称为“类肠(enteroids)”或“类结肠(colonoids)”。
4.肠类器官已成功递送至患有实验结肠炎的小鼠中，从而证实细胞粘附至并且成为上皮细胞的整体部分(yui等人,functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult lgr5 stem cell,nature medicine 18卷,4期,2012,618-624；fordham等人,transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury,cell stem cell 13,734
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744,2013年12月5日；和sugimoto等人,reconstruction of the human colon epithelium in vivo,cell stem cell 22,1
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6,2018年2月1日(https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.11.012))。在这些研究中，成功的肠类器官生长和移植依赖于用于pdo的建立和扩增的动物来源的基质(如matrigel)的使用。
5.描述了用于肠类器官在matrigel中的生长的3d培养系统，其维持了具有干细胞更新(stem cell turnover)的基本隐窝-绒毛生理学(sato等人,single lgr5 stem cells build crypt
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villus structures in vitro without a mesenchymal niche,nature,459卷,2009年5月14日,262-266；sato等人,paneth cells constitute the niche for lgr5 stem cells in intestinal crypts,nature,469卷,2011年1月20日,415-419；sato等人,long-term expansion of epithelial organoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and barrett’s epithelium,gastro-enterology 2011；141:1762
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1772；wo 2009/022907 a2；wo 2010/090513 a2；wo 2012/168930 a2；wo 2013/093812 a2)。在这
些研究中，用于饲喂在matrigel中生长的细胞的适合于细胞培养基的组分的鉴定是主要问题。
6.然而，动物来源的基质，如matrigel的批次间差异和不明确的组成阻碍了对于它们在人中的使用的监管审批。照此，为了将肠类器官移植疗法转化至人患者，肠类器官培养的一些方面需要对于临床使用进行改变。这些包括明确且对于人使用批准、可放大并且优选地无外源物质(即不含动物来源组分)的载体基质和培养基的开发。
7.在broguiere等人,growth of epithelial organoids in a defined hydrogel,adv.mater.2018,1801621中，补充有层粘连蛋白-111的明确但非合成(即，既不是无异源(allo-)也不是无外源(xeno-free)物质)的纤维蛋白水凝胶显示支持肠类器官的生长。纤维蛋白中rgd结构域的天然存在显示是类器官生长所必须的。
8.gjorevski(gjorevski等人,designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture,nature,539卷,2016年11月24日,560-56；gjorevski等人,synthesis and characterization of well-defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture,nature protocols,12卷,11期,2017,2263-2274；wo 2017/036533 a1和wo 2017/037295 al)开发了用于原代小鼠和人小肠类器官以及人结肠直肠癌类器官的生长的具有官能化rgd肽和不同的降解动力学，包括特异性酶促降解以及受控自降解动力学(peg-丙烯酸脂的水解)的酶促(凝血因子)交联的8-臂聚乙二醇(peg)水凝胶。从小鼠组织(完整蛋白)纯化的层粘连蛋白-111的添加对于支持类器官分化是必须的。
9.尽管对于从小鼠细胞的扩增和类器官形成显示出这种方法的一些成功，但是尚未显示(并且在gjorevski 2017,第2265页中质疑)上述系统适合于从来自人活组织检查的新近分离或冷冻的人细胞的扩增和类器官形成。另外，基于与凝血因子的酶促交联反应的仅有的所测试的系统是出于商业目的，昂贵、难以放大和/或难以自动化的，并且还已证明难以复制。
10.cruz-acuna所描述的工作(cruz-acuna等人,synthetic hydrogels for human intestinal organoid generation and colonic wound repair,nature cell biology,2017年10月23日在线发表的提前在线出版物；doi:10.1038/ncb3632,1-23；cruz-acuna等人,peg-4mal hydrogels for human organoid generation,culture,and in vivo delivery,nature protocols,13卷,2018年9月,2102
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2119；和wo 2018/165565 a1)基于使用人胚胎干细胞和诱导的多潜能干细胞开发用于肠类器官生长的用rgd官能化且与蛋白酶-可降解的肽gpq-w交联的完全合成的4-臂peg-马来酰亚胺水凝胶。然后，将在这些合成凝胶中扩增的类器官注入作为概念验证研究的小鼠结肠损伤模型中，从而证实了肠类器官移植的治疗潜力。
11.尚未显示使用该系统，来自患者活组织检查的新近分离的或冷冻的细胞可以扩增并形成类器官。对于该系统，必须的是交联剂组分是酶促可降解的。
12.目前，建立类器官离体培养的标准包括首先在“金标准”matrigel(是基底膜提取物(bme)的可商购产品之一)中包封(从组织)新近分离的细胞，并使细胞生长几代以扩增它们(即增加细胞数目)。bme(例如，matrigel)是来源于小鼠肉瘤提取物的凝胶，如以上所提及的，它具有不良的批次间一致性，具有不明确的组成，并因此不可以用于临床
转化应用，从而获得监管批准可以是困难或不可能的(madl等人,nature 557(2018),335-342)。
13.对于类器官的建立，除去具有不明确的外源组分或人组分的凝胶的使用将克服在临床应用，如再生医学、精准医学、药物测试或患者分层中使用类器官的主要障碍之一。
14.mazzocchi等人,in vitro patient-derived 3d mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening,scientific reports(2018)8:2886；votanopoulos等人,appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment:a feasibility study,ann surg oncol(2019)26:139
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147；和wo 2018/027023 a1已提供了来自在完全明确(非完全合成)基质中培养的活组织检查的新近分离的细胞的概念验证。简要地，将来源于间皮瘤和阑尾癌患者的细胞在玻尿酸/胶原蛋白-基水凝胶中培养以开发用于药物反应预测的平台。然而，如matrigel一样，胶原蛋白也是天然来源的基质并且遇到了类似的问题。
15.至今，尚未报道在不是天然来源的基质，如matrigel或胶原蛋白的完全明确和/或完全合成的水凝胶基质中，来自活组织检查或组织切除术的新近分离或冷冻的人细胞(即直接从人获得且尚未在另一个系统中预培养或预建立的细胞)的成功扩增以及类器官由此的后续形成。尽管如以上所讨论的现有技术中所述，明确需要这种方法，但是至今金标准仍是对于细胞扩增的至少第一步使用matrigel。这是对于涉及制备半合成或完全合成的三维水凝胶系统工作的困难的证实。
16.本发明的潜在问题在于提供用于来自活组织检查的新近分离或冷冻的人细胞的扩增以及由此肠类器官的后续形成的方法，其中所述方法完全避免使用天然来源的基质，如matrigel，并且提供了适合于临床应用且以商业可行方式，即成本-有效、可靠、可重复、可自动化和可放大产生的肠类器官。
17.根据本发明，通过如独立权利要求中所定义的水凝胶、部件试剂盒和方法解决了所述问题。
18.具体地，本发明涉及适合于新近分离或冷冻的肠细胞的生长和扩增以及由此的肠类器官的形成的生物功能性三维水凝胶，其中所述水凝胶是下列的反应产物
19.—至少一种前体分子，它是含有烯属不饱和基团的多臂peg，所述烯属不饱和基团选自乙烯基砜和丙烯酸脂部分，
20.—交联剂分子，其含有至少两个，优选地两个能够在迈克尔加成反应中与所述多臂peg的所述烯属不饱和基团反应的亲核基团，和
21.—至少一种生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型，优选地，层粘连蛋白-511，及其生物功能性片段，
22.其特征在于，所述交联剂分子包含至少一种rgd基序并且优选地尚不知道它是酶促可降解的。
23.与来自gjorevski 2016和2017、wo 2017/036533 a1和wo 2017/037295 al的在先水凝胶相比，本发明的水凝胶更廉价。由于它不需要存在用于交联的酶和激活因子，因此本发明的水凝胶对于商业目的可以是易于放大的。并且，这还因为在本发明中以上所描述的凝胶前体(即含有烯属不饱和基团的多臂peg、含有两个亲核基团的交联剂分子和至少一种
生物功能性配体)不需要如来自gjorevski 2016&2017、wo 2017/036533 a1和wo 2017/037295 al的现有技术凝胶中所需要的用于制备凝胶前体的额外步骤。
24.特别是，它非常适合于它们使用的生产放大以及自动化，即适合于使用移液机器人等的方法应用。本发明的水凝胶是非常可靠地可重复的。此外，与gjorevski等人的酶促交联凝胶相反，本发明的水凝胶与可商购的培养基，例如，来自stemcell technologies的intesticult
tm
类器官生长培养基相容，即它不过早分解。
25.与来自cruz-acuna 2017&2018和wo 2018/165565 a1的现有技术水凝胶相比，本发明的水凝胶基于不同的化学性质，更适合于自动化，即适合于使用移液机器人等的方法应用，并且可以更容易放大。这是因为在生产方法期间，本发明的所有凝胶前体材料(即含有烯属不饱和基团的多臂peg、含有两个亲核基团的交联剂分子和至少一种生物功能性配体)可以预混合并冻干而不会过早反应，这对于cruz-acuna等人所描述的系统是不可能的，因为它们的前体在那些条件下将反应。
26.本发明的水凝胶的重要方面在于以下事实：与其中在(以“悬垂”方式)连接至交联的水凝胶的配体中提供rgd基序的现有技术水凝胶相比，在交联剂分子内提供至少一种rgd基序。本发明所述的方法允许将水凝胶中rgd基序的量提高相当程度。已意外地发现对于本发明的目的，这导致水凝胶特征显著改善。
27.根据本发明，已意外地发现当与适合的培养基组合使用时，本文所讨论的水凝胶适合于类器官从来自人活组织检查或组织切除术的新近分离或冷冻的肠细胞(单个细胞和/细胞团)的从头形成、这些细胞的生长、传代和扩增以及任选地类器官由此的后续分化。因此，根据本发明，完全避免了对于必须使用天然来源的基质，如matrigel的需要。
28.根据本发明，术语“来自活组织检查或组织切除术的新近分离或冷冻的人细胞”是指通过任何所提及的程序直接从人获得并且在形成类器官的方法中使用前，尚未在另一个系统中预培育或预建立的细胞。通常，收集这些新鲜细胞并且立即或在最多3至4天的一段时间内在本发明所述的方法中使用。如果收集后未立即使用所述细胞，则出于储存的目的，可以在通常使用的条件下将它们冷冻。所收集的细胞可以是单个细胞和/或细胞“团”，包括解离的细胞、隐窝(crypts)和组织碎片。根据本发明的优选实施方式，使用上皮细胞。
29.根据本发明，术语“类器官的从头形成”是指已首次离体(即在来源生物外部)生长的新近分离或冷冻的人细胞(例如，人活组织检查或组织切除术)。可以同义地使用术语“首次离体细胞生长”或“第零代(p0)”。
30.根据本发明，术语“预建立的类器官”是指在应用于本发明的水凝胶之前，已在其他系统(例如，matrigel、2d或3d系统，体内作为患者来源的异种移植(pdx))中生长的细胞、单个细胞和/或细胞团(例如，细胞团块、类器官等)。
31.根据本发明，术语“细胞生长”是指细胞从预建立的类器官或从头形成的类器官的成功生长。
32.根据本发明，术语“细胞传代”或“代”或“细胞分裂”是指以下步骤：从一个凝胶提取细胞并将那些细胞在具有与上述凝胶相同或不同的特征的另一凝胶中接种并使其生长。
33.根据本发明，术语“细胞扩增”是指细胞生长和细胞数目增加的步骤(例如，在相同代内或者从一代到下一代)。
34.根据本发明，术语“类器官分化”是指细胞在类器官中分化的成功诱导。
35.本发明还涉及用于新近分离或冷冻的肠细胞的生长和扩增以及由此肠类器官的形成的部件试剂盒，其包括
36.—至少一种前体分子，它是含有烯属不饱和基团的多臂peg，所述烯属不饱和基团选自乙烯基砜和丙烯酸脂部分，
37.—交联剂分子，其含有至少两个，优选地两个能够在迈克尔加成反应中与所述多臂peg的所述烯属不饱和基团反应的亲核基团，其中所述交联剂分子包含至少一种rgd基序，和
38.—至少一种生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型，优选地，层粘连蛋白-511，及其生物功能性片段，
39.和培养基，其中所述培养基包含r-脊椎蛋白1，优选地r-脊椎蛋白1条件培养基，和wnt3a，优选地wnt3a条件培养基。
40.本发明还涉及用于新近分离或冷冻的肠细胞的生长和扩增的方法，其包括以下步骤：
41.a)使用如本文所描述的部件试剂盒，通过将所述试剂盒的水凝胶与所述新近分离或冷冻的肠细胞在存在所述试剂盒的培养基的情况下培育，类器官从新近分离或冷冻的人肠细胞的从头形成，
42.b)使用如本文所描述的所述部件试剂盒，使来自步骤a)的肠类器官的细胞生长，任选地传代和扩增，
43.c)任选地，在存在诱导细胞分化的改良培养基的情况下，来自步骤a)的类器官的分化，
44.其特征在于，在所述方法中，仅使用完全合成或完全明确的半合成水凝胶。
45.根据本发明，术语“完全合成的水凝胶”是指仅从合成前体，即在不存在任何天然来源的前体，如天然层粘连蛋白-111的情况下形成的水凝胶。
46.根据本发明，术语“完全明确的半合成水凝胶”是指包含至少一种天然来源的前体，如天然层粘连蛋白-111，但是由于用于其合成的前体分子的已知性质而具有完全明确的结构和/或组成的水凝胶。因此，完全明确的半合成水凝胶不同于具有未知的结构和/或组成的天然来源的水凝胶，如matrigel。
47.作为前体分子，本发明所述的水凝胶基于含有选自乙烯基砜或丙烯酸脂部分的烯属不饱和基团的多臂peg(聚(乙二醇))。
48.水凝胶(凝胶)是包含亲水聚合物链的网络的基质。生物功能性水凝胶是含有生物粘合(或生物活性)分子和/或与活细胞相互作用以促进细胞存活和所期望的细胞表型的细胞信号转导分子的水凝胶。
49.根据本发明的优选实施方式，所述多臂peg选自具有2至12个臂，优选地4-臂或8-臂的peg，即优选地为4-臂或8-臂peg。所述peg可以具有以下分子量：1,000-1,000,000、1,000-500,000、1,000-250,000、1,000-150,000、1,000-100,000、1,000-50,000、5,000-100,000、5,000-50,000、10,000-100,000、10,000-50,000、20,000-100,000、20,000-80,000、20,000-60,000、20,000-40,000或者40,000-60,000。上述分子量为平均分子量，以da为单位，如通过(例如)如gpc或maldi的方法所确定的。
50.这些peg在本领域中是已知的且可商购的。它们由核心组成，所述核心就4-臂peg
来说可以是季戊四醇，并且就8-臂peg来说可以是三季戊四醇或六甘油：
[0051][0052]
在4-臂peg-vs或8-臂peg-vs中，上述4-臂peg或8-臂peg的末端游离oh在本领域中已知的条件下被转化为乙烯基砜基团，从而在上述化学式r中变为，例如，
[0053][0054]
在4-臂peg-acr或8-臂peg-acr中，上述4-臂peg或8-臂peg的末端游离oh在本领域中已知的条件下被转化为丙烯酸脂基团，从而在上述化学式r中变为，例如，
[0055][0056]
优选地，上述4-臂peg或8-臂peg的所有末端游离oh基团被转化为乙烯基砜或丙烯酸脂部分。
[0057]
乙烯基砜或丙烯酸脂部分是适合于通过迈克尔加成反应交联peg前体分子的烯属不饱和基团。迈克尔加成反应是熟知的化学反应，其包括适合的亲核部分与适合的亲电子部分的反应。已知(例如)丙烯酸脂或乙烯基砜部分是与(例如)作为适合的迈克尔供体(即亲核试剂)的硫醇部分反应的适合的迈克尔受体(即亲电试剂)。
[0058]
对于获得根据本发明的水凝胶，因此将上述peg前体分子与交联剂分子反应，所述交联剂分子含有至少两个，优选地两个能够在迈克尔加成反应中与所述多臂peg的所述烯属不饱和基团反应的亲核基团。
[0059]
交联剂分子是将至少两个上述peg前体分子互相连接的分子。出于该目的，交联剂分子必须具有至少两个，优选地两个上述亲核基团，从而一个亲核基团与第一peg前体分子
反应，且另一个亲核基团与第二peg前体分子反应。
[0060]
尽管将在本发明中使用的交联剂分子包含大于两个上述亲核基团将是大体上有可能的，但是这对于三维网络的形成不是必需的，因为所述peg前体分子中的每一个可以与不止一个所述交联剂分子反应。
[0061]
本发明的水凝胶的重要方面在于以下事实：与其中在(以“悬垂”方式)连接至交联的水凝胶的配体中提供rgd基序的现有技术水凝胶相比，在交联剂分子内提供至少一种rgd基序。本发明所述的方法允许将水凝胶中rgd基序的量提高相当程度。已意外地发现对于本发明的目的，这导致水凝胶特征显著改善。
[0062]
对于本发明所述的水凝胶，水凝胶中大量rgd基序的存在是必需的。对于本发明的水凝胶，不可以确认wo 2017/037295 a1中所描述的结果：如果在水凝胶中提供层粘连蛋白-111配体，则rgd基序将不是必需的。
[0063]
因此，将在本发明中使用的交联剂分子是包含至少一个rgd基序，优选地至少两个rgd基序，更优选地2至8个rgd基序，更优选地2至5个rgd基序的肽，并且特别优选2、3或4个rgd基序。
[0064]
术语rgd或rgd序列是指最小生物活性rgd序列，它是精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(rgd)序列，并且它是足以模拟与纤连蛋白的细胞结合和/或促进锚定依赖性细胞的粘附的最小(最小程度)纤连蛋白来源的氨基酸序列。此外，含有赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列，如rgd是适合于(例如)用于凝胶解离的蛋白酶，如胰蛋白酶样酶的底物。
[0065]
适合的rgd基序的实例为rgd、rgds、rgdsp、rgdspg、rgdspk、rgdtp或rgdspasskp，但是在水凝胶和细胞培养物领域中，可以使用大体上任何已知且成功使用的rgd序列。
[0066]
根据本发明的优选实施方式，所述交联剂分子是包含至少两个rgd基序和至少两个半胱氨酸部分的肽。半胱氨酸是包含硫醇基团，即迈克尔供体部分的氨基酸。
[0067]
根据本发明特别优选的实施方式，所述交联剂分子是ac-gcregrgdspggrgdspgercg-nh2。
[0068]
根据本发明，所述水凝胶中rgd基序的量大于以上所讨论的现有技术水凝胶中的量(在wo 2017/037295 a1，第31页，实施例5中，据讨论将水凝胶中rgd的量提高至0,5mm以上不会导致任何改善；在cruz-acuna凝胶(cruz-acuna 2017)中，一致使用了2mm rgd的量)。根据本发明，水凝胶中rgd基序的量在1至15mm，优选地2.5至5.5mm的范围内，并且特别优选2.5至5mm。
[0069]
通常在水凝胶内存在要培养的细胞类型的情况下进行水凝胶前体分子的交联，以这样的方式通过形成水凝胶基质来包封单个细胞和/或细胞“团”，包括解离的细胞、隐窝和组织碎片，即所述单个细胞和/或细胞“团”在不同的细胞培养微环境中定居。
[0070]
根据本发明特别优选的实施方式，所述水凝胶是
[0071]
—与包含至少两个，优选地两个硫醇基团和至少两个，优选地两个rgd基序的肽交联的4-臂或8-臂peg乙烯基砜的反应产物，或者
[0072]
—包含与包含至少两个，优选地两个硫醇基团和至少两个，优选地两个rgd基序的肽交联的4-臂或8-臂peg乙烯基砜的反应产物，和/或与包含至少两个，优选地两个硫醇基团和至少两个，优选地两个rgd基序的肽交联的4-臂或8-臂peg丙烯酸脂的反应产物。
[0073]
在每个实施方式中，另外，水凝胶中存在生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋
白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型及其生物功能性片段。适合的重组层粘连蛋白同工型的实例是层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211、层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-511或者层粘连蛋白-521，优选层粘连蛋白-511。
[0074]
因此，这些实施方式中的第一个作为前体分子仅使用4-臂或8-臂peg乙烯基砜。根据所述实施方式，所述水凝胶是机械稳定的，即它不经历其剪切模量的任何降低并因此不随时间软化。
[0075]
因此，这些实施方式中的第二个作为前体分子使用4-臂或8-臂peg乙烯基砜和4-臂或8-臂peg丙烯酸脂两者，或者作为另外一种选择，仅使用4-臂或8-臂peg丙烯酸脂。如以下将讨论的，水凝胶中4-臂或8-臂peg丙烯酸脂的存在使得水凝胶在机械上是动态的，即它经历其剪切模量的降低并因此随时间软化。可以通过其中水凝胶中存在的4-臂或8-臂peg乙烯基砜和4-臂或8-臂peg丙烯酸脂的比例来调整水凝胶的软化度。根据本发明特别优选的实施方式，其中水凝胶中存在的4-臂或8-臂peg乙烯基砜和4-臂或8-臂peg丙烯酸脂的比例为5:1至1:5，优选地3:1至1:3，特别优选1:1。
[0076]
已发现对于其对于新近分离或冷冻的肠细胞的扩增和传代的适合性，优选使用机械动态水凝胶，优选地其中水凝胶中存在的4-臂或8-臂peg乙烯基砜和4-臂或8-臂peg丙烯酸脂的比例为1:1的实施方式(与具有另外类似结构的不可降解的凝胶相比，凝胶解离和细胞损失减少更有效)。此外，已意外地发现本发明的水凝胶显示出高度有利的动态降解行为。与来自现有技术(来自gjorevski 2016&2017、wo 2017/036533 a1和wo 2017/037295 al)的水凝胶(该水凝胶在适合于本发明的培养条件下(即在存在本发明的最优选的培养基的情况下)过早降低并因此不适合于细胞传代和扩增)相反，据发现本发明的水凝胶在通常所需要的8-11天的一段时间后仍存在(即未降解)并且特别是然后处于对于细胞传代和进一步细胞扩增最优的条件下。
[0077]
根据本发明的水凝胶还作为主要组分包含至少一种生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型及其生物功能性片段。适合的重组层粘连蛋白同工型的实例是层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211、层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-511或者层粘连蛋白-521。
[0078]
优选地，选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型及其生物功能性片段的至少一种生物功能性配体以0.01g/l-3g/l，更优选地0.05g/l-0.5g/l的浓度存在于所述水凝胶中。
[0079]
层粘连蛋白是具有由α、β和γ链组成的异源三聚体结构的胞外基质糖蛋白家族。例如，“111”标识出具有α1β1γ1的同工型链组成。层粘连蛋白-111与层粘连蛋白-1同义。在细胞粘附中，层粘连蛋白-111及其他同工型是将细胞锚定至胞外基质(ecm)的重要蛋白。通过将细胞表面受体结合至层粘连蛋白α链的一端并将ecm组分结合至层粘连蛋白的另一个区域，在细胞和ecm之间形成键合。α链的球状结构域(g-结构域)是层粘连蛋白-111上允许整合素、糖蛋白、硫酸酯化糖脂和肌营养不良蛋白聚糖结合的区域。除将细胞锚定至ecm外，层粘连蛋白还参与细胞及ecm的其他组分的信号转导。
[0080]
根据一个实施方式，使用天然层粘连蛋白，例如层粘连蛋白-111，优选地小鼠层粘连蛋白-111。在所述情况下，本发明的水凝胶是半合成的，因为天然层粘连蛋白-111是生物来源的。然而，因为天然层粘连蛋白-111，优选地小鼠层粘连蛋白-111的结构已知，因此本
发明的水凝胶是完全明确的并因此是可靠地可重复的。
[0081]
根据另一个实施方式，使用重组层粘连蛋白同工型。适合的重组层粘连蛋白同工型的实例是层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211、层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521，优选地层粘连蛋白-511。在所述情况下，本发明的水凝胶是完全合成的，因为层粘连蛋白同工型也是合成来源的。制备重组层粘连蛋白同工型的方法在本领域中是已知的并且不需要在本文中进行讨论。
[0082]
根据另一个实施方式，使用层粘连蛋白-511的生物功能性片段。层粘连蛋白-511的生物功能性片段是包含提供必要的生物学功能的完整层粘连蛋白-511的一部分的分子。换言之，所述片段必须包括可以与其他分子组分(例如，整合素、细胞表面受体蛋白、ecm组分)相互作用的完整层粘连蛋白-511的部分之一。
[0083]
避免使用天然层粘连蛋白-111的实施方式是优选的，因为它们提供了完全合成的三维基质并因此对于它们在临床应用中的使用的监管审批，具有优势。
[0084]
根据另一个实施方式，除选自天然层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型及其生物功能性片段的生物功能性配体外，本发明的水凝胶可以另外包含至少一种其他生物功能性配体。例如，包含如以上所讨论的至少一种rgd基序的配体可以连接至水凝胶。
[0085]
可以通过本领域中已知的方法，在本文中优选地通过生物功能性配体中半胱氨酸的硫醇基团与水凝胶聚合物中的迈克尔受体基团(乙烯基砜或丙烯酸脂)的反应，将所述至少一种生物功能性配体连接至交联的水凝胶。
[0086]
本发明的另一个方面涉及制备本发明的三维水凝胶的方法。具体地，该方法包括以下步骤：
[0087]
a1)将一种或多种不同的水凝胶前体分子，所述分子是含有选自乙烯基砜和丙烯酸脂部分的烯属不饱和基团的多臂peg，分配至基材上或者分配至基材的不连续的体积中，优选地多孔板中，并添加至所述水凝胶前体分子
[0088]
—一种或多种交联剂分子，其含有至少两个，优选地两个能够在迈克尔加成反应中与所述多臂peg的所述烯属不饱和基团反应的亲核基团，其中所述交联剂分子包含至少一种rgd基序，和
[0089]
—至少一种生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型，优选地，层粘连蛋白-511，及其生物功能性片段；或者
[0090]
a2)将再混悬的未反应的粉末，优选地冻干的未反应的粉末分配至基材上或者分配至基材的不连续的体积中，优选地多孔板中，其中所述未反应的粉末包含
[0091]
—一种或多种不同的水凝胶前体分子，它是含有烯属不饱和基团的多臂peg，所述烯属不饱和基团选自乙烯基砜和丙烯酸脂部分，
[0092]
—一种或多种交联剂分子，其含有至少两个，优选地两个能够在迈克尔加成反应中与所述多臂peg的所述烯属不饱和基团反应的亲核基团，其中所述交联剂分子包含至少一种rgd基序，和
[0093]
—至少一种生物功能性配体，其选自天然层粘连蛋白，例如，层粘连蛋白-111、重组层粘连蛋白同工型，优选地，层粘连蛋白-511，及其生物功能性片段，
[0094]
b)将细胞，优选地来自人活组织检查的新近分离或冷冻的肠细胞添加至基材上或者添加至基材的所述不连续的体积中，或者添加至a1)或a2)的水凝胶前体制剂中，然后添
加至基材上或者添加至基材的所述不连续的体积中；和
[0095]
c)使所述水凝胶前体分子和所述交联剂分子交联以形成水凝胶。
[0096]
根据优选实施方式，将处于未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂再混悬并分配至基材的不连续的体积上或体积中，优选地多孔板中。所述水凝胶前体制剂包含根据本发明的水凝胶的形成所需的所有组分，即上述所讨论的一种或多种不同的水凝胶前体分子、一种或多种交联剂分子和至少一种生物功能性配体，并且优选地还包含细胞，优选地来自人活组织检查的新近分离或冷冻的肠细胞。
[0097]
所述水凝胶前体制剂的所述未反应的粉末的提供在本领域中是已知的，例如，根据wo 2011/131642 a1。
[0098]
根据另一个实施方式，还可以将照此的水凝胶前体制剂(即无需先冷冻干燥然后再混悬)分配在基材的不连续的体积上或体积中。
[0099]
本发明的水凝胶是所谓的软水凝胶，即本发明的三维水凝胶通常具有50至1000pa，优选地200至500pa的剪切模量(硬度)。因此，通过将水凝胶内聚合物(peg)含量和交联剂含量之和固定为优选地1.0-10％w/v来实现所期望的硬度范围。
[0100]
在本发明的一个实施方式中，所述水凝胶是可自降解的。这通过水凝胶前体分子中丙烯酸脂部分的存在得以实现，因为那些部分经历水解(即它们的键在存在水的情况下断裂)，如本领域中已知的(gjorevski 2016,第563页，图4a)。因此，在所述实施方式中，本发明的三维水凝胶具有50至1000pa，优选地200至500pa的初始剪切模量(硬度)，和0-50pa，优选地0pa的最终剪切模量(硬度)。通常在水凝胶形成后7-18天达到所述最终剪切模量(硬度)。
[0101]
水凝胶的剪切模量相当于水凝胶的刚性模量g、弹性模量或弹性。将剪切模量定义为剪切应力与剪切应变之比。可以使用流变仪测量水凝胶的剪切模量。简言之，使厚度1-1.4mm的预制水凝胶圆盘在完全细胞培养基中膨胀至少3h，并随后夹在流变仪的平行板之间。通过在室温下，以恒应变(0.05)模式进行扫频(0.1-10hz)测量，记录凝胶的力学响应。将剪切模量(g')报告为凝胶机械性质的量度。
[0102]
可以通过改变水凝胶中亲水聚合物的含量以及聚合物水凝胶前体的分子量和/或官能性(交联可用的位点数目)来调整3d水凝胶的技术性质。
[0103]
在缓冲液中膨胀至平衡的水凝胶的聚合物(即peg分子)含量和交联剂含量之和可以在0.3至10％w/v的范围内，其中优选1.1至4.0％w/v和1.5至3.5％w/v的范围。
[0104]
不同于cruz-acuna 2017和2018和wo 2018/165565 a1的教导，根据本发明，据发现对于出于本发明的目的的水凝胶的效力，水凝胶中酶促可降解位点的提供不是优选的。因此，本发明的水凝胶优选地对需要特异性酶促可切割肽序列的酶促降解，如mmp或组织蛋白酶降解不敏感，即它们不含有对通过细胞-分泌的蛋白酶的酶促切割敏感的任何部分。
[0105]
通过本发明的水凝胶所提供的微环境提供了从人新近分离或冷冻的细胞或组织形成类器官所需的生物化学、生物物理学和生物复杂性。
[0106]
根据本发明，已发现当与适当培养基组合使用时，本文所描述的水凝胶适合于新近分离或冷冻的肠细胞的扩增和肠类器官的由此形成。
[0107]
已发现为了扩增新近分离或冷冻的肠细胞并且为了由此形成肠类器官，必须使用作为主要组分包含wnt激动剂的培养基，如r-脊椎蛋白1，优选地r-脊椎蛋白1条件培养基，
和wnt3a，优选地wnt3a条件培养基。
[0108]
可以以条件培养基的方式使用r-脊椎蛋白1，例如，稳定转染以分泌r-脊椎蛋白1的细胞的上清液。作为另外一种选择，可以使用重组r-脊椎蛋白1，优选地纯化的重组r-脊椎蛋白1。
[0109]
wnt3a优选地以条件培养基的形式使用，例如，稳定转染以分泌wnt3a的细胞的上清液。然而，已显示α白蛋白(afamin)稳定wnt蛋白(mihara等人,active and water-soluble form of lipidated wnt protein is maintained by a serum glycoprotein afamin/a-albumin elife 2016；5:e11621)。代替条件培养基，还可以使用复合物α白蛋白/重组wnt3a或者允许wnt蛋白稳定的其他类似复合物(holmberg等人,culturing human intestinal stem cells for regenerative applications in the treatment of inflammatory bowel disease.embo mol med 2017 9:558-57)。还可以使用如janda,surrogate wnt agonists that phenocopy canonical wnt/β-catenin signaling,nature 2017年5月11日；545(7653):234
–
237；和wo 2016/040895 a1中所描述的wnt替代蛋白。
[0110]
根据本发明的优选实施方式，所述培养基另外包含fbs(胎牛血清)。
[0111]
任选地，以下组分中的一种或多种可以存在于培养基中：基础培养基组分，如addmem/f12、氨基酸，如谷氨酰胺、蛋白，如转铁蛋白、诺金，例如，重组鼠科诺金和表皮生长因子(egf)，例如，重组鼠科egf、抗生素，如青霉素-链霉素、抗氧化剂，如谷胱甘肽、n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)、催化酶和超氧化物歧化酶、维生素，如生物素、l-卡尼汀、维生素e、维生素a、烟酰胺、激素，如三碘-l-甲状腺原氨酸(t3)、皮质甾酮、黄体酮和胰岛素、脂肪酸，如亚油酸或亚麻酸、糖，如d-半乳糖、抑制剂，如a83-01(alk抑制剂)、sb202190(p38抑制剂)或者y-27632(rock抑制剂)，以及其他组分，如腐胺、乙醇胺hcl、hepes或亚硒酸钠。
[0112]
在下表1中，描述了适合于本发明的培养基(标准培养基(scm)和分化培养基(dm)组合物)的优选实施方式：
[0113]
表1
[0114]
[0115][0116]
适合于本发明的可商购的培养基是intesticult
tm
(得自stemcell technologies)。
[0117]
根据本发明，已发现上述可商购的培养基(intesticult
tm
)可以不与来自现有技术，例如，来自gjorevski 2016&2017、wo 2017/036533 a1和wo 2017/037295 al的水凝胶一起使用。来自现有技术的水凝胶在所述培养基内，通常在一天内过早降解。现有技术的水凝胶可以不在这些培养基中保持对于细胞的生长和扩增足够的一段时间。
[0118]
本发明还涉及用于新近分离或冷冻的肠细胞的生长和扩增的方法，其包括以下步骤：
[0119]
a)使用如本文所描述的部件试剂盒，通过将所述试剂盒的水凝胶与所述新近分离或冷冻的肠细胞在存在所述试剂盒的培养基的情况下培育，类器官从新近分离或冷冻的人肠细胞的从头形成，
[0120]
b)使用如本文所描述的所述部件试剂盒，来自步骤a)的肠类器官的细胞的生长，任选地传代和扩增，
[0121]
c)任选地，在存在诱导细胞分化的改良培养基的情况下，来自步骤a)的类器官的分化，
[0122]
其特征在于，在所述方法中，仅使用完全合成或完全明确的半合成水凝胶。
[0123]
因此，本发明所述的方法完全避免了对于必须使用天然来源的基质，如matrigel的需要。
[0124]
可以通过适合的方法，例如，通过其中获得了1个至几个，例如，5个标准钻取活组织检查的标准乙状结肠镜检查获得要在本发明所述的方法中使用的细胞。
[0125]
可以通过本领域中已知的标准程序，例如，通过螯合作用(使用螯合剂，如edta)分离因此获得的细胞并通过本领域中已知的标准程序，例如，通过胰蛋白酶样酶的暴露制备成单个细胞或细胞“团”，包括解离的细胞、隐窝(crypts)和组织碎片。
[0126]
随后，使用本发明所述的部件试剂盒，即在与以上所定义的培养基组合的本发明的水凝胶中，将因此获得的单个细胞或细胞“团”，包括解离的细胞、隐窝和组织碎片体外扩增几代(例如，2代)，从而获得对于所期望的临床应用足够的细胞(例如，对于再生医学，最少107个细胞)。在细胞扩增期间，因此定期更换培养基，例如，每2至4天。
[0127]
可以通过本领域中已知的标准程序，例如，使用标准结肠镜检查导管将因此获得的类器官植入患者中。
[0128]
因此，在另一个方面，本发明提供了用于肠组织再生的方法，其包括a)在本发明的三维水凝胶中包封和扩增来自人活组织检查的新近分离或冷冻的肠细胞，和b)将所形成的类器官或细胞植入患者中。
[0129]
通过本发明所述的方法，有可能将新近分离或冷冻的肠细胞维持至少10代，所述肠细胞具有与matrigel相当的类器官形成能力并且具有与matrigel中类似数目的扩增细胞。本发明允许符合用于人和/或临床应用中使用的相关法规要求的类器官生产。
实施例
[0130]
现将参考非限制性附图和实施方式更详细地解释本发明。
[0131]
图1显示了使用商品化培养基intesticult
tm
，在根据实施例1的水凝胶(完全明确的半合成水凝胶)、根据实施例2的水凝胶(合成水凝胶)、现有技术凝胶(peg rgd和peg rgd lam)或者matrigel中培养不同培养代(p，在括号中表示天数)的从新近分离自人活组织检查的肠细胞的类器官形成。比例尺＝500μm。
[0132]
图2显示了从新鲜人活组织检查形成并且体外培养5代(p)的人肠类器官的类器官形成效率(以括号中表示的细胞在三维基质中接种后的天数计算)。
[0133]
图3显示了从使用商品化培养基intesticult
tm
，在matrigel中预培养并且在根据实施例1的水凝胶(完全明确的半合成水凝胶)、现有技术凝胶(peg rgd和peg rgd lam)或者matrigel中生长18天的肠细胞的类器官形成。比例尺＝500μm。
[0134]
材料和方法
[0135]
a)细胞从人结肠活组织检查的分离和第一包封
[0136]
在签署患者知情同意书后，从健康对照受试者获得结肠钻取活组织检查。通过螯合作用(使用edta)分离肠细胞并使用tryple表达(thermo fisher scientific)通过酶促解离制备成单个细胞。将来自新近解离的活组织检查的单个细胞在适合体积的基础培养基(dmem/f12、glutamax(1
×
)、pen-strep(青霉素-链霉素)(100u/ml)(thermo fisher scientific)和hepes(10mm)(thermo fisher scientific))中再混悬以获得2500个细胞/μl(5x最终浓度)并准备好用于matrigel、完全明确的半合成(实施例1)或合成(实施例2)水凝胶和现有技术凝胶(peg rgd和peg rgd lam)中的第一包封。
[0137]
现有技术水凝胶peg rgd和peg rgd lam的制备如gjorevski等人,synthesis and characterization of well-defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and or-ganoid culture,nature protocols,12卷,11期,2017,2263-2274中所述。简要地，为了产生水凝胶前体，使用用作激活的转谷氨酰胺酶凝血因子(fxiiia)的底物的存在赖氨酸和谷氨酰胺的肽使8-臂peg-vs和8-臂peg-acr大单体末端-官能化。通过两个肽底物之间fxiiia-介导的ε-(α-谷氨酰基)赖氨酸异肽侧链桥的形成，发生了大单体交联和所产生的凝胶形成。使用相同交联机制，将含有rgd的肽序列缀合至水凝胶主链。对于peg rgd lam，另外将天然小鼠层粘连蛋白-111加入至水凝胶。
[0138]
在实施例1中使用的水凝胶来源于作为前体分子的1:1比例的8-臂peg-vs和8-臂peg-acr、包含两个半胱氨酸部分和两个rgd基序并且非酶促可降解的肽交联剂分子和作为生物功能性分子的天然小鼠层粘连蛋白-111。
[0139]
在实施例2中使用的水凝胶来源于作为前体分子的1:1比例的8-臂peg-vs和8-臂peg-acr、包含两个半胱氨酸部分和两个rgd基序并且非酶促可降解的肽交联剂分子和作为生物功能性分子的重组层粘连蛋白-511。
[0140]
将凝胶和细胞(约10000个细胞)的混合物投入48-孔板中的20μl液滴中并置于37
℃。每隔一分钟反转测定板直至发生胶凝以避免细胞沉降。在20min后，在凝胶液滴上方加入300-330μl补充有rock抑制剂(10mmol/l)的intesticult
tm
培养基。每2-4天更换培养基，并将rock抑制剂在培养基中维持直至第7天。
[0141]
b)类器官的传代和细胞扩增
[0142]
基于细胞生长，通过将包埋在matrigel和本发明的水凝胶中的类器官酶促(tryple)和机械解离成单个细胞，每8-11天实施类器官传代。在凝胶和类器官解离后，对细胞计数并以约10000个细胞每20μl液滴的细胞密度重新接种到本发明的水凝胶或matrigel中。
[0143]
c)使用预建立的类器官的实验
[0144]
对于使用预建立的类器官所实施的实验，将在matrigel中扩增几代的类器官解离并如b)中所述，在现有技术凝胶剂、本发明的水凝胶和matrigel中重新接种。
[0145]
d)类器官形成效率和计划细胞总数
[0146]
通过图像分析评价集落或类器官形成效率(ofe)。将ofe定义为在特定时间点，在每幅图像中所检测到的所形成的类器官和对象总数(即单个细胞和类器官之和)之间的比值。
[0147]
从图1至3可以看出，根据本发明的水凝胶显示出与matrigel的类器官形成效率(ofe)相当的类器官形成效率(ofe)。因此，本发明的水凝胶至少与先前使用的标准matrigel同样适合于类器官形成，但是具有以上所讨论的优势，具体地完全明确并且特别是完全合成的组成，其导致了对于监管审批来说明显的优势。
[0148]
在图1至3中，可以看出在以上a)或b)中所述的条件下，本发明的水凝胶是稳定的并且提供了非常好的类器官形成效率(ofe)，然而来自gjorevski 2017的水凝胶(其中表示为“peg-rgd”和“peg rgd lam”)过早降解并因此不提供任何适合的类器官形成效率(ofe)。