抗岩藻糖基-GM1抗体的制作方法

抗岩藻糖基-gm1抗体
1.本发明涉及能够特异性结合岩藻糖基-gm1(fuc-gm1)的特异性结合成员，例如抗体及其片段。本发明还涉及这种结合成员在医药中的用途以及编码这种结合成员的核酸，涉及用于检测fuc-gm1的方法，以及使用抗fuc-gm1抗体治疗包括癌症在内的各种疾病的方法。
2.fucα1-2galβ1-3galnacβ1-4(neu5acα2-3)galβ1-4glc-神经酰胺(以下称为fuc-gm1糖脂)是一种鞘脂单唾液酸神经节苷脂，它由将该分子锚定在细胞膜中的神经酰胺脂质成分和暴露于细胞表面的碳水化合物成分组成。通过不同的葡萄糖基转移酶(i型跨膜蛋白葡萄糖基神经酰胺合成酶、β-半乳糖基转移酶、gm1合成酶、α1，2-岩藻糖基转移酶)将糖和唾液酸连续添加到神经酰胺(鞘氨醇和脂肪酸)中来进行fuc-gm1糖脂生物合成(kartal yandim,apohan,and baran 2013；tokuda et al.2006)。这些酶中有一些酶的过表达与小细胞肺癌(sclc)有关(martin-satue et al.1998)，进一步表明fuc-gm1参与肿瘤的发展。碳水化合物抗原是癌细胞表面上表达最丰富的抗原(feizi 1985)。在一些肿瘤类型(例如sclc)中，最初对化学治疗的应答令人印象深刻，但是之后迅速发生化疗难治性复发。用新型免疫治疗剂进行干预可成功克服抗药性复发(johnson 1995)。有几种碳水化合物抗原，例如神经节苷脂gd3和gd2，已经显示出作为用单克隆抗体(mabs)进行被动免疫治疗的有效靶标起作用(irie and morton 1986；houghton et al.1985)。在临床试验中也已证明，神经节苷脂抗原是用疫苗进行主动免疫治疗的有效靶标(krug et al.2004；dickler et al.1999；livingston et al.1994)。实际上，已证明来自在用klh偶联的抗原接种后产生对fuc-gm1的抗体滴度的sclc患者的血清与肿瘤细胞特异性结合，并且具有肿瘤特异性补体依赖的细胞毒性(cdc)。与抗fuc-gm1滴度相关的毒性是温和且短暂的，三名局限期sclc患者在18、24、30个月时没有复发(krug et al.2004；dickler et al.1999)。
3.已显示在高百分比(75％-90％)的sclc病例中有fuc-gm1表达(drivsholm et al.1994)，与其他神经节苷脂抗原不同，fuc-gm1在正常组织中极少表达或者不表达(nilsson et al.1984；krug et al.2004；brezicka et al.1989；zhang et al.1997；brezicka et al.2000；fredman et al.1986；brezicka et al.1991；nilsson et al.1986)。在sclc细胞系的培养基中，在异种移植的裸鼠的肿瘤提取物和血清中，以及在患有各期疾病的sclc患者的血清中，已经证明了fuc-gm1的存在((vangsted et al.1991；vangsted et al.1994)。这些报道提供了fuc-gm1是可被免疫治疗剂靶向的高度特异性肿瘤抗原的令人信服的证据。
4.因此，需要识别肺癌抗原、主要靶向糖鞘脂(如fuc-gm1糖脂)的有效药剂，以及使用这种药剂的方法。结合fuc-gm1的mab(“f12”)在本领域是已知的(brezicka et al.1989；brezicka et al.2000)。此外，wo2007/067992和wo2016/049256a1公开了抗fc-gm1抗体。
5.在第一方面，本发明提供能够与fucα1-2galβ1-3galnacβ1-4(neu5acα2-3)galβ1-4glc-神经酰胺(fuc-gm1糖脂)特异性结合但不能与fucα1-2galβ1-3galnacβ1-4(neu5acα2-3)galβ1-4glc(游离糖)结合的分离的特异性结合成员。
6.本发明的分离的结合成员与fuc-gm1糖脂结合，但不与游离糖结合。如本文实施例
中所详细描述的，最初mabs是针对用免疫佐剂配制于脂质体中的fuc-gm1糖脂而引起的，以确保抗体识别细胞膜内的fuc-gm1。然而，这不能诱导高亲和力抗体应答。为了提高fuc-gm1糖脂的免疫原性，将其与t细胞载体人血清白蛋白偶联。这通过利用臭氧分解除去脂质链中的一个以及与hsa的化学偶联来实现，从而为亲和力成熟提供t细胞帮助。利用fuc-gm1-hsa进行进一步免疫。出乎意料地，这产生了与fuc-gm1糖脂结合但不与游离糖结合的igg抗体。对于为进行抗体结合而存在的脂质链的这种要求是非常令人惊讶的，因为抗体一般不与疏水性部分(如脂质)结合。有趣的是，尽管它们是针对fuc-hs-hsa而引起的，但它们与fuc-gm1糖脂以及与肿瘤细胞结合的亲和力高1000至10,000倍。本文所示的抗fuc-gm1单抗f12也与gm1结合，而本发明的结合成员不与gm1交叉反应。
7.本发明人提供了展现出强效体内抗肿瘤活性的特异性结合成员。本发明的特异性结合成员经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和cdc对人sclc细胞显示出强效的免疫介导的体外细胞毒性活性。通过利用细胞/聚糖偶联物免疫，本发明人生产出了抗fuc-gm1糖脂mab。这些mabs的例子是本文称为“fl133.63”(图2a和图2d)和“fl133.67”(图2b和图2e)的igg3鼠mabs、igg1 mab“fl134.33”(图2c和图2f)、和higg1嵌合抗体“ch134”(图3)。
8.本发明的特异性结合成员具有非常严格的正态分布，因为正常组织不表达含2-羟基脂肪酸的脂质。然而，它们与sclc强结合。特异性反映在fl133.63/fl133.67/fl134.33/ch134.33可变重链区和可变轻链区的不同序列上。本发明的特异性结合成员可附着于在含2-羟基脂肪酸的脂质上表达的sclc特异性神经节苷脂。
9.本发明的特异性结合成员优选包含一个或多个结合结构域，该一个或多个结合结构域选自具有实质上作为图2a、2b、2c或3a的残基27至38(cdrh1)、54至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的结合结构域。该特异性结合成员可以包含结合结构域，该结合结构域含有实质上作为图2a、2b、2c或3a的氨基酸序列的残基105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列。这种特异性结合成员可以额外包含具有实质上作为图2a、2b、2c和3a中所示氨基酸序列的残基27至38(cdrh1)和56至65(cdrh2)列出的氨基酸序列的结合结构域中的一个或两个，优选两个。优选的特异性结合成员包含：
10.(a)图2a的cdrh1、cdrh2和cdrh3；
11.(b)图2b的cdrh1、cdrh2和cdrh3；
12.(c)图2c的cdrh1、cdrh2和cdrh3；或
13.(d)图3a的cdrh1、cdrh2和cdrh3。
14.该结合成员可以包含实质上作为图2a、2b、2c或3a的1至127(vh)列出的氨基酸序列。
15.该特异性结合成员可包含一个或多个结合结构域，该一个或多个结合结构域选自具有图2a、2e、2f或3b的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)的氨基酸序列的结合结构域。该结合成员可以包含结合结构域，该结合结构域具有实质上作为图2a、2e、2f或3b的氨基酸序列的残基105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列。这种特异性结合成员可以额外包含具有实质上作为图2a、2e、2f或3b中所示氨基酸序列的残基27至38(cdrl1)和56至65(cdrl2)列出的氨基酸序列的结合结构域中的一个或两个，优选两个。优选的特异性结合成员包含：
16.(a)图2d的cdrh1、cdrh2和cdrh3；
17.(b)图2e的cdrh1、cdrh2和cdrh3；
18.(c)图2f的cdrh1、cdrh2和cdrh3；或
19.(d)图3b的cdrh1、cdrh2和cdrh3。
20.包含具有相同或不同序列的多个结合结构域的特异性结合成员或其组合包括在本发明中。因此，每个结合结构域可以由人抗体框架携带。例如，一个或多个结合结构域可以替代整个人抗体或其可变区的互补决定区(cdr)。
21.本发明的一个分离的特异性结合成员包含实质上作为图2a、2e、2f或3b所示氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列。
22.本发明的分离的特异性结合成员可包含具有实质上作为图2a、2b、2c或3a的残基27至38(cdrh1)、56至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域和具有实质上作为图2d、2e、2f或3b的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域的组合。本发明的优选的分离的特异性结合成员包含：
23.(a)具有实质上作为图2a的残基27至38(cdrh1)、56至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域和及具有实质上作为图2d的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域的组合；
24.(b)具有实质上作为图2b的残基27至38(cdrh1)、56至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域和具有实质上作为图2e的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域的组合；
25.(c)具有实质上作为图2c的残基27至38(cdrh1)、56至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域和具有实质上作为图2f的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域的组合；或
26.(d)具有实质上作为图3a的残基27至38(cdrh1)、56至65(cdrh2)或105至116(cdrh3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域和具有实质上作为图3b的残基27至38(cdrl1)、56至65(cdrl2)或105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的一个或多个(优选所有)结合结构域的组合。
27.该结合成员可包含实质上作为图2a、2b、2c或3a的氨基酸序列的残基1至127(vh)列出的氨基酸序列，以及实质上作为图2d、2e、2f或3b的氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列。优选地，该结合成员包含：
28.(a)实质上作为图2a的氨基酸序列的残基1至127(vh)列出的氨基酸序列，以及实质上作为图2d的氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列；
29.(b)实质上作为图2b的氨基酸序列的残基1至127(vh)列出的氨基酸序列，以及实质上作为图2e的氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列；
30.(c)实质上作为图2c的氨基酸序列的残基1至127(vh)列出的氨基酸序列，以及实质上作为图2f的氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列；或
31.(d)实质上作为图3a的氨基酸序列的残基1至127(vh)列出的氨基酸序列，以及实
质上作为图3b的氨基酸序列的残基1至124(vl)列出的氨基酸序列。
32.一旦分离出具有本文中描述的期望特性的单个原型mab，例如fuc-gm1糖脂mab，则通过使用现有技术已知的方法来生成具有类似特性的其他mabs是很简单的。例如，可使用jespers et al.,1994的方法(jespers et al.1994)来指导选择具有相同表位且因此与原型mab具有相似特性的mabs。使用噬菌体展示，首先将原型抗体的重链与(优选人)轻链的库配对以选择结合神经节苷脂的mab，然后将新的轻链与(优选人)重链的库配对以选择与原型mab具有相同表位的结合神经节苷脂的(优选人)mab。
33.该特异性结合成员可以是抗体或抗体片段fab、(fab’)2、scfv、fv、dab、fd或双体抗体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是单克隆抗体(mab)。本发明的抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体或镶嵌化(veneered)抗体，或者可以是任何物种的非人抗体。
34.鼠抗体或嵌合抗体对患者中带来增加的不良抗鼠抗体(hama)反应的风险(schroff et al.1985；azinovic et al.2006；miotti et al.1999；d'arcy and mannik 2001)。因此，大多数批准的治疗性mabs是人源化抗体或全人igg抗体。
35.本发明的特异性结合成员可包含具有实质上如图2a所示的氨基酸序列的重链和具有实质上如图2d所示的氨基酸序列的轻链。
36.本发明的特异性结合成员可包含具有实质上如图2b所示的氨基酸序列的重链和具有实质上如图2e所示的氨基酸序列的轻链。
37.本发明的特异性结合成员可包含具有实质上如图2c所示的氨基酸序列的重链和具有实质上如图2f所示的氨基酸序列的轻链。
38.本发明的特异性结合成员可包含具有实质上如图3a所示的氨基酸序列的重链和具有实质上如图3b所示的氨基酸序列的轻链。
39.本发明还提供一种与抗体竞争结合含有fuc-gm1的神经节苷脂的结合成员，所述抗体包括具有图2a、2b、2c或3a的残基1至127的氨基酸序列的vh链和具有图2d、2e、2f或3b的残基1至124的氨基酸序列的vl链，优选包括图2a的vh链和图2d的vl链的组合、图2b的vh链和图2e的vl链的组合、图2c的vh链和图2f的vl链的组合、图3a的vh链和图3b的vl链的组合。
40.能够与fuc-gm1糖脂特异性结合但不能与游离糖(fucα1-2galβ1-3galnacβ1-4(neu5acα2-3)galβ1-4glc)结合、并且在vh和/或vl结构域中与图2或图3的vh或vl结构域至少90％、至少95％或至少99％相同的特异性结合成员包括在本发明中。能够与fuc-gm1特异性结合、并且与图2或图3的重链和/或轻链至少90％、至少95％或至少99％相同的特异性结合成员包括在本发明中。优选地，这种抗体与图2或图3的序列的不同之处在于少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入。
41.本发明的特异性结合成员可携带可检测的或功能性标记物。
42.在其它方面，本发明提供编码本发明的特异性结合成员的分离核酸以及制备本发明的特异性结合成员的方法，该方法包括在条件下表达所述核酸以引起所述结合成员的表达以及回收所述结合成员。编码能够与fuc-gm1糖脂特异性结合但不能与游离糖(fucα1-2galβ1-3galnacβ1-4(neu5acα2-3)galβ1-4glc)结合、并且与本文提供的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的特异性结合成员的分离的核酸包括在本发明中。
43.本发明的特异性结合成员可以用于治疗或诊断人体或动物体的方法，例如治疗患
者(优选人)的肿瘤的方法，该方法包括向所述患者给予有效量的本发明的特异性结合成员。本发明还提供本发明的特异性结合成员在医药中的用途，优选在治疗肿瘤中的用途，以及本发明的特异性结合成员在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。肿瘤可以是小细胞肺癌(sclc)。
44.本文公开了与本发明的特异性结合成员结合的抗原。优选地，可以提供能够由本发明的特异性结合成员结合(优选特异性结合)的fuc-gm1糖脂。fuc-gm1糖脂可以以分离的形式提供，并且可以在筛选中用于进一步开发针对该fuc-gm1糖脂特异性结合成员。例如，可以对化合物文库进行与fuc-gm1特异性结合的文库成员的筛选。fuc-gm1可以在脂质主链上。
45.在另一方面，本发明提供本发明第一方面的分离的特异性结合成员，该分离的特异性结合成员用于sclc的诊断或预后。
46.本发明还提供一种用于诊断癌症的方法，该方法包括使用本发明的特异性结合成员来检测来自个体的样本中含有fuc-gm1的gsl。在该诊断方法中，由结合成员检测到的神经节苷脂的图案可用于对个体进行治疗选项分层。
47.下面将进一步详细描述本发明的这些和其它方面。
48.如本文所使用的，“特异性结合成员”是一对彼此具有结合特异性的分子的成员。特异性结合对的成员可以是天然来源或全部或部分地合成产生。该对分子的一个成员在其表面上具有区域，该区域可以是突起或空腔，该区域与该对分子的另一个成员的特定空间和极性组织特异性结合，并因此与其互补。因此，该对的成员具有彼此特异性结合的特性。特异性结合对的类型的例子有抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明一般涉及抗原-抗体型反应，尽管它也涉及与本文定义的抗原结合的小分子。
49.如本文所用，“治疗”包括能够使人或非人动物、优选哺乳动物受益的任何方案。治疗可以针对现有病情，或者可以是预防性的(预防性治疗)。
50.如本文所用，“肿瘤”是组织的异常生长。它可以是局部的(良性的)或侵袭附近组织(恶性的)或远处组织(转移的)。肿瘤包括引起癌症并包括sclc的肿瘤生长、以及癌组织或细胞系。
51.如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论是天然的还是部分或全部地合成产生的。该术语还涵盖具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，该结合结构域是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源。这些抗体可来自天然来源，或者它们可以部分或全部地合成产生。本发明的抗体的例子有：免疫球蛋白同种型(例如，igg、ige、igm、igd和iga)及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，如fab、scfv、fv、dab、fd；以及双体抗体。优选的同种型为igg1和igg3。抗体可以是多克隆的或单克隆的。单克隆抗体可以被称为“mab”。
52.可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组dna技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。这种技术可能涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或cdr的dna引入到不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区中。例如参见ep-a-184187、gb 2188638a或ep-a-239400。杂交瘤或其他产生抗体的细胞可能会经历基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变所产生的抗体的结合特异性。
53.由于抗体可通过多种方式进行修饰，因此术语“抗体”应被解释为涵盖具备带有所
需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段、抗体的衍生物、功能等同物和同源物、人源化抗体，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是全部或部分地合成的。因此包括与另一多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。在ep-a-0120694和ep-a-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。人源化抗体可以是具有非人(例如鼠)抗体的可变区和人抗体的恒定区的修饰抗体。例如，专利号为5225539的美国专利中描述了用于制备人源化抗体的方法。
54.已经表明，完整抗体的片段能够执行结合抗原的功能。结合片段的例子有：(i)由vl、vh、cl和ch1结构域组成的fab片段；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)由单抗体的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)由vh结构域组成的dab片段(ward et al.1989)；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab')2片段：包含两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽接头连接，该肽接头使两个结构域缔合形成抗原结合位点(bird et al.1988；huston et al.1988)；(viii)双特异性单链fv二聚体(pct/us92/09965)；以及(ix)“双体抗体”：通过基因融合构建的多价或多特异性片段(wo94/13804；(holliger,prospero,and winter 1993))。
55.双体抗体是多肽的多聚体，每个多肽包括包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，所述两个结构域彼此连接(例如通过肽接头)，但不能相互缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过多聚体内一种多肽的第一结构域与多聚体内另一种多肽的第二结构域的缔合而形成(wo94/13804)。
56.在使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规双特异性抗体，其可以以各种方式制造(holliger and winter 1993)，例如，通过化学制备或由杂交成的杂交瘤制备，或者可以是上述任何双特异性抗体片段。可能优选使用scfv二聚体或双体抗体而不是完整抗体。双体抗体和scfv可以在没有fc区的情况下仅使用可变结构域构建，潜在地降低了抗独特型反应的效果。其它形式的双特异性抗体包括(traunecker,lanzavecchia,and karjalainen 1991)中描述的单链“janusins”。
57.与双特异性完整抗体相反，双特异性双体抗体也可能是有用的，因为它们可以容易地在e.coli中构建和表达。使用噬菌体展示技术(wo94/13804)从文库中可容易地选择具有适当结合特异性的双体抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。如果双体抗体的一个臂要保持恒定，例如，具有针对抗原x的特异性，则可以以改变另一个臂来建立文库，并选择具有适当特异性的抗体。
[0058]“结合结构域”是包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域的特异性结合成员的部分。在结合成员是抗体或其抗原结合片段的情况下，结合结构域可以是cdr。当抗原很大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。
[0059]“特异性”通常用于指特异性结合对的一个成员对与其特异性结合配偶体以外的分子不会表现出任何显著结合的情况，并且例如与任何其他分子具有小于约30％，优选20％、10％或1％的交叉反应性。该术语也适用于例如抗原结合结构域对由许多抗原携带的特定表位具有特异性的情况，在这种情况下，携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够与携带该表位的各种抗原结合。
[0060]
根据本发明，“分离的”是指本发明的特异性结合成员或编码这种结合成员的核酸将优选所处的状态。成员和核酸一般将不含或实质上不含与它们天然相关的物质，例如在它们的天然环境或制备(当这种制备是通过体外或体内实施的重组dna技术进行时)它们的环境(例如细胞培养基)中发现的其他多肽或核酸。特异性结合成员和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，但仍出于实际目的进行分离—例如，如果用于涂覆微量滴定板以用于免疫测定，则成员通常将会与明胶或其他载体混合，或者在用于诊断或治疗时与药学上可接受的载体或稀释剂混合。特异性结合成员可以是天然糖基化的或通过异源真核细胞系统糖基化的，或者它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达产生)未糖基化的。
[0061]“实质上如所列出的”意指本发明的氨基酸序列与所指的氨基酸序列相同或高度同源。通过“高度同源”，可设想序列中可以进行1至5、1至4、1至3、2或1个取代。
[0062]
本发明在其范围内还包括具有图2或图3所列出的氨基酸序列的多肽，以及具有图2或图3所列出的核酸序列和与其具有实质同一性(例如，与其具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％的同一性)的序列的多核苷酸。两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比一般通过以下方式确定：将序列以最优化比较目的(例如，可以在第一序列中引入空位来与第二序列进行最佳比对)进行比对，并比较对应位点上的氨基酸残基或核苷酸。“最佳比对”是获得最高百分比同一性的两条序列之间的比对。百分比同一性是通过比较序列中的相同氨基酸残基或核苷酸的数量来确定的(即，同一性％＝相同位点数/位点总数
×
100)。
[0063]
可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成两条序列之间的百分比同一性的确定。用于比较两条序列的数学算法的一个例子是1990年karlin和altschul的算法(karlin and altschul 1990)，1993年karlin和altschul进行了改进(karlin and altschul 1993)。1990年altschul等人的nblast和xblast程序(altschul et al.1990)合并了该算法。可以用nblast程序(得分＝100,字长＝12)来执行blast核苷酸检索，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用xblast程序(得分＝50,字长＝3)来执行blast蛋白质检索，以得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的空位比对，可以使用gapped blast，如1997年altschul等人所述(altschul et al.1997)。替代地，可以使用psi-blast来执行迭代检索，检测分子之间的远距离关系(id.)。当使用blast、gapped blast和psi-blast程序时，可以使用各程序(例如,xblast和nblast)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于序列比较的数学算法的另一例子是1989年myers和miller的算法(myers and miller 1989)。作为gcg序列比对软件包的一部分的align程序(版本2.0)合并了这种算法。本领域所知的用于序列分析的其他算法包括如torellis和robotti(1994)所述的advance和adam，以及如pearson和lipman(1988)所述的fasta。在fasta中，ktup是设置检索的灵敏度和速度的控制选项。
[0064]
本发明的分离的特异性结合成员能够结合特异性糖鞘脂(gsl)，但不能结合糖鞘脂的游离糖。非常不寻常的是，本发明的结合成员需要存在脂质才能结合。gsl是高度多样化的分子群，在结构上由附着到神经酰胺脂质部分(通过酰胺键与脂肪酸连接的鞘氨醇)的聚糖组成。神经酰胺结构在长度和饱和度上有所不同，这增加了gsl种类的多样性，但多样性的主要来源来自聚糖头部基团。与只能线性结合的氨基酸或核酸相比，碳水化合物可以在多个点彼此结合。包含实质上作为图2a、2b、2c或3a的残基105至116(cdrh3)和图2d、2e、
2f或3b的残基105至113(cdrl3)列出的氨基酸序列的类转换和亲和成熟抗体靶向结构域可以携带在允许这些区域与fuc-gm1神经节苷脂结合的结构中。
[0065]
用于携带本发明的结合结构域的结构一般是抗体重链或轻链序列或其实质部分，其中结合结构域位于由重排免疫球蛋白基因编码的与天然存在的vh和vl抗体可变结构域的cdr3区对应的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可通过参考http://www.imgt.org/来确定。实质上作为图2a、2b、2c或3a的残基105至116列出的氨基酸序列可以作为人重链可变结构域中的cdr3或其实质部分携带，并且实质上作为图2d、2e、2f或3b的残基105至113列出的氨基酸序列可以作为人轻链可变结构域中的cdr3或其实质部分携带。
[0066]
可变结构域可以源自任何种系或重排的人可变结构域，或者可以是基于已知的人可变结构域的共有序列的合成可变结构域。本发明的cdr3衍生序列可以使用重组技术引入到缺少cdr3区的可变结构域的库中。例如，1992年marks等人((marks et al.1992)描述了产生抗体可变结构域库的方法，其中指向可变结构域区域的5'端或其附近的共有引物与人vh基因的第三框架区的共有引物结合使用，以提供缺少cdr3的vh可变结构域库。1992年mark等人(marks et al.1992)还描述了如何将该库与特定抗体的cdr3组合。使用类似的技术，本发明的cdr3衍生的序列可以与缺少cdr3的vh或vl结构域的库打乱，打乱的完整vh或vl结构域与同源vl或vh结构域组合以提供本发明的特异性结合成员。然后可以在合适的宿主系统(例如，wo92/01047的噬菌体展示系统)中展示该库，以便可以选择合适的特异性结合成员。库可以由104个以上单独成员(例如106至108或10
10
个成员)中的任何成员组成。
[0067]
1994年stemmer(stemmer 1994)也公开了类似的打乱或组合技术，他描述了与β-内酰胺酶基因有关的技术，但注意到该方法可用于产生抗体。另一个替代方案是使用例如fuc-gm1 vh或vl基因的随机诱变产生携带本发明的cdr3衍生序列的新vh或vl区，以在整个可变结构域内产生突变。1992年gram等人(gram et al.1992)描述了这种技术，其使用了容错pcr。
[0068]
可以使用的另一种方法是使vh或vl基因的cdr区直接诱变。1994年barbas等人(barbas et al.1994)和1996年schier等人(schier et al.1996)公开了这种技术。免疫球蛋白可变结构域的实质部分一般将包含至少三个cdr区以及它们的介入框架区。该部分还可以包括第一框架区和第四框架区之一或两者的至少约50％，该50％是第一框架区的c末端50％和第四框架区的n末端50％。可变结构域的实质部分的n末端或c末端的额外的残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区相关联的残基。例如，通过重组dna技术进行本发明的特异性结合成员的构建可能导致引入由接头编码的n末端或c末端残基，所述接头是为了便于克隆或其他操作步骤而引入的，包括引入接头以连接本发明的可变结构域和其他蛋白序列，其他蛋白序列包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双体抗体产生时)或蛋白质标记物，如下文更详细讨论的。
[0069]
本发明提供包含一对结合结构域的特异性结合成员，该对结合结构域基于实质上如图2和图3中所列出的vl和vh区的氨基酸序列，即，图2a、2b、2c或3a的氨基酸1至127(vh)和图2d、2e、2f或3b的氨基酸1至124(vl)。基于这些序列中的任一个的单个结合结构域形成了本发明的其他方面。在结合结构域基于实质上如图2a、2b、2c或3a所列出的vh区的氨基酸序列的情况下，这种结合结构域可以用作靶向剂，因为已知免疫球蛋白vh结构域能够以特异性方式结合靶抗原。在任一单链特异性结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能
够形成双结构域特异性结合成员的互补结构域，双结构域特异性结合成员具有与本文公开的fl133/4抗体一样好或相等的体内特性。
[0070]
这可以通过噬菌体展示筛选法，使用如在wo92/01047中公开的所谓的分层双重组合方法(hierarchical dual combinatorial approach)来实现，其中使用了包含h或l链克隆的单个菌落来感染编码另一条链(l或h)的完整克隆库，并且根据噬菌体展示技术(例如在该参考文献中描述的)选择得到的双链特异性结合成员。1992年marks等人(marks et al.1992)也公开了这种技术。
[0071]
本发明的特异性结合成员还可以包含抗体恒定区或其部分。例如，基于图2d、2e、2f或3b所示的vl区的特异性结合成员可以在其c末端附着到抗体轻链恒定结构域。类似地，基于图2a、2b、2c或3a所示的vh区的特异性结合成员可以在其c末端附着至源自任何抗体同种型(例如igg、iga、ige和igm)和任何同种型亚类(特别是igg1、igg2和igg4)的免疫球蛋白重链的全部或部分。
[0072]
本发明的特异性结合成员可用于诊断和治疗人或动物对象的肿瘤的方法中。
[0073]
当用于诊断时，本发明的特异性结合成员可以用可检测标记物(例如，放射性标记物，如
131
i或
99
tc)来标记，这些标记物可以使用抗体成像领域已知的常规化学方法附着到本发明的特异性结合成员上。标记物还包括酶标记物，例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分，例如生物素，其可以通过与特异性同源可检测部分(例如，标记的亲和素)结合来进行检测。
[0074]
本发明的特异性结合成员可以用功能性标记物来标记。功能性标记物包括设计成靶向于癌症部位以引起其破坏的物质。这种功能性标记物包括毒素(例如蓖麻毒蛋白)和酶(例如细菌羧肽酶或硝基还原酶)，它们能够将前药转化为活性药物。此外，特异性结合成分可以附着到化学治疗剂或细胞毒性剂(例如美登素(dm1和dm4)、布地奈德(onides)、瑞奥西汀(auristatins)、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocamycin)、阿霉素(doxorubicin))或放射性标记物(例如
90
y或
131
i)或以其他方式与其缔合。
[0075]
此外，本发明的特异性结合成员可以单独给药或结合其他治疗而同时给药或按顺序给药，这取决于所治疗的病症。因此，本发明进一步提供含有本发明的特异性结合成员和活性剂的产品作为用于同时、单独或按顺序用于治疗肿瘤的组合制剂。活性剂可以包括化学治疗剂或细胞毒性剂，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素c、奥沙利铂(oxaliplatin)和他莫昔芬(tamoxifen)，其可以与本发明的结合成员协同作用。其他活性剂可以包括合适剂量的镇痛药，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片剂(例如吗啡)，或止吐药。
[0076]
虽然不希望被理论束缚，本发明的结合成员与活性剂协同以增强肿瘤杀伤的能力可能不是由于免疫效应机制，而可能是结合成员结合到细胞表面结合的fuc-gm1神经节苷脂的直接结果。涉及免疫检查点分子的抗体的癌症免疫治疗与不同免疫肿瘤学治疗方式组合后对各种恶性肿瘤显示出有效性。
[0077]
本发明的特异性结合成员将通常以药物组合物的形式给药，该药物组合物除了该特异性结合成员外还可以包含至少一种成分。除了活性成分之外，该药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他物质。这种物质应该是无毒的，并且应该不会干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性
质将取决于给药途径，给药途径可以是口服或注射(例如静脉注射)。预期注射将会是组合物的治疗给药的主要途径，但也可以通过导管或其他外科手术管来递送。一些合适的给药途径包括静脉内、皮下、腹膜内和肌肉内给药。液体制剂可在由粉末制剂复溶后使用。
[0078]
对于静脉内注射或在病痛部位注射，活性成分将处于无热原、ph合适、等渗且稳定的肠胃外可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗溶媒(例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸钠林格氏注射液)制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0079]
用于口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋葡萄糖或其他糖类溶液、或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当制剂为液体时，其可以是例如ph 6.8-7.6的含有非磷酸缓冲液的生理盐水溶液，或冻干粉末。
[0080]
该组合物也可以通过微球、脂质体、其他微粒递送系统或置于某些组织(包括血液)中的缓释制剂来给药。缓释载体的合适例子包括共享制品形式(例如栓剂或微胶囊)的半渗透聚合物基质。可植入或微胶囊缓释基质包括聚丙交酯(专利号为3,773,919的美国专利；ep-a-0058481)，l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman et al.1983)，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)。含有多肽的脂质体通过公知的方法制备：de 3,218,121a；(eppstein et al.1985)；(hwang,luk,and beaumier 1980)；ep-a-0052522；ep-a-0036676；ep-a-0088046；ep-a-0143949；ep-a-0142541；jp-a-83-11808；专利号为4,485,045和4,544,545的美国专利。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单层型，其中脂质含量约大于胆固醇的30mol％，所选比例针对多肽泄漏的最佳速率进行调节。所述组合物可以在肿瘤部位或其他期望部位以局部方式进行给药，或可以以所述组合物靶向肿瘤或其他细胞的方式来递送。
[0081]
该组合物优选以“治疗有效量”给药至个体，这足以显示对个体的益处。实际给药量、给药的速率和时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量的决策等，是全科医师和其他科医生的职责范围，且一般需要考虑到所治疗的病症、个体患者的情况、递送位点、给药方法和医师所知的其他因素。本发明的组合物尤其是涉及现有肿瘤(特别是癌症)的治疗，以及对这些病症在初期治疗或手术后的复发的预防。上述技术和方案的例子可以参见雷明登氏药学大全，第16版，1980年(remington1980)。
[0082]
最佳剂量可由医师基于许多参数来确定，这些参数包括例如年龄、性别、体重、所治疗病症的严重程度、给药的活性成分以及给药途径。一般来说，期望允许受体饱和的多肽和抗体的血清浓度。超过大约0.1nm的浓度通常是足够的。例如，100mg/m2的抗体剂量提供大约20nm的血清浓度，持续大约八天。
[0083]
作为粗略的指导，每周可以给予的抗体剂量为10mg/m
2-300mg/m2。应该以更频繁的间隔使用等效剂量的抗体片段，以使血清水平保持在超过使fuc-gm1碳水化合物饱和的浓度。组合物的剂量将取决于结合成员的特性，例如，其结合活性和体内血浆半衰期、制剂中多肽的浓度、给药途径、给药部位和剂量、所涉及患者的临床耐受性、患者遭受的病理状况等，如完全在医师的技术范围内的。例如，优选每名患者每次给药300μg剂量的抗体，尽管剂量可以在每剂约10μg至6mg的范围内。在一系列顺序接种期间使用不同的剂量；医师可能会
实施初始接种，然后使用相对较小剂量的抗体进行加强。
[0084]
本发明还涉及用于增强针对癌症的保护性免疫应答的优化的免疫方案。
[0085]
本发明的结合成员可以全部或部分通过化学合成来生成。该结合分子可根据得到确认的标准液体法(或优选地固相肽合成法)容易地制备，所述方法的一般性描述可广泛获得(例如参见j.m.stewart and j.d.young,1984(stewart and young 1984)、m.bodanzsky and a.bodanzsky,1984(bodanzsky and bodanzsky 1984))；或者，结合分子可以在溶液中通过液相法或通过固相法、液相法和溶液化学法的任意组合来制备，例如首先完成各个肽部分，然后如果需要和合适，在去除存在的任何保护基团后，通过其各自的碳酸或磺酸或反应性衍生物的反应来引入残基x。
[0086]
另一种产生根据本发明的结合成员的便利方法是，通过在表达体系中使用核酸来表达编码该结合成员的核酸。
[0087]
本发明还提供编码本发明的特异性结合成员的分离的核酸。核酸包括dna和rna。在一个优选的方面中，本发明提供了编码如上定义的本发明的特异性结合成员的核酸。这种核酸的例子示于图2和图3中。本领域技术人员能够确定对这种核酸的取代、缺失和/或添加，这仍将提供本发明的特异性结合成员。
[0088]
本发明还提供含有至少一种上述核酸的质粒、载体、转录体或表达盒形式的构建体。本发明还提供包含一个或更多个上述构建体的重组宿主细胞。如上所述，编码本发明的特异性结合成员的核酸构成本发明的一个方面；产生该特异性结合成员的方法也构成本发明的一个方面，该方法包括编码核酸的表达。通过在适当条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞，可以便利地实现表达。通过表达来产生后，可以使用任何合适的技术来分离和/或纯化特异性结合成员，然后适当使用。
[0089]
用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的体系是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、hela细胞、幼仓鼠肾细胞、nso小鼠黑色素瘤细胞和许多其他细胞。常见的优选细菌宿主为e.coli。抗体和抗体片段在原核细胞(例如e.coli)中的表达为在本领域得到确认的。综述参见pl
ü
ckthun,1991(pluckthun 1991)。本领域技术人员还可选择使用在真核细胞培养物中的表达来生成特异性结合成员，近期综述参见例如reff,1993(reff 1993)，trill et al.,1995(trill,shatzman,and ganguly 1995)。
[0090]
可以选择或构建含有适当调控序列的合适载体，该调控序列包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。载体视情况可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更多细节参见例如sambrook et al.,1989(sambrook 1989)。ausubel et al.,1992(ausubel 1992)中详细描述了核酸操作(例如核酸构建体的制备、dna诱变、测序、引入细胞和基因表达)以及蛋白分析的许多已知技术和方案。
[0091]
因此，本发明的又一方面提供了一种含有本文所公开的核酸的宿主细胞。在再一个方面中，提供一种包括将这种核酸引入宿主细胞的方法。可以使用任何可用技术进行引入。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染、以及使用反转录病毒或其他病毒(例如痘苗病毒，或对昆虫细胞而言，使用杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入之后可以引发或允许该核酸的表达，例如通过在表达该基因的条件下培养宿主细胞。
[0092]
本发明的核酸可以整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以根据标准技术，通过包含促进与该基因组重组的序列来促进整合。
[0093]
本发明还提供一种方法，该方法包括在表达体系中使用上述构建体以表达如上所述的特异性结合成员或多肽。
[0094]
本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改后用于每个其他方面。本文提到的现有技术文献在法律允许的最大范围内并入。
[0095]
本文公开的fl133/4mabs通过adcc和cdc表现出强效的体外细胞毒性活性。
[0096]
现在将在以下非限制性实施例和附图中描述本发明，其中：
[0097]
图1：fuc-gm1糖脂的生物合成途径。cer为神经酰胺；fuc为岩藻糖；fucgm1为岩藻糖基-gm1；gal为半乳糖；galnac为n-乙酰半乳糖胺；glc为葡萄糖；laccer为乳糖基神经酰胺；sa为唾液酸。
[0098]
图2a：小鼠fl133.63 igg3重链可变结构域的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。图2b：小鼠fl133.67 igg3重链可变结构域的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。图2c：小鼠fl134.33 igg1重链的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。图2d：小鼠fl133.63 k链的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。图2e：小鼠fl133.67 k链的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。图2f：小鼠fl134.33 k链的氨基酸和核苷酸序列。编号是指用于抗体序列编号的标准化imgt系统(lefranc et al.2009)。
[0099]
图3a：与人igg1重链恒定区嵌合的小鼠fl134.33重链可变区的氨基酸和核苷酸序列。图3b：与人k链恒定区嵌合的小鼠fl134.33 k链可变区的氨基酸和核苷酸序列。
[0100]
图4：gsl岩藻糖基gm1的臭氧分解及其随后通过还原胺化附着到蛋白质载体的示意图。反应性臭氧攻击gsl的鞘氨醇部分中的双键并生成稳定的游离醛基团，该游离醛基团随后可用于通过还原胺化过程将gsl附着于蛋白质。这里，醛与伯胺反应，首先形成不稳定的希夫碱，希夫碱需要进一步还原以形成稳定的仲胺。
[0101]
图5：经臭氧分解的岩藻糖基gm1和原始岩藻糖基gm1的傅里叶变换质谱分析。通过ftms测试，并使用高分辨率质谱系统exactive分析的a)臭氧分解的岩藻糖基gm1，b)原始岩藻糖基gm1。分析表明，根据脂肪酰基链的长度，有多种岩藻糖基gm1种类。岩藻糖基gm1离子是单电荷的。图中数字表示存在的种类的分子量。
[0102]
图6：利用elisa和蛋白质免疫印迹分析(western blot)对hsa-岩藻糖基gm1偶联物的检测。a)通过elisa检测的三个hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品，相对于620nm背景，读取450nm吸光度。用hsa或hsa-岩藻糖基gm1偶联物涂布板。第一抗体是含有抗hsa igg抗体(mod6 6l)或抗岩藻糖基gm1 mab f12的小鼠血清。使用抗小鼠igg-生物素和链霉亲和素-hrp检测第一抗体。未添加第一抗体的孔用作阴性对照。b)通过含有抗hsa igg抗体(mod6 6l)或抗-岩藻糖基gm1 mab f12的小鼠血清检测的三个hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品的蛋白质免疫印迹分析。使用泳道1至4作为对照，其中泳道1＝原始hsa，泳道2＝通过反应性胺化方法获得但未添加神经节苷脂的hsa，泳道3＝hsa-lewis y偶联物，泳道4＝hsa-gd3偶联物，泳道5＝hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品1，泳道6＝hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品2，泳道7
＝hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品3。使用抗小鼠igg-hrp检测第一抗体。将仅用第二抗体印迹的相同膜作为阴性对照。阳性条带由ecl显影。
[0103]
图7：小鼠血清igg与hsa-fuc-gm1偶联物和纯化的fuc-gm1的结合。筛选小鼠血清igg，用于与hsa-fuc-gm1偶联物(a，c，e，g)或纯化的fuc-gm1(b，d，f，h)结合。通过elisa分析小鼠血清，相对于620nm背景，读取450nm吸光度。将单独的第二抗体作为阴性对照。使用含有抗hsa igg抗体和抗-fuc-gm1 mab f12的小鼠血清作为阳性对照。*表示与不含第一抗体相比p＜0.05，仅分析1/4稀释度。
[0104]
图8：小鼠血清igg与dms79细胞表面的结合。将小鼠血清igg与fuc-gm1阳性细胞系dms79的细胞表面结合。首先将细胞与小鼠血清以1/10稀释度孵育。用10μg/ml的抗小鼠igg fitc来检测第一抗体的结合。通过流式细胞术对细胞进行分析。同种型igg1用作阴性对照(数据未示出)，mab f12用作阳性对照，二者均以10μg/ml使用。抗体结合的强度用几何平均值表示。
[0105]
图9：fuc-gm1-特异性mab与fuc-gm1表达细胞的细胞表面的结合。通过间接免疫荧光和流式细胞术分析来评价纯化的mab fl133.63、mab fl133.67和mab fl134.33与fuc-gm1阳性细胞系dms79、dms53、h128和h69的细胞表面的结合。用抗小鼠igg fitc来检测表面结合。同种型igg1用作阴性对照(数据未示出)，mab f12用作阳性对照。抗体结合的强度用几何平均值表示。
[0106]
图10：fuc-gm1-特异性mab与健康人志愿者的全血的结合。通过间接免疫荧光和流式细胞术分析评价a)同种型igg1、b)同种型igg3、c)抗mhc i类mab、d)mab f12、e)mab fl133.63、f)mab fl133.67、和g)mab fl134.33与健康人志愿者的全血的结合。首先用10μg/ml的第一抗体孵育全血，然后用10μg/ml的抗小鼠igg fitc检测该抗体。在分析之前，将红血球裂解。使用小鼠igg1同种型、小鼠igg3同种型和mab f12作为阴性对照。抗mhc i类mab用作阳性对照。使用阴性对照设置点图象限。
[0107]
图11：将fuc-gm1 mabs与各种纯化的糖脂结合。通过elisa分析a)fl133.63、b)fl133.67、c)fl134.33与各种纯化的神经节苷脂的结合，相对于620nm背景，读取450nm吸光度。通过生物素化的抗小鼠igg和链霉亲和素-hrp检测第一抗体的结合。d)f12、e)抗gd3 mab r24和f)抗gm1毒素ctxb-hrp用作阳性对照。尚未开发出针对剩余神经节苷脂的mab。*表示与乳糖基神经酰胺相比p＜0.05，仅分析1/3稀释度。
[0108]
图12：用纯化的神经节苷脂fuc-gm1预孵育的fuc-gm1 mab与dms79细胞系的竞争结合。首先将2μg mab与5μg纯化的fuc-gm1在室温下孵育1小时。通过间接免疫荧光和流式细胞术分析来分析与dms79细胞的细胞表面的结合。使用同种型igg1(数据未示出)和mhc i作为阴性对照。f12用作阳性对照。未与纯化的fuc-gm1预孵育的第一抗体也用作阳性对照。抗体结合的强度用几何平均值表示。
[0109]
图13：fl133.63和fl134.33的结合是针对功能糖基化聚糖阵列的联合体进行筛选的，所述功能糖基化聚糖阵列由610个哺乳动物聚糖靶组成。比较了a)fl133.63与b)fl134.33之间的精巧特异性。
[0110]
图14：fuc-tgl mab与纯化的fuc-tgl和dms79 pmtgl的结合。a)fl133.63、b)fl133.67、和c)fl134.33与dms 79pm tgl(每条泳道1
×
107个细胞)、纯化的神经节苷脂fuc-gm1(每条泳道5μg)、和gm1(每条泳道5μg)的结合。通过带有免疫检测的tlc分析来分析
结合。使用1μg/ml的第一抗体。通过以1/10000使用的irdye 680cw抗小鼠igg检测第一抗体的结合。d)将用抗-fuc-gm1mab f12免疫印迹的薄层层析板用作阳性对照。e)将仅用第二抗体免疫印迹的薄层层析板用作阴性对照。
[0111]
图15：抗-fuc-gm1 mab与hsa-fuc-gm1偶联物的结合。通过elisa分析与hsa-fuc-gm1偶联物结合的a)mab fl133.63、b)mab fl133.67、c)mab fl134.33、d)mab f12，相对于620nm背景，读取450nm吸光度。使用抗小鼠igg生物素和链霉亲和素hrp偶联物来检测第一抗体。使用原始hsa作为阴性对照。使用mab f12作为阳性对照。
[0112]
图16：抗fuc-tgl mabs与纯化的fuc-gm1和dms79细胞的结合。在100-0.001nm的浓度范围内，通过elisa评价了抗fuc-gm1 mab(fl133.63、fl133.67和fl134.33)与纯化fuc-gm1的结合。使用同种型igg1作为阴性对照。使用非线性剂量应答曲线拟合(graphpad prism)建立ec50值。使用相同的浓度范围，还通过流式细胞术来评价mabs与sclc细胞系dms79的结合。使用同种型igg1作为阴性对照。使用graphpad prism中的非线性结合曲线拟合(一个位点-特异性结合)建立kd值。
[0113]
图17：fuc-gm1 mab介导的dms79细胞的adcc和cdc。mab fl133.63、fl133.67和fl134.33介导的fuc-gm1阳性细胞系dms79的a)adcc和b)cdc。使用抗lewis
y/b mab sc101作为阳性对照。*表示p＜0.05。
[0114]
图18：mab fl134.33、mabfl133.63和mabfl133.67的vh区的序列。种系抗体序列以氨基酸密码子示出。下面，示出了每个fuc-gm1特异性抗体中的突变。
[0115]
图19：mab fl134.33、mabfl133.63和mabfl133.67的vl区的序列。种系抗体序列以氨基酸密码子示出。下面，示出了每个fuc-gm1特异性抗体中的突变。
[0116]
图20：通过elisa评价的抗体与纯化抗原结合的特异性。用抗体孵育涂布fuc-gm1的板，并使用抗小鼠fc特异性或抗人γ链特异性igg生物素和链霉亲和素hrp来检测。使用mab f12作为阳性对照。
[0117]
图21：通过间接免疫荧光评价抗体的细胞表面结合。将mabfl134.33、mabfl133.63、mabfl133.67和ch134.33与细胞孵育，并使用抗小鼠fc特异性或抗人γ链特异性igg fitc来检测结合。a)用细胞系通过流式细胞术来生成的直方图，b)所有细胞系的gm值的条形图。使用mab f12作为阳性对照。
实施例
[0118]
方法
[0119]
所有实验都按照适用的安全规定进行。通过以下标准操作程序进行实验室方法，并针对特定条件进行修改。
[0120]
免疫接种
[0121]
动物工作是在英国内政部项目许可下进行的。除非另有说明，所有使用的试剂均购自sigma-aldrich(普尔，英国)。所有免疫接种实验均使用6-8周龄的balb/c或cd1小鼠进行。由诺丁汉大学生物医学服务部的工作人员在规定的无病原体条件下饲养小鼠。使用0.5ml胰岛素注射器通过皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)，用稀释于最多100μl pbs中的抗原来使小鼠免疫。每次免疫接种中的注射频率不同，并在适当的结果章节中进行概述。为了评价小鼠对免疫接种的抗体应答，在每次免疫接种后7天，通过尾静脉将小鼠放血。以最大速度
(17968
×
g)将血液离心两次2分钟(sigma，1-15pk microfuge，osterode am harz，德国)以除去红血球，并将血清储存在-20℃直至进一步使用。
[0122]
细胞培养
[0123]
所有组织培养均在ii类安全柜中无菌进行。人来源的癌细胞系保持在补充有10％热灭活胎牛血清(hi-fbs)的罗斯威尔公园纪念研究所培养基(rpmi 1640)中，除此之外，h128保持在补充有20％hi-fbs的rpmi 1640中，dms53保持在10％hi-fbs的韦茅斯培养基中。将新购买的细胞系在干冰上移交，使其保持冷冻于-80℃。为了除去细胞培养冷冻培养基，将细胞在37℃水浴中解冻，并与10ml适当培养基一起转移到30ml通用容器(sterlin，纽波特，英国)中。将细胞在1000g下离心5分钟。然后除去上清液，并将细胞团块重悬在7ml适当培养基中。然后将细胞转移到t25 cellstar细胞培养瓶(vwr，拉特沃思，英国)中，并在37℃于5％co2中孵育。一旦细胞达到约80％的汇合度(confluency)，则将它们分裂或转移到较大的细胞培养瓶中。在贴壁细胞系的情况下，从瓶中抽出用过的培养基并加入5ml1
×
胰蛋白酶/edta。在37℃下孵育胰蛋白酶化细胞直至细胞脱壁(通常约10分钟)。然后将脱壁的细胞收集到30ml通用容器中，加入5ml培养基以降低胰蛋白酶对细胞的影响。然后以1000g离心细胞5分钟。去除上清液，用新鲜培养基重悬细胞团块。然后将细胞转移到t75 cellstar培养瓶中。一旦培养基耗尽(从橙色变成黄色)，或一旦细胞看起来不健康/开始死亡，作为漂浮聚集物生长的细胞就会分裂。将细胞(包括培养基)直接转移到t75培养瓶中，加入10ml新鲜培养基。为了增进并保持新购买的细胞系的库存量，采用上述方法从80％汇合度的t75培养瓶中收集细胞。使用血球计和以1:1比例应用的台盼蓝活力染色剂对细胞进行计数。在5％的二甲基硫(dmso)/适当的培养基中以5
×
106个细胞/毫升将细胞重悬，每2毫升微管加入1毫升(sarstedt，莱切斯特，英国)。首先将小瓶置于-80℃的冷冻箱中至少24小时，然后移入液氮中，在液氮中保持在-170℃。
[0124]
如果各种实验需要大量活细胞库存，则将细胞逐渐扩增到t175培养瓶中，并通过更新用过的培养基并分裂以确保细胞的对数期生长而使细胞保持在健康状态。当处理非贴壁细胞系时，将细胞转移到通用容器中并静置5分钟。这使得含有活细胞的漂浮聚集体能够沉降在通用容器的底部，然后可以去除含有死细胞的上清液。接着用适当的培养基重悬细胞团块，并将细胞转移回培养瓶中。
[0125]
抗体
[0126]
抗hla-abc(克隆w6/32)和抗cd44购自ebiosciences(哈特菲尔德，英国)。抗cd59(bric229)购自ibgrl(布里斯托尔，英国)。抗唾液酸化lewisa(ca19.9)、抗lewisb(2-25le)、抗lewis
x
(p12)、抗gd2(克隆2q549)、抗gm2、抗gb3、抗抑制素蛋白(克隆ii-14-10)购自abcam(剑桥，英国)。抗neugc gm3(克隆m2590)购自cosmobio有限公司(东京，日本)。抗cd46、抗cd14(克隆m5e2)、抗cd11c(克隆b-ly6)和igg1同种型购自bd biosciences(克拉雷，英国)。抗lewis y(br96)购自atcc(米德尔塞克斯，英国)。抗唾液酸化lewis x(km93)和抗ca125(oc125)购自calbichem(达姆施塔特，德国)。抗globoh(克隆mbr1)购自enzo生命科学(埃克塞特，英国)。抗fuc-gm1(f12)购自fujirebio(东京，日本)。抗转铁蛋白(unconj)购自invitrogen(佩斯利，英国)。抗egfr(if4)和抗钙联结蛋白购自cell signalling technology(danvers，ma，美国)。抗epcam(berep4)购自dako(剑桥，英国)。抗egfr(爱必妥)和抗her2(赫赛汀)是nhs馈赠的。抗gd3(r24)是斯隆凯特林癌症中心的菲利普
·o·
利文斯
顿馈赠的。链霉亲和素-hrpo偶联物购自invitrogen(佩斯利，英国)。兔抗小鼠免疫球蛋白fitc和猪抗兔igg1 fitc购自dako(剑桥，英国)。链霉亲和素pe购自ebiosciences(哈特菲尔德，英国)。霍乱毒素b亚单位生物素购自stratech scientific公司(纽马克特，英国)。irdye 680rd驴抗小鼠和irdye 800cw链霉亲和素购自li-cor(内布拉斯加州，美国)。
[0127]
抗原的制备
[0128]
将干细胞团块(在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤一次)储存在-80℃冷冻箱中直至使用。为了提取质膜，将来自2
×
108个细胞的细胞团块合并在一起，使用依次减小的针(23g、25g和最终29g)在2ml的50mm甘露醇/5mm hepes(ph7.4)和10mm氯化钙溶液中手动匀浆。然后将样品置于冰上20分钟，接着在3000
×
g下离心15分钟以除去细胞内膜和细胞核。将上清液移入聚异质同晶体超速离心管(贝克曼，海威科姆，英国(beckmann,high wycombe,uk))中，并在4℃下以48000
×
g离心30分钟，以将含pm团块与含细胞浆的上清液分离。然后用200μl pbs重悬团块，并储存于-20℃直至使用。
[0129]
通过加入2ml甲醇和2ml氯仿，将pm tgl直接提取到聚异质同晶体超速离心管中的pm团块中或提取到重悬于200μl pbs中的pm中。然后将该物质转移到15ml聚丙烯管中，充分涡旋并允许在室温(rt)下在辊上孵育30分钟。在2000
×
g离心10分钟后，收集含tgl的上清液并在-20℃孵育过夜。第二天，再次在相同的设定下离心样品，收集上清液并储存于4c。
[0130]
佐剂
[0131]
为了增强对抗原的免疫应答，在本文的过程中使用各种佐剂。在配制脂质体期间(每只小鼠10μg至25μg)，将α-galcer(α-半乳糖基神经酰胺)、α-galcer类似物7或α-galcer类似物8(enzo生命科学，埃克塞特，英国)连同脂质的其余部分一起干燥。抗小鼠cd40(r&d系统，阿宾顿，英国)、来自s.mennesota(mpla)(invivogen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)的c型cpg寡核苷酸和单磷酰脂质a以每只小鼠10μg使用，并混入已形成的脂质体中。使用弗氏完全或不完全佐剂来增强对蛋白质抗原的免疫应答。将它们以1:1的比例(v:v)与抗原混合。
[0132]
纯化的神经节苷脂与蛋白质的偶联
[0133]
纯化的神经节苷脂通过间接还原胺化与hsa共价结合，在间接还原胺化中，含醛的神经节苷脂与含胺(赖氨酸)的蛋白质反应形成稳定的胺键。为了将反应性醛基引入神经节苷脂，采用了如前所述的臭氧分解方法(song et al.,2011)。反应性臭氧是通过臭氧发生器ozv
–
8(ozone solutions)由干燥空气(空气干燥器mag-600，ozone solutions，赫尔，爱荷华州，美国)新产生的。使臭氧通过重悬于最小体积为500μl的2:1氯仿:甲醇中的含糖脂样品1分钟，同时保持蓝色。然后，加入50μl二甲基硫以破坏残留的臭氧，室温孵育1小时后，在氮气流下干燥溶液。将重悬于dmso中的臭氧分解的fuc-gm1(matreya，宾夕法尼亚州，美国)加入到重悬于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的人血清白蛋白(hsa)中，ph＞9，10倍摩尔过量。然后每1ml反应加入10μl在1m naoh中的5m硼氢化钠(h4bna)。然后将各样品室温孵育2小时。通过每1ml反应加入20μl的3m乙醇胺，保持15分钟，来封闭未反应的醛位。偶联物经pbs透析来纯化。
[0134]
通过全蛋白maldi-tof分析来分析蛋白-fuc-gm1偶联物。为了制备样品，首先用50％(v/v)乙腈:h2o溶液来活化ziptip c4移液枪枪头(millipore，马塞诸塞州，us)，然后用h20中的0.1％tfa来平衡。接着通过吹打15次将样品与ziptip的树脂结合。然后用h20中的
0.1％tfa洗涤与树脂结合的样品15次，并用洗脱溶液(50％(v/v)乙腈：含有0.1％tfa的h2o中的饱和芥子酸)分配在maldi板上。
[0135]
mabs的生成
[0136]
在融合前至少一周，多瓶ns0骨髓瘤细胞在补充有10％hi-fcs的rpmi培养基中生长。选择含有看起来最健康的细胞的烧瓶，并在融合前一天重新喂食。将去除的用过的ns0培养基储存在-4℃。在融合当天，首先将所有试剂加热到37℃。收获ns0细胞并计数四次。然后通过用无血清rpmi以1000
×
g离心5分钟两次来洗涤ns0细胞。处死免疫小鼠并移除脾脏，使用70％(v/v)乙醇保持切口部位无菌。通过针将rpmi培养基压入脾脏并同时用一对钳子施加压力来制备单细胞悬浮液。接着将脾细胞在rpmi培养基中以1000
×
g离心10分钟并计数四次。然后以10:1的细胞比例将脾细胞与ns0骨髓瘤细胞融合。更详细地，将1
×
108个脾细胞和1
×
107个ns0骨髓瘤细胞合并并以1000
×
g离心5分钟。除去上清液，用1分钟将800μl用于渗透细胞质膜的聚乙二醇1500温和混合到细胞团块中。然后，在温和混合的情况下，在1分钟内将1ml rpmi培养基缓慢加入到细胞中。在5分钟内使另外5ml rpmi缓慢分层置于细胞顶部。最后，另外20ml rpmi分层置于顶部。为了辅助融合过程，然后将细胞以1200
×
g离心7分钟。除去上清液，将细胞小心地重悬在补充有10％hi-fbs、5％次黄嘌呤甲氨蝶呤胸苷(hmt选择试剂；invitrogen，佩斯利，英国)、5％的杂交瘤克隆因子(hcf；paa，皮斯卡塔韦，美国)和10％的过滤的用过的ns0上清液的rpmi培养基中。然后将细胞接种到96孔培养板(thermo fisher scientific，罗克福德，英国)中，并在37℃、5％co2中孵育。
[0137]
在融合后约两周，当建立的杂交瘤占据约1/3的孔时，通过酶联免疫吸附试验(elisa)进行筛选以产生抗原特异性抗体。选择产生具有期望特异性的抗体的杂交瘤菌落用于进一步克隆，其目的是产生单细胞菌落。这是产生单克隆抗体的关键步骤。为此，将所选择的杂交瘤以每孔0.3个细胞的细胞密度接种到96孔培养板中。杂交瘤在37℃、5％co2中孵育，直至菌落足够大以再次筛选。克隆至少重复两次，直到所有克隆表现出与抗原结合阳性。
[0138]
mab纯化
[0139]
在补充有10％低ig新生小牛血清(life technologies)的gibco杂交瘤无血清培养基(life technologies，佩斯利，英国)中，对两次克隆的杂交瘤进行扩增。收集用过的培养基并以2000
×
g下离心15分钟以除去杂交瘤细胞和细胞碎片。然后通过0.2μm minisart一次性过滤器(sartorius stedim，萨里，英国)过滤含有抗体的上清液。使用1ml重组蛋白g柱(ge healthcare，白金汉郡，英国)通过fplc来纯化抗体，用100mm甘氨酸ph12洗脱，中和后，用2l pbs透析过夜。用分光光度计确定纯化的抗体的最终浓度，读取280nm吸光度。根据制造商的指南，使用小鼠单克隆抗体分型测试试剂盒(abd serotec，基德灵顿，英国)。
[0140]
酶联免疫吸附试验(elisa)
[0141]
对于糖脂elisa，用100ng纯化的神经节苷脂/孔、或相当于1
×
104个细胞/孔的wc tgl提取物、或相当于重悬在100％乙醇中的5
×
104个细胞/孔的pm tgl涂布96孔柔性pvc平底板(bd biosciences，牛津，英国)，并在室温下干燥过夜。
[0142]
将纯化的神经节苷脂在2:1(v/v)氯仿:甲醇中重悬至1mg/ml。上面描述了pm tgl的提取。抗原的制备。通过向干燥细胞团块中加入1ml甲醇和1ml氯仿来制备wc tgl。将细胞剧烈涡旋并使其在辊上室温孵育30分钟。在2000
×
g离心10分钟后，收集含tgl的上清液并
在-20℃储存过夜。第二天，将样品重新离心，收集上清液并储存于4℃。
[0143]
对于蛋白质elisa，用重悬在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)中的100ng蛋白质/孔涂布96孔柔性pvc平底板，并于4℃孵育过夜。第二天，用pbs中的2％牛血清白蛋白(bsa)室温封板1小时。然后弹出封闭缓冲液，然后将在1％bsa的pbs溶液中制备的第一抗体或小鼠血清加入孔中。室温孵育1小时后，将板在pbs中洗涤3次。通过适当的第二抗体和第三抗体来检测第一抗体的结合。然后通过向每孔添加90μl的3,3’5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)的磷酸盐/柠檬酸盐/过硼酸盐缓冲液来洗涤板并使其显影。通过加入30μl的2m h2so4使反应停止。用分光光度计来分析结果，并且针对620nm背景，读取450nm吸光度。使用微软excel计算数据的平均值和标准偏差。使用与阴性对照进行多重比较的一般单向anova计算各组之间的显著差异，其中p＜0.05被认为具有统计学意义。
[0144]
糖组分析
[0145]
为了阐明fl133和134mabs的精巧特异性，对抗体进行fitc标记，并送往功能糖原组学联盟(consortium for functional glycomics)(http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh8.shtml]))，其中针对≥600种天然和合成聚糖进行筛选。简言之，将具有氨基连接物的合成和哺乳动物聚糖印刷在n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化的玻璃显微镜载玻片上，形成酰胺键。这项工作由埃默里大学cfg的core h完成。在pbs中于室温以1μg/ml测试fg27。简言之，将抗体样品施加到微阵列的印刷表面，并在加湿室中孵育1小时。接着用pbs冲洗载玻片4次，然后加入荧光标记的(alexa fluor 488)抗兔igg，并孵育1h。接着在pbs中冲洗载玻片4次，用perkin-elmer微阵列xl4000扫描仪测量荧光，并用imagene软件(biodiscovery)进行分析。
[0146]
下面给出所使用的方案的进一步细节：
[0147]
利用未标记单克隆抗体的聚糖结合试验
[0148]
1.介绍
[0149]
1.1.core h的主要目的是使用打印的聚糖微阵列来确定聚糖结合蛋白(gbp)和由研究者提交的各种生物体的结合特异性。
[0150]
2.参考：
[0151]
2.1.www.functionalglycomics.org
[0152]
3.需要的材料：
[0153]
3.1.聚糖印刷的载玻片(core d)，印刷在带有白色蚀刻条形码和黑色标记的载玻片的侧面-不要触摸此区域
[0154]
3.2.盖玻片(fisher scientific,12-545f)
[0155]
3.3.加湿的载玻片处理腔室(fisher science，nc9091416)，或使用皮式培养皿的自制系统，在腔室底部具有湿纸巾
[0156]
3.4.用于洗涤载玻片的100ml科普林氏缸(coplin jars)
[0157]
3.5.tris-hcl(fisher scientific,bp152-1)
[0158]
3.6.nacl(fisher scientific,s271-3)
[0159]
3.7.cacl2(fisher scientific,c79-500)
[0160]
3.8.mgcl2(fisher scientific,bp214-500)
[0161]
3.9.磷酸二氢钾(fisher scientific,p285-3)
[0162]
3.10.dh
20[0163]
3.11.青色素5-链霉亲和素(zymed43-4316)
[0164]
3.12.适当的二抗，荧光标记(如果可用)
[0165]
3.13.bsa(fisher scientific,bp1600-100)
[0166]
3.14.tween-20(emd biosciences，655205)
[0167]
3.15.叠氮化钠(fisher scientific,s227-500)
[0168]
3.16.proscanarray扫描仪(perkin elmer)
[0169]
4.缓冲液：
[0170]
4.1.tsm＝20mm tris-hcl,ph 7.4 150mm nacl,2mm cacl2,2mm mgcl2[0171]
4.2.tsm洗涤缓冲液(tsmw)＝tsm缓冲液 0.05％tween-20
[0172]
4.3.tsm结合缓冲液(tsmbb)＝tsm缓冲液 0.05％tween 20 1％bsa
[0173]
5.实验方案：
[0174]
5.1.制作洗涤缓冲液(tsm、tsm洗涤缓冲液和h2o)的工作储备液或收集试剂，并将其置于室温(如果曾放置在冰箱中)。
[0175]
5.1.1.缓冲液(a)tsm：20mm tris-hcl,ph 7.4 150mm nacl,2mm cacl2,2mm mgcl2[0176]
5.1.2.缓冲液(b)tsm洗涤缓冲液(tsmw)：tsm缓冲液 0.05％tween-20
[0177]
5.1.3.缓冲液(c)tsm结合缓冲液(tsmbb)：tsm缓冲液 0.05％tween 20 1％bsa
[0178]
5.1.4.dh2o
[0179]
5.2.根据抗体的特性，通过将抗体稀释于tsmbb或适当的结合缓冲液中，使最终浓度为5-50ug/ml或分析所需的适当浓度，从而制备100μl样品。
[0180]
5.3.从干燥器中取出载玻片，并在黑色标记外的条形码附近将载玻片标上样品名称。
[0181]
5.4.通过将载玻片放置在含有100ml tsmw的玻璃科普林染色缸中5分钟，使其水合。
[0182]
5.5.将载玻片垂直放置以排空液体，从而去除载玻片上的过量液体。
[0183]
5.6.将70μl样品(见5.2)靠近左边缘载玻片小心地涂在黑色标记之间。
[0184]
5.7.缓慢地将盖玻片放置在载玻片上，尽量避免样品在盖玻片下形成气泡。如有必要，通过用移液枪枪头轻轻敲打盖玻片，或缓慢抬起盖玻片的一侧，以除去任何气泡。确保盖玻片位于黑色标记之间。
[0185]
薄层层析法(tlc)
[0186]
在tlc板(tlc板上的纳米硅胶)上以1μg/泳道加载纯化的脂质，或者加载上述从细胞系中提取的wc tgl(1
×
106个细胞/泳道)或pm tgl(1
×
107个细胞/孔)。为了帮助加载大量的源自细胞的tgl，首先使用设定为60℃的加热块干燥tgl，然后在最多20μl的2:1氯仿/甲醇中重悬。一旦加载，通过在溶剂1(氯仿:甲醇:dh2o，60:30:5)中将板运行两次至距离为5cm，并且在溶剂2(己烷:二乙基醚:冰醋酸，80:20:1.5)中运行一次至距离为8cm来使脂质移动。然后，通过在120℃下显影20分钟的地衣酚(20毫升5％h2so4中的20毫克地衣酚)或通过免疫印迹来使脂质显现。
[0187]
对于免疫印迹，在糖脂被移动之后，tlc板首先被丙酮中的聚异丁基甲基丙烯酸酯
50mg/50ml的薄喷涂涂层封闭。然后，通过在1％(w/v)bsa的pbs溶液中室温孵育1小时，进一步封闭板。在第一抗体(10ml/板，10μg)或小鼠血清(10ml/板，稀释度1/100)中孵育板，用抗小鼠igg生物素(1/1000)和驴抗小鼠ird 800cw(licor biosciences有限公司，剑桥，英国)进行检测。每次抗体孵育均以温和摇晃进行，持续1小时。第三抗体的孵育避光进行。所有抗体均在1％(w/v)bsa的pbs溶液中制备。每次抗体孵育后，将pbs直接倒在板上对板进行洗涤。最后，洗板，避光干燥过夜，并通过odyssey sa红外成像系统(licor)进行分析。
[0188]
抗体和补体依赖性细胞毒性
[0189]
用生理盐水中的放射标记的铬酸钠(cr
51
)对抗体和补体依赖性细胞毒性进行评价，cr
51
是由死亡细胞由于其浆细胞膜渗透性增加而释放出来的。具体而言，用40μl(1mbq)的cr
51
(perkin elmer，剑桥，英国)对2
×
106个靶细胞进行标记，然后在37℃下孵育至少1小时。培养后，将标记的靶细胞在25ml的sf rpmi培养基中以1400
×
g持续5分钟洗涤两次。接着将靶细胞重悬于25ml的sf rpmi培养基中，在37℃下静置20分钟。然后再次进行离心以除去sf rpmi培养基，在1ml培养基(补充有10％fcs和1％青霉素-链霉素的rpmi)中重悬并进行计数。最后，将标记的靶细胞重悬至1
×
105个细胞/1ml，将50μl(5
×
103个细胞)加入到96孔圆底板的相关孔中。在培养基中制备抗体稀释物，确保工作稀释物是最终浓度的4倍。将体积为50μl的稀释抗体添加到相关孔中。
[0190]
实验当天，使用涂布肝素的绿色帽真空采血管(bd，普利茅斯，英国)从健康志愿者离出外周单核细胞(pbmc)。首先将全血1:1稀释于sf rpmi中。为分离pbmc，将25ml稀释的血液轻轻层叠在50ml猎鹰管(falcon tube)中的15ml histopaque-1077的顶部。将血液以2100
×
g离心20分钟，加速度设为1，减速设为0。然后，使用10ml移液管收集含有pbmc的血沉棕黄层，并在20ml sf rpmi中以2000
×
g持续5分钟洗涤两次，。然后对pbmc进行计数，将其以5
×
106个细胞/1ml培养基重悬，将100μl细胞添加到相关孔中。
[0191]
为了准备血清，将来自健康志愿者的血液收集到红色帽含有促凝剂的真空管中(bd，普利茅斯，英国)。将凝结的血液转移到30ml通用容器中，以2000
×
g持续5分钟离心两次，以确保去除所有红血球。最后，制备得到培养基中20％的血清，并将100μl添加到相关孔中。
[0192]
通过将一滴(25μl)triton x-100用于50μl标记靶细胞和125μl培养基，从而诱导最大量细胞死亡。通过在150μl培养基中孵育50μl标记靶细胞来评价自发性细胞死亡。为评价pbmc直接诱导杀灭的水平，将50μl靶细胞与100μl pbmc和50μl培养基一起孵育。
[0193]
将板在37℃孵育24小时，之后将50μl上清液转移到lumaplate中，并使其干燥24小时。然后使用topcount闪烁计数器(perkin elmer，剑桥，英国)对lumaplate进行分析。
[0194]
亲和力研究
[0195]
通过biacore x(ge healthcare，白金汉郡，英国)，利用表面等离子体共振(spr)的原理来确定亲和力常数。根据制造商的说明，通过胺偶联将多价hsa-fuc-gm1偶联物(内部偶联物，5μg/ml，每块芯片686个应答单元)偶联到cm5生物传感器芯片的流动池。将以类似方式处理但省略偶联物的参比流动池用作参比池。根据在hbs-p缓冲液(10mmol/l hepes，ph 7.4，150mmol/l nacl，0.005％表面活性剂p20)中稀释和透析的几种已知浓度的抗体，使用涂布fuc-gm1的流动池以50μl/分钟的流速来确定结合动力学参数。使用由biacore仪器提供的曲线拟合软件(biaevaluation)来产生缔合速率和解离速率的估计值，
使用二价分析物模型由缔合速率和解离速率的估计值来计算亲和力。
[0196]
数据分析
[0197]
使用单向anova dunnett多重比较检验来确定elisa结果的统计显著性。在p＜0.05的水平上认为差异具有统计显著性。符号*表示p≤0.05，符号**表示p≤0.01，符号***表示p≤0.001，符号****表示p≤0.0001。
[0198]
与血液的结合：将50μl健康供体血液与50μl第一抗体在4℃下孵育1小时。用150μl rpmi 10％nbcs洗涤血液，并1,000rpm旋转5分钟。弃去上清液，使用50μl fitc偶联的抗小鼠igg fc特异性mab(在rpmi 10％nbcs中为1/100)作为第二抗体。将细胞于4℃避光孵育1小时，然后用150μlrpmi 10％nbcs洗涤，并1,000rpm旋转5分钟。弃去上清液后，使用50μl/孔cal-lyse(invitrogen，佩斯利，英国)，然后使用500μl/孔蒸馏水来裂解红血球。随后，将血液以1,000rpm旋转5分钟。弃去上清液，用0.4％甲醛固定细胞。在fc-500流式细胞仪(贝克曼库尔特(beckman coulter))上分析样品。为了分析和绘制原始数据，使用winmdi 2.9软件。
[0199]
rna提取和cdna合成
[0200]
从组织培养物中取出来自杂交瘤fl134.33、fl133.63和fl133.67的约1
×
106个细胞，在pbs中洗涤一次，并用500μl三唑(life technologies)处理。用0.1ml氯仿处理均质化的样品，并离心以从污染的dna和蛋白质中分离rna。用0.25ml丙烷-2-醇使rna沉淀，并进行离心以形成小团块。然后，用75％乙醇洗涤团块，并重悬在于无rna酶的水中。按照制造商的建议，用dna酶(dna酶i重组，不含rna酶，roche)处理rna以除去基因组dna。按照制造商的说明，使用amv逆转录酶试剂盒(roche diagnostics，巴塞尔，瑞士)，通过低聚核苷酸(dt)
15
引物，由1μg总rna制备第一链cdna。在cdna合成后，通过95℃孵育5分钟使酶变性。然后将cdna储存于-20℃。
[0201]
可变区pcr
[0202]
先前通过分型测试试剂盒(serotec.，基德灵顿，英国)对抗体进行了评价，确定fl134.33为igg1亚型，fl133.63和fl133.67为igg3亚型(数据未示出)。使用先前公开的一组引物(jones&bengey，1991)通过pcr来确定可变区。对于轻链，使用13个vk区特异性引物和1个ck区特异性引物进行pcr扩增，对于重链，使用12个vh区特异性引物和1个恒定区亚类特异性引物进行pcr扩增。使用1u聚合酶(amplitaq gold 360，applied biosystems.,加利福尼亚州,美国)、2'-脱氧核苷5'-三磷酸盐(dntp)(最终浓度各为0.2mm)和氯化镁(最终浓度为1.5mm)的混合物、以及1μm正向引物和反向引物，建立50μl pcr反应。反应的热启动步骤在95℃进行5分钟。然后扩增进行35个循环：94℃持续1分钟，然后60℃持续1分钟，72℃持续2分钟。最后，在72℃下进行20分钟的完善步骤。使用用1％ultrapure琼脂糖(invitrogen.，卡尔斯巴德,美国)在含溴化乙锭的tae缓冲液中制备的琼脂糖凝胶电泳评价扩增产物，并以90伏运行。使用uv透照使凝胶显现。
[0203]
pcr产物纯化(重链和轻链)
[0204]
使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen.,芬洛，荷兰)纯化pcr产物，以避免残留的核苷酸或引物的遗留并获得干净的序列图。将150μl重链和轻链pcr产物装入1％琼脂糖凝胶中，并在85v下运行。根据制造商的方案，从凝胶中切取dna片段，在柱上溶解和纯化。通过uv光谱仪(nanodrop，thermoscientific，沃尔瑟姆，美国)确定所得dna的最终浓度。
[0205]
校读pcr(proof-reading pcr)
[0206]
将用于执行校读pcr的引物设计为，基于序列数据维持读取框并保存氨基酸序列。考虑起始密码子、用于启动翻译过程的kozak共有序列，并结合允许整合到双表达载体的限制性内切酶位点。以cdna为模板，使用克隆引物和校对聚合酶(phusion，neb，伊普斯威奇，英国)进行pcr扩增。该反应进行三次，以提高产物的收率。如前所述设置50μl反应。热启动步骤98℃进行3分钟。然后扩增进行35个循环：98℃持续30秒，然后58℃持续30秒，68℃持续60秒。完善步骤在72℃进行10分钟。
[0207]
pcr产物的topo克隆
[0208]
按照制造商的说明，用taq聚合酶(neb)在72℃处理用校读聚合酶产生的pcr产物15分钟，以添加腺嘌呤悬挂物，并将pcr产物克隆到ta(topo)载体(pcr2 1，invitrogen)中，并转化到化学感受态top10f细胞中，用于随后的酶消化，并连接到pdcorig-higg1载体中。转化的细菌在补充有80μg/ml氨苄西林的lb琼脂板或液体培养基中生长。
[0209]
核酸纯化
[0210]
在37℃和120rpm下，在补充有适当抗体的液体培养物中，从转化后的细菌的过夜培养物中制备质粒dna。按照制造商的说明，少量时，使用spini miniprep试剂盒(qiagen)制备，大量时，使用plasmid maxi试剂盒(qiagen)制备。按照制造商的方法，如前所述，通过前述琼脂糖凝胶电泳和使用凝胶提取试剂盒对dna进行纯化，以回收dna。
[0211]
限制性内切酶消化和双表达载体克隆
[0212]
在存在牛血清白蛋白(bsa)和每种酶自己的最佳缓冲液的情况下，对10μl dna进行酶消化，并加入8个单位的各限制酶。在每种酶的活性温度下孵育2小时。按照制造商的指示，将双表达载体pdcorig-higg1和轻链插入体进行消化、琼脂糖凝胶纯化，并在16℃使用t4 dna连接酶(neb)连接过夜。随后对载体和重链进行第二次消化，通过凝胶提取再次纯化并在16℃进行第二次过夜连接。在每次消化后，将载体转化到化学感受态top10f细胞(invitrogen)中。使转化后的细菌在补充有35μg/ml zeocin(invivogen)的lb琼脂板或液体培养基中生长。
[0213]
嵌合抗体载体的测序和转染
[0214]
在诺丁汉大学的核酸测序设施中使用适当的5'和3'引物对pcr产物和质粒进行测序，并使用genetool软件包和小鼠免疫球蛋白核苷酸序列的imgt数据库进行分析。使用lipofectamine(invitrogen)和opti-mem减血清培养基(gibco，life technologies，沃尔瑟姆，美国)转染cho细胞。在cho-s-sfmii培养基(gibco)中悬浮培养细胞直至其耗尽。收集上清液，并使用蛋白-g琼脂糖预填充柱(hitrap蛋白ghp，ge healthcare)通过制备层析法(fplc，ge healthcare，little chalfont，uk)纯化抗体。纯化后，将抗体渗出，用紫外光谱法确定最终收率。
[0215]
实施例1：fuc-gm1 mabs的生成和初始表征：
[0216]
每只腹膜内给药小鼠每次免疫接种，用含10μg岩藻糖基gm1的经典脂质体进行免疫接种。在第1次和第3次免疫接种中使用alpha-galcer作为佐剂，而在第2次和第4次免疫接种中使用抗cd40单抗作为佐剂。所有小鼠均接受4次免疫接种。前三次免疫接种以每两周为间隔进行给药，而最后一次免疫接种在第三次免疫接种之后四周进行。从第二次免疫接种开始，在免疫接种之后一周对小鼠进行放血，然后用elisa对血清进行与纯化的岩藻糖基
gm1结合的igg和igg筛选。免疫接种后，小鼠产生对岩藻糖基gm1的显著的igg免疫应答，终点滴度为1/100。也评价了小鼠血清igg与表达岩藻糖基gm1的dms79细胞系的细胞表面的结合。很遗憾，只发现对细胞系存在弱结合。可以推测，小鼠血清识别出了岩藻糖基gm1抗原的表位，一旦脂质整合到细胞的质膜，该表位是不可接近的。
[0217]
当掺入脂质体中的纯化的糖脂不能产生高滴度igg应答时，评估其他免疫接种方法。传统上，碳水化合物和糖脂被分类为主要引起igm抗体应答的t细胞不依赖性抗原。高亲和力igg抗体应答主要产生于对蛋白质抗原的应答。因此，可以假设，提供连接的t细胞帮助将对碳水化合物和糖脂抗原产生更大和更一致的高亲和力igg抗体应答。因此，将岩藻糖基gm1与人血清白蛋白偶联。
[0218]
岩藻糖基gm1与蛋白质的偶联遵循两步法。首先，将纯化的神经节苷脂岩藻糖基gm1进行臭氧分解，其中反应性臭氧氧化糖鞘脂的鞘氨醇部分中存在的碳-碳双键，以产生游离醛基。在下一步骤中，通过还原胺化过程使臭氧分解的岩藻糖基gm1与hsa偶联。这里，使臭氧分解的岩藻糖基gm1的新生成的醛与hsa上的赖氨酸上的伯胺基反应，以首先形成不稳定的希夫碱，当希夫碱被硼氢化钠还原时，形成高度稳定的仲胺键。产生偶联物的示意图示于图4中。
[0219]
在臭氧分解之后，通过傅立叶变换质谱分析来自原始岩藻糖基gm1和臭氧分解的岩藻糖基gm1的样品。原始样品包含具有不同长度的脂肪酸链的几种岩藻糖基gm1。最大量的种类的分子量为1,746da。臭氧分解的样品还包含具有不同尺寸的脂肪酸链的种类。在臭氧分解的岩藻糖基gm1样品中，主要种类的分子量为1566da，表现出恰好180da的质量位移，与鞘氨醇部分的损失对应。此外，原始岩藻糖基gm1种类不能在臭氧分解的样品中检测到(图5)。将重悬于dmso中的臭氧分解的岩藻糖基gm1加入到重悬于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的hsa中。向其中加入还原剂硼水化钠(h4bna)，使反应在室温下孵育8小时，然后重悬于100μl pbs/edta缓冲液中。然后，加入磺基-mbs交联剂，在室温下孵育1小时。
[0220]
通过elisa、蛋白质免疫印迹法和质谱法，评价hsa-岩藻糖基gm1偶联物的成功生成。通过elisa，通过含有抗hsa的igg抗体的小鼠血清检测到原始hsa以及所有三种hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品(1/10,000终点滴度)，通过抗岩藻糖基gm1 mab f12(1/10,000终点滴度)仅检测到hsa-岩藻糖基gm1偶联物(图6a)。通过蛋白质免疫印迹分析也证实了在所有三个样品中均生成了hsa-岩藻糖基gm1偶联物。将抗hsa小鼠血清结合至原始hsa、经还原胺化但未添加岩藻糖基gm1的hsa、hsa-lewis y偶联物、hsa-gd3偶联物、以及所有三个hsa-岩藻糖基gm1偶联物样品。另一方面，抗岩藻糖基gm1 mab f12仅检测到hsa-岩藻糖基gm1偶联物，它们的预期大小为67kda。该分析还表明，与原始hsa相比，hsa-岩藻糖基gm1缀偶联物的分子量略有增加。这与将岩藻糖基gm1分子加入到hsa中一致(图6b)。
[0221]
用hsa-fuc-gm1偶联物(每次免疫接种10μg)以及含fuc-gm1的脂质体(每次免疫接种10μg)和fuc-gm1阳性小细胞肺癌细胞系dms79(每次免疫接种1
×
106个细胞)对小鼠进行免疫接种。15只小鼠分为5组，每组包含3只小鼠，使用的免疫佐剂的种类和顺序不同。
[0222]
第1组首先接受三次fuc-gm1脂质体免疫接种，然后接受两次hsa-fuc-gm1偶联物免疫接种。作为佐剂，在第一次免疫接种中使用α-galcer，在随后的两次免疫接种中使用抗cd40，不完全弗氏佐剂(ifa)用作hsa-fuc-gm1偶联物的佐剂。为了提高在细胞表面产生能够识别fuc-gm1的mabs的机会，首先用1
×
106个dms79细胞对第2组进行免疫接种，接着用含
fuc-gm1的脂质体进行两次免疫接种，并hsa-fuc-gm1偶联物进行两次免疫接种，在第二次和第三次免疫接种中使用α-galcer，而不完全弗氏佐剂与hsa-fuc-gm1偶联物一起使用。第3组首先用hsa-fuc-gm1偶联物进行免疫接种，然后用fuc-gm1脂质体进行免疫接种。完全弗氏佐剂作为佐剂与hsa-fuc-gm1偶联物一起使用，抗cd40在第二次免疫接种中用作佐剂，α-galcer在第三次中用作佐剂。第4组的抗原顺序相反：首先用两剂fuc-gm1脂质体对小鼠进行免疫接种，然后用hsa-fuc-gm1偶联物进行一次免疫接种。在第一次免疫接种中使用α-galcer作为佐剂，在第二次中使用抗cd40作为佐剂，在第三次中使用ifa作为佐剂。用三剂hsa-fuc-gm1偶联物对第5组进行免疫接种。在第一次免疫接种中使用cfa作为佐剂，在随后的两次免疫接种中使用ifa。组及其免疫原总结在表1中。
[0223]
表1：免疫接种中使用的组和免疫原的总结。
[0224][0225]
通过腹膜内途径对小鼠进行免疫接种。以2周的间隔进行前三次免疫接种。第1组和第2组在第三次后六周接受第四次免疫接种，在第四次后三周接受第五次免疫接种。
[0226]
除第一次外，每次免疫接种后，将小鼠尾部放血，并通过elisa对小鼠血清igg进行与hsa-fuc-gm1偶联物结合的筛选。此外，由于我们想要产生仅识别fuc-gm1的mab(与附着到赖氨酸残基的fuc-gm1相反)，因此还对小鼠血清进行与纯化的fuc-gm1结合的筛选。这些分析表明，所有小鼠均产生对hsa-fuc-gm1偶联物的igg免疫应答(终点滴度1/10000)，但只有6/15小鼠产生了期望的纯化的fuc-gm1应答。在来自第1组(3
×
脂质体 2
×
偶联物)的两只小鼠中检测到对纯化的fuc-gm1的显著的igg应答，终点滴度均为1/1000。另外，在来自第2组(dms79细胞 2
×
脂质体 2
×
偶联物)的两只小鼠(小鼠2p的终点滴度为1/1000，小鼠2r的终点滴度为1/100)和来自第5组(3
×
偶联物)的两只小鼠中存在可检测的滴度(小鼠5p的终点滴度为1/100，小鼠5r的终点滴度为1/1000)。在图7中仅示出了来自显示阳性抗fuc-gm1应答的小鼠的数据。
[0227]
血清分析表明，6只小鼠产生了对纯化的fuc-gm1的igg免疫应答。为了评估这些抗
体是否也能在完整细胞质膜的情况下识别fuc-gm1，通过流式细胞术对其进行与dms79细胞结合的筛选。该分析表明，仅来自第2组的两只小鼠(已用dms79细胞进行免疫接种，随后用两剂脂质体和两剂偶联物进行免疫接种)产生了能够与细胞表面上的fuc-gm1结合的抗体(gm≈500)。产生fuc-gm1特异性igg应答的其它组都不与活细胞表面结合，这表明将活dms79细胞包含在免疫接种方案中具有关键价值(图8)。
[0228]
在获得表明有希望的抗fuc-gm1 igg应答的数据后，处死小鼠2r并将其脾细胞与ns0骨髓瘤细胞融合。融合前五天，用静脉内给药的脂质体中的10μg fuc-gm1和α-galcer加强小鼠免疫应答。一旦建立，通过elisa对单个杂交瘤菌落进行产生与纯化的fuc-gm1结合的igg抗体的筛选。鉴定具有最强抗体结合的四个杂交瘤，并以0.3个细胞/孔克隆两次。在每一轮克隆后，通过elisa对杂交瘤上清液进行分泌与纯化的fuc-gm1结合的igg抗体的重新筛选(结果未示出)。克隆后，选择杂交瘤fl133.63、fl133.67和fl134.33，并进行扩增，从杂交瘤上清液中纯化mabs。使用同种型试剂盒，发现mab fl133.63和mab fl133.67是igg3(k链)，而mab fl134.33被鉴定为igg1(k链)。
[0229]
在克隆、扩增和纯化之后，重要的是评估这些mab与fuc-gm1阳性癌细胞系的细胞表面的结合。所有抗体均以10μg/ml的相同浓度使用，以允许进行直接比较。mab fl133.63与细胞系dms79的结合强(gm≈1000)，与细胞系dms53的结合弱(gm≈100)。mab fl133.67与dms79结合强(gm≈1000)，但不与任何其他的fuc-gm1阳性细胞系结合。mab fl134.33与dms79结合强(gm≈1000)，与h128结合中等(gm≈300)，与dms53结合弱(gm≈100)。与所有四个细胞系均结合的阳性对照mab f12表现出染色强度强更多，对于dms79，gm≈2000，对于dms53，gm≈700，对于h128，gm≈500，对于细胞系h69，gm≈100；在所有mab中，仅mab f12与细胞系h69结合。mab fl134.33在与细胞系h128的结合中表现出异常行为，强度比与细胞系dms53结合时更强；据报道，dms53表达的fuc-gm1量高于细胞系h128，这是通过mab f12染色证实的结果(图9)。
[0230]
对所有三种mab进行与健康人志愿者的全血结合的筛选，并且该所有三种mab表现出不与存在的任何有核细胞结合。同种型igg1、igg3和f12用作阴性对照，而抗mhc1类mab用作阳性对照(图10)。
[0231]
实施例2：定义由fuc-gm1 mab识别的表位
[0232]
通过糖脂elisa评估mab fl133.63、mab fl133.67和mab fl134.33对fuc-gm1的特异性，其中测试mab与一系列可用的纯化的神经节苷脂(即fuc-gm1、gd3、gm1、gm3、gd1a、gt1b、gb3和乳糖基神经酰胺)的结合。在1μg/ml-0.01μg/ml的浓度下，所有三种mab仅识别神经节苷脂fuc-gm1。在1μg/ml-0.01μg/ml的浓度下，阳性对照mab f12也识别fuc-gm1。在1μg/ml-0.01μg/ml的浓度下，通过阳性对照mab r24检测到神经节苷脂gd3。在1μg/ml下，通过阳性对照霍乱毒素b亚单位(ctxb)检测到神经节苷脂fuc-gm1、gm1和gd1a。尚未开发出对gm3、gt1b、gb3和laccer具有特异性的igg mab。
[0233]
为了进一步验证mab fl133.63、mab fl133.67和mab fl134.33与fuc-gm1的结合，在纯化的fuc-gm1与在细胞系dms79上表达的该神经节苷脂之间的竞争试验中对它们进行了评估。在该实验中，在将mab与纯化的fuc-gm1预孵育，然后将其用作流式细胞术中的主要试剂。将mab fl133.63与神经节苷脂fuc-gm1预孵育使其与dms79细胞系的结合从gm＝523降低到gm＝4，mab fl133.67的结合从gm＝201降低到gm＝3，mab fl134.33的结合从gm＝
434降低到gm＝29，阳性对照mab f12的结合从gm＝1195降低到gm＝6。将阴性对照mab抗mhc1类与神经节苷脂fuc-gm1预孵育对其与dms79细胞的结合没有影响(图12)。
[0234]
为了进一步阐明fl133/134mab的精巧特性，由功能糖原组学联盟针对≥600种天然和合成聚糖进行筛选。fl133.63(图13a)与聚糖阵列的结合表明(图2)，出乎意料地，fl133.63不能与在直接附着到芯片fucgm1sp0(图中编号63)时的fucgm1(游离糖)结合或fl133.63不能与通过九碳间隔物fuc-gm1sp9(图中编号64)附着到芯片的fucgm1(游离糖)结合。
[0235]
表2.fl133.63与糖组阵列上的糖的结合
[0236][0237]
fl134.33(图13b)与聚糖阵列的结合表明(图3)，出乎意料地，fl134.33不能与直接附着到芯片fucgm1sp0(图中编号63)时的fucgm1(游离糖)结合，并且当fucgm1(游离糖)通过九碳间隔物fuc-gm1sp9(图中编号64)附着到芯片时结合非常弱。
[0238]
表3.fl134.33与糖组阵列上的糖的结合
[0239][0240][0241]
最后，这些mabs对fuc-gm1的特异性也通过薄层层析法分析得以证实。将纯化的神经节苷脂fuc-gm1、纯化的神经节苷脂gm1和dms79 pm tgl加载到二氧化硅板上。所有三种
fuc-gm1 mab均识别纯化的fuc-gm1和存在于dms79 pm tgl中的条带，dms79 pm tgl的移动距离与纯化的fuc-gm1相同。没有抗体与纯化的神经节苷脂gm1结合。此处生成的fuc-gm1 mab的识别模式与阳性对照mab f12的识别模式相同，后者也识别纯化的fuc-gm1和dms79 pm tgl。令人惊讶的是，mab f12与纯化的神经节苷脂gm1弱结合，这种结合在先前的试验中未检测到(图14)。
[0242]
利用biacore x通过spr确定抗fuc-gm1 mab对其抗原的亲和力。最初用于产生三种抗fuc-gm1mab的hsa-fuc-gm1偶联物用作分析的靶标。通过elisa证实了抗fuc gm1 mab与偶联物的结合(图15)。
[0243]
为了将hsa-fuc-gm1偶联物耦合到cm5生物传感器芯片，首先用hsb-p缓冲液洗涤芯片，然后应用交联剂edc-nhs。接着将hsa-fuc-gm1偶联物以20μg/ml稀释在乙酸盐4.5偶联缓冲液中而注射到流动池中。注入5μl体积后，将686个应答单元的偶联物附着到芯片上。最后，用乙醇胺封闭未反应的偶联剂。使用hsa-fuc-gm1涂布的流动池，根据稀释于hbs-p缓冲液中的抗体的几个已知浓度，确定结合动力学参数。使用由biacore仪器提供的曲线拟合软件(biaevaluation)来产生缔合速率和解离速率的估计值，使用最佳拟合二价分析物模型由缔合速率和解离速率的估计值来计算亲和力。该模型计算二价蛋白的亲和力，但仅能计算抗体第一臂的附着的有意义的数据。根据该模型，fuc-gm1 mab具有平均缔合速率常数kon(mab fl133.63为3.56
×
104ms-1
，mab fl133.67为9.43
×
103ms-1
，mab fl134.33为2.01
×
103ms-1
)，但是具有非常快的解离速率常数koff(mab fl133.63为0.0637s-1
，mab fl133.67为0.0783s-1
，mab fl134.33为0.117s-1
)，导致这些mab的总体功能性亲和力低(mab fl133.63为1.8
×
10-6
m，mab fl133.67为8.3
×
10-6
m，mab fl134.33为5.8
×
10-5
m)(表4)。
[0244]
表4：通过spr确定的抗fuc-gm1 mab的动力学结合参数
[0245][0246]
通过在纯化的fuc-gm1和dms79细胞上分别滴定3种fuc-gm1抗体来确定它们的ec
50
和平衡解离常数。由fuc-gm1 elisa得到的ec
50
值和对dms79细胞的流式细胞术分析表示的功能性亲和力高于通过spr评价给出的值。mab fl133.63对于fuc-gm1 elisa的ec
50
为1
×
10-9
，对于dms79细胞的kd＝7.5
×
10-9
。这是通过spr建立的亲和力的1000倍。mab fl133.67对于fuc-gm1 elisa的ec
50
为2.1
×
10-9
，对于dms79细胞的kd＝1.2
×
10-8
。这是通过spr建立的亲和力的100至1000倍。mab fl134.33对于fuc-gm1 elisa的ec
50
为9.2
×
10-10
，对于dms79细胞的kd＝6.3
×
10-9
。这是通过spr建立的亲和力的10,000倍。这些结果表明，spr分析测量了单价抗体结合。当与细胞表面的抗原结合时，抗体的亲和力大大增强。
[0247]
实施例3：功能试验
[0248]
由于所有三种fuc-gm1 mab均与dms79细胞系结合，因此建立它们的效应器功能也
很重要。mab fl134.33(igg1)表现出50％至80％的adcc细胞毒性(取决于供体)，但仅20％的cdc细胞毒性。mab fl133.63(igg3)和mab fl133.67(igg3)均显示出20％的adcc细胞毒性，但cdc介导的细胞毒性为60％至80％。这些结果与先前报道的研究一致，这些研究表明，具有igg1同种型的mab在诱导adcc方面更有效，而igg3同种型的mab在诱导cdc方面更有效(lopez et al.,1983,niwa et al.,2005,bruggemann et al.,1987,natsume et al.,2008)。相反，阳性对照鼠mab sc101(igg1)对dms79细胞表现出70％adcc和80％cdc介导的细胞毒性(图17)。
[0249]
实施例4：嵌合mab
[0250]
对mab fl133.63、mab fl133.67和mab fl134.33进行测序，并使用程序imgt/v_quest将vh链和vl链的序列与种系igg抗体的序列进行比较。总之，所有数据都证明了体细胞超突变的证据,也表明存在一些亲和力成熟。所有三种fuc-gm1抗体的vh链都定位到基因v3、亚组1和等位基因02。与种系序列相比，mab fl134.33的vh区包含14个取代突变和7个氨基酸变化，mab fl133.63包含8个取代突变和6个氨基酸变化，而mab fl133.67包含6个取代突变和4个氨基酸变化(图18和表5)。
[0251]
所有三种mab在fr2中都包含导致氨基酸变化m53＞v的转换突变a157＞g。所有三种mab在cdr2中都含有导致氨基酸变化s59＞r的颠换突变a157＞c和导致氨基酸变化s64＞n的转换突变g191＞a。所有三种mab在fr3中都含有沉默颠换突变t231＞a、导致氨基酸变化s83＞y的颠换突变c248＞a、和最后的沉默转换突变c309＞t。
[0252]
mab fl134.33在fr1中还含有导致氨基酸变化d1＞a的颠换突变a2＞c、沉默转换突变g9＞a、和沉默转换突变c69＞t；在fr3中，还含有沉默转换突变c198＞t、导致氨基酸变化i76＞v的转换突变a226＞g、沉默转换突变g267＞a、沉默转换突变g273＞a、和导致氨基酸变化v94＞l的颠换突变g280＞c。
[0253]
mab fl133.63还含有导致氨基酸变化f87＞l的转换突变t259＞c和导致氨基酸变化q90＞r的转换突变a269＞g。
[0254]
表5：vh区突变和氨基酸变化
[0255][0256]
所有三种fuc-gm1抗体的v
l
链都定位到基因k5、亚组39和等位基因01。与种系序列相比，mab fl134.33的v
l
区包含10个取代突变和6个氨基酸变化，mab fl133.63包含7个取
代突变和6个氨基酸变化，而mab fl133.67包含7个取代突变和6个氨基酸变化(图19和表6)。
[0257]
表6：vl区突变和氨基酸变化
[0258][0259][0260]
所有三种mab在cdr1中都含有导致氨基酸变化y38＞d的转换突变t112＞g。所有三种mab在cdr2中都含有导致氨基酸变化a57＞v的转换突变c170＞t。所有三种mab在fr3中都含有导致氨基酸变化s90＞t的颠换突变g269＞c、和沉默转换突变g303＞a。
[0261]
mab fl134.33在fr1中还含有导致氨基酸变化a9＞d的颠换突变c26＞a；在fr2中，还含有沉默转换突变g153＞a；在cdr2中，还含有沉默转换突变c195＞t；在fr3中，还含有导致氨基酸变化g84＞r的转换突变g250＞a和g252＞a、以及导致氨基酸变化v101＞l的颠换突变g301＞c。
[0262]
mab fl133.63在fr1中还含有导致氨基酸变化t5＞s的颠换突变c14＞g；在cdr1中，还含有导致氨基酸变化s36＞g的转换突变a106＞g；在fr3中，还含有导致氨基酸变化d86＞y的颠换突变a256＞t。
[0263]
mab fl133.67在fr1中还含有导致氨基酸变化t5＞s的颠换突变c14＞g；还含有导致氨基酸变化s67＞y的颠换突变c200＞a、和导致氨基酸变化n92＞k的颠换突变c276＞g。
[0264]
在已获得可变区序列的三种抗体中，fl134.33是嵌合的首选抗体。为了允许对抗体的两个序列均进行克隆，必须专门为它们设计引物，并且必须将限制酶位点引入其中。双表达载体包含用于轻链的酶bamhi和bsiwi以及用于重链的酶hindiii和afei的限制性位点。引物可变区插入物还必须具有在消化后产生与载体粘性末端相容的粘性末端的位点。然而，在fl134.33的情况下，不能将用于bamhi消化的限制位点添加到引物中，因为该位点也存在于轻链的内部序列中。为此，需要产生与bamhi限制位点相容的粘性末端的替代消化位点。发现具有所述特性的限制酶是bgiii。
[0265]
设计并用于进行pcr扩增和随后的克隆程序的引物为：包含bgiii限制性位点的用于轻(κ)链正向的5'-attaagatctaagatggtgtccacttctcagctc-3’，和包含bsiwi限制性位点的用于轻(κ)链反向的5'-aattcgtacgtttgatttccagc ttggtgcct-3’。另外，5'-taataagcttaagatgagagtgctgattcttttg-3’是重链正向引物，包含hindiii限制性位点，5'-agagcagcgctggagacggtgact gaggt-3’是重链反向引物，包含afei限制性位点。用正向引物和反向引物并使用校读聚合酶来建立pcr反应。通过琼脂糖凝胶电泳中产物的存在证实了轻链和重链两者的扩增。将重链和轻链克隆到topo载体中，并转化到补充有氨苄西林的到化学感受态细胞中以进行选择性生长。选择6个携带轻链的菌落和6个携带重链的菌落在液体培养物中生长，并通过miniprep来制备质粒dna。凭借bamhi的内部限制性位点所代表的优势，酶消化可以证明是一种确定正确序列是否实际克隆到载体中的可靠方法。然后使用ecori(存在于克隆位点的5'和3'两端的两个位点)和bamhi bsiwi(分别为序列中间的内部位点和引物结合位点)进行酶消化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行评价。载体的ecori消化在针对轻链筛选的两个菌落和针对重链筛选的三个菌落中显示出预期尺寸(400bp)的序列。bamhi加bsiwi在针对轻链筛选的两个菌落和针对重链筛选的三个菌落中显示出预期尺寸(200bp)的序列。在通过测序确认正确克隆后，选择每条重链和轻链的一个菌落并使其在补充有氨苄西林的培养基中生长过夜，用于后面通过maxiprep来制备质粒dna。
[0266]
尽管先前已证明将pcr产物直接克隆到双表达载体中效率相对较低，但仍以期望其正常工作的方式进行了尝试。将轻链的pcr产物克隆到pdcorig-higg1载体中后，进行转化并将细胞在补充有吉欧霉素(zeocin)的培养基中培养过夜。通过miniprep来制备质粒dna，然后用bamhi和bsiwi对质粒进行酶消化。预期如果将正确的重链引入载体中，则凝胶上会出现200bp的小条带(来自序列中存在的内部bamhi)。然而，如果不引入重链并且在载体中保留原始链，则将显示400bp的条带(原始序列缺少内部bamhi位点)。少数菌落出现了正确插入的预期错误，后序列证实了轻链成功直接克隆到载体中。然后，选择一个菌落，使其在补充吉欧霉素的培养基中生长过夜，用于后面通过maxiprep来制备质粒dna。
[0267]
在确认轻链已引入pdcorig-higg1载体中时，也准备好重链的topo克隆并制备质粒。因此，不是尝试直接克隆pcr产物，而是通过琼脂糖凝胶纯化和提取，用酶hindiii和afei酶消化已制备好的topo载体来获得重链。在将凝胶纯化的重链序列克隆到含有轻链的
pdcorig-higg1载体中之后，进行转化，并将细胞在吉欧霉素补充培养基中培养过夜。通过miniprep制备质粒dna，然后用hindiii afei和hindiii bamhi afei进行酶消化。预期仅使用两种酶时，消化将显示约400bp的条带，而使用三种酶(由于重链在其中间也包含bamhi位点)将显示约200bp的条带。将呈现小200bp的菌落送去测序，在确认克隆正确后，选择其中一个并使其在吉欧霉素补充培养基中生长过夜，用于后面通过maxiprep来制备质粒dna。通过光谱学以776ng/μl确定质粒制备的收率。一旦证实抗体fl134.33的轻链和重链的序列，将质粒用于转染cho细胞。
[0268]
一旦该序列被证实包括预期的与人恒定区偶联的鼠重可变区和轻可变区，则进行瞬时转染。将15μg含嵌合抗体ch134.33的载体与cho-s细胞在lipofectamine存在下孵育，并在500ml培养基悬浮液中培养一周。在蛋白g柱上纯化含有mab的上清液，并在ph 8时洗脱。抗体的最终收率为0.4mg。
[0269]
抗体功能试验
[0270]
试验中测试的mabs如下：fl134.33、fl133.63、fl133.67和ch134.33，以在小鼠版本和嵌合版本之间以及在三种小鼠抗体之间进行直接比较。所有抗体均与fuc-gm1结合良好(图20)。还测试了抗体与显示出不同水平的fuc-g
m1
表达的四种细胞系dms79、dms53(atcc，米德尔塞克斯,英国)、h128和h69(ecacc.，索尔兹伯里,英国)的结合。阳性对照为市售的抗fuc-g
m1
(fujirebio，东京，日本)，阴性对照为鼠igg1同种型(dako，斯托克波特,英国)。除dms79之外，在所有细胞系中，阳性对照f12均发出最强的信号，其中fl134.33显示出更强。嵌合ch134.33与dms79细胞的结合良好(图21)。
[0271]
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