用于分析流体样品的生物活性的方法和系统与流程

1.本发明涉及用于分析流体样品的生物活性，例如用于确定微生物的存在、浓度和/或活性和/或用于确定微生物的一个或多个特性的系统和方法。


背景技术：

2.微生物和生物活性的检查用于许多不同的流体或固体的流体提取物。例如，通常检查水中是否有寄生虫，检查生物体液中是否有与疾病相关的微生物，检查建筑元素是否有真菌生长，以及检查食物是否有微生物生长。此外，在工业过程中，对微生物进行各种检查(包括定性和定量检查)是标准的。
3.许多此类检查是在实验室中进行的，通过采集样品并将样品在培养基上或培养基中培养，直到可以识别出微生物。这样的检查通常需要几天时间并且非常费力。此外，微生物的浓度可能非常低，这需要在检查前对样品进行浓缩。
4.在许多情况下，检查既快速又准确是非常重要的。例如，如果饮用水被高水平的微生物(例如大肠杆菌)污染，立即停止供应以避免污染管道并避免人们对水感到不适，这一点至关重要。
5.us2014342397公开了一种适用于在线应用的用于检测水中颗粒，特别是寄生虫的装置和方法。该方法包括使至少一部分水通过过滤器；利用超声波对过滤器进行间接超声处理以释放寄生虫，这些寄生虫已收集在过滤器中，不会破坏寄生虫；收集寄生虫进行检测；以及检测收集到的寄生虫。这用于在过滤器中收集寄生虫和/或在过滤器之前增加寄生虫的浓度和/或在不破坏寄生虫本身的情况下破坏聚集体。
6.us2011315625公开了一种用于检测微生物，例如混合物中的酵母和细菌的方法和装置。方法包括使样品混合物通过过滤装置，该过滤装置已用去污剂预处理，将滤渣从过滤膜中重悬，并检测滤渣中微生物的存在。
7.us3741877公开了一种用于收集和培养从水溶液中获得的微生物的结构，该结构包括密封到含有微生物营养物的吸收垫的一个表面的过滤器。水溶液中的微生物在垫的毛细作用下通过过滤器过滤。微生物沉积在过滤器上，流入垫的水溶液提供了用于接触营养物和生物体的载体。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的是提供一种用于分析流体样品的生物活性的系统和方法，其快速、操作简单、具有高精度和高灵敏度。
9.在一个实施例中，一个目的是提供一种用于分析流体样品的生物活性的系统和方法，即使在微生物浓度非常低的情况下也能够执行非常准确的分析。
10.在一个实施例中，一个目的是提供一种用于分析流体样品的生物活性的系统和方法，通过使用该系统和方法可以确定微生物的一个或多个特性。
11.这些和其他目的已经通过如权利要求中限定的和如下文所述的本发明来解决。
12.已经发现，本发明或其实施例具有许多额外的优点，这对于本领域技术人员而言从以下描述中将是清楚的。
13.已经发现一种用于分析流体样品的生物活性的方法非常快速和准确。
14.该方法包括
15.·
提供过滤器单元，该过滤器单元包括具有正面和背面的膜，
16.·
使流体样品从过滤膜正面通过过滤膜，
17.·
将过滤器单元应用在容器中，
18.·
将培养基添加到容器中，以及
19.·
使用至少一个所选择的扫描波长执行过滤膜的扫描和图像分析程序。
20.扫描是光学3d扫描并且包括沿着至少一个扫描路径获取多个图像。
21.即使流体样品中微生物的浓度非常低，该方法也可用于确定生物活性。样品可以根据需要很大，例如从几微升直到多升，例如从0.1毫升到约100升，例如从0.5毫升到500毫升。典型的样品量将是从约1毫升到约100毫升。
22.流体样品可以是包括流体液体和/或气体的样品。
23.流体样品可以例如通过将流体样品挤压通过过滤膜，例如通过在过滤膜背面的一侧施加减压(例如真空)而通过抽吸、通过泵送和/或通过离心来通过过滤膜。
24.流体样品中的微生物被收集在过滤膜上和/或其中，并且通过将由过滤膜收集的微生物置于培养基中，然后扫描过滤膜，可以非常快速地确定微生物是否已经收集在过滤膜中和/或过滤膜上，有利地，可以确定收集的微生物的数量和/或质量(活的或死的)，并且由此可以确定液体样品中微生物的浓度。
25.过滤器的正面是流体从那里进入过滤器的过滤器面，过滤器的背面是与正面相对的面。
26.通常滤液的主要部分被收集在过滤器的正面，而诸如一些微生物之类的小颗粒可能会进入过滤膜并在过滤膜中被捕获。
27.应该强调的是，本文使用的术语“包括/包含”应被解释为一个开放的术语，即，它应被视为具体说明存在具体陈述的特征，例如元素、单元、整体、步骤、组件及其组合，但不排除存在或添加一个或多个其他所述特征。
28.对“一些实施例”或“一个实施例”的引用是指结合此类实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在所公开主题的至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“在一些实施例中”或“在一个实施例中”不一定指的是相同的实施例。此外，本领域技术人员将理解特定特征、结构或特性可以在如权利要求限定的本发明范围内以任何合适的方式组合。
29.术语“基本上”在本文中应理解为包括普通的产品差异和公差。
30.在整个说明书或权利要求书中，除非上下文另有说明或要求，否则单数包括复数。
31.如本文所述的本发明的所有特征和本发明的实施例，包括范围和优选范围，可以在本发明的范围内以各种方式组合，除非存在不组合这些特征的特定原因。
32.样品可以包括液体和/或气体。水基样品中的样品是有利的。样品可以有利地是选自废水、地表水、饮用水、洗涤水、流质食品、人或动物体液(例如唾液或尿液)的样品、或包含其中任何一部分的任何样品。样品的其他示例包括渗出液，例如伤口渗出液和从皮肤上
刮下并与液体(例如，水)混合的样品。
33.可以使用适用于本发明的方法的任何扫描和分析程序来执行扫描和图像分析程序。例如在us2016069786a、wo11072698a1、us2011261164a、us2017350800a和/或us2003138139a中描述了可以应用的扫描和图像分析程序的示例，其中扫描和图像分析程序被修改以执行过滤膜的3d扫描，并且优选地使得3d扫描包括过滤膜的至少一部分厚度并且有利地包括过滤膜正面处的至少一层培养基。
34.在一个实施例中，扫描是或包括延时系列扫描。延时系列扫描例如可以包括在每次扫描之间以第一时间延迟执行连续扫描，然后以第二时间延迟运行各个扫描的图像或处理后的图像，该第二时间延迟有利地比第一时间延迟短。例如，可以在每次扫描之间以大约1分钟到2小时执行相应的连续扫描，并且可以运行相应扫描的图像或处理后的图像，例如，通过在彼此之后立即显示，例如具有1到30秒的第二时间延迟。
35.在一个实施例中，延时系列扫描包括将多个后续扫描中的每一个与作为相应的后续扫描的先前扫描的一个或多个扫描进行比较。
36.在一个实施例中，延时系列扫描包括将历史图像与后来获取的图像进行比较。
37.已经发现，通过将最近获取的与一个或多个先前扫描(例如包括紧邻的先前扫描)连续比较，可以获得生物活性的令人惊讶的快速确定。
38.有利地，过滤膜对于至少一种扫描波长是至少部分透明的。过滤膜不必是完全透明的。有利地，当浸入水中或浸入培养基中时，过滤膜对于所选择的扫描波长是至少约2％透明的。浸入水或培养基中应该有利地刚好足以覆盖过滤膜。
39.过滤膜可以有利地嵌入培养基中。
40.透明度可以通过以大约90度的角度(法向入射)向膜的正面发射包含所选择的扫描波长的光束并确定所选择的扫描波长通过膜的百分比来确定。
41.在透明度非常低的情况下，可以选择另一个扫描波长或几个扫描波长。此外，或可替代地，可以增加至少一种所选择的扫描波长的强度。
42.优选地，当浸入水中或浸入培养基中时，对于所选择的扫描波长，过滤膜是至少约10％透明的，例如是至少约50％透明的。
43.已经发现，在所选择的扫描波长处，在过滤膜材料的折射率相对接近于培养基的折射率的情况下，对生物活性的分析特别地将是准确、有效和快速的。在过滤膜没有浸入培养基中的情况下，由于过滤膜中的小开口，光波可能会向多个方向散射。然而，当过滤膜浸入培养基中，且在所选择的扫描波长处，培养基的折射率相对接近过滤膜的折射率时，过滤膜可能变得至少在该或这些扫描波长处基本上不可见。
44.在一个实施例中，过滤膜是在所选择的扫描波长处具有小于约1.5，例如在1.25和1.38之间，例如在1.3和1.35之间的折射率的材料。
45.在一个实施例中，过滤膜在波长589.29nm处具有小于约1.5，例如在1.25和1.38之间，例如在1.3和1.35之间的折射率。
46.优选地，过滤膜由具有过滤膜折射率的材料制成并且培养基具有培养基折射率，其中过滤膜折射率和折射率差(rid)之间的rid在所选择的扫描波长处和/或在波长589.29nm处小于约0.35，例如小于约0.1，例如小于约0.05，例如小于约0.025，例如小于约0.01。已经发现，低rid特别有利于快速检测生物活性。例如，扫描可以在过滤膜与培养基接
触并嵌入培养基后立即开始，即省略中间培养。
47.在一个实施例中，可以在几个小时内确定生物活性。有利地，过滤膜具有透明度和折射率，其被选择使得当过滤膜浸入培养基中时，扫描和图像分析程序将揭示膜上是否存在厚度为0.6-0.7μm的微生物，所述扫描和图像分析程序包括选自至少一个波长的相速度、群速度色散、波色散、波前、波相位、群延迟色散或飞行时间的扫描的波特性扫描。
48.因此，如果微生物对于所选择的扫描波长改变相速度、群速度色散、波色散、波前、波相位、群延迟色散或飞行时间中的至少一者，则过滤膜可适用于执行本发明的方法。
49.这可以通过比较微生物存在的所选择的扫描波长的相速度、群速度色散、波色散、波前、波相位、群延迟色散或飞行时间的扫描与微生物不存在的情况下的相应扫描来确定。微生物可以例如是大肠杆菌。
50.因此，在一个实施例中，该方法包括使用相速度、群速度色散、波色散、波前、波相位、群延迟色散或飞行时间的扫描来分析生物活性。
51.有利地，该至少一个所选择的扫描波长包括多个扫描波长，例如波长范围和/或两个或更多个离散波长。因此，对微生物执行形态分析会更简单。
52.优选地，以至少约0.05μm，例如从约1μm到约5mm，例如从约5μm到约3mm的扫描深度执行扫描。
53.由此，可以分析在过滤膜内捕获的微生物。迄今为止，从未有人建议分析过滤膜内捕获的微生物。由于样品中的微生物可能具有多种尺寸，因此这种微生物很可能会被捕获在过滤膜内。因此，包括分析过滤膜内捕获的微生物的方法更加准确。此外，可以非常准确地获得微生物数量的定量确定。
54.在一个实施例中，微生物包括真菌和/或病毒和/或噬菌体。
55.在一个实施例中，该方法包括执行用于检测或量化病毒的测定。
56.a)液体样品中潜在的病毒含量通过过滤保留在过滤膜上。将具有捕获的病毒的过滤器放置在优选的融合单层宿主细胞上并用固化培养基覆盖。宿主细胞是例如用于噬菌体或用于病毒的细菌。
57.b)将可能带有病毒的液体样品与宿主细胞混合并通过过滤保留在过滤膜上。将带有捕获的病毒和细胞的过滤器放置在固化培养基上或直接放在透明窗口上并用固化培养基覆盖。
58.c)潜在病毒感染的细胞通过过滤保留在过滤膜上。将带有捕获的细胞的过滤器放置在固化培养基上或直接放在透明窗口上并用固化培养基覆盖。
59.连续监测细胞在其起始裂解周期中的感染单位。感染性病毒从最初感染的宿主细胞迁移到周围细胞，导致附近细胞裂解，形成斑块。这被称为斑块形成单位(pfu)，通常看起来很清晰，因为该区域包含被破坏的细胞。
60.在某些情况下，病毒不会杀死宿主细胞，但可能会形成可见的受感染细胞群(表示为病灶)，并作为病灶形成单位(ffu)进行计数。
61.有利地，3d扫描包括扫描过滤膜厚度的至少一部分。优选地，扫描包括扫描整个过滤膜厚度。
62.在一个实施例中，3d扫描包括扫描整个过滤膜厚度并且包括位于邻近膜的正面的至少一定体积的培养基，和可选地位于邻近培养基背面的一定体积的培养基。
63.包括活微生物的滤液可以被捕获在过滤膜的厚度内，即在其正面和背面之间。通过过滤膜材料和培养基的折射率匹配，现在可以光学访问捕获在过滤膜内的滤液，甚至是位于膜侧后侧的物体。因此，生物活性的检测对过滤器表面方向(上/下)变得不敏感。
64.然而，当该方法包括确定微生物菌落的生长时，方向可能很重要。当过滤膜正面面向容器底部时，有限体积的培养基可以位于容器底部和过滤器之间。菌落可能限于在该体积中生长，因为菌落可能难以生长到过滤膜中。尽管微生物可能在过滤膜内部生长，但膜中有限的空间可能导致有限的生长。
65.因此，在生物活性包括一种或多种微生物菌落的活性的情况下，过滤膜的正面背向容器底部可能是有利的。
66.在一个实施例中，过滤膜正面面向容器的底部，并且位于正面的微生物的生长被限制在由容器底部和过滤器正面在几何上限定的薄培养基层中。待扫描的体积将相当小，因此可以快速确定任何生长和生物活性。这个起点对于cfu确定来说可能很好，因为在几次细胞分裂后可能已经可以测量到菌落。
67.在菌落的某些类型确定中，允许生长发生在更大厚度的培养基中可能是有利的，使得菌落可以自由形成3d结构，该3d结构可用于微生物的分型确定。然而，不排除薄层生长可能产生适合类型分化和类型确定的菌落结构(二维)。
68.此外，使生物活性尽可能靠近窗口(例如容器的底部或获得扫描图像的盖子)可能是有利的：对于典型的成像系统，点失真随着通过窗口以及活性和窗口之间的培养基的光路的延长而增加。即，通过使该光路变小，可以使失真最小化。
69.在一个实施例中，对包括滤液和周围薄层培养基的整个过滤膜进行3d扫描显微术和图像分析。有利地包括该培养基，特别是在它用指示性物质功能化的情况下，其例如导致所选择活性的颜色变化。例如，显色培养基可能会导致对细菌、古细菌(细菌)和真菌分泌的特定酶产生局部颜色反应。
70.可以使用包括光发射器和图像获取装置的扫描仪来执行扫描，其中图像获取装置具有光轴。
71.扫描路径可以与光轴具有任何角度，但是优选地，扫描路径基本上正交于光轴。
72.在一个实施例中，扫描路径可以与光轴重合。在一个实施例中，扫描路径与光轴的角度高达约45度，例如高达约30度，例如高达约15度，例如高达约10度，例如高达约5度，例如高达约2.5度，例如高达约1度。
73.有利地，光发射器具有布置成与过滤膜的正/背面成角度的中心轴，该角度高达约45度，例如高达约30度，例如高达约15度，例如高达约10度，例如高达约5度，例如高达约2.5度，例如高达约1度。图像获取装置可以有利地相对于过滤膜正/背面倾斜相应的角度。
74.扫描和图像分析程序有利地包括沿着扫描路径连续执行扫描并且对于每次扫描生成一组所获取的图像。扫描可以一个接一个地立即执行，或者在各个扫描之间可能存在时间延迟。时间延迟可以例如取决于先前扫描之间的任何差异，因此与观察到较少生物活性的地方相比，在生物活性较高的地方增加扫描频率。
75.有利地，扫描和图像分析程序包括沿着扫描路径执行背景扫描并生成一组背景图像。这些背景图像或一个或多个合成图像包括来自这些背景图像的数据。
76.该组背景图像优选地在已经将培养基添加到容器中之后尽可能早地生成。优选地
在20分钟内，例如10分钟内，例如5分钟内，例如1分钟内。
77.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括通过一种方法处理每组所获取的图像，该方法包括从该组所获取的图像的相应所获取的图像的对应像素值中减去相应背景图像的对应像素值。
78.因此，由于生物活性引起的任何变化都将被非常快速地检测到，并且可以高精度地显示出来。可以抑制由于过滤膜的微小缺陷以及过滤膜材料和培养基之间的微小折射率差异引起的噪声。
79.扫描和图像分析程序可以包括从相应组的所获取的图像来合成结果图像。合成可以包括生成从另一个视点(例如从与过滤器前部呈90度)看到的图像，合并部分或整个图像，例如使得过滤膜的一部分和在过滤膜的整个深度中的所有生物活性可以在一个图像中看到。在一个实施例中，每个结果图像主要是从一组所获取的图像合成的。优选地，每个结果图像是从一组所获取的图像和可选地高达10％的先前所获取的图像的替换图像合成的。
80.每组所获取的图像可以有利地与时间属性相关联，该时间属性表示获取所选择的一个图像的时间，例如获取扫描的第一个图像的时间或获取扫描的最后一个或任何其他预选择图像的时间。
81.因此，可以提供从连续扫描生成的图像组表示作为时间的函数的所获取的图像组。
82.在一个实施例中，结果图像中的每一个与主要用于图像合成的所获取的图像组的时间属性相关联。因此，每个图像和每个合成图像都与时间属性相关联，这使得对图像进行排序以确定生物活性变得更加简单。
83.扫描和图像分析程序原则上可以使用任何类型的显微技术来执行。例如，扫描和图像分析程序可以包括明场显微术、暗场显微术、相差显微术和/或荧光显微术。
84.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括倾斜照明、离轴照明、多轴照明(例如双轴照明)和/或直列式照明，可选地，照明可以从一次扫描到下一次扫描不同。
85.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括光透射扫描和/或光反射扫描。
86.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括高光谱扫描和成像。
87.已经发现高光谱扫描在本方法中非常有益。高光谱扫描包括以多个所选择的扫描波长对其进行扫描。传感器可以将信息收集为图像的波长组，其中每个图像代表电磁光谱的一个窄波长范围，也称为光谱带。这些“图像”组合起来以形成一个三维(x,y,λ)高光谱数据立方体以进行处理和分析，其中x和y代表场景的两个空间维度，λ代表光谱维度(包括一系列波长)。
88.这些传感器的精度可以用光谱分辨率来度量，光谱分辨率是捕获的每个光谱带的宽度。如果扫描仪检测到大量相当窄的频带，即使仅在少量像素中捕获物体，也可以识别物体。
89.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括至少一个波长的波特性扫描，其中波特性包括至少一个波长的特性，该特性取决于它通过的材料。波特性的示例包括相速度、群速度色散、波色散、波前、波相位、群延迟色散、飞行时间或它们的任意组合。
90.波特性扫描可用于非常快速地检测是否有任何颗粒或微生物已被过滤膜捕获。为了表征微生物，可以优选使用可见光范围内的所选择的扫描波长。
91.飞行时间是对物体、颗粒或波在培养基中传播一段距离所用时间或被反射所用时间的度量。如果过滤器对波长至少部分透明，并且捕获的颗粒/微生物对波长没有透明度或具有其他程度的透明度，则飞行时间扫描仪将检测到这一点。
92.在波特性扫描包括波前扫描的情况下，可以应用波前传感器从通过过滤膜之后的具有所选择的扫描波长的光来测量检测到的光信号中的任何波前像差。如果波前像差从一次扫描到后续扫描增加，则表明存在生物活性。
93.在一个实施例中，波特性扫描包括沿扫描路径(例如，至少一个扫描路径)获取多个波特性图像。
94.有利地，扫描和图像分析程序包括沿着扫描路径执行波特性背景扫描，并生成一组背景波特性图像，并将所获取的波特性图像中的至少一个与背景波特性图像的对应图像进行比较。
95.至少一个所选择的扫描波长原则上可以包括不妨碍生物活性(例如，通过杀死微生物)的任何波长。至少一个所选择的波长可以例如包括在200nm到1200nm范围内的一个或多个波长，例如在380nm到740nm的可见光范围内的至少一个波长，例如从450nm到700nm。
96.期望波长取决于预期在过滤膜中/上发现哪种微生物。可能需要使用所选择的扫描波长的组合，例如一个波长约为700nm，另一个波长约为400nm等。
97.在微生物可以产生颜色反应的情况下，至少一个所选择的波长优选地包括所讨论颜色的波长。例如，可以选择培养基以使得活的微生物形成颜色或改变颜色，例如由于ph值的变化。
98.紫外线范围内的波长可能会破坏微生物，因此使用此范围内的波长的强度或时间可能会受到限制。然而，一些微生物比其他微生物对紫外线范围内的波长具有更强的抵抗力，并且该因素可以例如用于表征微生物。
99.可以根据所使用的培养基有利地选择至少一个所选择的波长。
100.培养基通常呈淡黄色，在500nm以下的波长处可能具有高吸光度。
101.培养基可以或可以不吸收包括至少一个所选择的扫描波长的一些扫描光。在培养基和/或容器底部和/或过滤器吸收至少一个所选择的扫描波长的光的情况下，有利地调节所选择的扫描波长的强度以确保所获取的图像足够清晰，例如通过增加强度来补偿由于吸光度造成的光损失。
102.在一个实施例中，所述至少一个所选择的波长包括用于激发荧光团的一个或多个激发波长，所述荧光团例如存在于培养基中的荧光团、预期在微生物活化时在培养基中产生的荧光团和/或样品中预期的生物荧光活性微生物的荧光团。
103.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括高光谱显微术和/或拉曼光谱。
104.扫描和图像分析程序可以有利地包括确定一种或多种微生物和/或菌落的至少一个形态参数，例如尺寸、形状和/或质地。为了确定至少一个形态参数，可能需要在可见光范围内应用至少一个所选择的扫描波长，例如，从约450nm到约750nm。
105.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括确定一种或多种微生物和/或菌落的至少一个时间参数，例如数量、尺寸形状和/或质地的时间变化。
106.3d扫描可以有利地使用两个或更多个所选择的扫描波长来执行，并且其中图像分析程序包括光谱分析，例如两个或更多个波长之间的复用。
107.将过滤器单元应用到容器中和将培养基添加到容器中的步骤可以以任何顺序执行。在一个实施例中，在将过滤器单元应用在容器中之前和之后都添加培养基。
108.在一个实施例中，在将过滤器单元应用在容器中之前添加培养基的至少一部分。
109.在一个实施例中，培养基被预制在容器中，并且过滤器单元被放置在容器中的预制培养基上，其正面背离培养基。培养基穿透过滤膜，因此可以被过滤膜上和过滤膜中捕获的微生物接触到。
110.过滤器可以嵌入培养基中。
111.在一个实施例中，在将过滤器单元应用在容器中之后添加培养基的至少一部分。
112.容器包括底部和优选地限定开口顶部的壁。优选地，3d扫描从开口顶部执行。由此可以避免由于容器的材料引起的光的任何吸收、反射或散射。
113.即使过滤膜正面面向底部，也可以从顶部执行扫描。扫描可以包括扫描过滤膜的整个厚度。
114.在一个实施例中，将过滤器单元应用在容器中包括将过滤器单元应用在容器中，使过滤膜的正面面向容器的底部。
115.在一个实施例中，将过滤器单元应用在容器中包括将过滤器单元应用在容器中，使过滤膜的背面面向容器的底部。
116.在从底部执行扫描的情况下，容器的底部对于所选择的扫描波长至少部分透明。在一个实施例中，容器底部对于所选择的扫描波长是至少50％透明的。
117.在一个实施例中，从过滤膜的正面执行扫描。
118.在一个实施例中，从过滤膜的背面执行扫描。
119.有利地，培养基以液体形式添加。
120.培养基可以是适合生长和/或测试微生物的任何种类的培养基。
121.在一个实施例中，培养基是营养肉汤和/或琼脂。
122.培养基的示例包括以下内容：
123.营养培养基——氨基酸和氮源(例如牛肉、酵母提取物)。这是一种未定义的培养基，因为氨基酸源包含多种化合物，其确切成分未知。这些培养基包含大多数细菌生长所需的所有元素并且是非选择性的，因此它们用于保存在实验室培养集合中的细菌的一般培养和维护。
124.基本培养基——包含菌落生长可能的最低限度营养物质的培养基，通常不存在氨基酸，微生物学家和遗传学家经常使用这种培养基来生长“野生型”微生物。这些培养基还可用于选择支持或禁止特定微生物的生长。通常，必须了解有关微生物的大量信息才能确定其基本培养基要求。
125.选择性培养基——仅用于所选择的微生物的生长。例如，如果微生物对某种抗生素(如氨苄青霉素或四环素)产生抗药性，则可以将这种抗生素添加到培养基中，以防止其他不具有抗药性的微生物生长。
126.鉴别性培养基——也称为指示培养基，用于区分生长在同一培养基上的一种微生物类型与另一种微生物类型。这种类型的培养基利用微生物在添加到培养基的特定营养物质或指示剂(诸如中性红、酚红、曙红y或亚甲蓝)的存在下生长的生化特性，以明显地指示微生物的定义特性。这种类型的培养基用于微生物的检测和识别。
127.在一个实施例中，培养基是由于微生物活性而发生光学变化的培养基。
128.在一个实施例中，培养基是显色培养基，例如根据其是否为大肠菌群和大肠杆菌而局部改变颜色的显色培养基。它们分泌不同的酶。大肠菌群分泌β-d-半乳糖苷酶，使培养基变红，大肠杆菌分泌β-d-半乳糖苷酶和β-d-葡萄糖醛酸酶，使培养基变蓝。
129.该方法可以进一步包括向容器中添加附加物质，附加物质优选是杀生物剂和/或抗生素。由此，可以确定微生物或菌落对附加物质的反应，这可以提供关于微生物的附加信息。
130.在一个实施例中，培养基可以包括一种或多种继代培养物，一种或多种继代培养物可添加至培养基和/或过滤膜上。继代培养物可以有利地是促进目标微生物生长的微生物或抑制目标微生物生长的微生物，例如，通过与目标微生物竞争或通过产生抑制目标微生物生长的物质，例如对目标微生物有毒的物质。
131.目标微生物用于指代在流体样品中测试的微生物。
132.继代培养物可以例如在过滤之前添加到流体样品中。
133.在一个实施例中，继代培养物是在样品通过过滤膜后立即添加的，例如通过使包含继代培养物的流体体积通过过滤膜。
134.在一个实施例中，在过滤膜已经与培养基接触之后立即将继代培养物添加到过滤膜中。
135.在一个实施例中，在过滤膜已经与培养基接触并且已经观察到过滤膜上的生物活性的第一个迹象之后，将继代培养物添加到过滤膜中。
136.在一个实施例中，该方法包括测试治疗剂是否具有治疗患者身体部位的感染或微生物组失衡的期望效果，其中样品包括来自所述身体部位的样品，例如流体样品、尿液、唾液、伤口分泌等和/或悬浮在流体中的细胞。如上文关于添加继代培养物所述，将治疗剂添加至样品、培养基和/或过滤器。治疗剂的任何效果可以观察为相对于省略所述治疗剂的相应程序的生物活性变化。治疗剂可以例如是一种或多种益生菌，例如乳酸菌。
137.因此，可以在使用前测试治疗剂是否具有期望效果。例如，可以在将益生菌护肤品和/或伤口护理治疗剂应用于患者之前测试其是否具有期望效果。
138.在一个实施例中，该方法包括确定过滤膜上和过滤膜中的活的微生物和/或菌落的数量，并将该数量与液体样品体积相关联，以确定每体积单位的微生物数量。
139.已发现本发明的方法对于确定过滤膜正面上的滤液作为时间的函数的特性非常有用。由于生物活性引起的变化可以作为时间的函数以高精度确定，因此该方法可以包括确定一种或多种微生物的特性，例如作为对培养基和/或附加添加物质的反应。
140.在一个实施例中，扫描和图像分析程序包括执行连续扫描和生成所获取的图像组，其中，第一次扫描是参考扫描，在每次后续扫描之后，通过包括以下的方法处理后续的一组所获取的图像：从后续的一组所获取的图像的相应图像的对应像素值提取相应背景图像的对应像素值，合成至少一个结果图像并分析结果图像以指示活微生物和/或检测到的活微生物的特性。
141.在一个实施例中，该方法包括分析从同一母样品获得的多个流体样品，其中液体样品中的至少两个经受不同的培养基和/或附加物质。该方法可以包括比较来自各个流体样品的分析的结果图像。优选地，该方法包括及时比较来自各个流体样品的分析的对应的
结果图像。
142.培养基和/或添加的继代培养物可以帮助识别检测到的活微生物。此外，检测到的微生物可以直接从其生长模式、形状或尺寸来识别。在一个实施例中，可以对一种或多种检测到的微生物进行进一步识别。在一个实施例中，该方法包括从一个或多个菌落中挑选微生物，例如使用挑选方法，例如已知从传统的琼脂平板挑选。然后可以对挑选的微生物进行进一步的识别步骤。
143.在一个实施例中，该方法包括提取整个过滤膜或其一部分，并使其经受识别位于其上的微生物的附加步骤。识别微生物的附加步骤可以例如包括聚合酶链式反应(pcr)、和/或例如使用飞行时间质谱仪(maldi-tof)的基质辅助激光解吸/电离(maldi)分析。当样品包含大颗粒或其他固体或半固体物质时，可能需要对样品进行预过滤。
144.在一个实施例中，该方法包括两步过滤，该方法包括提供具有包括正面和背面的预过滤膜的预过滤过滤器单元，在将样品挤压通过过滤膜之前将流体样品从预过滤膜正面挤压通过预过滤膜，其中预过滤膜具有比过滤膜更大的截止粒径。
145.在预过滤之后，可以丢弃预过滤过滤器单元，或者该方法可以包括在过滤过程之后分析预过滤过滤器单元，其中分析包括
146.·
将预过滤过滤器单元应用在容器中，
147.·
将培养基添加到容器中，以及
148.·
使用至少一个所选择的扫描对预过滤单元的过滤膜执行扫描和图像分析程序，
149.并且其中所述扫描是光学3d扫描并且包括沿着扫描路径获取多个图像。
150.预过滤过滤器单元过滤膜可以通过本文所述的用于分析过滤器单元的过滤膜的方法进行分析。
151.该方法可以有利地使用本文描述的系统来执行。
152.本发明还包括用于分析流体样品的生物活性的系统。该系统包括
153.·
过滤器单元，包括具有正面和背面的膜以及围绕膜的过滤环装置，
154.·
过滤器外壳，适于将过滤器单元保持在临时固定位置，以及
155.·
适用于过滤器单元的容器，
156.其中过滤器外壳包括入口，用于在过滤器单元处于其临时固定位置时将流体样品馈送到外壳中并通过过滤膜，并且其中过滤器单元适于从其在外壳内的临时固定位置释放，并且转移到容器中。
157.过滤器单元、过滤膜和容器可以如上所述。
158.在一个实施例中，当浸入水中和/或浸入所选择的培养基中时，过滤膜对于所选择的扫描波长是至少约2％透明的，优选地，过滤膜对于至少一个扫描波长是至少约10％透明的，例如是至少约50％透明的。所选择的培养基可以如上所述。
159.在一个实施例中，过滤膜由以下材料制成，该材料在所选择的扫描波长下，优选地在可见光范围内和/或波长589.29nm处，在干燥条件下的折射率小于约1.5，例如在1.25和1.38之间，例如在1.3和1.35之间。
160.过滤膜可以由单一材料或材料的组合制成。
161.过滤膜有利地具有透明度和折射率，其被选择以使得当过滤膜浸入培养基中时，扫描和图像分析程序，包括选自至少一个波长的相速度、群速度色散、波色散、波前、波相
位、群延迟色散或飞行时间的扫描的波特性扫描，将揭示膜上是否存在具有诸如0.6-0.7μm的长度尺度的细胞尺寸的微生物。微生物可以如上所述。
162.过滤膜例如可以由一种或多种玻璃、一种或多种陶瓷、一种或多种半导体材料、一种或多种金属或包括上述中的一种或多种的任意组合制成。
163.过滤膜优选地由聚合物材料制成。用于过滤膜的合适材料的示例包括聚四氟乙烯(ptfe)、四氟乙烯(tfe)的共聚物、全氟环状聚合物(cytop)、全氟二甲基二氧戊环(pdd)以及包含这些中的至少一种的任意组合。
164.已经发现，无机材料的过滤膜可能无法提供期望的透明度来执行有效的光学扫描。尽管无机材料的过滤膜可以提供为非常薄且薄壁的过滤膜，使得它们在润湿条件下可能看起来具有相对低的折射率，但实际折射率(即在非润湿条件下)主要仍然很高并且与使用聚合物过滤膜相比，可能会导致扫描不那么清晰。
165.过滤膜有利地具有约0.05μm至约0.5cm，例如约1μm至约1mm，例如约10μm至约500μm，例如约30μm至约100μm的厚度。在一个实施例中，厚度为50微米或更小。
166.过滤膜的截止尺寸有利地根据要确定的期望生物活性来选择。
167.在一个实施例中，过滤膜具有约0.01μm至约500μm，例如约0.05μm至约300μm，例如约0.1μm至约100μm的截止尺寸(cut off size)。
168.膜可以有利地具有基本上平坦的正面并且优选地具有基本上平坦的背面。
169.过滤膜可以例如可以由一种方法生产，该方法包括双轴拉伸聚合物片，例如通过us 4,049,589中描述的方法。
170.为了确保过滤膜保持在稳定的位置，环有利地在20
°
处是刚性的。环优选地由聚合物材料制成，例如与过滤膜材料相容的聚合物材料。环可以例如机械固定、胶粘或焊接到过滤膜上。
171.在一个实施例中，过滤器外壳包括前部和后部。前部和后部可以可释放地安装到彼此以形成外壳。有利地，后部适于将过滤器单元保持在临时固定位置。优选地，前部和后部适于安装到彼此以将过滤器单元保持在外壳内的临时固定位置。
172.过滤器外壳的后部有利地包括用于将过滤器单元从其临时固定位置释放的释放装置。因此，过滤器单元可以以非常简单的方式转移到容器中，同时降低了污染过滤器单元的风险。优选地，后部适于将过滤器单元机械地保持在临时固定位置，并且优选地，释放装置适于将过滤器单元从其临时固定位置机械地释放。
173.在其变型中，过滤器外壳的前部适于将过滤器单元保持在临时固定位置，并且前部适于将过滤器单元机械地保持在临时固定位置，并且释放装置适于从其在前部的临时固定位置机械地释放过滤器单元。
174.过滤器外壳中用于将流体样品馈送至外壳中的入口优选地位于过滤器外壳的前部。优选地，过滤后的样品的出口位于外壳的后部。因此，过滤后的样品可以以简单的方式排出。可替代地，外壳的后部包括用于收集过滤后的样品的排放收集器。然后可以稍后处置样品，或者可以将整个外壳放置在其一次性使用的地方。
175.然而，期望外壳由可高压灭菌、干热灭菌或环氧乙烷灭菌、电子束灭菌和/或通过伽马辐射灭菌的材料制成，例如灭菌相容的聚合物、陶瓷、玻璃、金属或它们的任意组合。
176.有利地，外壳由可序列化聚合物材料制成或包括可序列化聚合物材料的材料，例
如聚乙醇酸(pga)、乙烯丙烯(二烯-)三元共聚物(epdm)、有机硅、聚偏二氟乙烯(pvf2)、聚氟乙烯(pvf)、乙烯四氟乙烯(etfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、全氟烷氧基(pfa)、聚砜(psu)、聚苯硫醚(pps)、液晶聚合物(lcp)、聚醚醚酮(peek)、高温聚碳酸酯(pc)、乙缩醛(pom)、聚丙烯共聚物(ppc)、聚丙烯(pp)、芳香族聚酰胺(ap)或其任意组合。
177.在一个实施例中，释放装置是包括至少一个弹簧的弹簧加载释放装置。优选地，当过滤器单元保持在其临时固定位置时，至少一个弹簧处于空载位置。
178.因此，可以通过将后部与前部分开，以简单的方式将过滤器单元从外壳中移除，然后可以使用外壳的后部将过滤器单元放置在容器中，并且当过滤器单元到达容器时，弹簧可被压缩以从外壳的后部释放过滤器单元。
179.容器优选地具有基本平坦的底部或凸出的底部。平坦的底部可能是优选的，因为在过滤膜和容器底部之间只有很小体积的培养基。
180.容器有利地具有适合过滤器单元的环的外周边的内壁尺寸。因此，过滤器单元可以以高精度放置。
181.在一个实施例中，当过滤器布置在容器中时，容器底部具有与过滤膜的正面一致的内表面。
182.有利地，容器底部对于所选择的扫描波长是至少2％透明的，优选地容器底部由光学级聚合物，例如聚碳酸酯(pc)、pmma、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、离聚物树脂、环烯烃共聚物、无定形共聚酯(petg)和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)制成。在一个实施例中，容器底部由玻璃和/或陶瓷材料制成。
183.容器可以有利地形成多容器板，例如多凹槽板的一部分。由此可以连续扫描几个过滤膜。
184.在一个实施例中，膜过滤器包括两个或更多个横向定位的过滤膜。例如，每个横向膜可以例如被环装置包围和分离，并且优选地被环装置彼此分离。因此，可以使用一个单一的过滤器单元来执行多个确定。该系统可以例如进一步包括容器分离器，该容器分离器适于将容器分成与横向定位的过滤膜的相应过滤膜相关的横向部分。因此，可以使横向定位的过滤膜中的一个经受一种培养基和/或附加物质，而使横向定位的过滤膜中的另一个经受另一种培养基和/或附加物质。
185.在一个实施例中，横向定位的过滤膜是相同的。
186.在一个实施例中，横向定位的过滤膜在至少一个性质上不同，例如在厚度、结构上的截止尺寸或折射率上。
187.过滤膜可以有利地包括位于预定义位置处，例如在定义坐标系的位置处的光学可检测标记。
188.这可以帮助3d扫描系统找到过滤器的焦点。
189.例如，可以使用预览来建立扫描配置文件，以确保在每个后续的小时间隔测量中实现最佳聚焦。
190.过滤器中的标记还可用于对齐来自不同时间记录的图像，特别是在过滤器可能由于培养基蒸发而移位的情况下。
191.标记可进一步用作“坐标系”以寻找菌落以进行进一步分析。颜色校准标记可用于校正培养基的颜色，从而改进光谱分析。
192.在一个实施例中，该系统还包括预过滤单元，该预过滤单元包括具有比过滤单元大的截止尺寸的预过滤膜。这种预过滤单元可用于流体样品具有许多颗粒的情况，例如较大和较小的颗粒，例如，如上述方法所述。外壳可以适于将预过滤单元保持在过滤器单元的前面。预过滤单元例如可以由外壳的前部保持在临时固定位置。优选地，前部适于将预过滤单元机械地保持在临时固定位置，并且包括弹簧可激活的释放装置，例如，如上面的后部所述。
193.该系统还可以包括至少一种培养基。优选地，至少一种培养基具有培养基折射率，其中过滤器折射率和折射率差(rid)之间的rid在所选择的扫描波长和/或在波长589.29nm处小于约0.25，例如小于约0.1，例如小于约0.05，例如小于约0.025，例如小于约0.01。
194.该系统还可以包括扫描和图像分析系统，该系统适于使用可见光范围内的至少一个所选择的扫描波长从过滤膜的正面执行过滤膜的3d反射扫描和图像分析程序，包括沿着扫描路径获取多个图像。扫描和图像分析系统可以例如如上所述。
195.包括范围和优选范围在内的本发明的所有特征可以在本发明的范围内以各种方式组合，除非有不组合这些特征的特定原因。
附图说明
196.下面结合优选实施例并参考附图进一步说明本发明。这些图是示意性的并且可能不是按比例绘制的。
197.图1a是适用于本发明的方法的过滤器单元的俯视图。
198.图1b和1c示出了包括横向定位的过滤膜的过滤器单元。
199.图2是本发明的系统的透视图，包括保持未示出的过滤器单元的过滤器外壳、注射器和适用于过滤器单元的容器。
200.图3是过滤器外壳和过滤器单元的剖视图。
201.图4是过滤器外壳和过滤器单元的透视图。
202.图5-8示出了在容器中应用过滤器的步骤。
203.图9示出了延时序列的图像。
204.图10a-10c显示了在ptfe过滤器上收集和培养的水生细菌的扫描结果的示例。
205.图11a-11b显示了在ptfe过滤器上收集和培养的水生细菌的扫描图像的示例。
206.图12a-12d示出了本发明的方法的示例的一系列步骤。
具体实施方式
207.图1中所示的过滤器单元包括过滤膜1和围绕过滤膜的环装置2。如上所述，过滤膜有利地是基本上平坦的并且包括正面和背面。
208.图1b和1c中所示的过滤器单元包括横向定位的过滤膜1a-1d。图1b的过滤器单元包括两个横向定位的过滤膜1a和1b。横向定位的过滤膜1a和1b都被环装置2a、2b围绕，其中环装置的第一部分2a限定过滤器单元的周边，环装置的第二部分2b限定两个横向定位的过滤膜1a、1b之间的交叉间隔。
209.图1c的过滤器单元包括四个横向定位的过滤膜1a、1b、1c、1d。横向定位的过滤膜1a、1b、1c、1d都被环装置2a、2b围绕，其中环装置的第一部分2a限定过滤器单元的周边，环
装置的第二部分2b限定四个横向定位的过滤膜1a、1b、1c、1d之间的两个交叉间隔。
210.横向定位的过滤膜可以布置成任何期望的构造。
211.为了确保在各个横向定位的过滤膜上均匀过滤，可能期望在各个横向定位的过滤膜上的流动阻力基本相等。带有横向定位的过滤膜的过滤器单元确保可以使用一个单一的过滤器单元(例如如上所述)执行几个确定。
212.图2中所示的系统公开了保持未示出的过滤器单元的过滤器外壳5、注射器3和适用于过滤器单元的容器4的示例。
213.过滤器外壳5包括前部5a和后部5b。未示出的过滤器单元被保持在过滤器外壳的前部5a和后部5b之间的临时固定位置。
214.注射器3被布置成将流体样品馈送至过滤器外壳5的前部5a的入口5a1。如上所述，样品可以通过任何方式被驱动通过过滤膜，因此注射器是系统的可选部分。容器4是容器板4a的一部分，容器板4a包括多个容器，例如凹槽。
215.在图3中，更详细地示出了过滤器外壳15a、15b的示例和过滤器单元16的示例。
216.过滤器单元包括具有正面f和背面r的过滤膜17和围绕过滤膜17的环装置18。环装置18延伸超过过滤膜17的背面r以形成安装装置19，用于通过过滤器外壳的后部15b机械地保持在临时固定位置。
217.过滤器外壳包括前部15a和后部15b。前部15a包括入口11，例如具有适合注射器或用于注射流体样品的其他装置的鲁尔接口(luer)联接器的形状。在过滤器外壳的前部15a的内部，设置有垫圈12，使得当过滤器外壳与过滤器单元16组装时，过滤器单元的环装置18抵靠前部15a的垫圈12密封。前部还包括用于将前部15a锁定到后部15b的锁定装置的多个滑动框架13(仅示出两个)。
218.过滤器外壳的后部15b包括第一可移动部分15c和第二可移动部分15d以及弹簧装置21，弹簧装置21被布置为保持第一可移动部分15c和第二可移动部分15d并由此提供适合于将过滤器单元从其在后部的临时固定位置机械释放的释放装置。
219.过滤器外壳的后部15b包括位于第一部分15c处的垫圈19，当过滤器外壳与过滤器单元16组装时，该垫圈将抵靠环装置18的内侧密封。支撑结构22被布置为支撑过滤膜并确保当流体样品被挤压通过过滤膜17时过滤膜不会变形或爆裂。在第二部分15d处设有卡扣和/或摩擦结构20，其适于与安装装置19配合，用于将过滤器单元机械地保持在临时固定位置。
220.第一部分15c包括最后面的凸缘15c'，并且当将第二部分15d拉向最后面的凸缘15c'时，过滤器单元在被后部15b保持在其临时固定位置时，将从该位置释放。同时，弹簧装置21被压下。直到弹簧装置21被压下，过滤器单元16才被释放。因此，弹簧装置21确保过滤器单元16被安全地保持在其临时固定位置，直到主动从那里释放。
221.过滤器外壳的后部15b的第二部分15d还包括锁定装置的多个突出锁定元件14，适于与前部15a的相同数量的滑动框架13配合，用于将前部15a锁定到后部15b。锁定元件14可以通过扭转插入到滑动框架13中，并在该位置保持所需的时间。当锁定装置处于其锁定位置时，第一可移动部分15c和第二可移动部分15d以彼此固定的关系被保持。
222.后部15b还包括出口23，过滤后的样品可以通过出口23逸出。如所提到的，后部15b可以替代地包括用于收集过滤后的样品的收集室，或者可以将附加的一次性收集室临时安
装到后部15b以收集过滤后的样品。
223.在图4中，过滤器外壳和过滤器单元以透视图示出。附图标记与图3相同。
224.图5-8示出了在容器中应用过滤器的步骤。在图5中，过滤器外壳的后部15b已从过滤器外壳的未示出的前部拆下。过滤器16保持在其相对于后部15b的临时固定位置，并且用户将要在容器4中应用过滤器单元。
225.在图6中，用户已经将过滤器单元连同后部15b的一部分插入容器4中并且压下弹簧装置以从后部15b释放过滤器单元16。
226.在图7中，可以看出过滤器单元16已经被释放并且用户正在移除后部15b。
227.在图8中，过滤器单元16现在准备好添加培养基。
228.图9显示了单个细菌在膜过滤器上15小时内形成菌落的延时图像系列的示例。
229.所描绘的细菌是从ptfe过滤器(孔径截止尺寸：0.2μm)上的流体样品中收集并嵌入pca培养基(主成分分析培养基)中的众多细菌之一。
230.图像系列清楚地示出了通过增殖从单个细菌到微菌落形成单位的转变。
231.图10a显示了生长5小时后在ptfe过滤器上收集和培养的水生细菌的扫描图像的示例。将细菌收集在pfte过滤器上并嵌入在wpca培养基(水平板计数琼脂)中。过滤器参数为：孔径截止尺寸为0.2μm，直径为13mm。
232.图10a显示了10a中扫描的过滤器图像的背景扫描减除(或校正)图像。校正后的图像增强了自记录延时图像1(第一延时扫描图像)以来产生的时间变化。第一延时图像被用作背景减除图像。
233.图10c显示了通过过滤器上的细菌生长检测到的cfu浓度作为培养时间的函数的曲线。请注意8小时后cfu的小幅下降。这种下降是由于一些菌落的裂变。
234.图11a显示了生长6小时后在ptfe过滤器上收集和培养的水生细菌的扫描图像的示例。将细菌收集在pfte过滤器上并嵌入wpca培养基中。过滤器参数为：孔径截止尺寸为0.2μm，直径为13mm。
235.图11a显示了扫描图像的细节，示出了过滤器上的细胞形成单元的异质性。
236.图12a-12d显示了本发明的方法的示例的一系列步骤。在图12中，过滤器单元安装在过滤器外壳15中，流体样品经由入口11进入外壳12并经由出口23流出外壳15。
237.在图12b中，过滤器单元16已经从过滤器外壳中取出。在容器4中，已经施加了一层培养基m，并且过滤器单元16已经放置在容器4中，正面朝向容器4的底部。包括照明装置(光发射器)24和图像获取装置25的扫描和图像分析系统已经被布置成使用至少一个所选择的扫描波长来执行过滤膜的扫描和图像分析程序。
238.图12c示出了来自两个后续扫描的两个系列的图像。
239.图12d示出了所确定的生物活性的结果，显示每毫升样品的菌落形成单位(cfu)随时间(以小时为单位)的变化。